PÉCSI TUDOMÁNYEGYETEM

Átírás

1 PÉCSI TUDOMÁNYEGYETEM Biológia Doktori Iskola A Hypogymnia physodes (L.) Nyl. zuzmófaj populációi depszid- és depszidon-típusú szekunder anyagcseretermékeinek analitikai vizsgálata és molekuláris genetikai elemzése PhD-értekezés Molnár Katalin Témavezetı: dr. Farkas Edit, a biol. tud. kandidátusa MTA ÖBKI, Vácrátót Belsı konzulens: Salamonné dr. Albert Éva, PhD, egyetemi docens PTE TTK, Pécs PÉCS, 2011

2 1. Bevezetés és célkitőzések A zuzmók (lichenizált gombák) sokféle szekunder anyagcsereterméket (ún. zuzmóanyagot) állítanak elı, amelyek többsége kizárólagosan a zuzmókban fordul elı. A zuzmótelepben a mikobionta állítja ıket elı, és a gombafonalak külsı felszínén rakódnak le apró extracelluláris kristályokként a kéregben vagy a bélrétegben. A fotobionta szintén hatással lehet a gombapartner szekunder anyagcseréjére. Napjainkig körülbelül 1050 zuzmóanyagot azonosítottak. A szekunder anyagcseretermékek mennyisége általában 0,1 10%-a a telep szárazanyag-tartalmának, de néha akár 30%-a is lehet. A zuzmóvegyületek elıfordulási mintázata általában taxonspecifikus, ezért széles körben használják a zuzmótaxonómiában és -szisztematikában. Ugyanakkor több zuzmófajnak különbözı kémiai változatai ismertek azonos vagy eltérı környezettel jellemezhetı élıhelyekrıl (pl. Calatayud és Rico, 1999; Culberson és mtsai, 1984; Randlane és Saag, 1989; Sheard, 1974). A másodlagos anyagcseretermékek jelenléte számos elınyt szolgáltathat a zuzmók életében. Befolyásolhatják a zuzmók kapcsolatát a biotikus és az abiotikus környezeti tényezıkkel. Szerepet játszhatnak a növényevık, a patogének, a kompetítorok, valamint külsı abiotikus tényezık, pl. magas UVbesugárzás elleni védekezésben. Számos zuzmóanyag mutat többféle biológiai hatást. A kísérletes vizsgálatoknak köszönhetıen ma már többet tudunk ezen anyagok biológiai aktivitásáról, mint elsı leírásuk idején (kb. 100 évvel ezelıttıl napjainkig!), azonban ténylegesen betöltött szerepük a zuzmószimbiózisban még mindig nem eléggé ismert. A zuzmókémiával kapcsolatos szakirodalomban számos olyan tanulmánnyal találkoztunk, amelyek kimutatták, hogy a különbözı környezeti faktorok, pl. fény, hımérséklet, táptalaj ph-ja, táptalaj összetétele hatással vannak a zuzmók másodlagos anyagcseréjére (pl. BeGora és Fahselt, 2001; Culberson és mtsai, 1977, 1983; Fahselt, 1979; Hamada, 1989, 1991, 1996; Mirando és Fahselt, 1978). Ezek az eredmények laboratóriumi kísérleteken vagy transzplantációs vizsgálatokon alapulnak. A levegıszennyezettség és a szekunder anyagcseretermékek kapcsolata vizsgálataink indításakor még ismeretlen volt, mára már ezen a területen is jelent meg publikáció (Białonska és Dayan, 2005). A fajon belüli kémiai diverzitás a másodlagos anyagcseretermékek tekintetében zuzmók esetén is ismert, több fajnál mutattak ki különbözı kemotípusokat (pl. Calatayud és Rico, 1999; Culberson és mtsai, 1984; Filson, 1981; Giralt és mtsai, 2010; Hale, 1962; Randlane és Saag, 1989; Sheard, 1974). A kemotípusok elterjedése jellegzetes földrajzi mintázatot mutathat (pl. Randlane és Saag, 1989; Sheard, 1974). Fentiekkel összefüggésben merült fel egy toxitoleráns zuzmófaj eltérı földrajzi helyekrıl (különös tekintettel a magyarországi lelıhelyekre) származó populációi kémiai diverzitásának meg- 2

