PÉCSI TUDOMÁNYEGYETEM

Átírás

1 PÉCSI TUDOMÁNYEGYETEM Biológia Doktori Iskola A Hypogymnia physodes (L.) Nyl. zuzmófaj populációi depszid- és depszidon-típusú szekunder anyagcseretermékeinek analitikai vizsgálata és molekuláris genetikai elemzése PhD-értekezés Molnár Katalin Témavezető: dr. Farkas Edit, a biol. tud. kandidátusa MTA ÖBKI, Vácrátót Belső konzulens: Salamonné dr. Albert Éva, PhD, egyetemi docens PTE TTK, Pécs PÉCS, 2011

2

3 Tartalomjegyzék 1. Bevezetés és irodalmi áttekintés A zuzmók: lichenizált gombák A zuzmóanyagok: másodlagos anyagcseretermékek Analitikai módszerek fejlődése és alkalmazása a lichenológiában A zuzmóanyagok jelentősége és biológiai szerepe Szabadgyökfogók, antioxidánsok Zuzmóanyagok hatása a nehézfém-homeosztázisra és a levegőszennyezettség-tűrésre Fény- és UV-védelem Allelopátia Antimikrobiális hatás Antiherbivor hatás Zuzmóanyagok hatása az emberi szervezetre Citotoxikus, rákellenes és vírusellenes hatás Allergének Láz- és fájdalomcsillapító hatás Fajon belüli kémiai variabilitás és ennek összefüggése a földrajzi elterjedéssel Zuzmópopulációk genetikai diverzitásának vizsgálata Összefoglalás Problémafelvetés és célkitűzések Anyag és módszer A vizsgált Hypogymnia physodes faj jellemzése A vizsgált szekunder anyagcseretermékek jellemzése A műszeres analitikai kémiai vizsgálatoknak alávetett példányok adatai Példányok HPTLC-vizsgálathoz Példányok HPLC-vizsgálathoz A szekunder anyagcseretermékek műszeres analitikai kémiai vizsgálatának módszerei HPTLC HPLC A molekuláris genetikai vizsgálathoz használt anyagok és módszerek Eredmények és értékelés Szekunder anyagcseretermékek vizsgálata a Hypogymnia physodes zuzmófajban HPTLC és HPLC műszeres analitikai kémiai módszerekkel Eredmények HPTLC HPLC Protocetráriasav hidroxi-fizodsav Fizodálsav O-metil-fizodsav Fizodsav Atranorin

4 Klór-atranorin Látó-hegy (Budapest) Hosszúerdő-hegy (Budapest) Remete-hegy (Budapest) Zalaegerszeg Salgótarján Almásfüzitő-felső Tarjánka-szurdok (Mátra) Kolozs-lápa (Bükk) Csákpilis (Bükk) Egerszalók Csévharaszt Avenului Zgurăşti (Bihar-hegység) Štrbské Pleso (Magas-Tátra) Eredmények értékelése Az eredmények hasznosításának lehetőségei Hypogymnia physodes (L.) Nyl. populációinak molekuláris genetikai vizsgálata Összefoglalás Irodalomjegyzék Függelék Köszönetnyilvánítás Absztrakt Abstract Az értekezés témakörében publikált tudományos közlemények Teljes publikációs lista

5 1. Bevezetés és irodalmi áttekintés Egyetemista koromban, 1996-ban több más kortársamhoz hasonlóan környezeti problémákhoz kötődő területen kezdtem meg a diplomamunkámmal (Molnár, 1999) kapcsolatos kutatásaimat. Ekkor fordult érdeklődési területem a zuzmók irányába. A zuzmók és a bioindikációs terület közelebbi megismerése a hiányterületeket is egyre jobban kirajzolta számomra. A lichenológiai szakirodalomban számos részlet található a zuzmók másodlagos anyagcseretermékeiről, hazánkban azonban a zuzmókémiai vizsgálatok csak 1998-ban kezdődtek el (Farkas és mtsai, 1998, 1999), ennélfogva a legtöbb faj hazai példányainak zuzmóanyagösszetétele a mai napig feltáratlan. Mennyiségi méréseket pedig nemzetközi szinten is csak korlátozott számban végeztek. A zuzmókémiával kapcsolatos szakirodalomban számos olyan tanulmánnyal találkoztunk, amelyek kimutatták, hogy a különböző környezeti faktorok, pl. fény, hőmérséklet, táptalaj ph-ja, táptalaj összetétele hatással vannak a zuzmók másodlagos anyagcseréjére (pl. BeGora és Fahselt, 2001; Culberson és mtsai, 1977c, 1983; Fahselt, 1979; Hamada, 1989, 1991, 1996; Mirando és Fahselt, 1978). A levegőszennyezettség és a szekunder anyagcseretermékek kapcsolata vizsgálataink indításakor még ismeretlen volt, mára már ezen a területen is jelent meg publikáció (Białonska és Dayan, 2005). A fajon belüli kémiai diverzitás a másodlagos anyagcseretermékek tekintetében zuzmók esetén is ismert, több fajnál mutattak ki különböző kemotípusokat (pl. Culberson és mtsai, 1984; Filson, 1981; Hale, 1962; Moore, 1968; Sheard, 1974). A kemotípusok elterjedése jellegzetes földrajzi mintázatot mutathat (pl. Randlane és Saag, 1989; Sheard, 1974). Fentiekkel összefüggésben merült fel egy toxitoleráns zuzmófaj eltérő földrajzi helyekről származó populációi kémiai diverzitásának megismerésére vonatkozó problémakör, ami összekapcsolja a szupraindividuális és infraindividuális kutatási területeket. Egy faj eltérő földrajzi helyekről származó populációi a kémiai változatosságon kívül genetikai variabilitást is mutathatnak. A nemzetközi szakirodalom néhány zuzmófaj esetén közöl ilyen jellegű adatokat (pl. Beard és DePriest, 1996; Zhou és mtsai, 2006). Ezért indokoltnak láttuk az általunk kiválasztott faj populációinak kémiai változatossága mellett megvizsgálni azok genetikai diverzitását is. Bevezetésemben áttekintést adok a zuzmókról és a zuzmóanyagokról általában, valamint részletesen írok azok szerepéről, mert ez a terület Magyarországon alig ismert, illetve a szerepük nemzetközi szinten sem teljesen feltárt (Molnár és Farkas, 2010). Áttekintem továbbá a zuzmópopulációk kémiai és genetikai diverzitására vonatkozó szakirodalmat. 4

6 1.1. A zuzmók: lichenizált gombák A zuzmó stabil, ökológiailag obligát, önfenntartó mutualizmus egy gombapartner (mikobionta) és egy vagy több extracellulárisan elhelyezkedő, egysejtű vagy fonalas fotoautotróf partner (fotobionta: alga vagy cianobaktérium) között (Hawksworth és Honegger, 1994 után módosítva). A zuzmótelepek inkább tekintendők apró ökoszisztémáknak, mintsem organizmusoknak (Farrar, 1976; Lumbsch, 1998). A legfrissebb becslések szerint megközelítően zuzmófaj létezik (Boustie és Grube, 2005; Feuerer és Hawksworth, 2007; Kirk és mtsai, 2008) óta a zuzmókat a gombapartner alapján nevezzük el (Voss és mtsai, 1983). Jelen disszertációban az aktuális zuzmónevek tekintetében a online adatbázist követem, a hivatkozásokban használt neveket pedig zárójelben tüntetem fel. A gombapartner a zuzmók 98%-ában aszkuszos gomba (Ascomycota) (Gilbert, 2000; Honegger, 1991), a többi pedig a bazídiumos gombák (Basidiomycota) és az anamorf gombák (Fungi Imperfecti) csoportjába tartozik. Az összes ismert gomba körülbelül 21%-a fordul elő a zuzmókban, mint mikobionta (Honegger, 1991), így a zuzmók képviselik a legnagyobb mutualista csoportot a gombák között. Mai ismereteink szerint a lichenizált gombák kb. 85%- a él mutualizmusban egysejtű vagy fonalas zöldalgával (Chlorophyta, 25 nemzetség), kb. 10%-a cianobaktériummal (Cyanophyta, 15 nemzetség), 3 4%-a (az ún. cefalódiumos zuzmók) mindkettővel egyszerre (Honegger, 1991; Kirk és mtsai, 2008). Mindössze 2 3 sárgászöld algás (Xanthophyceae) zuzmót ismerünk, pl. Verrucaria funckii, V. laevata, V. maura (mindhárom Heterococcus caespitosus fotobiontával) (Tschermak-Woess, 1988). Mindezidáig egyetlen barnaalgás (Phaeophyceae) fajt írtak le, ez a Verrucaria tavaresiae, amelyben a fonalas Petroderma maculiforme a fotobionta (Moe, 1997). A zuzmók 98%-ában nem ismerjük a fotoautotróf partner hovatartozását faji szinten (Honegger, 2001). A lichenizált gombák sokféle élőhelyen fordulnak elő: a sarkoktól a trópusokig, az alföldi régióktól a legmagasabb hegységekig, vizes élőhelyektől a száraz területekig (Nash, 1996, 2008). Aljzat tekintetében megtalálhatók kőzeteken vagy azok felső rétegében, talajon, fakérgen, élő levelek felszínén, mohán, állatok páncélján, valamint bármilyen mozdulatlan, zavarásmentes antropogén anyag felszínén, pl. megmunkált fán, bőrön, csonton, üvegen, porcelánon, fémen, betonon, habarcson, téglán, gumin és műanyagon (Brightman és Seaward, 1977; Farkas, 2007; Seaward, 2008). Lisická (2008) például 18 zuzmófajt azonosított akrilbevonatú alumínium tetőn. A zuzmók többsége szárazföldi, de ismerünk fajokat édesvízi patakokból (pl. Aspicilia aquatica, Dermatocarpon rivulorum, Peltigera hydrothyria, Staurothele fuscocuprea, Verrucaria aquatilis), és tengerek litorális zónájából (pl. Coccotrema maritimum, Verrucaria halizoa, V. maura) is (Nascimbene és Nimis, 2006; Nash, 2008; Rogers, 1988). A zuzmók képesek túlélni extrém környezeti feltételek között is: képesek alkalmazkodni extrém hőmérsékleti viszonyokhoz, szárazsághoz, árvízhez, extrém sótartalomhoz, levegőszennyező anyagok magas koncentrációjához, tápanyagszegény, magas nitrogéntartalmú környezethez (Nash, 2008). Szárazföldi élőhelyeken ők az első kolonizálók, azaz pionír szervezetek (Francis, 1842; Hale, 1974; Linnaeus, 1762; Syers és Iskandar, 1973; Topham, 1977). Továbbá, mindkét mutualista partner képes túlélni az űrben (Sancho és mtsai, 2007). A partnerek közötti kapcsolat részben magyarázatot ad a zuzmók e lenyűgöző 5

7 adaptációs képességére (Bačkor és Fahselt, 2008). Mindemellett számos zuzmófaj rendkívül érzékeny a különböző levegőszennyező anyagokra, elsősorban a nitrogén-, kén- és nehézfémtartalmú vegyületekre, ezért széles körben használják őket bioindikátorként (pl. Fernández- Salegui és mtsai, 2007; Glavich és Geiser, 2008; Gries, 1996; Sheppard és mtsai, 2007) A zuzmóanyagok: másodlagos anyagcseretermékek A lichenizált gombák sokféle szekunder anyagcsereterméket állítanak elő, amelyek többsége kizárólagosan a zuzmókban fordul elő. Ezek a kémiailag változatos (alifás és aromás) zuzmóanyagok relatíve alacsony molekulatömegűek (Galun és Shomer-Ilan, 1988). A zuzmótelepben a mikobionta állítja őket elő (Elix, 1996; Huneck, 1999), és a gombafonalak külső felszínén rakódnak le apró extracelluláris kristályokként a kéregben (pl. atranorin, parietin, uzneasav, melaninok) vagy a bélrétegben (pl. fizodsav, fizodálsav, protocetráriasav) (1. és 2. ábra). A fotobionta szintén hatással lehet a gombapartner szekunder anyagcseréjére (Brunauer és mtsai, 2007; Yamamoto és mtsai, 1993; Yoshimura és mtsai, 1994). Napjainkig körülbelül 1050 zuzmóanyagot azonosítottak (Stocker-Wörgötter, 2008). Ez a szám jóval magasabb annál, mint amit korábbi irodalmakban találunk (pl. Culberson, 1970; Culberson és Elix, 1989; Culberson és mtsai, 1977b; Elix, 1996; Elix és Stocker-Wörgötter, 2008; Galun és Shomer-Ilan, 1988; Hegnauer, ; Huneck, 1999; Huneck és Yoshimura, 1996; Lumbsch, 1998), ami annak köszönhető, hogy ma már a zuzmótelepben előforduló anyagok mellett a zuzmógomba-tenyészetek szekunder anyagcseréjét is vizsgálják. 1. ábra. Az Umbilicaria mammulata zuzmó telepének keresztmetszetéről készült fénymikroszkópos felvétel. 2. ábra. A Hypogymnia physodes lombos telepének keresztmetszete. A hifák felületét a zuzmóanyagok extracelluláris kristályai borítják be. (Bóka Károly és Molnár Katalin SEM felvétele.) 6

