Az oxidatív stressz és a fizikai erőkifejtés kapcsolata Doktori értekezés Dékány Miklós Semmelweis Egyetem Sporttudományi Doktori Iskola Témavezető: Dr. Pucsok József egyetemi tanár, az MTA doktora Hivatalos bírálók: Dr. Fehér János, egyetemi tanár, Ph.D. Dr. Szabó Tamás, főigazgató, Ph.D. Szigorlati bizottság elnöke: Szigorlati bizottság tagjai: Dr. Istvánfi Csaba, egyetemi tanár, Ph.D. Dr. Mohácsi János, egyetemi tanár, Ph.D. Dr. Szabó Tamás, főigazgató, Ph.D. Dr. Martos Éva, főigazgató, Ph.D. Budapest 2006.
Tartalomjegyzék 1. Bevezetés 5 2. Irodalmi áttekintés 10 2.1. A szabadgyökök kémiai reakciói 10 2.2. Az antioxidáns rendszer, mint a szervezet egyik védőmechanizmusa 15 2.2.1. Elsődleges antioxidáns enzimek 16 2.2.1.1. Szuperoxid-diszmutáz 16 2.2.1.2. Glutation-peroxidáz 17 2.2.1.3. Kataláz 18 2.3. Fizikai aktivitás hatása a gyökképződésre 19 2.3.1. Hemolízis 22 2.3.2. Az antioxidáns hatású vegyületekkel való ellátottság 22 2.3.3. Laktátképződés 25 2.3.4. Lipid- és fehérje peroxidáció 26 2.3.5. Adaptáció 28 2.3.6. Akut fizikai erőkifejtés hatása 30 3. Célkitűzés 34 4. Módszerek 36 4.1. Biokémiai meghatározások 36 4.1.1. Tejsav meghatározása 36 4.1.2. Szuperoxid diszmutáz aktivitás meghatározása 37 4.1.3. Glutation peroxidáz aktivitás meghatározása 40 4.1.4. Kataláz aktivitás meghatározása 42 4.1.5. A szérum malondialdehid koncentrációjának meghatározása 44 4.1.6. Bilirubin meghatározása 45 4.1.7. Glükóz meghatározása 46 4.1.8 Kreatin kináz meghatározása 46 4.2. Terheléses vizsgálatok 47 4.3. Statisztikai módszerek 49 5. Eredmények 50 5.1. Laboratóriumi terheléses vizsgálatok és az oxidatív stressz 50 2
5.1.1. Labdajátékosok vizsgálata 50 5.1.1.1. A vizsgálatban résztvevők jellemzése 50 5.1.1.2. Eredmények ismertetése 51 5.1.1.3. Megbeszélés 56 5.1.2. Különböző nagy állóképességű sportágak összehasonlítása 57 5.1.2.1. A vizsgálatban résztvevők jellemzése 57 5.1.2.2. Eredmények bemutatása 58 5.1.2.3. Megbeszélés 63 5.2. Pályakörülmények között végzett terhelés és az oxidatív stressz 64 5.2.1. A vizsgálatban résztvevők jellemzése 64 5.2.2. Eredmények 64 5.2.3. Megbeszélés 69 5.3. Különböző állóképességű sportágak összehasonlítása 71 5.3.1. A vizsgálatban résztvevők jellemzése 71 5.3.2. Eredmények ismertetése 72 5.3.3. Megbeszélés 86 5.4. Az antioxidáns enzimrendszer adaptációja 89 5.4.1. A vizsgálatban résztvevők jellemzése 89 5.4.2. Eredmények ismertetése 89 5.4.3. Megbeszélés 95 5.5. Antioxidáns kapacitás különböző kompartmentekben 96 5.5.1. A vizsgálatban résztvevők jellemzése 96 5.5.2. Eredmények ismertetése 96 5.5.3. Megbeszélés 99 6. Következtetések 101 7. Összefoglalás 105 8. Summary 106 9. Irodalomjegyzék 107 3
Rövidítések jegyzéke 1 g O 2 singlet oxigén 3 go 2 triplet oxigén AMP adenozin monofoszfát ATP adenozin trifoszfát BMI testtömeg index CAT kataláz CRP C reaktív fehérje GPX glutation peroxidáz GSH redukált glutation GSSG oxidált glutation H 2 O 2 hidrogén-peroxid HO hidroxil gyök IL-6 interleukin 6 L lipid gyök LOO lipid oxigyök MDA malondialdehid MVV maximális akaratlagos ventilláció NADP nikotinamin adenin dinukleotid foszfát NADPH redukált nikotinamin adenin dinukleotid foszfát O -. 2 szuperoxid gyök PUFA többszörösen telítetlen zsírsav Q-ciklus citokróm bc1 komplex redox ciklusa ROS reaktív oxigén vegyületek SOD szuperoxid diszmutáz SQ szemikinon gyök TBARS tiobarbitursav reaktív vegyületek TH tokoferol gyök TH 2 tokoferol TNF-α tumor nekrózis faktor alfa VE percventilláció VO 2max relatív aerob kapacitás 4
1. Bevezetés Intenzív erőkifejtések során az emberi szervezet oxigén felvétele a nyugalminak a sokszorosára növekszik. A felvett oxigénnek a legnagyobb része az izomsejt mitokondriumában az energiaszolgáltató oxidatív foszforilációban vesz részt és vízzé redukálódik. Az oxigén mennyiségének mintegy 2-5%-a nagy reakcióképességű reaktív oxigén vegyületté alakul, melynek egy része a külső elektronhéjon páratlan elektront tartalmaz. Az ilyen vegyületeket szabadgyököknek nevezzük. A reaktív oxigén vegyületek káros hatásának kivédésére szervezetünk bonyolult védekező rendszerrel rendelkezik, amely antioxidáns hatású vitaminokat és enzimeket, valamint kéntartalmú aminosavakat egyaránt tartalmaz. Ez az antioxidáns rendszer biztosítja a sejt folyamatos anyagcseréjéhez szükséges redox egyensúlyt egyrészt nyugalomban, másrészt mérsékelt intenzitású erőkifejtés alkalmával. Vizsgálataimban tanulmányoztam, hogy az intervallumos és a nem-intervallumos erőkifejtéssel járó sportágakban, hogyan alakulnak az aerob és az anaerob energiaszolgáltatás komponensei, valamint hogyan változik az előbbiekkel összefüggésben egyes antioxidánsok aktivitása a terhelés intenzitásának és időtartamának függvényében. A disszertáció bevezető részében a fizikai erőkifejtéssel összefüggésben rövid áttekintést adok a szabadgyökös reakciók jelentőségéről és az antioxidáns védelmi rendszer általános szerepéről. Az irodalmi részben ismertetem a szabadgyökös folyamatok szervezetben lejátszódó kémiai reakcióit, az antioxidáns rendszert mint a szervezet egyik védekező mechanizmusát valamint a fizikai aktivitás és az antioxidáns hatású vitamin pótlás hatását a gyökképződésre és a szervezet antioxidáns védelmi rendszerére. A célkitűzésben megfogalmazom a munkám során felmerült kérdéseket, hipotéziseket. A módszerek fejezetben a munkám során felhasznált analitikai, biokémiai metodikákat valamint a terhelés előtt és után mért élettani mutatók meghatározását ismertetem. Az eredmények tárgyalását a felmerülő kérdések, hipotézisek szerinti sorrendben tárgyalom, minden esetben a vizsgálati személyek alapadatainak (kor, nem, BMI) és terhelési protokolljának ismertetésével. Az eredmények ismertetése után a megbeszélés részben a 5