3 ismerésére vonatkozó problémakör. Ez összekapcsolja a szupraindividuális és infraindividuális kutatási területeket. Ennek vizsgálatára modellfajként a Hypogymnia physodes zuzmófajt választottuk, mivel ez gyakori az egész északi féltekén (Magyarországon is), így egymástól eltérı környezeti feltételek közül származó herbáriumi és frissen győjtött példányokat vizsgálhattunk. Fajválasztásunk másik oka az volt, hogy a H. physodes viszonylag jól tőri a levegıszennyezést, így városi környezetbıl is hozzájuthatunk összehasonlító példányokhoz. Kutatási célként annak a feltárását jelöltük meg, hogy a környezeti tényezıkben természetesen fennálló különbségek tükrözıdnek-e a zuzmókra speciális depszidek és depszidonok produkciójában a fenti faj esetében, vannak-e minıségi és/vagy mennyiségi különbségek az egyes populációk között. A szakirodalomban számos részlet található a H. physodes másodlagos anyagcseretermékeirıl, vizsgálataink elıtt azonban a magyarországi példányok zuzmóanyag-összetétele ismeretlen volt. Mivel hazánkban a zuzmókémiai vizsgálatok csak 1998-ban kezdıdtek (Farkas és mtsai, 1998, 1999; Farkas, 2007), a legtöbb faj hazai példányainak zuzmóanyag-összetétele a mai napig feltáratlan. Akkor a nemzetközi szinthez képest több évtizedes lemaradás és az újként bevezetett kromatográfiás módszer alkalmazásához kapcsolódó kezdeti problémák megoldása okozott idıhátrányt. Mennyiségi méréseket pedig nemzetközi szinten is csak korlátozott számban végeztek (Białonska és Dayan, 2005; Czeczuga és mtsai, 2000). Ezért célul tőztük ki: a legnagyobb hazai zuzmógyőjteményekben található Hypogymnia physodes példányok depszid- és depszidon-típusú zuzmóanyagainak vizsgálatát a sztenderd HPTLC-eljárással, azzal a céllal, hogy: összehasonlítsuk az eltérı földrajzi helyekrıl származó populációkat képviselı példányok kémiai diverzitását, feltárjuk, hogy a fajon belüli kémiai variabilitás, ha fennáll, mutat-e valamiféle mintázatot és ez korrelál-e a földrajzi elterjedéssel, kimutassuk, van-e különbség a külföldi és a hazai, a herbáriumban tárolt és a frissen győjtött telepek és azok teleprészeinek zuzmóanyag-tartalma között, megállapítsuk, hogy elbomlanak-e a zuzmóanyagok tárolás közben, megállapítsuk, hogy a megváltozott környezet/levegıminıségi helyzet okoz-e kimutatható különbségeket, friss példányok depszid- és depszidon-típusú zuzmóanyagainak (a továbbiakban zuzmóanyagainak) mennyiségi vizsgálatát HPLC mőszeres analitikai kémiai módszerrel, 3