8 Tenyészetben a fotobionta nélkül növő mikobionta, megfelelő tenyésztési feltételek mellett, képes termelni a zuzmóra specifikus szekunder metabolitokat (Brunauer és mtsai, 2006; Culberson és Armaleo, 1992; Fazio és mtsai, 2007; Hager és Stocker-Wörgötter, 2005; Hager és mtsai, 2008; Mattsson, 1994; Stocker-Wörgötter és Elix, 2002), de termelhet olyan anyagokat is, amelyek eltérnek azoktól, amit a szimbionta telepben találunk (Brunauer és mtsai, 2007; Yoshimura és mtsai, 1994). Minden egyes zuzmógomba speciális tenyésztési körülményeket (mint például táptalaj, hozzáadott cukrok és poliolok, ph, hőmérséklet, fény, stressz) igényel ahhoz, hogy előállítsa az adott zuzmófajra jellemző másodlagos anyagcseretermékeket (Hager és mtsai, 2008). Ugyanígy egy faj különféle kemotípusai esetén is eltérőek lehetnek a mikobionta számára ideális (azaz az adott kemotípusra jellemző zuzmóanyagok termelését támogató) tenyésztési feltételek, pl. a táptalaj összetétele, hőmérséklet- és fényingadozások, kiszáradás (Stocker-Wörgötter és mtsai, 2004). Hasonlóképpen, zuzmótenyészetek (fotobionta és mikobionta együtt) is képesek számos esetben zuzmóanyagokat termelni (Yamamoto és mtsai, 1985, 1993), de ezek általában eltérőek a zuzmótelepben természetesen előforduló anyagoktól (Yamamoto és mtsai, 1993). A lichenizált bazídiumos gombák nem termelnek zuzmóanyagokat (Lumbsch, 1998). Az egyes zuzmóvegyületek a telep speciális részeiben találhatóak (Feige és Lumbsch, 1995; Lawrey, 1995; Nybakken és Gauslaa, 2007), ami összefüggésben van a biológiai szerepükkel. Ez a mintázat jellegzetes és állandó bizonyos taxonómiai egységeken belül (Lawrey, 1995). Hyvärinen és munkatársai (2000) szerint a szekunder anyagcseretermékek koncentrációja a Hypogymnia physodes, Vulpicida pinastri és Xanthoria parietina lombos zuzmók esetében magasabb a szexuális (apotéciumok X. parietina) és aszexuális (szorédiumok H. physodes, V. pinastri) reproduktív teleprészekben, mint a vegetatívakban. Ez az eloszlási mintázat összhangban van az ún. optimális védelmi elmélettel (optimal defense theory, ODT), amely szerint a fitness szempontjából legjelentősebb struktúrák kémiailag védettebbek. Különféle módszereket használnak a zuzmóanyagok térbeli elhelyezkedésének megállapítására, pl. fluoreszcens mikroszkópia (Kauppi és Verseghy-Patay, 1990), szkenning elektronmikroszkópia (SEM) és lézer mikropróba tömegspektroszkópia (LMMS) párosítva fluoreszcens mikroszkópiával és transzmissziós elektronmikroszkópiával (TEM) (Elix, 1996; Elix és Stocker-Wörgötter, 2008). Továbbá, intakt zuzmótelepeknél használatos az FT-Raman spektroszkópia, amely egy nem-roncsoló típusú analitikai módszer (Edwards és mtsai, 2005). A zuzmók jelentős mennyiségű szekunder anyagcsereterméket tartalmazhatnak, általában 0,1 10%-át a telep szárazanyag-tartalmának, de néha akár 30%-át is (Galun és Shomer-Ilan, 1988; Solhaug és mtsai, 2009; Stocker-Wörgötter, 2008). A zuzmóvegyületek előfordulási mintázata általában taxonspecifikus, ezért széles körben használják a zuzmótaxonómiában és -szisztematikában (Brodo és mtsai, 2008; Carlin, 1987; Culberson, 1963, 1969b; Culberson és Culberson, 1956; Egan, 1986; Fehrer és mtsai, 2008; Hawksworth, 1976; Nelsen és Gargas, 2008; Nordin és mtsai, 2007; Nylander, 1866; Piercey- Normore, 2007; Schmitt és Lumbsch, 2004; Stenroos és mtsai, 2002). Azonban nem szabad figyelmen kívül hagyni, hogy a zuzmóanyag-produkció lehet homoplázikus, emiatt a másodlagos anyagcserében mutatkozó hasonlóságok nem feltétlenül jelentenek közeli filogenetikai rokonságot (Nelsen és Gargas, 2008). A szekunder metabolizmus genetikailag kontrollált 7

9 (Culberson és Culberson, 2001), és néhány nemzetség, illetve faj esetében összefüggésben van a morfológiával és a földrajzi elterjedéssel (Egan, 1986; Zhou és mtsai, 2006). A zuzmóanyagokat elsőként Asahina és Shibata (1954) osztályozta kémiai szerkezetük és bioszintézisük alapján. Rendszerük 80 vegyületet tartalmazott. Az analitikai módszerek fejlődésével ez az osztályozás újra és újra módosult. A ma elfogadott osztályozás Culberson és Elix (1989) nevéhez kötődik, akik a zuzmóanyagokat bioszintézisük és kémiai tulajdonságaik alapján csoportosították (1. táblázat). A legtöbb szekunder metabolit az acetil-polimalonil anyagcsereút terméke (beleértve a poliketid útvonalat is), míg a többi a mevalonsav és a sikimisav útvonalakon képződik (3. ábra). A szekunder anyagcseretermékek szintéziséhez szükséges szénatomokat a fotobionta fotoszintézise szolgáltatja, és a szénhidrátok főként glükóz és cukoralkoholok (poliolok) formájában szállítódnak a gombapartnerbe. 1. táblázat. A szekunder anyagcseretermékek fő osztályai zuzmókban [Culberson és Elix (1989), valamint Elix és Stocker-Wörgötter (2008) alapján]. 1. Acetil-polimalonil anyagcsereútvonal 1.1 Másodlagos alifás savak, észterek és rokon származékok 1.2 Poliketid-eredetű aromás vegyületek Monociklikus fenolos vegyületek Egyszerű fenolos egységek di- és triaril származékai a Depszidek, tridepszidek és benzil-észterek b Depszidonok és rokon difenil-éterek c Depszonok d Dibenzofuránok, uzneasavak és származékaik Antrakinonok és biogenetikailag rokon xantonok Kromonok Naftakinonok Xantonok 2. Mevalonsav anyagcsereútvonal 2.1 Di-, szeszter- és triterpének 2.2 Szteroidok 3. Sikimisav anyagcsereútvonal 3.1 Terfenilkinonok 3.2 Pulvinsavszármazékok 8

10 3. ábra. A zuzmók szekunder anyagcseretermékeinek feltételezett bioszintetikus útvonalai [Elix és Stocker- Wörgötter (2008) alapján] Analitikai módszerek fejlődése és alkalmazása a lichenológiában William Nylander, finn botanikus és entomológus volt az első, aki a zuzmók kémiáját taxonómiai célokra alkalmazta (Nylander, 1866). Különböző zuzmóanyagok jelenlétét mutatta ki a ma is használatos cseppreakciók segítségével. A XX. század elején Zopf (1907) és Hesse (1912) számos zuzmóvegyületet írt le, többnyire azonban még szerkezeti jellemzés nélkül (Shibata, 2000). Nem sokkal később Yasuhiko Asahina kifejlesztette a mikrokristályosítás technikáját a zuzmóanyagok azonosítására (Asahina, ). Ezzel az egyszerű és gyors módszerrel több száz zuzmófajban mutatták ki a lichenológusok a fő ( major ) zuzmóanyagokat, azonban alkalmatlannak bizonyult a kísérő ( minor ) komponensek kimutatására, valamint zuzmóanyag-keverékek vizsgálatára ben Carl Axel Wachtmeister kezdte el a papírkromatográfia használatát a zuzmóanyagok szétválasztására és jellemzésére. Mitsuno (1953) magyarázatot adott a zuzmóvegyületek kémiai szerkezete és retenciós faktoruk (R f ) közötti kapcsolatra. Mivel ez a módszer nem volt képes minden egyes vegyület elkülönítésére, Ramaut (1963a, b) elkezdte használni a vékonyréteg-kromatográfiát (TLC) depszidek és depszidonok analízisére [a zuzmó szekunder anyagcseretermékek legnagyobb hányada ebbe a két csoportba tartozik, különösen igaz ez azokra a vegyületekre, amelyek kizárólagosan a zuzmókban fordulnak elő (Lumbsch, 1998)]. 9

11 A vékonyréteg-kromatográfiát széles körben használták specifikus zuzmóanyagcsoportok vizsgálatára (Bendz és mtsai, 1965, 1966, 1967; Santesson, 1965, 1967a, b), azonban a különböző szerzők különböző oldószerelegyeket és kromatográfiás körülményeket alkalmaztak, ezért az eredmények nem voltak összehasonlíthatóak. Ennek a problémának a megoldására fejlesztett ki egy sztenderdizált módszert Chicita F. Culberson és Hörður Kristinsson ben. Bevezették az R F -osztályok (2. táblázat) használatát, amelyek a TLC-foltok relatív elhelyezkedésétől függenek, ennélfogva állandóbbak és megbízhatóbbak. Módszerük rutin technikává fejlődött a kemotaxonómiában és a növénykémiában (Culberson, 1972b, 1974; Culberson és Johnson, 1976, 1982; Culberson és mtsai, 1981). 2. táblázat. A zumóanyagok R F osztályainak meghatározása vékonyréteg-kromatográfiás vizsgálatok során [Culberson és Kristinsson (1970) alapján]. RF osztály Formula a számításhoz 8 R F X > R F A 7 R F X = R F A 6 R F X < R F A és R F X > R F N + ½ (R F A R F N) 5 R F X < R F N + ½ (R F A R F N) és R F X > R F N 4 R F X = R F N 3 R F X < R F N és R F X > ½ R F N 2 R F X < ½ R F N és R F X > 0 1 R F X = 0 Rövidítések: R F, retenciós faktor (mm); A, atranorin; N, norsztiktasav; X vizsgált anyag. Később elkezdődött a nagyfelbontású vékonyréteg-kromatográfia (HPTLC) használata (Arup és mtsai, 1993), amely érzékenyebb módszer, valamint több minta vizsgálatát teszi lehetővé rövidebb idő alatt és kevesebb reagens felhasználása mellett. Egyszerűsége miatt újabban ez a mikrokémiai technika vált a legelterjedtebbé a zuzmóanyagok analízisében. Mindkét módszert (TLC és HPTLC) ma már rutinszerűen alkalmazzák a lichenológiában a zuzmók azonosításához. Mindemellett fontos adatokat szolgáltatnak a molekuláris, morfológiai és anatómiai információk mellé, a filogenetikai kapcsolatok tisztázásánál és a zuzmók rendszerezésénél (McDonald és mtsai, 2003; Miadlikowska és Lutzoni, 2000; Thell és mtsai, 2002). A szekunder anyagcseretermékek nagy része kis illékonyságú és hőstabilitású, ezért nem alkalmasak gázkromatográfiás vizsgálatra. Emiatt kezdte el Chicita F. Culberson (1972a) a nagysebességű folyadékkromatográfia alkalmazását zuzmókivonatokon. Először normálfázisú kromatográfiát használt, amelynél az állófázis poláris (szilikagél oszlop) és a mozgófázis (eluens) pedig apoláris (hexán-izopropanol-ecetsav elegy). Később bevezette a fordított fázisú kromatográfia használatát a lichenológiában, apoláris C18 oszlop és poláris vízmetanol-ecetsav eluens alkalmazásával, elsőként orcinol és β-orcinol depszidek és depszidonok szétválasztására (Culberson és W. Culberson, 1978a; W. Culberson és Culberson, 1978b). Az elúció mindegyik esetben izokratikus volt, és bár kiváló eredményeket hozott a zuzmóanyagok elválasztásában és azonosításában, a gradiens elúció hatékonyabb a zuzmókivonatok HPLC-analízisénél, mivel azok sokszor igen eltérő hidrofóbicitású vegyületeket tartalmaznak (Culberson és Elix, 1989). A gradiens elúciót Strack és munkatársai (1979) alkalmazták először a lichenológiában, akik 13 fenolos zuzmóvegyületet választottak el, köz- 10