felmerült kérdésekre adandó válaszokat összesítem. A következtetés című fejezet a vizsgálatokból levonható megállapításokat, tanulságokat valamint a jövőre vonatkozó kutatási elképzeléseket tartalmazza. A munka magyar és angol nyelvű összefoglalását követően az értekezésben felhasznált irodalomjegyzéket ismertetem. A szabadgyökös reakciók tanulmányozása biológiai rendszerekben az utóbbi két évtizedben került a tudományos érdeklődés előterébe. A természettudományok különböző területein (kémia, fizika, biokémia) történt számos felismerés a vizsgálandó gyökös mechanizmusok interdiszciplináris tanulmányozását tette szükségessé és lehetővé. Az utóbbi évtized vizsgálatai szerint a szabadgyökök képzésére hajlamos vegyületek az egyes betegségek, szöveti sérülések kialakulásában jelentős szerepet játszanak. A kutatók érdeklődéssel fordultak ezen vegyületek irányába és számos közleményben mutattak rá a fizikai munkavégzés és a sporttevékenység során keletkező szabadgyökök szerepére. Szent-Györgyi Albert már 1960-ban az elsők között hívta fel a figyelmet az elektron helyzete, mozgása és az életjelenségek közötti összefüggésre [1]. Az elmúlt 20 évben számos tanulmány jelent meg arról, hogy az oxigén szabadgyökök a fizikai erőkifejtés során feleslegben keletkezhetnek, és felelősek lehetnek az erőkifejtés káros következményeiért. A szabadgyökök keletkezése szoros kapcsolatban áll az erőkifejtés során igénybe vett izom típusával és tömegével illetve az izom által felvett oxigén mennyiségével, így az erőkifejtés időtartamával és intenzitásával is. A legtöbb fizikai tevékenység komplex jellege miatt a szabadgyökök az izomszöveten kívül számos egyéb szövetben (tüdő, szív, máj) is keletkezhetnek és a képződés üteme összefüggésben lehet a mechanikai stresszel, a mitokondriális aktivitás fokozódásával és az izomösszehúzódással. A szabadgyökös vegyületek a képződés mechanizmusa szerint elsődlegesen és másodlagosan keletkezhetnek (1.1. táblázat). Az elsődleges szabadgyök képződés az oxidatív stressz közvetlen hatását jelenti, míg a másodlagosan keletkező szabadgyökök az oxidatív stressz közvetett hatásaként értelmezhetők. 6
1.1. táblázat A szabadgyökök képződésének mechanizmusai Elsődleges szabadgyök források Másodlagos szabadgyök források 1. mitokondriumban képződő gyökök 1. fehérvérsejtek által képződő gyökök 2. xantin oxidáz által képződő gyökök 2. izom kalcium akkumulációja során képződő gyökök 3. prostanoidok által képződő gyökök 3. fémtartalmú fehérjék sérülése nyomán képződő gyökök 4. katekolaminok által képződő gyökök 5. NAD(P)H oxidáz által képződő gyökök Az izom kontraktilitás fokozódása során a mitokondriumon belül szuperoxid gyök képződik. A szuperoxid gyök és a belőle képződő hidrogén-peroxid az izomsejtből az intersticiális térbe jut. A vas által (Fe 2+ ) katalizált folyamatban a felszabaduló szuperoxid gyökből és a hidrogén-peroxidból hidroxil gyök keletkezik. A gyökös vegyületek képződését Ashton és munkatársai [2] elektron-spin rezonancia vizsgálattal igazolták. A többszörösen telítetlen zsírsavakból álló mitokondrium membránban az oxigén szabadgyökök lipid peroxidokat képezhetnek, amelynek következtében a membrán hidrofilebb tulajdonságúvá válik. Emiatt többlet víz tud a sejtekbe áramolni, amely gyulladásos folyamatokat idéz elő. A gyulladás további oxigén szabadgyök felszabadulással jár és ez a pozitív feed-back hatás további lipid peroxidációs termék képződését segíti elő. Valószínűsíthető, hogy mérsékelt intenzitású erőkifejtés során (40 min/nap 35 ml/(kg*min)-es relatív aerob kapacitással) sem endogén, sem exogén forrásokból eredően a nagyobb mennyiségű szabadgyökökkel szemben nincs további antioxidáns védelem az inaktív állapothoz, azaz a terheléshez nem adaptálódott szervezethez képest. Kimerítő erőkifejtés során nő a lipid peroxidációs melléktermékek koncentrációja (nevezetesen a malondialdehidé) és antioxidáns hatású vegyületek bevitele gyengíti a káros lipid peroxidációt és a malondialdehid képződését [3]. Ischemia során xantin-dehidrogenázból xantin-oxidáz képződik, amellyel párhuzamosan ATP-ből AMP lesz. A xantin-oxidáz az izomban ill. a kapilláris falához kötődve fontos szerepet játszik a szuperoxid gyök képződésében az erőkifejtés alatt és után, főként nagy 7
intenzitású, rövid ideig tartó terhelések során. A xantin-oxidáz az egyik legfontosabb enzim, amely részt vesz a szuperoxid gyök, a hidrogén peroxid és más oxidatív vegyületek képződésében. Hellesten és munkatársai [4] vizsgálatai szerint az izomrostok xantin-oxidáz szintje kimerítő erőkifejtés után 8-szorosa volt a kontroll izombiopsziás mintákhoz képest. A plazma xantin-oxidáz aktivitás szintjének emelkedése összefüggésben van a lipid peroxidok, az oxidált glutation és más oxidatív sérülést okozó marker képződésével. Allopurinol kezelés hatására a plazma xantin és hipoxantin szintje nő és a húgysav szintje csökken. A prostanoid marker szerepe az oxidatív stressz mechanizmusában még nem tisztázott. Az izomaktivitás során emelkedő prostaglandin szint hasznos illetve ártalmas hatásának tisztázása további kutatásokat igényel. Erőkifejtés során katekolaminok szabadulnak fel, amelyek autooxidáció vagy fémion által katalizált folyamat során szabadgyököket termelnek. A NAD(P)H oxidáz enzim szabadgyök termelő képessége számos sejttípusban ismert. Az enzim jelenlétét még nem igazolták a vázizomzatban, ezért az izomösszehúzódással összefüggő hatása tisztázatlan. Izomsérüléseknél a vérből és az interstíciumból makrofágok és más fagocita sejtek kerülnek a sérülés helyére. Fagocitózis során jelentős mennyiségben oxigén gyökök szabadulnak fel, amelyek a nekrotikus terület megszüntetésében nyújtanak segítséget, de a környező élő szövetekre is veszélyt jelenthetnek. Antioxidáns vegyületeknek nincs hatása a fagocitózis során másodlagosan (nem közvetlenül az oxidatív stressz következtében) keletkező szabadgyökök felszabadulásának mértékére. Az izom kalcium egyensúlyának megbomlása is okozhatja az erőkifejtés általi izomkárosodást. Az intramuszkuláris kalcium szint emelkedése aktiválja az endogén foszfolipáz és proteolitikus enzimeket, amelyek a szabad zsírsavak felszabadulását és az intracelluláris membrán szerkezet károsodását váltják ki. 8