4 a kapott eredmények alapján a zuzmóanyagok relatív koncentrációjának összehasonlítását, esetleges tendenciák kimutatását késıbbi bioindikációs kutatásokra való lehetséges felhasználás szempontjából. Egy faj eltérı földrajzi helyekrıl származó populációi a kémiai változatosságon kívül genetikai variabilitást is mutathatnak. A nemzetközi szakirodalom néhány zuzmófaj esetén közöl ilyen jellegő adatokat (Beard és DePriest, 1996; Zhou és mtsai, 2006; Zoller és mtsai, 1999). Ezért indokoltnak gondoltuk az általunk kiválasztott faj populációinak kémiai diverzitása mellett megvizsgálni azok genetikai diverzitását is. Zuzmók esetén a sejtmagi riboszomális génkomplex: nucssu (18S) rdns, ITS rdns (5.8S, ITS I és ITS II), nuclsu (28S) rdns, IGS rdns (5S, IGS 1 és IGS 2), valamint a mitssu rdns és az EF1α lokuszok használhatóak populációs szintő vizsgálatokhoz. Az AFTOL (Assembling the Fungal Tree of Life) nemzetközi kutatási program keretében lehetıségünk volt a Hypogymnia physodes epifiton zuzmófaj mikobiontájának molekuláris genetikai vizsgálatára. Célunk az volt, hogy a Hypogymnia physodes fajnál megszekvenáljuk az AFTOL programban használt lokuszokat [nucssu (18S) rdns, ITS rdns (5.8S, ITS1 és ITS2), nuclsu (28S) rdns, mitssu rdns, RPB1, RPB2, EF1α és mitokondriális ATP-szintáz], összehasonlítsuk az eltérı környezeti körülmények között élı populációkból származó minták génszekvenciáit a populációk genetikai diverzitásának megállapítása céljából, feltárjuk az esetlegesen létezı különbözı genotípusok földrajzi elterjedésének mintázatát. 2. A vizsgálati anyag A nagyhatékonyságú vékonyréteg-kromatográfiás (HPTLC) analízis során 297 Magyarországról származó és 44 külföldi példányt vizsgáltunk meg a BP (Magyar Természettudományi Múzeum, Növénytár, Budapest), az EGR (Eszterházy Károly Fıiskola, Növénytani Tanszék, Eger), és a VBI (MTA Ökológiai és Botanikai Kutatóintézete, Vácrátót) győjteményekbıl. Ezek eltérı földrajzi helyekrıl származó populációkat reprezentálnak. A minták között voltak egy populációból származó példányok is, a populáción belüli kémiai diverzitás összehasonlítására. A minták között szerepeltek a faj változatai és formái is. A legtöbb zuzmóminta korábbi győjtésbıl származott, a legrégebbi 1852-bıl. Saját győjtéseinket között végeztük. 4

5 A frissen győjtött vizsgálati anyag esetében összesen 13 lelıhelyrıl 1-1 zuzmóminta nagyhatékonyságú folyadékkromatográfiás (HPLC) vizsgálatára volt lehetıségünk. A lelıhelyek különbözı természetközeli és városi élıhelyeket jelentenek. Összesen 21 különbözı populációból származó Hypogymnia physodes példány molekuláris genetikai vizsgálatára volt lehetıségünk. 3. Alkalmazott módszerek HPTLC nagyhatékonyságú vékonyréteg-kromatográfia (High Performance Thin Layer Chromatography) Körülbelül 5 mm 5 mm nagyságú telepdarabok acetonos kivonatából 6 8 µl mintát kromatografáltunk 10 cm 10 cm-es vékonyréteg-kromatográfiás lapon, a lichenológiai vizsgálatokhoz kidolgozott sztenderd módszert (Arup és mtsai, 1993) követve. Kontrollként Platismatia glauca (atranorin), Cladonia symphycarpia (atranorin, norsztiktasav), Pleurosticta acetabulum (atranorin, norsztiktasav) és Heterodermia leucomelaena (atranorin, zeorin) példányokat alkalmaztunk. HPLC nagyhatékonyságú folyadékkromatográfia (High Performance Liquid Chromatography) A zuzmóminták vizsgálatára fordított-fázisú kromatográfiát (RP-HPLC) és gradiens elúciót alkalmaztunk. A sztenderdizált módszert (Feige és mtsai, 1993) követtük néhány módosítással (eltérı típusú oszlopot használtunk és bisz-(2-etil-hexil)-ftalátot alkalmaztunk belsı sztenderdként a benzoesav mellett). 10 mg száraz zuzmótelepet áztattunk 1 ml acetonban. A belsı sztenderdeket az extrakciós oldathoz adagoltuk. Az acetonos kivonatból 20 µl mintát vittünk fel a C18-as oszlopra. Két oldószerelegyet használtunk a gradiens elúcióhoz: 1%-os orto-foszforsav-oldatot (A-oldószerelegy) és 100%-os metil-alkoholt (B-oldószerelegy). A zuzmóanyagok elúcióját 245 nm hullámhosszon monitoroztuk. Kétféle retenciós értéket számoltunk a mérési eredmények (retenciós idı) alapján (I érték és R. I.). Meghatároztuk a zuzmóanyagok relatív koncentrációját (area%). 5