12 tük depszideket, depszidonokat, dibenzofuránokat és pulvinsav-származékokat. RP-8 típusú oszlopot használtak, valamint 70 perces lineáris gradienst 2%-os ecetsav-oldattól (A oldószerelegy) 100% metil-alkoholig (B oldószerelegy). Huovinen (1987) kifejlesztett egy sztenderdizált HPLC-módszert az aromás zuzmóanyagok minőségi és pontos mennyiségi analízisére háromféle fordított fázisú oszlopon (RP-8, RP-18 és RP-fenil). Gradiens elúciót alkalmazott metanol és orto-foszforsav-oldatokkal, valamint két belső sztenderddel: benzoesav (alacsony retenciós idő) és bisz-(2-etil-hexil)-ftalát (magas retenciós idő). Bevezette a retenciós indexet (R.I.), aminek értéke a belső sztenderdekhez viszonyított és ennélfogva sokkal állandóbb, mint a retenciós idő, azaz összehasonlításokra alkalmasabb. Később a módszert továbbfejlesztették Feige és munkatársai (1993b), akik belső sztenderdként a benzoesav mellett a szolorinasav (solorinic acid) használatát javasolták, mivel ez jobban hidrófób jellegű a bisz-(2-etil-hexil)-ftalátnál (következésképpen még magasabb retenciós idejű), így alkalmassá téve a technikát az olyan zuzmókivonatok vizsgálatára is, amelyek kloroxantonokat vagy hosszú láncú depszideket is tartalmaznak. Ugyan a HPLC alkalmazása költségessége miatt nem vált rutinszerűvé a lichenológiában, taxonómiai vizsgálatok során azonban gyakran alkalmazzák (Feige és Lumbsch, 1995; Zeybek és mtsai, 1993a, b). A 1 H és 13 C NMR spektroszkópiák, a tömegspektrometria és a röntgenkrisztallográfia alkalmazása a szerkezetfeltárásban szintén tovább növelte az ismert zuzmómetabolitok számát (Culberson és Elix, 1989). Ma már a molekuláris genetikai módszerek jelentik az uralkodó irányt a zuzmók kémiájának vizsgálatában is. A molekuláris technikákat használó kutatások elsődlegesen a zuzmók filogenetikai viszonyainak feltárására irányultak (pl. Lutzoni és Vilgalys, 1995), de egyre inkább kiterjedtek más területekre is, pl. fotoszimbiodémek (Armaleo és Clerc, 1991), a zuzmószimbiózis és a DNS-metiláció kapcsolata (Armaleo és Miao, 1999), fotomorf párok (Goffinet és Bayer, 1997), kemotípusok (Nelsen és Gargas, 2009). A zuzmók másodlagos anyagcseretermékei bioszintézisének genetikai hátteréről azonban még kevés információ áll rendelkezésünkre (Schmitt és mtsai, 2005). A poliketid-szintáz enzimeket kódoló gének (PKS-gének) szerkezete és típusai zuzmógombákban is ismertek (Elix és Stocker-Wörgötter, 2008; Schmitt és mtsai, 2008; Stocker-Wörgötter, 2008), és ezeket a géneket felhasználják a különböző zuzmócsoportok filogenetikai vizsgálatában (Grube és Blaha, 2003; Schmitt és mtsai, 2005; Schmitt és Lumbsch, 2009) A zuzmóanyagok jelentősége és biológiai szerepe A másodlagos anyagcseretermékek nem nélkülözhetetlenek a zuzmók túléléséhez és növekedéséhez (Bentley, 1999), de jelenlétük számos előnyt szolgáltathat az élőlény számára. A kísérletes vizsgálatoknak köszönhetően ma már viszonylag sokat tudunk ezen anyagok biológiai aktivitásáról, azonban ténylegesen betöltött szerepük a zuzmószimbiózisban még kevéssé ismert (Hager és mtsai, 2008). Befolyásolhatják a zuzmók kapcsolatát a biotikus és az abiotikus környezeti tényezőkkel. Szerepet játszhatnak a növényevők, a patogének, a 11

13 kompetítorok, valamint külső abiotikus tényezők, pl. magas UV-besugárzás elleni védekezésben. Számos zuzmóanyag mutat többféle biológiai hatást (4. ábra). CH 3 CO HO O OH H 3 C OH H 3 C O CO CH 3 4. ábra. Az uzneasav szerkezeti képlete és az Usnea florida telepe. Az uzneasav az összes Usnea faj telepének kéregrétegében megtalálható. Többféle biológiai aktivitását (pl. antimikrobiális, antivirális, rákellenes, gyulladásgátló, láz- és fájdalomcsillapító hatások, UV-abszorpció és allergén reakciók okozása) is kimutatták. (Lőkös László felvétele.) Amikor a zuzmóvegyületek biológiai hatásait vizsgáljuk, fel kell derítenünk a természetes életfolyamatokban betöltött szerepüket, de emellett szintén vizsgálnunk kell hasznosságukat egyéb speciális területeken is, például a farmakológiában. Szerkezetileg nagyon hasonló felépítésű anyagcseretermékek gyakran mutatnak alapvetően különböző biológiai aktivitást. Hager és munkatársai (2008) vizsgálata szerint a barbátasav és a diffraktasav, melyek mindössze egyetlen funkciós csoportban különböznek, eltérő biológiai hatásokkal rendelkeznek. Heterodea muelleri mikobionta-tenyészetéből kivont barbátasav, a természetes körülmények közöttivel megegyező koncentrációban, erősen gátolja a zuzmó saját fotobiontájának (Trebouxia jamesii) a növekedését és lelassítja az alga mitózisát in vitro. Magasabb koncentrációkban sejthalált okozhat. Ezzel szemben az ugyanabból a gombatenyészetből származó diffraktasav semmilyen hatással sincs az alga növekedésére. Fenti eredmények alapján megállapíthatjuk, hogy a barbátasavnak szerepe lehet az algasejtek növekedésének és mitózisának szabályozásában a zuzmótelepben Szabadgyökfogók, antioxidánsok A szabadgyökök [reaktív oxigén-származékok (ROS), pl. hidroxil-gyök, szuperoxidanion, hidrogén-peroxid, és reaktív nitrogén-származékok (RNS), pl. nitrogén-monoxid gyök] fontos szerepet játszanak számos sejten belüli kémiai folyamatban, azonban nem kívánt hatásaik is vannak, például sejtkárosodást okozhatnak. Megtámadják a sejt fehérjéit és nukleinsavait, valamint a sejthártya telítetlen zsírsav-alkotóelemeit. Élelmiszerek romlása, öregedési folyamatok és számos humán krónikus betegség, például Alzheimer-kór, Parkinson-kór, skizofrénia, arterioszklerózis (érelmeszesedés), emfizéma (tüdőtágulás), hemokromatózis 12

14 (vasanyagcsere zavara), rák többféle formája (pl. melanoma) mind kapcsolatban lehetnek a szabadgyökökkel. Az oxidatív stressz, ami tulajdonképpen az egyensúly megbomlása a ROStermelés és a különféle enzimatikus, illetve nem-enzimatikus biológiai rendszerek azon képessége között, hogy védelmet nyújtsanak a ROS-okozta károsodások ellen (Amo de Paz és mtsai, 2010), a zuzmótelepben is jelen van. A zuzmók másodlagos anyagcseretermékei védelmet nyújtanak az UV-fény hatására képződő szabadgyökök ellen (Marante és mtsai, 2003). Kétféle mechanizmus létezik a sejtben a szabadgyökök-okozta károsodások kivédésére: a szabadgyökfogók és a láncreakció-terminátorok. Ezek lehetnek enzimek, például szuperoxiddiszmutáz, kataláz, glutation-peroxidáz, glutation-reduktáz, valamint kismolekulájú, nem enzimatikus antioxidánsok, például glutation, polifenolok (ligninek, flavonoidok), karotinoidok, melaninok, A-vitamin, C-vitamin és E-vitamin. Mivel a szintetikus antioxidánsok gyakran rákkeltőek, a természetes antioxidánsok feltárása fontos feladat. A zuzmókban sok olyan szekunder anyagcsereterméket találtak, amelyek erős antioxidánsok. Ezek olyan fenolos zuzmóvegyületek, amelyek képesek befogni a toxikus szabadgyököket (azaz szabadgyökfogók, scavengerek). Hidalgo és munkatársai (1994) közölték néhány depszid (pl. atranorin, divarikátasav) és depszidon (pannarin, 1-klórpannarin) antioxidáns tulajdonságát. Mindegyik vegyület gátolta az autooxidációt patkányagy homogenátumban és a β-karotin-oxidációt is, de a depszidonok hatékonyabbnak bizonyultak. Russo és munkatársai (2008) hasonló eredményeket kaptak. Vizsgálataik során a depszidtípusú szferoforin és a depszidon-típusú pannarin egyaránt gátolta a szuperoxid-anion képződését in vitro, és a pannarin hatékonyabb volt. Lobaria pulmonaria metil-alkoholos kivonata növelte a szuperoxid-diszmutáz és glutation-peroxidáz enzimek szintjét patkánygyomorban, ezáltal csökkentve az indometacin által kiváltott oxidatív stresszt (Karakus és mtsai, 2009). Odabasoglu és munkatársai (2006) vizsgálataiban az uzneasav gátolta a neutrophil infiltrációt és csökkentette az oxidatív károsodást indometacin-kiváltotta gyomorfekély esetén patkányokban, azaz gasztroprotektív vegyületként viselkedett. Odabasoglu és munkatársai (2004) kimutatták, hogy a Dolichousnea longissima (= Usnea longissima) és a Lobaria pulmonaria zuzmók metanolos kivonata jelentős antioxidáns hatással rendelkezik in vitro. Luo és munkatársai (2009) szerint, az Antarktiszon uralkodó extrém környezeti körülmények (például alacsony hőmérséklet, szárazság, téli sötétség, magas UV-B-sugárzás) növelik az oxidatív stressz szintjét, következésképpen az itt élő zuzmók nagyobb mennyiségű és magasabb antioxidáns hatással rendelkező vegyületet tartalmaznak, mint a trópusi vagy mérsékelt övi elterjedésű zuzmók. Az Umbilicaria antarctica acetonos kivonata bizonyult a leghatékonyabb antioxidáns ágensnek szuperoxid-anion és egyéb szabadgyökök elfogásában (scavenging), valamint a redukáló hatás tekintetében az antarktiszi King George-szigeten gyűjtött zuzmók összehasonlító vizsgálata során. A zuzmó fő aktív komponense a lekanorasav. Bhattarai és munkatársai (2008) öt antarktiszi zuzmófaj (Caloplaca regalis, Caloplaca sp., Lecanora sp., Ramalina terebrata, Stereocaulon alpinum) antioxidáns hatását vizsgálták difenil-pikrilhidrazillal (DPPH) szemben vékonyréteg-kromatográfiás lapon, és a különböző zuzmók eltérő aktivitást mutattak. Amo de Paz és munkatársai (2010) Xanthoparmelia camtschadalis és X. conspersa zuzmók metil-alkoholos kivonatai, továbbá a belőlük izolált zuzmóanyagok (szalazinsav, sztiktasav, uzneasav) antioxidáns hatását vizsgálta. Kimutatták, hogy a zuzmókivonatok és az izolált vegyületek egyaránt csökkentik a hidrogén-peroxid-indukálta ROSképződést U373 MG humán asztrocitákban. A két faj esetén a X. camtschadalis extraktuma 13

