Zárójelentés A kutatás fő célkitűzése a β 2 agonisták és altípus szelektív α 1 antagonisták hatásának vizsgálata a terhesség során a patkány cervix érésére összehasonlítva a corpusra gyakorolt hatásokkal. A) A cervix nyújthatóságának (rezisztencia) állatkísérletes meghatározása terhes és nem terhes patkányban. A nem terhes és terhes állatokból a cervix szövetminták kimetszését követően izomgyűrűket preparáltunk és izolált szervfürdőbe helyeztük. A preparátumokat lépcsőzetesen 1 g-onként feszítettük és minden egyes lépésben mértük a feszítésre kapott relaxációs választ (1. ábra). A kezdeti, valamint a relaxációs időt (5 perc) követő feszülési értékeket koordináta rendszerben ábrázoltuk és egyenest illesztettünk rá. Az egyenes meredekségével arányos a cervix rezisztenciája (2. ábra). 1. ábra. Cervix rezisztencia vizsgálat reprezentatív regisztrátuma
feszülés 5 perc múlva (g) 13 12 11 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0 0.00 1.25 2.50 3.75 5.00 6.25 7.50 8.75 10.00 11.25 12.50 feszítés (g) nem terhes 15 napos 18 napos 20 napos 21 napos 22 napos 2. ábra Cervix rezisztenciát jellemző regressziós egyenesek nem terhes és terhes patkányban. Az egyenesek meredeksége arányos a cervix rezisztencia értékével. B) Adrenerg hatóanyagok hatása a corpusra és cervixre Az eredményeink alapján megállapítható, hogy a terbutalin a terhesség 18. napjától a cervix rezisztenciáját fokozza (3. ábra). kontroll terbutalin 10-6 M meredekség 1.05 1.00 0.95 0.90 0.85 0.80 0.75 0.70 0.6 ns 0.0 nem terhes 18 napos 20 napos 21 napos 22 napos terhességi napok 3. ábra A terbutalin patkány cervix rezisztenciát fokozó hatása A terbutalin nyújtással szembeni rezisztenciát fokozó hatása nem terhes cervixen nem mutatható ki, míg a terhesség 18. napjától jelentős fokozás tapasztalható
A mechanizmus feltárása érdekében meghatároztuk a β 2 adrenerg receptor fehérje változást (Western blot) és azt találtuk, hogy a 18. napon szignifikáns emelkedés mutatható ki, mely a terminusig fennáll. A fokozott receptor szintézist PCR technikával is igazoltuk. GTPγS kötési vizsgálatokkal igazoltuk, hogy terbutalin hatására a cervix β 2 adrenerg recptorainak G-protein kapcsoltsága csökken (4. ábra), mely magyarázza a cervix rezisztenciájának növekedését. [ 35 S]GTP S kötés stimulációja (%) 105 100 95 90 nem terhes 18 napos 20 napos 21 napos 22 napos 85 basal 10-10 10-9 10-8 10-7 10-6 terbutalin koncentráció (M) 4. ábra Az aktivált G-protein változása terbutalin hatására patkány cervix preparátumon A nem terhes cervixben lényegében nincs kapcsoltság a receptor és a G-protein között, míg a 18. naptól a terhesség végéig a terbutalin dózisfüggően csökkenti az aktivált G-protein mennyiségét. A terbutalin ezen hatása teljesen ellentétes más szervek símaizomra gyakorolt eddig ismert hatásával. A feltárt jelenség a klinikai tokolízis során jótékony hatású lehet, amennyiben az állatkísérletben igazolt mechanizmus humán vonatkozásban is érvényesül. C) Terbutalin hatása a corpus kontraktilitásra Eredményeink alapján a corpus terbutalin érzékenysége csökken a terhesség előrehaladtával (5. ábra), melynek molekuláris szintű magyarázata szintén a G-protein kapcsoltságban keresendő (6. ábra).