Hosszantartó fizikai erőkifejtés a vörösvértestek károsodását okozhatja és ennek során felszabaduló fém vas katalitikus hatással van a szabadgyökök kialakulására. A vérkeringésbe felszabaduló nagy mennyiségű vastartalmú fehérje is izomkárosodást okozhat, katalizálja az oxigén szabadgyökök képződését és ezzel másodlagosan további oxidatív vegyületek sejtkárosító hatását indíthatja el. Rendszeres sporttevékenységeket végzők esetén növekvő kockázati tényezőt jelent a vashiányos állapot, amelyet a szérum ferritin, transzferrin és hemoglobin szintje alapján együttesen kell diagnosztizálni. Mérsékelt intenzitású erőkifejtést végzők vastabletták bevitele helyett étrendi változtatással tarthatják fenn a normális ferritin szintjüket (12-135 ng/ml). Antioxidáns hatású vegyületek bevitele hatással van az erőkifejtés közben kialakuló oxidatív stresszre. Nem elfogadott tény, hogy kimerítő terhelések esetében szükséges-e többlet antioxidáns felvétele. Amennyiben a szabadgyökök mennyisége intenzíven fokozódik, a rendelkezésre álló antioxidánsok nem képesek semlegesíteni és a gyökök károsító hatása a sejtmembrán lipid alkotórészein érvényesül. Mindez láncreakcióban további gyököket generál és beindítja a lipidperoxidáció folyamatát, amely további sejtalkotórészeket károsíthat. A szervezet képes eliminálni a szabadgyökök egy részét, azonban kísérletek igazolták, hogy a fokozódó számú reaktív oxigén vegyületekre szükség van a megfelelő vázizom adaptáció kialakításához [5]. Összefoglalva megállapítható, hogy a fizikai erőkifejtés során keletkező szabadgyökök a terhelés intenzitásától és időtartamától, a szabadgyökök mennyiségétől és keletkezési helyétől függően hatással vannak az izom működésére. A fizikai erőkifejtéssel közvetlen módon összefüggő oxidatív stressz bizonyítását a szabadgyökök keletkezési mechanizmusának jellege nehezíti. 9
2. Irodalmi áttekintés 2.1. A szabadgyökök kémiai reakciói A gyök kifejezés eredeti jelentése: a molekulának egy független, önálló létezésre alkalmas része [6]. A manapság használatos szabadgyök kifejezés alatt egy olyan molekulát vagy molekula fragmentumot (atomot, atomcsoportot) értünk, amelynek a külső elektronhéján párosítatlan elektronja van [7]. Minden kémiai kötést két elektron alkot. A kételektronos kémiai kötések hasadhatnak aszimmetrikusan, amit heterolízisnek nevezünk. Ekkor mindkét elektron ugyanazon a fragmentumon marad és ionok képződnek. Homolízis esetén szimmetrikus hasadás történik, amikor mindegyik fragmentumon egy-egy elektron marad. Ilyenkor keletkeznek a szabadgyökök is: X: Y X + Y A gyökképződés igen gyakori jelenség. Olyan molekulákból (pl. nitrogén-oxidok), amelyek párosítatlan elektronnal rendelkeznek a külső molekulapályájukon, könnyen képződhetnek szabadgyökök. Bizonyos körülmények között a vízből is keletkezhetnek szabadgyökök (H., HO., HOO. ). Szabadgyökök képződhetnek termikus homolízissel, molekula indukált homolízissel, egy elektron átmenettel járó redox reakciókkal, nagy energiájú sugárzással és fotolízissel [8]. Az 2.1. táblázat a szabadgyök képződés általános menetét mutatja szerves és szervetlen reakciókban. A három leggyakoribb folyamat a következő: (a) az aktív gyök képződése (kialakulás); (b) további gyökök keletkezése (növekedés); (c) gyök reakciója másik gyökkel vagy gyökfogóval stabil molekulát eredményez (lezárás). Az elmúlt évtizedben a tudományos érdeklődés az aktív oxigén vegyületek felé fordult, ezek közül is főleg a triplet állapotú molekuláris oxigén felé, amely a vegyértékhéján két párosítatlan elektronnal rendelkezik. Ebből következik, hogy ez a molekula kétszeresen káros hatású gyök. A Pauli-elv szerint ugyanazon az elektronpályán levő elektronok ellentétes spinnel rendelkeznek [9]. A triplet oxigén gyök 2 elektronja viszont ugyanolyan spinű. Annak érdekében, hogy kettesével kerüljenek az elektronok az elektronpályákra, az egyik elektron spinjének ellentettjére kell változnia. Egy ilyen spinátfordulás energia- és időigényes folyamat. Hill [10] megállapítása szerint a 10
spinátfordulás esélye igen csekély, ezért a triplet molekuláris oxigén egy elektron felvételével O 2-vé alakul. 2.1. táblázat A szerves és szervetlen szabadgyökök reakciói a következő általános formát követik: gyökképződés, gyöksokszorozódás, stabilizálódás. A szerves szabadgyökök életútját a lipid peroxidáció mutatja be. PUFA=többszörösen telítetlen zsírsav, HO =hidroxil gyök, L =lipid gyök, LOO =lipid oxigyök, TH 2 =tokoferol, TH =tokoferol gyök [11]. Szervetlen szabadgyökök Szerves szabadgyökök kialakulás: Cl 2 hν 2 Cl O 2 + Fe 3+ O 2 + Fe 2+ növekedés: H 2 + Cl HCl + H H 2 O 2 + Fe 2+ + H + Cl 2 + H HCl + Cl HO + Fe 3+ + H 2 O lezárás: Cl + Cl Cl 2 PUFA H + HO H 2 O + L H + H H 2 L + O 2 LOO H + Cl HCl PUFA H + LOO LOOH + L L + TH 2 LH + TH LOOH + TH 2 LOOH + TH A 2.2. táblázat az oxigén molekula elektron felvételének következményeit mutatja. A b reakció szerint az O 2-ből közvetlen úton hidrogén-peroxid képződik. A szuperoxid diszmutáz feladata, hogy segítse ezt a gyors, spontán lefolyású reakciót, hogy a sejtekben nagyon alacsony koncentrációban forduljanak elő gyökös vegyületek. Marklund [12] a szuperoxid dizmutáz számos szerepére mutatott rá klinikai esetekben. A SOD által katalizált reakció előnyét a c reakció illusztrálja, ahol a H 2 O 2 mellett triplett O 2 keletkezik. A képződött H 2 O 2 -t a legtöbb sejt katalázzal eliminálja. A szívizomsejtek glutation peroxidázzal és redukált glutationnal közömbösítik a H 2 O 2 -t, oxidált glutation képződése mellett. Az oxidált glutationt glutation reduktáz alakítja vissza a redukált formává. Ez utóbbi folyamatokat mutatja be a d és e reakció. 11
2.2. táblázat Az oxigén molekula elektronfelvételének következményei 1 g O 2 =singlet oxigén; 3 go 2 =triplet oxigén; SOD=szuperoxid dizmutáz; GSH=redukált glutation; GSHase=glutation peroxidáz; GSSG=oxidált glutation; SQ =szemikinon gyök [11]. (a) O 2 e O 2 (b) 2 O 2 + 2 H + H 2 O 2 + 1 g O 2 (c) 2 e + 2 H + 2 O 2 SOD H 2 O 2 + 3 go 2 (d) 2 H 2 O 2 kataláz 3 go 2 + 2 H 2 O (e) 2 H 2 O 2 + 2 GSH GSHase GSSG + 2 H 2 O (f) H 2 O 2 + SQ + H + kinon + HO + H 2 O (g) H 2 O 2 + Fe 3+ Fe 2+ + HO + HO A f és g reakciók a különösen ártalmas hidroxil gyökök képződését mutatják. A hidroxil gyökök reaktivitására jellemző, hogy nagy valószínűséggel egy molekula átmérőnyi távolságot sem képesek diffúzió útján megtenni anélkül, hogy ne lépnének reakcióba a környezetükkel [13]. A hidroxil gyökök hátrányosan változtatják meg az enzimek, a sejtmembránok és a nukleinsavak struktúráját. A f reakció szerint a szemikinon gyök H 2 O 2 jelenlétében és nagy H + -ion koncentráció mellett hidroxil gyököt képez. Ez a reakció jelentheti az egyik kapcsolódási pontot a szabadgyökös reakciók kémiája és a terhelés élettan között. Nohl és munkatársai [14] igazolták a kinonok biológiai fontosságát. Az ubikinonok vagy szemikinonok, különösen a koenzim Q 10, az egyetlen nem fehérje típusú karrierek a mitokondriális elektrontranszfer láncban. Ezek a vegyületek a membránban találhatók jellemzően nagy kereszt és hosszirányú mobilitással. A 2.3. táblázat a szabadgyökök képződésének számos forrását illusztrálja. Cadenas és munkatársai [15] vizsgálatai szerint a Q ciklus (citokróm bc1 komplex redox ciklusa) termeli legnagyobb mennyiségben az O - 2-t. 12