15 bizonyult erősebb szabadgyökfogónak. Az izolált zuzmóanyagok esetén az uzneasav volt a leghatékonyabb antioxidáns, majd ezt követte a szalazinsav, végül a sztiktasav. Az asztrociták az első védelmi vonalat jelentik az agyban a ROS-okozta neurotoxicitás ellen, így az említett anyagok felhasználhatóak lehetnek az oxidatív-károsodásokhoz kapcsolódó neurodegeneratív betegségek (pl. Alzheimer- és Parkinson-kór) gyógyászati kezelésében. Mindezek az eredmények azt mutatják, hogy a zuzmók másodlagos anyagcseretermékei a természetes eredetű antioxidánsok új forrását jelenthetik Zuzmóanyagok hatása a nehézfém-homeosztázisra és a levegőszennyezettség-tűrésre A zuzmók másodlagos anyagcseretermékei érzékenyek a nehézfémekre és a levegőszennyező anyagokra, és szerepet játszhatnak a zuzmótelep fémháztartásában és szennyezéstűrésében. Białonska és Dayan (2005) számottevő változást detektált a szekunder metabolitok szintjében, nehézfémvegyületekkel és szervetlen, savas kénvegyületekkel szennyezett területekre transzplantált Hypogymnia physodes telepekben. Például az atranorin, a fizodsav és a hidroxi-fizodsav szintje jelentősen csökkent azokban a telepekben, amelyeket króm-, foszforés kénvegyületeket előállító vegyi üzem szomszédságába telepítettek. Ezzel szemben a fizodálsav szintje szignifikánsan növekedett, azt sugallva, hogy ez a komponens hatékony lehet a szennyezésstresszel szemben. Hauck és Huneck (2007b) ionspecifikus csökkenést, illetve növekedést mutatott ki a nehézfémionok adszorpciójában, Hypogymnia physodes négyféle zuzmóanyagával (atranorin, fizodsav, fizodálsav, protocetráriasav) bevont cellulózfilterek kationcserélő helyein (OH-csoportok). Ez a modell a zuzmógomba sejtfalának felszínét imitálta, amely számos, a fémkationok megkötésére alkalmas hidroxil- és karboxil-csoportot tartalmaz. Méréseik során az alkálifém Na + iont, az alkáliföldfém Ca 2+ és Mg 2+ ionokat, valamint az átmenetifémek közül a Cu 2+, Fe 2+, Fe 3+ és Mn 2+ ionokat vizsgálták. A zuzmóvegyületek szignifikánsan gátolták a Na +, Ca 2+, Mg 2+, Cu 2+ és Mn 2+ ionok kötődését, azonban növelték a Fe 3+ adszorpcióját, valamint a Fe 2+ kationra nem voltak hatással. A depszidontípusú fizodálsav volt a leghatékonyabb. Hasonló kísérleti körülmények között a depszidontípusú fumár-protocetráriasav, a Lecanora conizaeoides fő zuzmóanyaga, csökkentette a Mn 2+ megkötődését a cellulózfilter kationcserélő helyein (Hauck és Huneck, 2007a). A fumár-protocetráriasav ezen tulajdonsága kulcsfontosságú lehet a faj magas mangántűrésében. Hasonló eredményeket kapott Hauck (2008), aki azonban a mesterséges modellrendszer helyett zuzmótelepeket használt. Kimutatta, hogy a Cu 2+ és Mn 2+ ionok intracelluláris felvétele jelentősen alacsonyabb intakt Hypogymnia physodes telepekben (amelyek tartalmazzák a hét zuzmóanyagot), mint az acetonnal kezelt zuzmókban. A zuzmóanyagok nem voltak hatással a Fe 2+ és a Zn 2+ ionok felvételére. Hauck és munkatársai (2009) vizsgálataiban a dibenzofurán-típusú uzneasav és a depszidtípusú divarikátasav szignifikánsan növelte a Cu 2+ ion sejtbe történő felvételét tápanyagszegény élőhelyekről származó Evernia mesomorpha és Ramalina menziesii (csak uzneasav) 14

16 fajokban. Ugyanakkor a Mn 2+ felvételét csökkentették. Mivel a Cu 2+ ion az egyik legritkábban jelenlevő mikrotápanyag savas fakérgeken és a Mn 2+ ion viszont gyakran eléri a mérgező koncentrációt, a két zuzmóanyag említett hatásai elősegítik a két faj túlélését. Összefoglalva, az említett eredmények azt mutatják, hogy a zuzmók másodlagos anyagcseretermékei szabályozzák a zuzmótelep fém-homeosztázisát azáltal, hogy elősegítik bizonyos fémkationok felvételét a sejtbe, míg mások adszorpcióját gátolják. Ily módon elősegítik a zuzmók toleranciáját nehézfémekkel szennyezett területeken Fény- és UV-védelem A zuzmók többféle stratégiát alkalmaznak arra a célra, hogy védelmezzék fényérzékeny fotobiontáikat az erős fénytől és az UV-sugárzás káros hatásaitól. A legfontosabbak a xantofill-ciklus az algák tilakoid membránjában, valamint a fényszűrés és UV-B-védelem zuzmóanyagok által. A fényszűrés elmélete Ertl (1951) nevéhez fűződik, aki megfigyelte, hogy a felső kéregrétegben elhelyezkedő zuzmóvegyületek növelik annak átlátszatlanságát, és így csökkentik az algasejtek rétegét elérő beeső fénysugárzás mennyiségét. A fényszűrő kéregpigmentek (például parietin, uzneasav, vulpinsav) elnyelik a beeső fény nagy részét (Rao és LeBlanc, 1965), ezáltal védik a fotoszintetizáló partnert a túl erős fénysugárzástól (Galloway, 1993; Rao és LeBlanc, 1965; Rundel, 1978; Solhaug és Gauslaa, 1996). Az UV-B-sugárzás gátolja a fotoszintézist és károsítja a DNS-t. Számos szekunder anyagcseretermék (pl. atranorin, kalicin, pinasztrisav, pulvinsav, rizokarponsav, uzneasav, vulpinsav) rendelkezik erős UV-abszorpciós képességgel, és ezáltal UV-B-szűrőként funkcionálhat a telepben (Galloway, 1993; Rundel, 1978; Solhaug és Gauslaa, 1996). Azonban az UV-Bsugárzás bizonyos mennyiségben nélkülözhetetlen az azt elnyelő pigmentek szintéziséhez (Nybakken és Julkunen-Tiitto, 2006; Nybakken és mtsai, 2004). Rao és LeBlanc (1965) vizsgálatai szerint a kéregrétegben előforduló depszid-típusú atranorin fluoreszcens spektruma egybeesik az alga-klorofill abszorpciós spektrumával, ezért az atranorin által kibocsátott fény hasznosítható a fotoszintézisben Allelopátia A zuzmók szekunder anyagcseretermékei allelopatikus ágensként viselkedhetnek, azaz befolyásolhatják a szomszédos zuzmók, nem-lichenizált gombák, mohák és edényes növények, valamint mikroorganizmusok fejlődését és növekedését (Kershaw, 1985; Lawrey, 1986, 1995; Macías és mtsai, 2007; Romagni és mtsai, 2004; Rundel, 1978; Yamamoto és mtsai, 2002). Ezek a vegyületek, amelyeket a környezetébe bocsájt a zuzmó, hatással lehetnek más élőlények fotoszintézisére, légzésére, párologtatására, fehérje- és nukleinsavszintézisére, valamint a membránokon keresztüli iontranszportra és a membránok permeabilitására (Chou, 2006; Macías és mtsai, 2007). 15

17 Culberson és munkatársai (1977a) megfigyelték, hogy a Lepraria sp. elterjedése nem random két morfológiailag hasonló, de kémiailag nagyon eltérő, és egymás mellett élő Xanthoparmelia fajon. A zuzmólakó ( lichenicolous ) Lepraria sp. a vizsgált Xanthoparmelia verruculifera (= Parmelia verruculifera) telepek 73%-án megtalálható volt, ezzel szemben mindössze a vizsgált Xathoparmelia loxodes (= Parmelia loxodes) példányok 13%-a szolgált gazdaszervezetül ugyanannak a Lepraria fajnak. A zuzmóanyagok feltételezhetően allelopatikus hatással voltak a Lepraria-ra, és a X. loxodes másodlagos anyagcseretermékei károsabbak voltak a zuzmólakó zuzmó növekedésére. Whiton és Lawrey (1984) kimutatták, hogy a vulpinsav és az everniasav erősen gátolja a Graphis scripta és Caloplaca citrina kéregtelepű zuzmók aszkospóráinak csírázását. Az atranorin csak a C. citrina esetében volt gátló hatású, teljesen megszüntette annak spóracsírázását. A sztiktasav viszont egyik fajra nézve sem volt hatásos inhibitor. A Cladonia cristatella spóráinak csírázását szintén gátolta a vulpinsav, az everniasav és sztiktasav ellenben nem (Whiton és Lawrey, 1982). A zuzmótelepek közötti versengés a fényért és élőhelyért a különféle szubsztrátumokon fontos szerepet játszik a zuzmóközösségek szerkezetének és az egyes fajok elterjedésének a meghatározásában (Armstrong és Welch, 2007). A zuzmóanyagok szerepet játszhatnak ebben a versengésben (Armstrong és Welch, 2007). Moha- és zuzmópopulációk gyakran élnek együtt sziklán, talajon (5. ábra) és fakérgen, versengve a fényért, szubsztrátumért, tápanyagokért és vízért (Lawrey, 1977). 5. ábra. Hypogymnia physodes, hazánkban is gyakori zuzmófaj telepei egy kriptogám közösségben az Ökrös-fertőn (Bükk). A zuzmóanyagok gátló hatással lehetnek más kriptogám szervezetekre is (pl. mohákra) az adott élőhelyen, és jelentősen befolyásolhatják a versengési viszonyokat a kriptogám életközösségekben. Heilman és Sharp (1963) az Amerikai Egyesült Államok keleti részén húzódó Great Smoky Mountains területén figyelte meg, hogy a Thelotrema petractoides (= Ocellularia subtilis) zuzmó gátolta és túlnőtte a Frullania eboracensis mohafaj kolóniáit Aesculus octandra kérgén. Hasonlóképpen, a kőzetlakó Porpidia albocaerulescens (= 16

18 Lecidea albocaerulescens) gátló hatással volt az Anomodon attenuatus, Hedwigia ciliata, Porella platyphylla, Sematophyllum sp. fajok alkotta mohaközösségre homokkő aljzaton. Lawrey (1977) vizsgálataiban a depszid-típusú everniasav és szkvamátsav egyaránt késleltették három, velük együtt élő mohafaj (Ceratodon purpureus, Funaria hygrometrica, Mnium cuspidatum) előtelepének növekedését és a spóráik csírázását. A zuzmókról már régóta ismert, hogy gátolják vagy erőteljesen késleltetik magasabbrendű növények növekedését is (Pyatt, 1967). Például Fisher (1979) megfigyelte, hogy a Cladonia stellaris (= C. alpestris) és a C. rangiferina, boreális erdőkben gyakori zuzmófajok, allelopatikus hatással vannak a fehér lucra (Picea glauca) és a Banks-fenyőre (Pinus banksiana). A mindkét zuzmófajt tartalmazó talajtakaró szignifikánsan gátolta az említett fenyőfélék csemetéinek növekedését, valamint csökkentette azok nitrogén- és foszfortartalmát. A kontroll növényekhez képest, a zuzmógyeppel borított csemeték gyökere hoszzabb volt, de kevésbé masszív, és lényegesen kevesebb mikorrhizát tartalmazott. Marante és munkatársai (2003) szerint a Lethariella canariensis fenolos frakciójában (az ún. Letharal -ban) kimutatott 12 zuzmóanyag gátolta több közönséges kerti növény (fejeskáposzta, paprika, paradicsom, saláta) magjának csírázását. Szintén kimutatták, hogy az esővíz oldja ki és szállítja a zuzmóvegyületeket a talajba. A zuzmók szekunder anyagcseretermékei az említetteken kívül gátolják a mikorrhizagombákat és azok gazdanövényének fejlődését is (Fisher, 1979; Lawrey, 1995; Rundel, 1978). Henningsson és Lundström (1970) szerint a Hypogymnia physodes epifiton zuzmó fungisztatikus hatással van több fakorhasztó gombára, ezáltal védi saját szubsztrátumát a korhadástól. Yamamoto és munkatársai (2002) kimutatták, hogy több zuzmófaj (pl. Acarospora fuscata, Arthonia cinnabarina, Ramalina exilis) mikobiontájának tenyészete is gátolta (in vitro) két fakorhasztó gomba, a Trametes versicolor és a Fomitopsis palustris növekedését. Az aktív zuzmóanyagok kivonása és azonosítása további kutatások tárgyát képezi és potenciálisan új növekedésgátlókat mint tartósítószereket szolgáltathat a faipar számára Antimikrobiális hatás A zuzmók által termelt antibiotikus hatású szekunder anyagcseretermékek védelmet biztosítanak a legtöbb patogén szervezettel szemben. Az alábbiakban néhány példával támasztom ezt alá. Az atranorin (Physcia aipolia zuzmóból), fumár-protocetráriasav (Cladonia furcata zuzmóból), giroforasav (Umbilicaria polyphylla zuzmóból), lekanorasav (Ochrolechia androgyna zuzmóból), fizodsav (Hypogymnia physodes zuzmóból), protocetráriasav [Flavoparmelia caperata (= Parmelia caperata) zuzmóból], sztiktasav [Xanthoparmelia conspersa (= Parmelia conspersa) zuzmóból] és uzneasav (Flavoparmelia caperata zuzmóból) zuzmóanyagok viszonylag erős antimikrobiális hatást mutattak hat baktérium és tíz gomba ellen, ezek között voltak állati-, növényi- és humánpatogének, mikotoxin termelők és élelmiszerek romlását okozó organizmusok (Ranković és Mišić, 2008; Ranković és mtsai, 2008). Az uzneasav volt a legerősebb antimikrobiális ágens (erőssége összemérhető volt a sztreptomicinével), a fizodsav és a sztiktasav pedig a leggyengébbek. 17