6 Molekuláris genetikai vizsgálatok A genomikus DNS-t száraz zuzmótelepekbıl vontuk ki, és vizsgálataink során 2%-os nátriumdodecil-szulfátot (SDS) használtunk lízispufferként. A következı lokuszokat amplifikáltuk (polimeráz láncreakcióval) és szekvenáltuk gomba-, illetve lokuszspecifikus primerekkel: ITS rdns, nucssu rdns, nuclsu rdns, IGS rdns, mitssu rdns, RPB1, RPB2 és EF1α. A kapott szekvenciák szerkesztéséhez a Sequencher 4.5 szoftvercsomagot használtuk. A szekvenciák összehasonlítása és illesztése MacClade 4.06 programmal történt manuálisan. A populációk közötti hasonlóság megállapítására maximum parszimónia elven alapuló bootstrap tesztet végeztünk az ITS és az EF1α lokuszok esetén, PAUP* 4.0b10 programcsomaggal. 4. Eredmények Szakirodalmi kutatások és elméleti megalapozás 1. A zuzmóanyagok biológiai szerepére (pl. antimikrobiális, antivirális, antiherbivor, antitumor, citotoxikus és antioxidáns hatások, szerepük a nehézfém-homeosztázisban és levegıszennyezettség-tőrésben, továbbá a fény- és UV-B-védelemben, láz- és fájdalomcsillapítás stb.) irányuló szakirodalmi kutatásaink nemzetközi szinten elismert, egyedülálló, a legújabb (2009-ben megjelent) eredményeket is tárgyaló szintézist eredményeztek (179 szakirodalmi hivatkozással). 2. A szekunder anyagcseretermékek minıségi és mennyiségi viszonyainak bioindikációs célú kutatása nemzetközi szempontból új, amit a kutatásaink kezdete óta publikált, az egyelıre rövid idıszaknak köszönhetıen kisszámú, mindösszesen tíz irodalmi forrás igazol. Emiatt disszertációs témám elméleti szempontból is új területet képvisel. HPTLC 1. Összesen 341 Hypogymnia physodes példány vékonyréteg-kromatográfiás (HPTLC) vizsgálata alapján 5 zuzmóanyag: a protocetráriasav, a 3-hidroxi-fizodsav, a fizodálsav, a fizodsav, és az atranorin jelenlétét tudtuk kimutatni. 2. A vizsgálatok szerint a minták többségénél (93%) nincs különbség a detektált anyagok tekintetében a különbözı helyekrıl származó minták között. 3. A vizsgálatok szerint a minták többségénél nincs különbség a detektált anyagok tekintetében a különbözı győjtési idıpontokból ( ) származó minták között. 6

7 4. A telep fiatalabb (telepszéli) és idısebb (szubmarginális és középsı) részei között nincs eltérés a szekunder anyagcseretermékek minıségi összetételében. 5. A faj változatai és formái között nincs kémiai különbözıség. Néhány mintánál a protocetráriasav és az atranorin foltja nem jelent meg, vagy a halvány színárnyalat utalt ezen anyagok kis koncentrációjára. Azokban a morfológiai változatokban, ahol hiányzott ezen anyagok egyike, az ugyanezekbıl a változatokból/formákból vizsgált más mintákból viszont kimutatható volt. 6. Ugyanazon zuzmópéldányból származó minták (ép telepdarab, bélréteg, szorálium) vizsgálatával az atranorin/klór-atranorin kéregrétegbeli lokalizációját tudtuk megállapítani. A többi zuzmóanyag (protocetráriasav, a 3-hidroxi-fizodsav, a fizodálsav és a fizodsav) elıfordulását pedig a bélréteghez tudtuk kötni. HPLC 1. Folyadékkromatográfiával hétféle zuzmóanyag jelenlétét tudtuk kimutatni a vizsgált telepek mindegyikében: atranorin, fizodálsav, fizodsav, 3-hidroxi-fizodsav, klór-atranorin, 2 -O-metilfizodsav, protocetráriasav (1. ábra). 2. HPLC-eredményeinket a HPTLC-vizsgálatokkal és irodalmi ismeretekkel összevetve megállapítottuk a zuzmóanyagok telepen belüli lokalizációját: a kéregrétegben található a β-orcinol paradepszid-típusú atranorin és klór-atranorin, a bélrétegben pedig a β-orcinol depszidon-típusú fizodálsav és protocetráriasav, valamint az orcinol depszidon-típusú fizodsav, 3-hidroxi-fizodsav és 2 -O-metil-fizodsav. 3. A HPLC-kromatogram csúcsai alatti terület nagysága (area%) alapján megállapíthatóak az anyagok mennyiségi viszonyai a telepben: a bélréteg hifáin lerakódott depszidonok képezik a fı szekunder anyagcseretermék-készletet (41,66 77,56 area%), a kéregrétegben található atranorin és klór-atranorin jelentısen kisebb koncentrációban fordul elı (minor v. kísérı anyagok, 2,61 16,88 area%). 4. A vizsgált depszid- és depszidon-típusú anyagok mennyisége variábilis volt az egyes minták között (atranorin: 1,71 15,18 area%, klór-atranorin: 0,79 1,93 area%, fizodálsav: 7,95 23,39 area%, protocetráriasav: 0,26 1,87 area%, fizodsav: 0,007 5,14 area%, 3-hidroxi-fizodsav: 22,22 50,75 area% és 2 -O-metil-fizodsav: 4,44 15,00 area%). 5. Minthogy a zuzmóanyagok azonosítására irányuló HPLC-vizsgálatokhoz felhasznált mintáink (durva, becsült skálán) eltérı környezetminıségő helyekrıl származtak és a vizsgálatok mennyiségi elemzésre alkalmasak (ld pont), igazoltuk, hogy az ilyen jellegő vizsgálatok alkalmasak bioindikációs, illetve monitorozó vizsgálatok számára. 7