A g reakció (ún. Fenton reakció) a fémionok fontos szerepére utal. Az ilyen típusú reakciókat számos nyomelem (pl.: Zn, Cu stb.) katalizálja. A fémiont tartalmazó enzimek jelenlétében, a fehérje szerkezete megakadályozhatja az enzimek gyökös reakcióban való részvételét. Ezek a fémionok kelátokat képeznek az alacsony molekulatömegű vegyületekkel (ADP, citrát). Az ilyen kelátkötésben levő fémek fontos szerepet játszanak a hidroxil gyökök képződésében. 2.3. táblázat Szabadgyökök képződésével és eliminációjával összefüggésbe hozható vegyületek [11] Szuperoxid dizmutáz (SOD) Citokróm P450 Xantin oxidáz NADPH transzhidrogenáz Lipoxigenáz Ciklo-oxigenáz Elektrontranszport Kinon A szabadgyökök sejtszintű mechanizmusainak helyét és elvét mutatja be a 2.1. ábra. A sejtekben a szabadgyökök elleni védelem több szinten érvényesül. Elsősorban a többszörösen telítetlen zsírsavakból hidrofil kettős réteget alkotó membrán szerkezete jelenti a védelmet. Másodsorban a membrán belsejébe beágyazódott zsíroldékony E- vitamin gyors reakcióban eliminálja a zsírsav gyököt és tokoferol kinont képez belőle. Harmadsorban számos fémion transzferrinhez, albuminhoz, ceruloplazminhoz és húgysavhoz kötődve vesz részt szabadgyököt eltávolító reakciókban. Negyedsorban a szabadgyökök intermedierként vesznek részt az enzim-szubsztrát molekulák kialakulásakor és ezért olyan rövid élettartamúak, hogy nem tudnak más molekulákkal reagálni. Ötödsorban a sejt különböző helyein előforduló enzimek (CAT, SOD, GPX) eltávolítják a szabadgyököket. Végül néhány szövetben előfordulnak olyan enzimek (pl. foszfolipáz A 2 ), amelyek el tudják távolítani a károsodott membrán szegmenseit. 13
foszfolipáz A2 mitokondrium E-VIT. peroxiszóma H2O2 SODCuZn O2 Q Q. e O2- H2O GSSG H+ SODMn H2O2 GSH kataláz H2O O2 retikulum MFO E-VIT. O2 SFA PUFA sejtmembrán belső membrán 2.1. ábra A sejt szabadgyökök elleni védekezőrendszerének felépítése Q = kinon gyök, SOD Mn = mangán szuperoxid dizmutáz, SOD CuZn = réz-cink szuperoxid dizmutáz, MFO = kevert funkciójú oxidáz vagy citokróm P450, SFA = telített zsírsav, PUFA = többszörösen telítetlen zsírsav, GSSG = oxidált glutation, GSH = redukált glutation [11]. 14
2.2. Az antioxidáns rendszer, mint a szervezet egyik védőmechanizmusa Az élő szervezet rendelkezik olyan mechanizmussal, amely védelmet nyújt a szabadgyökök ellen. Ezeket csoportosíthatjuk aszerint, hogy milyen fokon vesznek részt a szervezetbe bejutó, vagy a szervezetben keletkező szabadgyökök elleni védekezésben [16]. Elsődleges és egyben fő védelmi vonal az alacsony szöveti oxigénnyomás kialakulása és fenntartása, ez mintegy 26 Hgmm vagy ennél kisebb érték. Az elsődleges antioxidánsok közé tartoznak azok a vegyületek, melyek az egyes molekulákból vagy meggátolják a szabadgyökök keletkezését, vagy újabb szabadgyökök keletkezését akadályozzák azáltal, hogy a már meglevő gyököket kevésbé káros molekulákká alakítják. Enzimatikus úton alapvetően három enzimfajta működik közre az oxigén redukciós melléktermékeinek eltávolításában, melyeket az 2.4. táblázat szemléltet. Az enzimatikus védekezést másodlagosan kiegészítik az antioxidáns, scavenger tulajdonságú lipofil- (pl.: α- tokoferol, β-karotin, húgysav) és hidrofil (pl.: C vitamin, albumin, bilirubin) tulajdonságú vegyületek. A redox egyensúly fenntartásában fontos szerepet töltenek be a d-mező egyes elemei (Cu, Zn, Mn) valamint a szelén. Az extracelluláris tér kevésbé védett a szabadgyök reakciókkal szemben, mert az előbb említett védekező enzimek aktivitása a sejten kívül elhanyagolható. Az extracelluláris tér védelmét a következő fehérjék szolgálják: albumin, ferritin, transzferrin, cöruloplazmin, melyek a fémkatalízisből (Fe 2+, Cu + ) származó hidroxil gyökök felszaporodását gátolják, valamint a tetramer SOD [14]. 2.4. táblázat Legfontosabb elsődleges enzimatikus antioxidánsok neve és funkciója [16] Enzim neve és rövidítése Enzim funkciója Szuperoxid dizmutáz (SOD) a szuperoxid aniont alakítja hidrogén-peroxiddá 2O - 2 + 2H + H 2 O 2 + O 2 Kataláz (CAT) H 2 O 2 H 2 O + ½ O 2 Glutation peroxidáz (GPX) a hidrogén-peroxidot és a lipid-peroxidot alakítja kevésbé reaktív termékké 15
Harmadlagos antioxidánsok azok a vegyületek, melyek a szabadgyökök által károsított biomolekulákat rekonstruálják. Ilyenek a DNS-t javító enzimek (pl. a metionin szulfoxid reduktáz) valamint a fehérje- és lipiddegradátumokat elimináló repair folyamatok. Ide sorolják még a szervezetbe kívülről bejutó anyagok nem toxikus termékekké való átalakítását végző citokróm p-450 enzimrendszert is. A károsodott DNS-t exonukleázok, endonukleázok, glikozilázok, polimerázok és ligázok javítják. A fehérjedegradátumok eltakarításában proteinázok, proteázok és peptidázok vesznek részt. Az oxidált lipidek eliminálásában a foszfolipázok, az organikus hidroperoxidokat bontó glutation-peroxidáz, a transzferázok és a reduktázok segédkeznek. 2.2.1. Elsődleges antioxidáns enzimek 2.2.1.1. Szuperoxid-diszmutáz A sejtek elsődleges védelmét a szuperoxid anionokkal szemben a szuperoxid-diszmutáz (SOD) biztosítja. A SOD diszmutálja a szuperoxid gyököt hidrogén-peroxiddá és oxigénné (2.2. ábra). A szuperoxid-diszmutáznak a humán és az emlős állatok vázizomzatában kétféle izoenzimje található: ezen izoformáknak eltérő a sejten belüli elhelyezkedése, valamint az aktív centrumhoz kötődő fém kofaktora. A Cu-Zn szuperoxid-diszmutáz izoforma elsődlegesen a citoszólban található, míg a Mn szuperoxid-diszmutáz izoforma a mitokondrium mátrixban fordul elő [17, 18, 19]. Mindkét izoforma hasonló hatékonysággal diszmutálja a szuperoxid aniont [19]. A szuperoxid-diszmutáz izoformák előfordulása szövetenként eltérő. A teljes szuperoxiddiszmutáz aktivitás 15-35 %-ban a vázizomzat mitokondriumban-, míg 65-85 %-ban a citoszólban nyilvánul meg [20]. A szuperoxid-diszmutáz aktivitása legnagyobb a nagy oxidatív kapacitással rendelkező izomrostokban (I-es és IIa-típusú ), az alacsony oxidatív kapacitású IIb-típusú izomrostokhoz viszonyítva [21, 22]. 16