19 Schmeda-Hirschmann és munkatársai (2008) szerint a Protousnea poeppigii zuzmó diklórmetános és metanolos kivonatai erős gombaölő hatást mutattak a Microsporum gypseum, Trichophyton mentagrophytes és T. rubrum gombapatogének ellen. A kivonatok még aktívabbak voltak a Candida albicans, C. tropicalis, Saccharomyces cerevisiae élesztőgombák, és az Aspergillus niger, A. flavus és A. fumigatus fonalas gombákkal szemben. Az izodivarikátasav, a divarikatinasav és az uzneasav, a Protousnea poeppigii fő szekunder anyagcseretermékei, szintén gombaölő hatást mutattak Microsporum gypseum, Trichophyton mentagrophytes és T. rubrum ellen, és az uzneasav volt a legkevésbé aktív. Ugyanebben a vizsgálatban az Usnea florida kivonatai szintén erős gombaölő tulajdonságúak voltak. Paudel és munkatársai (2008) vizsgálataiban öt antarktiszi zuzmó (Caloplaca regalis, Caloplaca sp., Lecanora sp., Ramalina terebrata, Stereocaulon alpinum) metanolos kivonata mutatott specifikus antibakteriális hatást, különösen erős hatással voltak Gram-pozitív baktériumokkal szemben. Türk és munkatársai (2003) Cetraria aculeata zuzmóból izolált proto-licheszterinsav antibakteriális hatását igazolták több baktérium esetében. Alectoria sarmentosa és Cladonia rangiferina vizes, etanolos és etil-acetátos kivonata közepes gombaölő hatást mutatott különféle gombafajok, köztük humánpatogének ellen, és az etil-alkoholos kivonatok voltak a legaktívabbak (Ranković és Mišić, 2007). Halama és Van Haluwyn (2004) közölte, hogy az Evernia prunastri és Hypogymnia physodes zuzmók acetonos kivonata erősen gátló hatással volt több növénypatogén gomba (pl. Phytophthora infestans, Pythium ultimum és Ustilago maydis) növekedésére. A zuzmóanyagok védelmet biztosíthatnak a zuzmólakó mikroszkopikus gombák ellen is, de utóbbiak közül néhány toleráns a zuzmóvegyületekkel szemben. Lawrey (2000) kimutatta, hogy a zuzmó belsejében élő (ún. endolichenikus) Fusarium sp. enzimatikus úton lebontja a Punctelia rudecta telepében a lekanorasavat, így lehetővé teszi a Nectriopsis parmeliae (= Nectria parmeliae) obligát zuzmólakó gomba megtelepedését a zuzmótelepen. Mivel a mikroorganizmusok rezisztenciát fejleszthetnek ki az antibiotikumokkal szemben, a gyógyszerkutatóknak újabb és újabb forrásait kell megtalálnia a hatékony antimikrobiális szereknek. A fentiekben említett eredményekből is látni, hogy a zuzmók szekunder anyagcseretermékei új bioaktív anyagokként szolgálhatnak a különféle mikroorganizmusok által okozott betegségek kezelésében Antiherbivor hatás A zuzmók táplálékul szolgálhatnak egyes növényevők számára, pl. rovarok, atkák, csigák, lepkék hernyói, azonban úgy tűnik, hogy a zuzmók legelése viszonylag ritka jelenség, feltételezhetően alacsony tápértékük, bizonyos speciális szerkezeti tulajdonságaik (például a cianobakteriális fotobiontasejtek kocsonyás burka Collemataceae fajokban, vastag kéregréteg) és védőanyagok termelése következtében (Lawrey, 1986; Rundel, 1978). Zukal (1895) javasolta először, hogy a másodlagos anyagcseretermékek zuzmóknál védelmet nyújthatnak a herbivorok ellen, később ezt az elméletet többen is alátámasztották kísérletes bizonyítékokkal (pl. Asplund és Gauslaa, 2007, 2008, 2010; Gauslaa, 2005; Nimis és Skert, 2006; Pöykkö és 18

20 mtsai, 2005). A zuzmóanyagok szintén fontos szerepet játszanak a növényevők táplálékpreferenciájában (Asplund és Gauslaa, 2010; Baur és mtsai, 1994; Pöykkö és Hyvärinen, 2003; Reutimann és Scheidegger, 1987). Asplund és Gauslaa (2010) a talajlakó Nephroma arcticum zuzmó (amelyben a fő fotobionta a Coccomyxa sp. zöldalga, és mellette elszórtan elhelyezkedő, nagy, internális cefalódiumokban lokalizálódó, N-fixáló Nostoc sp. cianobakteriális partner is található) telepein azt figyelték meg (természetes élőhelyén), hogy míg a cefalódiumok jelentősen károsodottak feltehetően meztelen csigák általi legelés következtében, addig a zöldalgás teleprészek általában érintetlenek voltak. A cefalódiumokban magukban nem termelődik zuzmóanyag, míg a zöldalgát tartalmazó teleprészekben többféle is szintetizálódik (nefroarktin, fenarktin, uzneasav). HPLC-vel meghatározták, hogy a tisztán zöldalgás részekben kétszer annyi zuzmóanyag található, mint a szomszédos hifákkal körülvett cefalódiumokban (a cefalódiumos részekben található zuzmóanyagokat a cefalódium alatti és/vagy fölötti hifák termelik). A metil-giroforát csak az utóbbiban volt kimutatható. Laboratóriumi kísérletes vizsgálataik során Arion fuscus meztelen csigát (ami a természetben is együtt él a N. arcticummal) kínáltak a zuzmó telepdarabjaival, és megfigyelték, hogy a csiga szelektíven a cefalódiumokat fogyasztja. Egy másik kísérletben acetonnal átmosott telepdarabokat (az aceton eltávolította a nefroarktin és a fenarktin 97%-át, továbbá az uzneasav 27%-át) és kezeletlen teleprészeket (kontroll) szolgáltattak táplálékul a meztelen csigáknak. A csigák az acetonos kezelésnek alávetett táplálékot preferálták (85,2 ± 5,1%-a a teljes fogyasztásnak) a kontroll-teleprészekkel szemben, nem téve különbséget a zöldalgás és cefalódiumos részek között. Mindezek az eredmények azt bizonyítják, hogy a zuzmóanyagok védelmet biztosítanak a növényevők ellen a zöldalgát tartalmazó teleprészekben, a herbivor cefalódiumok iránti preferenciája pedig a zuzmóanyagok hiányával (ill. nagyon alacsony koncentrációjával) magyarázható. A csak a cefalódiumos teleprészekben előforduló metil-giroforát nem rendelkezik antiherbivor hatással. Az uzneasav (gyakori, kéregrétegben előforduló dibenzofurán) mindkét enantiomerje erős lárvaölő hatással volt a házi szúnyog (Culex pipiens) L 2 és L 3 lárvaállapotaira (Cetin és mtsai, 2008). A lárvák mortalitása dózisfüggő volt. Hasonlóképpen, a vulpinsav és az uzneasav mindkét enantiomerje, a hemolimfába fecskendezve, toxikus volt a Spodoptera littoralis növényevő rovar polifág lárvájára nézve (Emmerich és mtsai, 1993). Mindhárom zuzmóanyag nagymértékben gátolta a lárvák növekedését olyan, sőt annál alacsonyabb koncentrációkban, mint amilyenek a zuzmótelepben természetesen előfordulnak. Emellett dózistól függően növelték a lárvaállapot hosszát (azaz késleltették a bebábozódást). Ismeretes, hogy a szintetikus vegyszerekkel szemben a természetes növényi eredetű anyagok kevésbé ártalmas hatásúak a környezetre, ezért a zuzmóanyagok alkalmasak lehetnek új növényvédő szereknek (Cetin és mtsai, 2008; Dayan és Romagni, 2001; Fahselt, 1994; Romagni és Dayan, 2002). A zuzmóvegyületek gerinces növényevő állatokra gyakorolt káros hatása szintén ismert. Az Egyesült Államokbeli Wyoming államban 2004 telén körülbelül vapiti (Cervus elaphus) pusztult el, feltehetően Xanthoparmelia chlorochroa elfogyasztásával kapcsolatos mérgezés következtében (Cook és mtsai, 2007; Dailey és mtsai, 2008). A zuzmó megtalálható volt a területen és az állatok bendőjében is (Cook és mtsai, 2007). A mérgezés során többféle klinikai tünet volt megfigyelhető, pl. vörös vizelet, a mozgás koordinációjának 19

21 hiánya (ataxia), izomgyengeség, amely gyorsan izomsorvadáshoz és fekvő (rekumbens) állapothoz vezetett. A méreganyag azonosítása céljából X. chlorochroa-ból kivont (+)-uzneasavat adagoltak nőstény juhoknak, ami magas dózisokban szelektíven roncsolta a vázizomzatot. Mivel a toxikus dózis nagyon magas volt, valószínűleg a (+)-uzneasav mellett egyéb zuzmóanyagok is szerepet játszhattak a vapitik mérgezésében. Az ilyen jellegű mérgezések rendszeresen bekövetkeznek Észak-Amerika nyugati felén, amikor a zord időjárási viszonyok miatt a vapitiknak el kell hagyniuk szokásos téli élőhelyüket, és új helyre kell vándorolniuk (Anonymous, 2004; Durrell és Newsom, 1939; MacCracken és mtsai, 1983) Zuzmóanyagok hatása az emberi szervezetre Citotoxikus, rákellenes és vírusellenes hatás Több zuzmóanyag rendelkezik citotoxikus, antivirális vagy virucid tulajdonságokkal, és így gyógyszeralapanyagok potenciális forrásait jelenthetik. A HPV (Human Papilloma Virus) kulcsszerepet játszhat a méhnyakrák kialakulásában. A HPV-nek több, mint 100 típusa ismeretes, és ezek közül számos képes megfertőzni a nemiszervek hámját, növelve a méhnyakrák kialakulásának kockázatát (Berman, 2005). A legtöbb ember élete során megfertőződik HPV-vel (akár több típussal is), azonban az immunrendszer rendszerint elpusztítja a vírust, így nem fejlődnek abnormális sejtek és méhnyakrák is viszonylag ritkán alakul ki. A HPV-vel fertőzött genitális terület kezelése radioterápiásan történhet. Klinikai kísérletek bizonyítják, hogy ha a sugárkezelést követően uzneasavat és cink-szulfátot is alkalmaznak, akkor jelentősen rövidebb idő alatt újrahámosodik a kezelt terület (a sugárkezelés után 2 hónappal a reepitelizáció mértéke 94% volt a hatásjavító terápiában is részesült betegeknél, míg ez az érték a kontroll csoportnál 76% volt), és a kiújulás esélye is kisebb (Scirpa és mtsai, 1999). Bézivin és munkatársai (2003) nyolc zuzmófaj [Cladonia convoluta, C. rangiformis, Evernia prunastri, Flavoparmelia caperata (= Parmelia caperata), Parmotrema perlatum (= Parmelia perlata), Platismatia glauca, Ramalina cuspidata, Usnea rubicunda] citotoxikus aktivitását közölték két rágcsáló- és négy emberi rákos sejtvonalon vizsgálva. A zuzmók extrakciója háromféle oldószerrel történt (n-hexán, dietil-éter és metil-alkohol), és a 24 zuzmókivonatból mindösszesen három nem volt citotoxikus egyetlen vizsgált sejtvonalra nézve sem (E. prunastri és P. glauca dietil-éteres kivonatai, valamint U. rubicunda metanolos kivonata). Az n-hexános extraktumok voltak általában a legaktívabbak, és a metanolos frakciók általában kevésbé voltak szelektívek. A legaktívabb fajok a C. convoluta (dietiléteres frakció), C. rangiformis (dietil-éteres frakció) és F. caperata (n-hexános frakció) voltak. A C. convoluta és C. rangiformis dietil-éteres és metanolos kivonatai voltak a legszelektívebbek a különféle sejtvonalakon. Han és munkatársai (2004) kimutatták, hogy a (+)-uzneasav rágcsálók májsejtjeinek mitokondriumaiban akadályozza az elektrontranszport-láncot és oxidatív stresszt okoz, ennélfogva erősen májkárosító hatású (ún. hepatotoxikus anyag). Bézivin és munkatársai (2004) vizsgálataiban a másik enantiomer, a Cladonia convoluta zuzmóból izolált ( )-uzneasav 20