8 1. ábra. Hypogymnia physodes (Budapest, Látó-hegy) acetonos kivonatának RP-HPLC kromatogramja 245 nm hullámhosszon. Molekuláris genetikai vizsgálatok 1. A DNS-amplifikáció és -szekvenálás 16 ITS (6 kb), 18 nuclsu (1,4 kb), 3 nucssu (1,6 kb), 21 mitssu (8 kb), 1 RPB1 (A D régió 1,2 kb; D G régió 1,8 kb), 10 RPB2 (5 7 régió 1,2 kb; 7 11 régió 9 kb), és 15 EF1α (1,4 kb) szekvenciát eredményezett. 2. Zuzmókban a populációs szintő vizsgálatokhoz használható ITS, LSU, nucssu és EF1α lokuszok az általunk tanulmányozott populációk esetén kismértékő variabilitást mutattak. A szekvenciák illesztése során is jól látható finom eltéréseket az ITS és az EF1α maximum parszimónia elven alapuló analízise is megerısítette. A mitssu szekvenciák sem hosszukban, sem nukleotidsorrendjükben nem különböztek. Módszertani és egyéb eredmények 1. Magyarországon elsıként alkalmaztuk a HPTLC-t egy faj teljes hazai populációjában elıforduló zuzmóanyagok elemzésére. 2. A Hypogymnia physodes-ben elıforduló zuzmóanyagok HPTLC-vizsgálatának részleteivel kapcsolatban a következıket állapítottuk meg: a) Az A- és B-oldószerelegyeket alkalmazva általában jobb elválasztást kaptunk, mint a C-vel. b) Az atranorin/klór-atranorin detektálása szempontjából a B-elegy bizonyult a legjobbnak. c) A protocetráriasav csak a B-elegyben volt kimutatható. d) A 3-hidroxi-fizodsav és a fizodálsav amelyek nem voltak megkülönböztethetıek egymástól a B-elegyben, az A-elegyben váltak szét jól. 8