2.2.1.2. Glutation peroxidáz A glutation peroxidáz katalizálja a hidrogén peroxid és más szerves peroxidok redukcióját vízzé vagy alkohollá elektron donorként redukált glutation (GSH) felhasználásával (2.6 ábra) [17]. A glutation peroxidáz szelénium-függő enzim és egyetlen izoformája létezik. Nagy specificitású a GSH-ra nézve, de alacsony specificitású a hidroperoxidokkal szemben. A hidroperoxidok és a komplex szerves peroxidok széles skáláját képes redukálni [23]. Ezáltal a glutation-peroxidáz a sejtek fontos védőfaktora a reaktív oxigén vegyületek károsító hatása ellen. SOD szabadgyök H 2 O H 2 O 2 GPX GSSG Oxidált állapot GSH GR NADP Redukált állapot NADPH ATP 2.2. ábra A glutation szerepe a sejtciklusban [24] A glutation peroxidáz aktivitása a különböző típusú vázizomrostokban eltérő: az I-es típusú lassú rostokban az aktivitása a legnagyobb, míg a IIb típusú izomrostokban a legkisebb [22, 25]. A szuperoxid disztmutázhoz hasonlóan a GPX is a citoszólban és a mitokondriumban található. A citoszólban a GPX mintegy 45 %-ban fejti ki hatását, míg a mitokondriumban a maradék 55 % lokalizálódik [25]. Mindez lehetővé teszi, hogy a 17
különböző biokémiai úton keletkező szerves és szervetlen peroxidokat hatékonyan semlegesíteni tudja [18, 25]. A GPX működéséhez redukált glutationra (GSH) van szükség. A GSH-t a glutation peroxidáz alakítja át oxidált glutationná (GSSG), amely a sejt más biokémiai útvonalain visszaalakul redukált glutationná. Ezt a folyamatot a glutation reduktáz katalizálja, amelyhez NADPH-ra van szükség. Számos szövetben a NADPH legnagyobb részben a glükóz-6-foszfát dehidrogenáz útján alakul ki, ám a vázizomzatban elsődlegesen az izocitrát-dehidrogenáz segítségével képződik [21, 23]. 2.2.1.3. Kataláz A kataláz elsődleges funkciója a hidrogén peroxid vízzé és oxigénné történő alakulásának katalízise. A katalitikus aktivitás biztosításához a kataláz Fe 3+ -ionokat igényel, amely az enzim aktív centrumához kapcsolódik [23]. Bár a kataláz és a glutation peroxidáz működése hasonló, de a két enzim hidrogén peroxidhoz való affinitása jelentősen eltér. Emlősökben a glutation peroxidáznak nagyobb az alacsony koncentrációban jelen levő hidrogén peroxidhoz való affinitása, mint a kataláznak (K m(gpx) = 1 µmol vs. K m(cat) = 1 mmol). Mindez azt jelenti, hogy alacsony peroxid koncentráció mellett a GPX jelentősebb szerepet játszik a hidrogén peroxid eliminálásában az izomsejtekből, mint a kataláz. A kataláz nagy koncentrációban megtalálható a sejten belül mind a peroxiszómában, mint a mitokondriumban [23]. Hasonlóan a szuperoxid diszmutázhoz és a glutation peroxidázhoz, a kataláz aktivitása is az oxidatív I-es típusú izomrostokban a legnagyobb és a IIb-típusú izomrostokban a legalacsonyabb [22]. 18
2.3. Fizikai aktivitás hatása a gyökképződésre Az oxigén egy olyan általános elektron akceptor molekula, amely az aerob szervezetek számára biztosítja a szénhidrátokból, zsírokból, fehérjékből származó energia felhasználását. Széles körben elfogadott és kísérleti úton bizonyított, hogy ez a katabolikus folyamat oxigén szabadgyököket és más reaktív oxigén vegyületeket (ROS) generál, mint például a szuperoxid gyök (O -. 2 ), a hidroxil gyök (. OH) és a hidrogén peroxid (H 2 O 2 ) [26]. Normális élettani körülmények között a ROS a mitokondriális elektrontranszportláncban keletkezik, miközben az oxigén 90 %-a a mitokondriumban vízzé redukálódik [27]. Azonban a ROS más biokémiai folyamatok közben is keletkezhet a sejtben. A respirációs burst során a neutrofil sejtek ROS vegyületeket generálva pusztítják el a baktériumokat, vírusokat és más xenobiotikumokat [28]. A peroxiszomában lényegesen megnő a hidrogén-peroxid mennyisége, miközben a ß- oxidáció során nagy mennyiségű zsír metabolizálódik [29]. Más egy elektron transzportjával járó folyamatban, oxigén jelenlétében képződhet szuperoxid gyök és hidrogén-peroxid, mint például a D-aminosavak oxidációjakor, a citokróm P 450 enzimrendszer aktivációjakor, a xantin húgysavvá történő lebomlása kapcsán, valamint a katekolaminok autooxidációjakor [30]. Becslések szerint fiziológiás körülmények között egyetlen sejt 2*10 10 db szuperoxid gyököt és hidrogén-peroxidot termel naponta, amely 3.3*10-14 mol mennyiségnek felel meg [27]. Mindezen folyamatok a fiziológiás sejt működéséhez szorosan kapcsolódnak, azonban a reaktív oxigén vegyületek igyekeznek elektron felvétellel kémiailag stabilabb formába kerülni és ezért számos sejt alkotórészben káros oxidatív folyamatok játszódhatnak le [27]. A legtöbb állat esetében a mozgás lényeges szerepet játszik a túlélésben. Embernél a fizikai aktivitás végzése nem az életben maradás elengedhetetlen feltétele, de hozzá tartozik az életmódhoz, a rekreációhoz és adott esetben a terápiás célzatú kezeléshez is. A fizikai aktivitás következtében a szervezet oxigénfelvevő képessége a nyugalminak sokszorosára nő, különösen a vázizomzatban és a szívben. Az elmúlt évtized kutatásai során nyilvánvalóvá vált, hogy a kimerítő fizikai erőkifejtés felboríthatja a ROS és az antioxidáns védelmi rendszer közötti egyensúlyi helyzetet, és oxidatív stressz keletkezik [31, 32, 33, 34, 35]. 19
Számos tanulmány ír arról, hogy az erőkifejtés, edzés hatására felszabaduló szabadgyökök fontos mediátor szerepet játszhatnak a gyulladások és izomsérülések keletkezésében. Több szerző megállapította, hogy az oxigén szabadgyökök száma terhelés hatására emelkedik. Davies és munkatársai [36] elektron-spinrezonancia vizsgálattal igazolták, hogy a fárasztó erőkifejtés után megnőtt a szabadgyökök száma. Jackson [37] nem tudta kimutatni a szabadgyökök jelenlétét a vázizomzatban szobahőmérsékleten, de sikerült megfigyelnie 350 C-on kísérleti úton. Az adaptáció nélküli edzés és versenyterhelés a szabadgyökök tömegét küldi a fokozott oxigénfelhasználást igénylő mitokondriumokhoz. Az elektrontranszport megfelelő védelem nélkül a sejtek károsodásához vezethet, aminek eredménye pl. a súlyos izomsérülés. Nyugalomban a sejtek hatékony nem-enzimatikus és enzimatikus antioxidáns rendszerrel távolítják el a káros hatású reaktív oxigén vegyületeket [32]. Smith és munkacsoportja [38] úgy találta, hogy a szubmaximális erőkifejtés szignifikáns változást eredményez a vörösvértestek oxidatív stresszre való hajlamában, amelynek következtében kimerítő erőkifejtés hatására a vörösvértest turnover fokozódik. Margaritis és munkatársai [39] szerint az antioxidáns védelmi rendszer fokozódásának nagysága összefügg az edzés mennyiségével. Kimerítő, hosszú ideig tartó fizikai terhelés és fárasztó edzés a reaktív oxigén vegyületek oxidatív stresszt okozó hatását csökkenti [40]. Ezért az állóképességi tréning fokozza a vörösvértestekben a szabadgyök-scavengelő enzimek aktivitását. Edzés következtében a szuperoxid diszmutáz enzim aktivitása a vázizomzatban fokozódik [41, 42, 43, 44, 45, 46, 47]. Ennek ellenére számos tanulmány nem tudta igazolni a SOD edzésre bekövetkező adaptációját állatkísérletekben [47, 48, 49, 50]. A vizsgálatok közötti eltérés oka a különböző izoenzimek tanulmányozásából, az eltérő biokémiai meghatározásokból, az alkalmazott edzés intenzitásából és gyakoriságából, valamint a vizsgált szövetminta típusából adódott. A kataláz aktivitása erőkifejtést követően szintén fokozódik a vázizomzatban [45, 51, 52, 53], bár néhány szerző nem talált változást [31, 32, 33], egyes tanulmányok csökkenésről számolnak be [44, 48]. 20