22 apoptotikus sejthalált váltott ki rágcsálók leukémiás limfocita sejteiben, és más rákos sejtvonalakra nézve is citotoxikus volt, pl. Lewis tüdőkarcinóma, humán krónikus myeloid leukémia, humán emlő-adenokarcinóma és humán glioblasztóma. Mayer és munkatársai (2005) szerint az uzneasav csökkenti a humán emlőrák- és humán tüdőráksejtek proliferációját, anélkül, hogy a DNS-t roncsolná. Ez azért is nagy jelentőségű, mert a rákkutatás egyik célja olyan terápiák kifejlesztése, amelyek nem károsítják az örökítőanyagot, ennélfogva a későbbiekben nem okoznak másodlagos rosszindulatú daganatot. Következésképpen, az uzneasav megfelelő jelöltje lehet egy új, természetes eredetű, nem-genotoxikus kemoterápiás gyógyszernek. Russo és munkatársai (2008) közölték, hogy a depszid-típusú szferoforin (Sphaerophorus globosus zuzmóból izolálva) és a depszidon-típusú pannarin (Psoroma reticulatum, P. pulchrum, P. pallidum zuzmókból izolálva) gátolta az M14 humán melanóma sejtek növekedését, apoptotikus sejthalált kiváltva. Az említett zuzmóanyagok antitumor aktivitása ígéretes ennek az agresszív, kezelésekre gyakran rezisztens bőrráknak a terápiájában. Esimone és munkatársai (2009) kimutatták a Ramalina farinacea zuzmó metanolos kivonata etil-acetát-oldékony frakciójának (ET4) széles spektrumú vírusölő hatását. Az ET4 hatékony volt RNS (HIV-1) és DNS (adenovírusok, herpes simplex 1) vírusokkal szemben egyaránt. Az ET4 anti-hiv hatása a vírus replikációs ciklusának entry és post-entry fázisára is hatékony. Fazio és munkatársai (2007) szerint az uzneasav specifikus antivirális hatást mutatott a Junin virus (az Argentín vérzéses láz okozója) és a nem-patogén Tacaribe virus arenavírusokkal (Arenaviridae) szemben, a parietin pedig virucid hatású volt ugyanazokra a vírusokra nézve Allergének A zuzmók és szekunder anyagcseretermékeik kontakt allergének lehetnek olyan embereknél, akik azokra érzékenyek. Foglalkozási allergiás kontakt dermatitiszt okozhatnak az erdészetben és kertészetben dolgozóknál ( favágók ekcémája ), továbbá nem foglalkozási jellegűt bármilyen szabadban töltött tevékenység során, mint például tűzifavágás, vadászat, zuzmógyűjtés, valamint olyan kozmetikumok használata során, amelyek zuzmóanyagokat tartalmaznak, pl. parfümök, borotválkozás utáni szerek, dezodorok, fényvédő szerek (Aalto- Korte és mtsai, 2005). A 3. táblázat 11 olyan zuzmóanyagot tartalmaz, amelyek allergiás reakciókat okozhatnak. 3. táblázat. Szakirodalmi források 11 allergiás reakciót okozó zuzmóanyaghoz. Zuzmóanyag Irodalom Atranorin Dahlquist és Fregert, 1980; Thune és Solberg, 1980; Gonçalo és mtsai, 1988; Hausen és mtsai, 1993; Stinchi és mtsai, 1997; Aalto-Korte és mtsai, 2005; Cabanillas és mtsai,

23 Diffraktasav Thune és Solberg, 1980 Everniasav Fumár-protocetráriasav Dahlquist és Fregert, 1980; Thune és Solberg, 1980; Gonçalo és mtsai, 1988; Hausen és mtsai, 1993; Aalto-Korte és mtsai, 2005; Cabanillas és mtsai, 2006 Dahlquist és Fregert, 1980; Thune és Solberg, 1980; Gonçalo és mtsai, 1988; Hausen és mtsai, 1993 Lobáriasav Thune és Solberg, 1980 Perlatolsav Hausen és mtsai, 1993 Fizodálsav Thune, 1977; Thune és Solberg, 1980 Fizodsav Thune, 1977; Thune és Solberg, 1980 Szalazinsav Thune és Solberg, 1980 Sztiktasav Thune és Solberg, 1980; Hausen és mtsai, 1993 Uzneasav Mitchell és Champion, 1965; Thune és Solberg, 1980; Gonçalo és mtsai, 1988; Hausen és mtsai, 1993; Stinchi és mtsai, 1997; Aalto-Korte és mtsai, 2005; Cabanillas és mtsai, 2006 A zuzmóanyagok által kiváltott kontakt dermatitisz immunológiailag specifikus, mivel egy adott személy csak egyetlen zuzmóvegyületre, vagy szerkezetileg hasonló vegyületek egy csoportjára érzékeny (Mitchell és Champion, 1965). Többféle bőr és légzőszervi tünetet figyeltek meg, pl. bőrpír, viszketés, hámlás, kontakt csalánkiütés, szénanátha és asztma (Aalto-Korte és mtsai, 2005; Mitchell és Champion, 1965). Számos zuzmóanyag (pl. atranorin és sztiktasav) képes fényérzékennyé tenni az emberi bőrt, és ún. fotokontakt dermatitiszt okozni, amely esetén napfény hatására súlyosbodnak a tünetek (Elix és Stocker- Wörgötter, 2008; Thune és Solberg, 1980) Láz- és fájdalomcsillapító hatás Néhány zuzmóvegyületről kimutatták, hogy hatékony fájdalom- és lázcsillapítók, valamint gyulladáscsökkentők különféle emlős állatokban, és feltételezhető, hogy az emberi szervezetben is hatásosak lehetnek. Vijayakumar és munkatársai (2000) megállapították, hogy a Roccella montagnei zuzmóból kivont (+)-uzneasav szignifikáns, dózisfüggő gyulladáscsökkentő hatást mutatott patkányokban, csökkentve a karagenin-indukálta ödémát az állatok mancsán. Okuyama és munkatársai (1995) vizsgálatai szerint a diffraktasav és az uzneasav fájdalomcsillapító hatású egerekben, az uzneasav emellett lázcsillapító is. 22

24 1.5. Fajon belüli kémiai variabilitás és ennek összefüggése a földrajzi elterjedéssel A zuzmóanyagok fontos taxonómiai bélyegek faj-, nemzetség- és családszinten (kemotaxonómia). A fajon belüli kémiai diverzitás a másodlagos anyagcseretermékek tekintetében azonban zuzmók esetén is ismert. Több fajnál mutattak ki egymástól a zuzmóanyag-összetételben eltérő kemotípusokat (pl. Calatayud és Rico, 1999; Culberson, 1958; Culberson és mtsai, 1984; Filson, 1981; Giralt és mtsai, 2010; Hale, 1962; Halvorsen és Bendiksen, 1982; Moore, 1968; Randlane és Saag, 1989; Sheard, 1974; Stocker-Wörgötter és mtsai, 2004). A különböző kemotípusok a bélrétegben előforduló fő komponensben térnek el, a kéregpigmentek megegyeznek, valamint a járulékos (minor) anyagok is megegyezhetnek. Ezen kémiai változatok néhány esetben összefüggenek a morfológiával, vagy földrajzi elterjedésük mutat jellegzetes mintázatot, más esetekben viszont a kémiai diverzitás nem korrelál sem a földrajzi elterjedéssel, sem pedig az ökológiai vagy morfológiai trendekkel. Hale (1962) összesen 254 az Egyesült Államokból származó Usnea strigosa példány szekunder anyagcseretermékeinek vizsgálata során négy zuzmóanyagot (uzneasav, norsztiktasav, pszoromasav, és egy azonosítatlan rozsdavörös pigment a bélrétegben) és három kemotípust mutatott ki: norsztiktasav-kemotípus (uzneasavat és norsztiktasavat tartalmazott), pszoromasav-kemotípus (uzneasavat és pszoromasavat tartalmazott), KOH és PD kemotípus (csak uzneasav volt benne). A rozsdavörös pigment minden kemotípusban előfordult, eltérő gyakorisággal, és környezeti faktorokra vagy az öregedésre adott válasznak tekintette a szerző. A pszoromasavat tartalmazó kemotípus elterjedése az Egyesült Államok délkeleti részére korlátozódott, a másik kettő viszont kimutatható volt a faj teljes elterjedési területéről. Moore (1968) további két kemotípust mutatott ki a faj floridai példányainál (uzneasavat és fumár-protocetráriasavat tartalmazó típus, valamint uzneasavat és egy ismeretlen zuzmóanyagot tartalmazó típus), de ezek sem korreláltak a morfológiai variációkkal és elterjedési tendenciát sem mutattak. A Dimelaena oreina fajnál összesen hét kemotípus ismert. Sheard (1974) észak-amerikai példányok esetén a telepek cseppreakciói alapján öt kémiai típust különített el, amelyekből a norsztiktasavat tartalmazó kemotípus az Egyesült Államok nyugati részének hegyvidékein volt megtalálható, míg a fumár-protocetráriasavat tartalmazó kemotípus elterjedési területe a Mississippi folyótól keletre volt. A másik három kemotípus elterjedése nem mutatott hasonló földrajzi mintázatot. Culberson és munkatársai (1984) kimutattak egy hatodik kemotípust, amely szferoforint tartalmazott fő összetevőként, valamint változó koncentrációban giroforasavat, mint járulékos zuzmóanyagot. Ez a kemotípus kizárólag kaliforniai elterjedésű. Calatayud és Rico (1999) az Ibériai-félszigetről egy további kemotípust írt le, amely sztiktasavat és giroforasavat tartalmaz. Az uzneasav mind a hét kemotípusban jelen volt. Filson (1981) 23 zuzmóanyag jelenlétét mutatta ki Cladia aggregata fajban, amelyek ötven különböző kombinációban fordultak elő. A kemotípusok nem korreláltak sem a morfológiai különbségekkel, sem pedig a földrajzi elterjedéssel. Halvorsen és Bendiksen (1982) összesen 728 norvégiai Pseudevernia furfuracea herbáriumi példány zuzmóanyag-összetételét vizsgálták meg, és megállapították, hogy a 23

25 példányok három kemotípusba sorolhatóak: 48,8%-uk olivetorsavat, 1,2%-uk olivetor- és fizodsavat, 50%-uk fizod- és oxi-fizodsavat tartalmazott a bélréteg fő zuzmóanyaga(i)ként. Az olivetorsavat tartalmazó példányok mennyisége növekedést mutatott a DK-Norvégia felől ÉNy-Norvégia felé mutató gradiens mentén. A kemotípusok elterjedése nem korrelált a tengerszint feletti magassággal, az évi közepes csapadékmennyiséggel, a csapadék gyakoriságával és a szubsztrátummal sem. Mivel a három kemotípus biológiai izolációja kérdéses, a szerzők fajon belüli kemotípusoknak tekintik őket. Hawksworth és Chapman (1971) szerint Nagy-Britanniában ugyanennek a fajnak két kemotípusa fordul elő: var. furfuracea, amelynek bélrétegében fizodsav található, valamint az olivetorsavat tartalmazó var. ceratea. A két változat mindegyikében megtalálható az atranorin a kéregrétegben, és morfológiailag jelentősen nem térnek el egymástól. Földrajzi elterjedésük is hasonló, bár relatív gyakoriságukban jelentős eltérések mutatkoznak Nagy-Britannia különböző részein. A szubsztrátum típusa és a kemotípus közötti korreláció nem volt kimutatható. Randlane és Saag (1989) az egykori Szovjetunió különböző területeiről származó 62 Asahinea chrysantha példányt vizsgált meg TLC-vel. Három különböző kemotípust mutattak ki, melyek mindegyike sajátos földrajzi elterjedéssel rendelkezik. Az I. kemotípus uzneasavhiányos; -kollatolsavat, atranorint és -alektoronsavat tartalmaz. Ez a legkevésbé elterjedt a három kemotípus közül: a Szihote-Aliny hegységben, valamint Badzhal és Japán területén fordul elő. A II. kemotípus az -kollatolsav, az atranorin és az -alektoronsav mellett uzneasavat is tartalmaz. Diszjunkt elterjedésű: a Tajmír-félszigeten, Szibériában, a Távol-Keleten, Japánban és Észak-Amerikában él. A III. kemotípusban uzneasav, atranorin és -alektoronsav talalható és ennek van a legszélesebb földrajzi elterjedése: Skandináviától és a Kola-félszigettől Kamcsatkán és Csukotkán keresztül egészen Észak-Amerikáig előfordul. Giralt és munkatársai (2010) a Buellia s. lat. fajainak herbáriumi revíziója során mutattak ki egy új, az atranorin mellett különféle xanthonokat is tartalmazó kemotípust a Buellia triseptata faj esetén. Korábban a faj kizárólagosan atranorint tartalmazó kemotípusa volt ismert. Sem morfológiai, sem ökológiai, sem pedig földrajzi különbségek nem korreláltak a két kemotípussal. Egy fajon belül a zuzmóanyagok minősége mellett azok mennyiségében is mutatkozhatnak különbségek az egyes telepek között. Fahselt (1984) Cladonia stellaris (= Cladina stellaris) telepek perlatolsav- és uzneasav-tartalmát vizsgálta négy különböző élőhelyen. Mindegyik helyen jelentős különbségek mutatkoztak a zuzmótelepek között mindkét anyagra vonatkozóan. Mivel az élőhelyek között volt olyan, amely a környezeti faktorok tekintetében homogén volt, valamint a telepek közötti különbségek nem voltak nagyobb mértékűek azokon a helyeken, ahol többféle mikrohabitat-típus volt jelen, a szerző szerint a telepek közötti heterogenitást nem külső környezeti hatások okozták, hanem öröklött különbségeket tükröztek. Fahselt kimutatta továbbá, hogy az idősebb teleprészek jelentősen alacsonyabb mennyiségben tartalmazták mindkét zuzmóvegyületet. Miyawaki és munkatársai (1998) Japán, Fidzsi, Kína, Vanuatu és Uruguay területéről származó Parmotrema tinctorum példányok lekanorasav- és atranorin-tartalmát vizsgálták HPLC-vel. Megállapították, hogy mindkét zuzmóanyag mennyisége nagymértékben variábilis volt, azonban arányuk konstansnak mutatkozott élőhelytől függetlenül. A zuzmóanyag-tartalom a telepek korával nem mutatott összefüggést. 24