9 e) A klór-atranorinról és a 2 -O-metil-fizodsavról nincsenek HPTLC-s R F -adatok az irodalomban, és sztenderd anyag sem volt elérhetı számunkra. Az R F -osztályok amelyek ugyan TLCadatokon alapulnak viszont alkalmasak összehasonlításra ilyen esetekben is. Ezek alapján B- elegyben a klór-atranorin foltja az atranorinéval (azonos R F -osztályba tartoznak), a 2 -O-metilfizodsav foltja pedig a 3-hidroxi-fizodsav és a fizodálsav foltjával lehet együtt. (HPLC-vel jelenlétük igazolható.) 3. Magyarországon elsıként alkalmaztuk a HPLC-t lichenológiai vizsgálatban mind minıségi mind mennyiségi szempontból. A sztenderd módszert a 3. fejezetben leírtak szerint módosítottuk. A HPLC mennyiségi alkalmazása nemzetközileg is új a lichenológiában. 4. Összeállítottuk a Hypogymnia physodes zuzmófaj magyarországi elterjedési térképét saját győjtéseink és herbáriumi adatok alapján (2.ábra). 5. Farkas (2007) ajánlásait és példáit követve munkánk során tíz zuzmóanyag magyar nevét újként alkottuk meg: diffraktasav, divarikatinasav, giroforasav, orszellinsav, perlatolsav, pinasztrisav, pszoromasav, szferoforin, 2 -O-metil-fizodsav, 3-hidroxi-fizodsav. 6. Magyarországon a zuzmókon végzett molekuláris genetikai vizsgálataink teljesen újnak számítanak (Farkas és mtsai, 2008), korábban a környezeti tényezık és a molekuláris genetikai változatosság összefüggésének vizsgálatára irányuló tanulmányokat nemzetközi szinten is csak kis számban végeztek. 2. ábra. A Hypogymnia physodes elterjedése Magyarországon. 5. Következtetések, kitekintés Vizsgálataink szerint a különbözı helyekrıl származó Hypogymnia physodes példányok kvalitatív kémiai különbségeket nem mutatnak a zuzmóanyagok tekintetében. Mivel a szakiroda- 9

10 lomban számos kísérleti adat számol be arról, hogy a környezeti tényezık hatással lehetnek a zuzmók kémiai összetételére kvalitatív értelemben, az általunk kimutatott eredményt azzal magyarázzuk, hogy a vizsgált minták természetes élıhelyei között nem volt olyan mértékő (extrém) különbség, mint az irodalomból ismert kísérletes vizsgálatokban, és az élıhelyi faktorok közötti eltérések nem voltak olyan mértékőek, amelyek teljesen gátolták volna bármelyik anyag bioszintézisét. Ez a hatás azonban más fajok további anyagain megvalósulhat. A különbözı idıpontokból származó herbáriumi példányok anyagtartalma is hasonló volt a frissen győjtött példányokéhoz, ami azt igazolja, hogy a herbáriumi példányok hosszú idı után is felhasználhatók (lesznek) taxonómiai és monitorozó vizsgálatokhoz. A HPLC-vel kimutatott hétféle szekunder anyagcseretermék az összes vizsgált mintában (beleértve a változatokat és formákat is) jelen volt, ezzel megerısítettük a HPTLC-s eredményünket, miszerint a faj kémiailag jól meghatározott karakterő, és nincsenek egymástól eltérı kemotípusai. A mennyiségi szempontból ismert összetételő törökországi mintákkal való összevetés egy anyag tekintetében mennyiségi különbséget mutatott, ami igazolja vizsgálatunk létjogosultságát. Molekuláris genetikai eredményeink alapján megállapítható, hogy a különbözı földrajzi helyekrıl származó Hypogymnia physodes populációk (15 magyarországi és 3 svédországi) genetikailag kis eltéréseket mutattak a vizsgált lokuszok tekintetében, de ezek a genotípusos különbségek nem mutattak földrajzi mintázatot. Azaz, a különbözı természetességő élıhelyeken ugyanaz a tág tőréső faj fordul elı, nem lehetett kimutatni a finom élıhelyi különbségeknek megfelelı típusok jelenlétét. Az eredmények nagymértékő génáramlásra utalnak a különbözı populációk között. Az eredmények megerısítése a mintaszám növelésével, illetve a zuzmók populációgenetikai kutatásaiban újabban használt mikroszatellitek vizsgálatával tervezhetı. Azt is figyelembe kell vennünk, hogy az általunk vizsgált, poliketid-eredető depszidek és depszidonok bioszintézisével legközelebbi kapcsolatban álló elsı poliketid-szintáz (PKS) géneket 2006-ban izolálták és szekvenálták zuzmóknál. Ennek megfelelıen vizsgálatainkat a PKS-géneken is célszerő lesz folytatni, különös tekintettel a génexpresszió mértékének meghatározására. Az általunk vizsgált széles elterjedéső toxitoleráns faj eddigi zuzmóanyag-produkciós eredményeinek számos részlete még nem kellıen ismert, és további vizsgálatra szorul a bioindikációs felhasználás tekintetében. Acetonos kioldással kombinált transzplantációs vizsgálatok és más, ritkább, érzékenyebb fajok összehasonlító vizsgálata is szükségessé válhat annak megállapítására, hogy mely anyagok termelıdésére vannak hatással a különbözı környezeti tényezık. További vizsgálat esetén a statisztikai szempontból tervezett mintavételt és kísérleti körülményeket is érdemes lesz megvalósítani. 10