A glutation-peroxidázzal kapcsolatban egyes tanulmányok fizikai terhelés hatására egyöntetűen növekedésről számolnak be [42, 43, 44, 46, 48, 52, 54, 55, 56]. A GPX enzim adaptációja izomrost típusonként más, a legkifejezettebb változás a 2a-típusú izomrostokban mutatható ki. Mi az alapvető oka annak, hogy a különböző antioxidáns enzimek eltérő módon adaptálódnak a fizikai aktivitáshoz? Mindez függ az enzimek génexpressziós profiljától, az indukciós küszöbtől és a környezettel illetve az egymással való kölcsönhatástól. Az enzimek de novo szintézise energiaigényes és viszonylagosan lassú folyamat. A SOD enzim aktivitása meglehetősen magas és viszonylag egységes a különböző szövetekben és izomrostokban, ezért a szuperoxid anion eliminációjának sebessége nem feltétlenül meghatározó lépése az oxidatív stresszállapot megszüntetésének. Összehasonlítva, a GPX a reaktív oxigén vegyületeket termelő útvonalak végtermékeinek lebontásában vesz részt (hidrogén-peroxid, lipidperoxidok, nukleotid peroxidok), és az aktivitása viszonylag alacsony. Ez adja meg a magyarázatot arra, hogy miért a GPX adaptálódik nagyobb mértékben az erőkifejtéshez, edzéshez és nem a SOD vagy a CAT [57]. A terhelés során keletkező szabadgyököket gyökkötő enzimek részben eltávolítják. A terheléssel járó oxigénigény az izom mitokondriumaiban fokozza az oxigén-felhasználást. A növekvő oxigénellátás eredménye a szuperoxid gyökök keletkezésének lehetősége, a lipidperoxidáció beindulása és a következményes szöveti károsodás. A folyamat intenzitásában szerepet játszik a légzési lánc redukciója, a testhőmérséklet emelkedése és az acidózis. Az élő szervezet rendelkezik olyan folyamattal, amely védelmet nyújt az oxigénszabadgyökök ellen, de ezt az erőkifejtés megzavarhatja. Ennek során számos tényező okozhatja a szabadgyökök fokozott képződését és eliminációját, amelyet a következő alfejezetek mutatnak be [16]. 21
2.3.1. Hemolízis Számos irodalmi utalást találunk az erőkifejtés különböző formái következtében létrejövő vörösvértest hemolízisről [58, 59, 60, 61, 62]. A futás következtében kialakuló hemolízis elsődleges és legfőbb okaként a talpat ért ütést kell megemlíteni, azonban más a keringésben adódó vörösvértest sérülés jelentőségéről az eddigi irodalmi adatok nem tesznek említést. Telford és munkatársai [63] triatlonosoknál a talpat érő ütés következtében kialakuló hemolízis mértékét vizsgálták egy órás futást követően. Az önkontrollos vizsgálat részeként ugyanezen sportolókat kerékpároztatták ugyanilyen oxigénfelvétel mellett. A hemolízis mértékének meghatározására a plazma szabad hemoglobin és a szérum haptoglobin koncentrációját határozták meg. A vörösvértest oxidatív stresszállapotát jelző methemoglobin értékét a teljes hemoglobin százalékában közvetlenül erőkifejtést követően mérték. A plazma szabad hemoglobin koncentrációja szignifikánsan emelkedett terhelés hatására, de futás után a növekedés négyszer akkora volt, mint kerékpározást követően. A haptoglobin szint egy órával futás után szignifikánsan csökkent. A methemoglobin szint mind futás, mind kerékpározás után ugyanolyan mértékben szignifikánsan nőtt. Mindezen adatok alátámasztották azt a korábbi feltételezést, hogy a futást követő hemolízis elsődlegesen a talpat érő mechanikai hatás következtében alakul ki és kevésbé egy általános, keringésben jelentkező traumáról van szó. 2.3.2. Az antioxidáns hatású vegyületekkel való ellátottság A szervezet antioxidáns védelmi rendszere alapvető fontosságú az oxidatív stressz elleni védelemben. Lényeges, hogy különbséget tegyünk az indukálható és a nem indukálható antioxidánsok között. Az előbbiek közé tartoznak az antioxidáns enzimek és a GSH rendszer, amelyek főleg a vázizomzatban az ismétlődő erőkifejtésre adaptívan reagálnak. A nem indukálható antioxidánsok nagymértékben függnek az étrendtől és ebből adódóan érzékenyen reagálnak mindenfajta hiányra. A különböző antioxidáns hatású vegyületek szabályozó működésének és egyedi jellemzőinek megértése vezethet el ahhoz a megfelelő stratégiához, amellyel a különféle sejtek antioxidáns kapacitását fiziológiásan 22
és a táplálkozással fejleszteni lehet. Ez úgy tünik nem egyszerűen kivitelezhető startégia, mert bármely antioxidáns rendszer kapacitását nem lehet ugyanolyan eljárással növelni. A sejtmembrán védelmében és a többszörösen telítetlen zsírsavak oxidációjának megelőzésében az E vitamin jelenléte nélkülözhetetlen. Különösen az acetát formájában bejutó α-tokoferol biológiailag igen aktív. Az E vitamin membránvédő hatása nagyban szerkezeti felépítésével is kapcsolatos. Az ún. chromanol-híd a molekulán belül kapcsolódni tud a membrán felszínéhez és hidrogént ad le. Az E vitamin redukálódik és a folyamat a lipidperoxidok semlegesítését és a sejtmembrán védelmét biztosítja. A redukálódott E vitamint a C vitamin regenerálni képes és ezáltal az E vitamin visszanyeri antioxidáns gyökkötő képességét. A C vitamin által regenerálódott E vitamin koncentrációja és gyökkötő kapacitása emelkedik. A tokoferol szöveti eloszlásában is lényeges különbség van. Az izomszövetben, ahol a fizikai terhelésre a szabadgyökképződés fokozott, jelentős a tokoferol izomszöveti kötődése. E-vitamin hiányos diétán tartott állatoknál kimutatták, hogy fokozódik a lipidperoxidok képződése. Lipidek peroxidációjakor számtalan vegyület keletkezik, többek között Schiff-bázisok, konjugált diének és malondialdehid. Ez utóbbi