26 1.6. Zuzmópopulációk genetikai diverzitásának vizsgálata A molekuláris genetikai kutatások a korábban már említett területek (pl. filogenetika, fotoszimbiodémek és fotomorf párok vizsgálata) mellett a zuzmópopulációk vizsgálatára is kiterjednek. Populációkon belüli (Beard és DePriest, 1996; DePriest, 1993; Lindblom és Ekman, 2006; Zoller és mtsai, 1999) és/vagy közötti (Beard és DePriest, 1996; DePriest, 1993; Lindblom és Ekman, 2006; Zhou és mtsai, 2006; Zoller és mtsai, 1999) genetikai variabilitást már több zuzmófaj esetén kimutattak. Ezek a vizsgálatok a mikobionta DNS-re (leginkább a sejtmagi riboszomális génkomplexre és az EF1 -ra) irányulnak, mivel a fotobionták többsége nagyon kis mértékű polimorfizmust mutat például a sejtmagi riboszomális génkomplex esetén. Beard és DePriest (1996) öt különböző földrajzi régióból (Florida 1 gyep, Georgia 1 gyep, Maryland 2 élőhelyről 1-1 gyep, Észak-Karolina 5 gyep) származó Cladina subtenuis gyepeken végzett populációgenetikai felméréseket. A populációkon belüli és azok közötti variabilitás meghatározásához genetikai markerként a nrssu régiót használták. A lokusz hosszát és a restrikciós-helyek változatosságát vizsgálták. Egy adott élőhelyről származó gyepen belüli podéciumok esetén az említett lokusz nem mutatott polimorfizmust, gyepek között viszont igen. Különböző földrajzi helyekről származó gyepek esetén a nrssu hossza szintén variábilis volt. A genetikai diverzitás az intronok (group I intronok) számán (1 vagy 2) és hosszán (200 vagy 400 nukleotid) kívül azok pozíciójából is adódott. Ezek alapján a példányokat három osztályba sorolták: az első osztályba tartozóknál a lokusz két inzerciót tartalmazott: egy kb. 400 nukleotid hosszúságút az pozícióban és egy kb. 200 nukleotid hosszúságút az pozícióban, a második osztály esetén két kb. 200 nukleotidnyi inzerció volt az és az pozícióban, a harmadik osztály esetén pedig egyetlen kb. 200 nukleotidnyi intron volt az pozícióban. A marylandi minták egyike az első, a másik pedig a második osztályba tartozott, a georgiai minta a harmadikba, a floridai a másodikba, az észak-karolinai példányok közül pedig kettő az első osztályba, három pedig a másodikba volt sorolható. DePriest (1993) a C. chlorophaea fajkomplex esetén mutatott ki populációs szintű genetikai diverzitást az nrssu hosszában és szekvenciájában (a fentiekhez hasonlóan a group I intronokra vonatkozóan), így ez a jelenség a Cladoniaceae családra jellemző bélyeg lehet. Zoller és munkatársai (1999) a svájci Alpokból származó hat Lobaria pulmonaria populáció esetén vizsgálták a populációkon belüli és közötti genetikai variációkat sejtmagi és mitokondriális régiók (nrlsu, nrigs, nrssu, nrits, mtrlsu, mtrssu, beta-tubulin és hiszton 3) szekvenciájának összehasonlításával. A vizsgált nyolc lokusz közül mindössze az ITS és a nrlsu mutatott variabilitást (intra- és interpopulációs szinten egyaránt). A legnagyobb mértékű genetikai diverzitást azok a populációk mutatták, amelyekben a gombapartner szexuálisan szaporodott. Kimutatták, hogy a populációk mérete és genetikai diverzitása között nincs korreláció. Szintén nem találtak összefüggést a populációk közötti földrajzi és genetikai távolság között. A hat kimutatott genotípus közül ötnek az elterjedése nem mutatott földrajzi mintázatot. 25

27 Zhou és munkatársai (2006) öt élőhelyről származó Rhizoplaca chrysoleuca példányok genetikai, morfológiai és kémiai diverzitását vizsgálták a kínai Mount Wuling hegységben. Az apotéciumok, illetve a telep felszínének és fonákjának színe, valamint a telep növekedési formája (szemcsés vagy lebenyes) alapján 2 morfotípust különítettek el. A másodlagos anyagcseretermékek vékonyréteg-kromatográfiás (TLC) vizsgálatával 12 kemotípust mutattak ki, amelyek 2 fő csoportba tartoztak a pszeudo-plakodiolsav és egy azonosítatlan zuzmóanyag jelenléte, illetve hiánya alapján. A genetikai variabilitás feltárására 43 példány ITS szekvenciájának vizsgálatát végezték el, nyolc másik Rhizoplaca fajt is bevonva az analízisbe. A R. chrysoleuca példányok monofiletikus csoportot alkottak, két jól elkülöníthető kláddal. Az I. klád magába foglalta az I. morfotípust és az 1. kemotípust, a II. klád pedig a II. morfotípust és a 2. kemotípust. Vizsgálták továbbá az nrssu esetén az inzerció mintázatát és megállapították, hogy a fenti két klád ebben a tekintetben is jól elkülönül egymástól. Mindezek a különbségek azt mutatják, hogy a két klád között nincs génáramlás, azaz két genetikailag izolált populációt (esetleg változatot) jelentenek. Mattsson és munkatársai (2009) populációkon belüli és azok közötti genetikai variabilitást vizsgáltak Hypogymnia physodes elsődlegesen szorédiumokkal szaporodó lombos zuzmónál a szubsztrátum-preferenciával összefüggésben. Genetikai markerként a teljes ITS nrdns régiót (ITS1, 5.8S, ITS2) és az előtte elhelyezkedő group 1 intront használták. Összesen 104, Észtországban, Finnországban és Svédországban gyűjtött telepet vizsgáltak meg. A fajon belüli genetikai diverzitás feltárása 15 haplotípust eredményezett. Az egyes régiók (intron, ITS1, 5.8S, ITS2) külön-külön is eltérő mértékű variabilitást mutattak: 5, 5, 1, 5 volt a különböző haplotípusok száma régiónként. Azt a hipotézist viszont, miszerint a zuzmók szubsztrátumpreferenciája tükröződhet a genetikájukban is, nem tudták igazolni, azaz a különböző haplotípusok különböző szubsztrátumok iránti preferenciája nem volt kimutatható. A 15 haplotípus földrajzi elterjedése sem volt eltérő Összefoglalás Napjainkig több mint 1000 másodlagos anyagcsereterméket azonosítottak zuzmókban, és új vegyületek kimutatása bizonyosan várható a kevésbé vizsgált vagy újonnan felfedezett fajokból, különös tekintettel a még feltáratlan trópusi területekről származókra. A fentiekben számos példával alátámasztottam, hogy a zuzmók szekunder anyagcseretermékei sokféle biológiai aktivitást mutatnak, és többnek fontos ökológiai szerepe is van, továbbá potenciális gyógyszeralapanyagok és növényvédő szerek. Mindazonáltal tekintettel kell lennünk arra, hogy a zuzmók lassú növekedésű szervezetek, és szekunder anyagcseretermékeik kiaknázása veszélyeztetheti túlélésüket. Utóbbi problémára megoldást kínálnak a fejlett tenyésztéses technikák és az alkalmazott változatos növekedési feltételek, amelyek elősegítik az aposzimbiotikusan növő mikobionták és a zuzmótenyészetek másodlagos anyagcseréjét (Stocker-Wörgötter, 2008; Behera és mtsai, 2009) anélkül, hogy veszélyeztetnék a természetes közösségek létét. 26

28 A zuzmóanyagok előfordulási mintázata fontos taxonómiai bélyeg család-, nemzetség- és faji szinten. A fajon belüli kémiai variációkat kemotípusnak nevezzük, amelyek elterjedése mutathat földrajzi mintázatot. Egy faj példányai között a zuzmóanyagok mennyisége is eltérhet, aminek oka lehet a mikrohabitatok különbözősége vagy a genetikai heterogenitás. Egy faj populációi a kémiai diverzitás mellett genetikai variabilitást is mutathatnak. A genotípusok elterjedésében több esetben mutattak ki tendenciákat, valamint a különböző geno- és kemotípusok közötti korrelációra is említettünk példát. 2. Problémafelvetés és célkitűzések A zuzmókémiával kapcsolatos szakirodalomban számos olyan tanulmánnyal találkoztunk, amelyek kimutatták, hogy a különböző környezeti faktorok, pl. fény (BeGora és Fahselt, 2001; Culberson és mtsai, 1983; Fahselt, 1979; Hamada, 1991), hőmérséklet (Culberson és mtsai, 1977c, 1983; Hamada, 1982, 1983, 1984, 1989; Mirando és Fahselt, 1978), táptalaj ph-ja (Hamada, 1989), táptalaj összetétele (Hamada, 1996; Hamada és mtsai, 1996; Stocker- Wörgötter és mtsai, 2004), levegőszennyezettség (Białonska és Dayan, 2005) hatással vannak a zuzmók másodlagos anyagcseréjére. Ezek az eredmények laboratóriumi kísérleteken vagy transzplantációs vizsgálatokon alapulnak. Fahselt (1981) három zuzmófaj (Cladonia turgida, Parmelia cumberlandia, Stereocaulon saxatile) telepeit transzplantálta az eredeti élőhelyről északra és délre, majd egy év eltelte után mikrokémiai (TLC és denzitometriás) vizsgálatoknak vetette őket alá. A fentiekkel ellentétben kimutatta, hogy a transzplantáció nem okozott szignifikáns változást a zuzmóanyagok minőségében és mennyiségében. Czeczuga és munkatársai (2000) 15 fajnál, köztük a Hypogymnia physodes-nél, mutattak ki minőségi és mennyiségi különbségeket a különböző természetes élőhelyekről származó telepek karotinoid-tartalmában. Mindent egybevetve több eredmény alapján feltételezhető (mint amennyi alapján nem), hogy a környezeti faktorok hatással lehetnek több szekunder anyagcseretermékcsoportra is (a karotinoidok mellett). Érdemes megjegyezni, hogy az abiotikus környezeti tényezők mellett biotikus faktorok is befolyásolhatják a zuzmóanyagok termelését. Feige és munkatársai (1993b) figyelték meg, hogy a Lecanographa grumulosa (= Lecanactis grumulosa) zuzmólakó zuzmó különféle Roccella fajokban változást idézett elő a zuzmóanyagok szintézisében a nem fertőzött zuzmótelepekhez képest. Roccella arnoldii és R. phycopsis fajok nem fertőzött telepeiben a fő szekunder anyagcseretermék az erythrin (a lekanorasav erythrityl-észtere), emellett montagnetol (az orszellinsav erythrityl-észtere) és lekanorasav mutatható még ki, mint minor metabolitok. A fertőzött telepekben az erythrin mellett a giroforasav is jelen volt, mint major komponens, míg a lekanorasav kis mennyiségben fordult elő. A R. tuberculata telepében a fő komponens a lekanorasav, az orszellinsav pedig detektálható mennyiségben fordul elő. A fertőzött telepekben azonban az erythrin volt a major komponens, a montagnetol, a lekanorasav és az orszellinsav pedig nyomokban volt jelen. Úgy tűnik, mintha ez utóbbi faj esetében 27