11 6. Az értekezés témakörében publikált tudományos közlemények Folyóiratcikkek Molnár K. és Farkas E. (2011), Chemical analyses of depsides and depsidones in populations of the lichen Hypogymnia physodes (L.) Nyl. and an analysis of its genetics. Annales Botanici Fennici (közlésre elfogadva). IF: 0,692 (2009-ben) Molnár K. és Farkas E. (2010), Current results on biological activities of lichen secondary metabolites: a review. Z. Naturforsch. 65c, IF: 0,800 (2009-ben) Sass-Gyarmati A., Molnár K., Orbán S., Pócs T., és Erzberger P. (2009), The cryptogamic flora of the Zgurăşti Sinkhole System and its surroundings (Apuseni Mountains, Romania). Kanitzia 16, Farkas E., M. Kovács G., Molnár K., Lıkös L., és Veres K. (2008), Molecular investigations of various lichen taxa and populations in Hungary. Acta Microbiol. Immunol. Hung. 55, Molnár K. és Lıkös L. (2006), Adatok az Upponyi-szoros zuzmóflórájához. Folia Historico Naturalia Musei Matraensis 30, Molnár K. (2005), Adatok a Mátra hegység zuzmóflórájához III. Ilona-völgy. Folia Historico Naturalia Musei Matraensis 29, Molnár K., Kis G., és Kékes J. Y. (2005), Data for the bryophyte and lichen flora of the Mátra Mts II. Acta Acad. Paed. Agriensis, Sectio Biol. 32, Kis G. és Molnár K. (2004), Adatok a Mátra hegység moha- és zuzmóflórájához. Acta Acad. Paed. Agriensis, Sectio Biol. 25, Farkas E. és Molnár K. (2002), A zuzmók szekunder anyagcseréjének és élıhelyi tulajdonságainak összefüggése. Acta Microbiol. Immunol. Hung. 49, 376. Molnár K. (2002), A zuzmók szerepe Komárom és környéke környezetminıségének vizsgálatában. Bot. Közlem. 89, 230. Farkas E., Lıkös L., és Molnár K. (2001), Lichen mapping in Komárom, NW Hungary. Acta Bot. Hung. 43, Konferencia-összefoglalók Molnár K. és Farkas E. (2009), Secondary metabolites of the epiphytic lichen Hypogymnia physodes (L.) Nyl. In: Farkas E. és Veres K. (szerk.): Information, program and abstracts. 11

12 Young lichenologists workshop in Hungary, April 2009, Vácrátót, Hungary. Institute of Ecology and Botany, Hungarian Academy of Sciences, Vácrátót, p. 14. Pénzes-Kónya E., Orbán S., Molnár K., Kis G., és Sass-Gyarmati A. (2005), Special habitat types and new floristical data of the cryptogams in the area of the Bükk National Park. Conservation Ecology of Cryptogams, Sweden, Mid Sweden University, p. 54. Molnár K., Sass-Gyarmati A., Kis G., Orbán S., Pénzesné Kónya E., és Sántha T. (2005), Mohák, zuzmók és nagygombák florisztikai feldolgozása acidofil erdıállományokban a Bükk-hegység területén. III. Magyar Természetvédelmi Konferencia, Eger, p Molnár K. (2005), Adatok az Upponyi-szoros zuzmóflórájához. III. Magyar Természetvédelmi Konferencia, Eger, p Sass-Gyarmati A., Molnár K., Orbán S., Pócs T., és Erzberger P. (2005), The cryptogamic flora of the Zgurasti Cave and surroundings (Apuseni Mountains, Romania). XVII International Botanical Congress, Vienna, Austria, p Molnár K. és Farkas E. (2003), Hypogymnia physodes (L.) Nyl. és Lecanora conizaeoides Nyl. ex Crombie toxitoleráns zuzmófajok élıhelyi tulajdonságainak és szekunder anyagcseréjének összefüggése. 6. Magyar Ökológus Kongresszus, Gödöllı, p A tézisek szövegében idézett irodalom Arup U., Ekman S., Lindblom L., és Mattsson J. (1993), High performance thin layer chromatography (HPTLC), an improved technique for screening lichen substances. Lichenologist 25, Beard K. H. és DePriest P. T. (1996), Genetic variation within and among mats of the reindeer lichen, Cladina subtenuis. Lichenologist 28, BeGora M. D. és Fahselt, D. (2001), Usnic acid and atranorin concentrations in lichens in relation to bands of UV irradiance. Bryologist 104, Białonska D. és Dayan F. E. (2005), Chemistry of the lichen Hypogymnia physodes transplanted to an industrial region. J. Chem. Ecol. 31, Calatayud V. és Rico V. J. (1999), Chemotypes of Dimelaena oreina (Ascomycotina, Physciaceae) in the Iberian Peninsula. Bryologist 102,