vegyület tiobarbitursavval történő reakciója az egyik közvetett bizonyítéka a lipidek peroxidációjának. Az ω-zsírsavak oxidációja során pentán és etán szabadul fel, amelyek kimutathatóak a kilégzett levegőből is. Dillard és munkatársai 1978-ban elsőként mutatták ki [64] a pentán mennyiségének emelkedését a kilégzett levegőben a VO 2max 50%-ánál. Vizsgálataik szerint a respirációs pentán kibocsátás mennyisége mind nyugalomban, mind erőkifejtés után szignifikánsan csökken két hetes E vitamin kúra után. Viitala és munkatársai [65] kimutatták, hogy nagy intenzitású akut rezisztencia terhelés szignifikánsan növeli a lipidperoxidáció mértékét, ugyanakkor két hetes E-vitamin kiegészítés (885 mg/nap α-tokoferol acetást) nem ad ez ellen védelmet. A rezisztencia edzés hatására az edzettségi állapot javulása mellett, ugyanolyan intenzitású munkavégzésnél edzett és edzetlen egyének között nincs különbség a terhelés közben változó MDA koncentrációjában. 23
Mastaloudis és munkatársai [66] 22 futónál vizsgálták 6 hetes antioxidáns pótlás hatását (napi 1000 mg C vitamin és 300 mg RRR-α-tokoferol) a lipidperoxidációra 50 km-es ultramaratoni futás alatt. Az antioxidáns pótlás hatására a kezelt csoportban az α- tokoferol, valamint az aszkorbinsav plazma szintje emelkedett, míg a kontroll csoportban nem. A lipidperoxidáció mértékét jelző F 2 -izoprosztánok szintje a terhelés következtében csak a placeboval kezelt kontroll csoportban emelkedett. Emellett azonban a vizsgált gyulladásos markerek szintje (IL-6, TNF-α, CRP) a futást követően emelkedett még az antioxidánsokkal kezelt csoportban is. Az antioxidáns pótlás tehát kedvezően hatott a lipidperoxidációra, de nem befolyásolta a gyulladásos markerek szintjének változását. Ezért valószínűsíthetően a szabadgyökök által okozott oxidatív károsodás és a gyulladásos válaszrekció egymástól független mechanizmussal alakul ki [67]. A kimerítő aerob jellegű fizikai erőkifejtés jellemzően oxidatív és gyulladásos stresszválaszt idéz elő, amely állapot hasonló a miokardiális infarktust, az ischémiás stroke-ot vagy bármilyen sérülést követő stressz reakcióhoz [68, 69, 70]. Ezért az aerob erőkifejtés jól kontrollálhatóan és viszonylagosan non-invazív módon jó modell az antioxidáns pótlás hatás tanulmányozására az akut oxidatív és gyulladásos folyamatokra. Senturk és munkacsoportja [71] az antioxidáns vitamin pótlás hatását vizsgálta a hematológiai és a hemoreológiai változásokra akut fizikai erőkifejtést (vita maxima kerékpár ergométeres terhelés) követően edzett és edzetlen személyeknél. Az antioxidáns pótlás 2 hónapig tartott a következő napi bevitellel: A vitamin (50 mg β-karotin), C vitamin (1000 mg aszkorbinsav), E vitamin (800 mg α-tokoferol). A vitamin pótlást megelőzően edzett személyeknél a fizikai erőkifejtést követően a granulocita százalékban valamint a lipidperoxidáció mértékében volt szignifikáns emelkedés a nyugalmi szinthez képest. Ugyanebben a periódusban edzetleneknél terhelés hatására értékelhetően emelkedett az aggregációs index, a vörösvértest alaki változása, a lipidperoxidáció szintje, a granulocita százaléka valamint a fehérvérsejtszám. A vitamin pótlást követően terhelés hatására sem edzetleneknél, sem edzetteknél szignifikáns változás egyik mutatóban sem volt kimutatható. Az antioxidáns enzimek (SOD, CAT, GPX) nyugalomban mért aktivitása a vitamin pótlást megelőzően és a vitamin pótlás után is magasabb volt az edzetteknél, mint az edzetleneknél. A multivitamin pótlás tehát előnyös 24
lehet a rendszeres edzést nem végző egyéneknél az akut fizikai erőkifejtéssel összefüggésbe hozható káros hatások megelőzésére (kedvezőtlen szöveti perfúzió, limitált vazodilatáció, kedvezőtlen vaszkuláris hemodinamikai tényezők). 2.3.3. Laktátképződés Az irodalomban eltérő adatokat közöltek a laktát ionok és a terhelés közbeni szabadgyök termelésre vonatkozóan. Groussard és munkatársai [72] a laktát ion pro- illetve antioxidáns hatását vizsgálták in vitro különböző koncentrációban és különböző metodikával. Elektron spin rezonancia (ESR) spektroszkópia segítségével a laktát ionok közvetlen scavengelő képességét tanulmányozták a szuperoxid anionok és a hidroxil gyökök hatására. A sejtmembrán lipidperoxidációjának modellezésére zsírsav micellumokat használtak. Végül patkány májsejt kultúrában előidézett oxidatív stresszre vizsgálták a laktát ion hatását. Az ESR módszer segítségével mindkét szabadgyökre semlegesítő képességet mutatott a laktát ion. Hasonlóképpen a laktát ion gátolta a májsejt kultúrában a lipidperoxidáció mértékét. Mindkét hatás összefüggést mutatott a laktát koncentrációval. A zsírsav micella modellben nem volt megfigyelhető a laktát ion gátló hatása. Ezek az eredmények azt jelzik, hogy a laktát ionok jelenlétében megelőzhető a lipidperoxidáció a szuperoxid anionok és a hidroxil gyökök eliminációjával, azonban a lipid gyököket nem képes semlegesíteni. Ez nem meglepő tulajdonság, hiszen a laktát ion nem zsíroldékony komponens, így a lipid gyökök eliminálásában nem tud részt venni. Mindez tehát azt mutatja, hogy a laktát ion egy lehetséges antioxidáns hatású vegyület a szervezetben, bár kisebb a reakciósebességi állandója, mint a kataláznak vagy az aszkorbinsavnak. A laktát ion szabadgyök közömbösítő hatása a plazmában kisebb mértékű, mint vizes oldatban. Mindez abból adódik, hogy a plazma önmagában is antioxidáns hatással rendelkezik a jól ismert antioxidáns tulajdonságú vegyületek miatt. Ezért az alacsony koncentrációban jelen levő tejsav (1-15 mmol/l) csak részben tudja kifejteni a közömbösítő hatását ezen egyéb antioxidáns hatású vegyületek mellett. Nagyobb laktát ion koncentrációnál (30-60 mmol/l) ez a hatás fokozódik. Nagy intenzitású, rövid időtartamú erőkifejtéseknél a vázizomzatban ilyen nagyságrendű a laktát koncentráció. Ilyen erőkifejtések esetében a sejteknek a tejsav valószínűsíthetően védelmet nyújt a szabadgyökök által okozott oxidatív sérülésekkel szemben. 25