29 az észterképződést serkentené a Lecanographa grumulosa. Ennek módja, a jelenség pontos magyarázata még nem ismert. A bevezetésben (vö fejezet) számos példát említettünk a zuzmófajokon belül előforduló kemotípusokra, amelyek földrajzi elterjedésében több esetben mutattak ki tendenciákat. Kutatási célként annak a feltárását jelöltük meg, hogy a különböző földrajzi helyekről (ahol a környezeti tényezőkben természetesen fennálló különbségek vannak) származó zuzmópopulációk között variábilis-e a zuzmókra speciális depszidek és depszidonok produkciója, vannak-e minőségi és/vagy mennyiségi különbségek. Ebből a célból természetes élőhelyükről származó példányokat vizsgáltunk meg kémiailag. Modell-fajként a Hypogymnia physodes zuzmót választottuk, mivel ez elterjedt az egész északi féltekén (Magyarországon is), így egymástól eltérő környezeti feltételek közül származó herbáriumi és frissen gyűjtött példányokat vizsgálhattunk. Fajválasztásunk másik oka az volt, hogy a H. physodes viszonylag jól tűri a levegőszennyezést, így pl. szennyezett, városi környezetből is hozzájuthatunk összehasonlító példányokhoz. Fajválasztásunkat szintén indokolja, hogy ugyan a szakirodalomban számos részlet található a H. physodes zuzmófaj másodlagos anyagcseretermékeiről, ez idáig azonban magyarországi példányokról nem közöltek adatokat, valamint mennyiségi méréseket is csak korlátozott számban végeztek (pl. Białonska és Dayan, 2005; Czeczuga és mtsai, 2000). Ezért célul tűztük ki a legnagyobb hazai zuzmógyűjteményekben BP, EGR, VBI, a rövidítések megfelelnek az Index Herbariorumnak [(Holmgren és mtsai (1990), illetve online verzió: Thiers (2010, folyamatosan aktualizált), található Hypogymnia physodes példányok depszid- és depszidon-típusú zuzmóanyagainak minőségi vizsgálatát HPTLC (nagyhatékonyságú vékonyréteg-kromatográfia) műszeres analitikai technikával, azzal a céllal, hogy: összehasonlítsuk az eltérő földrajzi helyekről származó populációkat képviselő példányok kémiai diverzitását, feltárjuk, hogy a fajon belüli kémiai variabilitás, ha fennáll, mutat-e valamiféle mintázatot és ez korrelál-e a földrajzi elterjedéssel, kimutassuk, van-e különbség a külföldi és a hazai, a herbáriumban tárolt és a frissen gyűjtött telepek és azok teleprészeinek zuzmóanyag-tartalma között, megállapítsuk, hogy elbomlanak-e a zuzmóanyagok tárolás közben, megállapítsuk, hogy a megváltozott környezet/levegőminőségi helyzet okoz-e kimutatható különbségeket, friss példányok depszid- és depszidon-típusú zuzmóanyagainak (a továbbiakban zuzmóanyagainak) mennyiségi vizsgálatát HPLC (nagyhatékonyságú folyadékkromatográfia) műszeres analitikai kémiai módszerrel, a kapott eredmények alapján a zuzmóanyagok relatív koncentrációjának összehasonlítását, esetleges tendenciák kimutatását későbbi bioindikációs kutatásokra való lehetséges felhasználás szempontjából. 28

30 A lichenológiában egy faj eltérő földrajzi helyekről származó populációinak összehasonlítására a másodlagos anyagcseretermékek mellett a molekuláris genetikai különbözőségeket is használják. Emiatt indokoltnak láttuk megvizsgálni a populációk közötti kémiai variabilitás mellett a genetikai diverzitást is. A molekuláris genetikai kutatások zuzmók esetén többnyire a gombapartner örökítőanyagára irányulnak, törzsfejlődéstani és rendszertani vizsgálatok céljából (Gueidan és mtsai, 2007; Hibbett és mtsai, 2007; Lutzoni és mtsai, 2004; Miadlikowska és mtsai, 2006; Schoch és mtsai, 2009), de a fotobiontákról is egyre többet tudunk meg (Beck és mtsai, 1998; Lücking és mtsai, 2009). Az utóbbi években megindultak a zuzmók szimbionta partnerei genomjára irányuló kutatások Cladonia grayi és Xanthoria parietina fajoknál. Elsőként Armaleo és May (2009) qpcr-on alapuló módszerrel meghatározták a nukleáris genom méretét C. grayi mikobiontájánál (28,6 Mb) és fotobiontájánál (Asterochloris sp., 106,7 Mb). A működő gének számát ennél a zuzmófajnál (algában és gombában együttesen) és közöttire becsülték más fajok ismert adatai alapján. Azonban mindössze néhány nemzetközi szakirodalom foglalkozik a zuzmók populációin belüli és közötti genetikai változatossággal (Beard és DePriest, 1996; DePriest, 1993; Lindblom és Ekman, 2006; Zhou és mtsai, 2006; Zoller és mtsai, 1999). Az AFTOL (Assembling the Fungal Tree of Life) nemzetközi kutatási program adott lehetőséget a molekuláris genetika alapjainak megismerésére és vizsgálataink elvégzésére. E program célja a teljes gombatörzsfa rekonstrukciója több mint 1500 faj nyolc génlokusza [nucssu (18S) rdns (nuclear small subunit ribosomal DNA), ITS rdns (internal transcribed spacer: 5.8S, ITS I és ITS II), nuclsu (28S) rdns (nuclear large subunit ribosomal DNA), mitssu rdns (mitochondrial small subunit ribosomal DNA), RPB1 (RNA polymerase II largest subunit), RPB2 (RNA polymerase II second largest subunit), EF1 (eukaryotic translation elongation factor 1 alpha), és mitokondriális ATP-szintáz] szekvenciájának összehasonlítása, valamint morfológiai és ultrastrukturális bélyegei alapján (James és mtsai, 2006; Lutzoni és mtsai, 2004). E program keretében lehetőségünk volt a Hypogymnia physodes epifiton zuzmófaj mikobiontájának molekuláris genetikai vizsgálatára. Célunk az volt, hogy a Hypogymnia physodes fajnál megszekvenáljuk az AFTOL programban használt lokuszokat, így adatokat szolgáltassunk a projekthez, összehasonlítsuk az eltérő környezeti körülmények között élő populációkból származó minták génszekvenciáit, annak megállapítására, hogy a környezeti különbségek megmutatkoznak-e a példányok genotípusában, illetve a különböző genotípusok földrajzi elterjedése mutat-e valamiféle mintázatot. A fentiekben említett génszakaszok közül a sejtmagi riboszomális génkomplex: nucssu (18S) rdns, ITS rdns (5.8S, ITS I és ITS II), nuclsu (28S) rdns, IGS rdns (5S, IGS 1 és IGS 2) (6. ábra), valamint a mitssu rdns és az EF1α lokusz használható populációs szintű vizsgálatokhoz zuzmók esetén (Beard és DePriest, 1996; DePriest, 1993; Ekman és Wedin, 2000; Lindblom és Ekman, 2006; Simon és mtsai, 2005; Zoller és mtsai, 1999). 29

31 6. ábra. A sejtmagi riboszomális génkomplex részei. ( weboldal alapján.) 3. Anyag és módszer 3.1. A vizsgált Hypogymnia physodes zuzmófaj jellemzése Hypogymnia physodes (L.) Nyl., Les lichens des environs de Paris, p. 39 (1896). Basionym: Lichen physodes L., Species Plantarum, vol. 2, p (1753). Magyar név: Ajakos tányérzuzmó (Kremer és Muhle, 2000), Duzzadt tányérzuzmó (Simon, 1974), Pöffedt bodrány (herbáriumi név Greschik V., Lichenotheca Parva; Farkas, 1995, 2007). Rendszertani besorolás (Hibbett és mtsai, 2007; Kirk és mtsai, 2008) Regnum: Fungi Phylum: Ascomycota Subphylum: Pezizomycotina Classis: Lecanoromycetes Subclassis: Lecanoromycetidae Ordo: Lecanorales Familia: Parmeliaceae Genus: Hypogymnia Species: Hypogymnia physodes 30

32 A faj jellemzéséhez Brodo és munkatársai (2001), Nash és munkatársai (2002), valamint Purvis és munkatársai (1992) flóraműveit használtam. Morfológiai és anatómiai jellemzés Nagyon változékony, lombos telepű zuzmó (5. ábra), szélessége egészen 6( 8) cm-ig terjed, felszíne általában halványszürke, szürke, fehéres vagy szürkészöld, sima, ritkán ráncos. Lebenyei lenyomottak vagy felemelkedőek, duzzadtak (7. ábra), a csúcsoknál általában kiszélesednek, 0,5 2,5( 5) mm szélesek, barna vagy fekete szegélyük van. Csúcsaik alsó részén a kéregréteg ajakszoráliummá (8. ábra) repedhet fel, ami durva-szemcsés szorédiumokat (9. ábra) tartalmaz. Izidiumok nincsenek. Apotéciumok ritkán fordulnak elő, akár 2( 4) mm átmérőjűek is lehetnek, a telephez vastag nyéllel kapcsolódnak vagy a telepen ülők, lekanoratípusúak, a korong (discus) barna, vörösesbarna (10. ábra). Aszkospórák (8/aszkusz) ellipszoid alakúak, 7 8 4,5 5 µm nagyságúak, színtelenek. Piknidiumok előfordulhatnak, feketék, pontszerűek, telepbe mélyedők (11. ábra). Piknospórák (konidiumok) pálcika alakúak, méretük 5,5 5,8 0,5 0,6 µm. A bélréteg üreges, az üreg felső felszíne általában fehér, de lehet sötét is, alsó felszíne sötét. Az alsó telepfelszín ráncos, fekete, a szélei felé általában barna, rhizinák nincsenek (12. ábra). Trebouxia sp. zöldalga a fotobionta (Hauck és mtsai, 2007a). 7. ábra. Hypogymnia physodes duzzadt lebenye. (Bóka Károly és Molnár Katalin SEM felvétele.) 8. ábra. Hypogymnia physodes ajakszoráliumai a lebenyek szélén. (Bóka Károly és Molnár Katalin SEM felvétele.) 31

33 9. ábra. Hypogymnia physodes szorédiumai felszínükön az algasejteket körülölelő gombafonalakkal. (Bóka Károly és Molnár Katalin SEM felvétele.) 10. ábra. Hypogymnia physodes mikobiontájának ivaros szaporodását szolgáló termőtestei az apotéciumok. 11. ábra. Hypogymnia physodes telepének felszínébe süllyednek a mikobionta ivartalan szaporítóképletei, a piknidiumok. 12. ábra. Hypogymnia physodes telepének jellegzetesen ráncos, sötétbarna fonákja. Tesztreakciók Kéregréteg: K+ sárga, C, KC, PD+ halványsárga, UV (a kémiai reagensek jelölése megtalálható a 5. táblázatban). Bélréteg és szorálium: PD+ narancs vörös, K, C, KC+ narancs vörös, UV+ halvány ibolya-kék (fizodsav, 3-hidroxi-fizodsav, fizodálsav jelenléte miatt). [Nash és mtsai (2002), Purvis és mtsai (1992), Smith és mtsai (2009), valamint Wirth (1995) alapján.] Szaporodás Elsődlegesen ivartalanul szaporodik (szorédiumokkal és piknospórákkal, teleptöredékekkel), azonban a rekombinációt e fajnál is kimutatták, így ha ritkán is, de ivaros szaporodás (aszkospórákkal) szintén előfordul (Mattsson és mtsai, 2009). Armstrong (1987, 1992) kimutatta, hogy egy új élőhely (pl. fa) kolonizációja szél által terjesztett szorédiumokkal 32

34 történhet, a további terjedésben a szélen kívül az esővíznek is szerepe van. Madarak és mókusok lábán is szállítódhatnak szorédiumok. Élőhely Általában savas (ph ~ 4,5) karakterű fakérgen él, leggyakrabban fenyőkön (13. ábra), ritkábban azonban előfordul sziklán, talajon és mohán is (5. ábra). Magyarországon leggyakrabban különböző fenyő- és lombhullató fák kérgén telepszik meg, néha szilikátos kőzeteken, mohán (Verseghy, 1994). Elterjedés Gyakori az egész északi féltekén, a tengerszinttől a fahatárig előfordul. Összeállítottuk a faj magyarországi elterjedésének térképét herbáriumi adatok és saját gyűjtéseink alapján (14. ábra). Hazánkban ez az egyik leggyakoribb lombos telepű zuzmófaj. 13. ábra. Hypogymnia physodes epifiton zuzmófaj leggyakrabban fenyők kérgén fordul elő. 14. ábra. A Hypogymnia physodes elterjedése Magyarországon. Hasonló hazai elterjedésű fajok Magyarországon két másik Hypogymnia faj él (Lőkös és Farkas, 2009), a H. farinacea Zopf és a H. tubulosa (Schaer.) Hav. A fejlett példányok morfológiai bélyegeik és kémiai tulajdonságaik (l fejezet) alapján jól elkülöníthetőek. A H. farinacea lebenyei aljzatra simulók, felszínűk ráncos. Szoráliumai a telep felső felszínén találhatók (a kéregréteg hasadékszerű felrepedésével alakulnak ki). Kéregréteg: K+ sárga, C, KC, PD+ halványsárga, UV. Bélréteg: K, C, KC+ narancsvörös, PD, UV+ halvány ibolyakék (fizodsav és 3-hidroxi-fizodsav jelenléte miatt). [Nash és mtsai (2002), valamint Purvis és mtsai (1992) alapján.] 33