13 Culberson C. F., Culberson W. L., és Johnson A. (1977), Thermally induced chemical artifacts in lichens. Phytochemistry 16, Culberson C. F., Culberson W. L., és Johnson A. (1983), Genetic and environmental effects on growth and production of secondary compounds in Cladonia cristatella. Biochem. Syst. Ecol. 11, Culberson C. F., Hale M. E., Jr., Tønsberg T., és Johnson A. (1984), New depsides from the lichens Dimelaena oreina and Fuscidea viridis. Mycologia 76, Czeczuga B., Kilias H., Czeczuga-Semeniuk E., Muhr L.-E., Lumbsch H. T., és Hestmark G. (2000), Carotenoids in the thalli of lichen species from Central Europe. J. Hattori Bot. Lab. 89, Fahselt D. (1979), Lichen substances of transplanted thallus segments of Parmelia cumberlandia. Can. J. Bot. 57, Farkas E. (2007), Lichenológia a zuzmók tudománya. MTA Ökológiai és Botanikai Kutatóintézete, Vácrátót. Farkas E., Lıkös L., és Mázsa K. (1998), HPTLC-vizsgálatok magyarországi Umbilicaria zuzmófajokon. Kitaibelia 3, Farkas E., Lıkös L., és Mázsa K. (1999), Introducing HPTLC analysis for screening of lichen substances in Hungary. Acta Microbiol. Immunol. Hung. 46, Feige G. B., Lumbsch H. T., Huneck S., és Elix J. A. (1993), Identification of lichen substances by a standardized high-performance liquid chromatographic method. J. Chromatogr. 646, Filson R. B. (1981), A revision of the lichen genus Cladia Nyl. J. Hattori Bot. Lab. 49, Giralt M., Nordin A., és Elix J. A. (2010), A new chemotype of Buellia triseptata (Physciaceae). Bryologist 113, Hale M. E., Jr. (1962), The chemical strains of Usnea strigosa. Bryologist 65, Hamada N. (1989), The effect of various culture conditions on depside production by an isolated lichen mycobiont. Bryologist 92,

14 Hamada N. (1991), Environmental factors affecting the content of usnic acid in the lichen mycobiont of Ramalina siliquosa. Bryologist 94, Hamada N. (1996), Induction of the production of lichen substances by non-metabolites. Bryologist 99, Mirando M. és Fahselt D. (1978), The effect of thallus age and drying procedure on extractable lichen substances. Can. J. Bot. 56, Randlane T. és Saag A. (1989), Chemical variation and geographical distribution of Asahinea chrysantha (Tuck.) Culb. & C. Culb. Lichenologist 21, Sheard J. W. (1974), The genus Dimelaena in North America North of Mexico. Bryologist 77, Zhou Q., Guo S., Huang M., és Wei J. (2006), A study of the genetic variability of Rhizoplaca chrysoleuca using DNA sequences and secondary metabolic substances. Mycologia 98, Zoller S., Lutzoni F., és Scheidegger C. (1999), Genetic variability within and among populations of the threatened foliose lichen Lobaria pulmonaria (L.) Hoffm. in Switzerland. Mol. Ecol. 8,