A fizikai erőkifejtés során termelődő tejsav összefügg az acidózis kialakulásával, amely háromféle mechanizmussal prooxidáns tulajdonságú [72, 73]. Először is a hidrogén-ion koncentráció emelkedése fokozza a szuperoxid anion diszmutációját hidrogén-peroxiddá, amelyből a Fenton reakcióban nagy toxicitású hidroxil gyök képződik. Másodszor acidózis során a hidrogén-ionok és a szuperoxid anion rekaciójával jóval reaktívabb és lipidoldékonyabb gyökös vegyület, hidroperoxil gyök képződhet. Harmadszor a szöveti acidózis hatására beindul a szabadgyökök termelődése a fehérjéhez kötött vas disszociáció fokozódása miatt [72]. Valószínűsíthető, hogy az oxidatív stressz az acidózissal hozható összefüggésbe és nem a laktát ionok termelődésével [74]. Korábbi eredmények [73, 75] is ezt a hipotézist támasztják alá, mely szerint a tejsav fokozza a lipidperoxidációt és nem a laktát ion önmagában. A fizikai sportterheléssel összefüggő laktátképződés befolyásolja az antioxidáns enzimek funkcióját. A fokozott tejsavképződés és a lassú elimináció a NAD és a NADP képződését csökkenti és ezáltal a sejtek kevesebb antioxidáns enzim szekréciójára képesek. A magas tejsavszinttel járó izomláz, izomfájdalom, gyulladás a csökkent szabadgyök eliminációval és a terhelés indukálta oxidatív stresszel is magyarázható. 2.3.4. Lipid- és fehérje peroxidáció A lipid és fehérje peroxidáció a membrán fehérjék és lipidek károsodása révén a membrán permeábilitás fokozódását és a kalcium transzport csökkenését okozza a szarkoplazmás retikulumban. Watson és munkatársai [76] 17 jól edzett nagy állóképességű férfi sportolónál az antioxidáns hiányos étrend hatását vizsgálták az oxidatív stressz, az antioxidáns védelmi rendszer valamint a teljesítőképesség alakulására. Az első terheléses vizsgálatot megelőzően a sportolók a szokásos, antioxidánsokban gazdag étrenden éltek, majd a második vizsgálatot megelőzően két héten át antioxidánsokban hiányos étkezést folytattak. Az oxidatív stresszt jelző marker vegyület (F 2 -izoprosztán) koncentrációja értékelhetően nagyobb volt a terhelést követően az antioxidánsokban hiányos táplálkozás 26
esetében, az antioxidánsokban gazdag étrendhez képest. Az F 2 -izoprosztánok az in vivo lipidperoxidációt jelző biomarkerek, amelynek alsó kimutatási határa a pikogram tartományba esik [77]. Ezen vegyületek az arachidonsav nem enzimatikus, szabadgyökök által katalizált oxidációs folyamatának specifikus végtermékei [78]. A szervezet teljes antioxidáns kapacitása valamint a keringésben levő antioxidánsok koncentrációja nem változott szignifikánsan a két időszakot figyelembe véve. A nagy intenzitású, rövid időtartamú erőkifejtés nagy mennyiségű exogén antioxidánst igényel, amely megfelelő védelmet nyújt az oxidatív stressz ellen. Mindezt az antioxidánsokban gazdag étrend fedezni tudja, ezért az antioxidáns tartalmú táplálékkiegészítők alkalmazása nagy intenzitású, rövid ideig tartó erőkifejtések mellett nem javasolt, kivéve azokat a sportolókat akik hosszú időn keresztül alacsony antioxidáns tartalmú étrenden éltek. Özbay és munkatársa [79] török populációban (n=257) az antioxidáns enzimaktivitást és a lipidperoxidációt vizsgálta a korral, nemmel, fizikai aktivitással és a dohányzással összefüggésben. A szérum MDA szintje a korral nő, tehát a lipidperoxidáció mértéke az öregedéssel fokozódik. A GPX aktivitása szignifikánsan csökken terhelés hatására, ugyanakkor értékelhetően magasabb az edzetteknél, mint a kontroll csoportban. A SOD aktivitása a korral csökken, dohányosoknál és akut erőkifejtés hatására alacsonyabb lesz, edzettebbeknél magasabb, mint edzetleneknél. Akut erőkifejtés, dohányzás valamint öregedés hatására az antioxidáns enzimaktivitás szignifikáns csökkenését és a lipidperoxidáció emelkedését figyelték meg, ugyanakkor a nemek között nem volt kimutatható értékelhető különbség. Ilhan és munkatársai [80] a tiobarbitursav reaktív vegyületeit (TBARS) vizsgálták sportolóknál (n=60) aerob, anaerob valamint kombinált (aerob+anaerob) terheléseket megelőzően és azt követően. Az aerob+anaerob terhelést követően értékelhetően nagyobb volt az oxidatív stresszhatás az aerob típusú terheléshez képest. A férfi és a női sportolók összehasonlítása során megállapították, hogy a nők ugyanolyan terhelésre szignifikánsan kisebb mértékű oxidatív stresszel reagáltak, mint a férfiak. Mindezekből következően az anaerob jellegű edzés nagyobb mértékben igénybe veszi a szervezet antioxidáns kapacitását, bár e tanulmány szerint az aerob-anaerob erőkifejtés ettől még 27
kifejezettebben érinti a reaktív oxigén vegyületeket elimináló rendszereket. Ez a hatás nagy valószínűséggel a terhelést követő rövid idejű restitúcióval magyarázható. 2.3.5. Adaptáció A rendszeres testedzés, sporttevékenység során, mind az állati, mind az emberi szervezetben adaptációs folyamat működik. Az oxidatív stresszhez való alkalmazkodás is az adaptáció egyik része, amely végül is lehetővé teszi, hogy a szervezet molekuláris szinten alkalmazkodik a terhelés, illetve a teljesítmény kívánta követelményekhez. Az élettani és biokémiai adaptáció részleges védelmet nyújt a szervezetet ért oxidatív stressz károsító hatásaitól. Biztosítja az adott szervezet számára az antioxidáns enzimek megfelelő aktivitását. Természetesen az adaptációt a gyökkötő vitaminok, nyomelemek segítik. Metin és munkatársai [81] fiatal férfi labdarúgók (n=25) vörösvértest SOD aktivitását, a plazma MDA-szintjét, valamint néhány nyomelem (Zn, Cu) koncentrációját hasonlították korban és nemben megfelelő kontroll személyek adataival. Megállapították, hogy a lipidperoxidációra jellemző MDA koncentráció a sportolóknál szignifikánsan alacsonyabb, mint a kontroll személyeknél, azonban a SOD aktivitás magasabbnak bizonyult a futballistáknál. A futballisták antioxidáns kapacitása a rendszeresen végzett edzésmunka során jelentősen kedvezőbb az inaktív kontroll személyekhez képest. A plazma réz koncentráció, a vörösvértest szám és a haemoglobin koncentráció a sportolóknál értékelhetően alacsonyabb volt, mint a kontroll személyeknél. Az edzettségre jellemző relatív aerob kapacitás értéke (VO 2max ) értéke és a SOD aktivitás között pozitív korrelációt lehetett kimutatni. A tanulmány eredménye jelzi, hogy a rendszeresen végzett fizikai erőkifejtés előnyös hatású az oxidatív stressz csökkentése szempontjából, amelyet a lipidperoxidációs végtermékek csökkenése valamint a szuperoxid diszmutáz aktivitásának növekedése jelez. Jenkins és munkatársai [82] kimutatták humán és állatkísérletekben is az oxigénfelvétel és az antioxidáns védelmi rendszer (CAT, SOD) szoros összefüggését. Hasonló vizsgálatokban kimutatták [83], hogy a szérum szabadgyök elimináló képessége jól korrelál a maximális oxigénfelvétellel. 28