gátlás (%) 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 10-9 10-8 10-7 10-6 10-5 koncentráció (M) 15 nap 18 nap 20 nap 22 nap 5. ábra A terbutalin elektromos erőtér stimulált uterusz kontrakciót gátló hatása A terhesség előrehaladtával a terbutalin maximális hatása folyamatosan csökken, ezzel párhuzamosan a dózishatás görbék egyre inkább jobbra tolódnak, mely szintén jelzi a hatékonyság csökkenését. [ 35 S]GTP S kötés stimulációja % 26 24 22 20 18 16 14 12 10 8 6 4 2 0-2 -4-6 -8-10 -12 basal 10-10 10-9 10-8 10-7 10-6 10-5 terbutaline koncentráció (M) 15 nap 18 nap 20 nap 22 nap 6. ábra A terbutalin aktivált G-protein befolyásoló hatása terhes patkány corpus preparátumon A terhesség előrehaladtával a terbutalin G-protein aktiválódást kiváltó hatása mindinkább jobbra tolódik, a 22. napon pedig kifejezett aktivált G-protein szint csökkenés figyelhető meg.
A corpusban a cervix-szel ellentétben betamimetikumok hatására a G-protein kapcsoltság fokozódik, melynek eredményeképpen a corpus relaxál. Ennek mértéke azonban markánsan csökken a terminushoz közeledve, mely megmagyarázza a betamimetikumra adott csökkent farmakológiai reaktivitást. Ez a jelenség magyarázatot adhat a betamimetikumok klinikumban észlelt hatástalanságára is. Mivel az adrenerg rendszer a terhes uteruszban a szteroid hormonok szabályozása alatt áll, további kísérleteinkkel igazoltuk, hogy a terhesség 15. napjától adott gesztagén szubsztitúció szignifikánsan megnöveli a corpus beta agonista érzékenységét, azaz fokozza a G-protein kapcsoltságot (7.-8. ábra). [ 35 S]GTP S kötés stimulációja (%) 120 110 100 90 kontroll progeszteron kezelt basal 10-10 10-9 10-8 10-7 10-6 10-5 terbutalin koncentráció (M) 7. ábra Progeszteron kezelés hatása a terbutalin aktivált G-protein szintet befolyásoló hatására 22 napos terhes corpus preparátumon A 7 napos progeszteron előkezelés megfordította a terbutalin hatását és jelentős mértékben fokozta a terbutalin G-proteint stimuláló hatását.
100 90 80 70 progeszteron kezelt nem kezelt gátlás (%) 60 50 40 30 20 10 0 10-10.0 10-9.5 10-9.0 10-8.5 10-8.0 10-7.5 10-7.0 10-6.5 10-6.0 10-5.5 10-5.0 terbutalin koncentráció (M) 8. ábra Progeszteron kezelés hatása a terbutalin corpus relaxáló hatására 22 napos terhes patkányban in vitro A 7 napos progeszteron kezelés a terbutalin kontrakciót gátló dózishatás görbéjét balra tolta, a mximum értékét pedig fokozta. A feltárt mechanizmusnak klinikai-terápiás jelentősége is lehet a jövőben. Ennek érdekében vizsgálatainkat kiterjesztettük in vivo patkány koraszülés modellre is, melyben a gesztagén szubsztitúció potencírozó hatását bizonyítottuk (8. ábra). szülés időpontja a mifepriszton kezeléstől számítva (h) 32 31 30 29 28 27 26 25 24 23 22 21 20 n.s. n.s. nem-kezelt progeszteron salmeterol salm+prog salm.+17 HPcap. 8. ábra A gesztagén-betamimetikus kombináció hatása patkány koraszülés modellen Sem a gesztagén, sem a betamimetikus kezelés önmagában nem nyújtotta ki az indukált koraszülés időpontját, ugyanakkor a salmeterol kombinációja progeszteronnal és 17-hidroxiprogeszteron-kapronáttal mintegy 5-6 órával késleltette a koraszülést, ami ebben a modellben igen jelentős hatásnak számít.
Mindezen experimentális evidenciák elégségesnek bizonyultak arra, hogy a gesztagén + betamimetikum kombinációs terápia humán kivizsgálására javaslatot tegyünk a Richter G. RT-nek. D) α 1 -adrenerg receptor altípus szelektív antagonisták hatása a cervix rezisztenciára terhes patkányban A program egyik fő célja annak bizonyítása volt, hogy az α 1 -adrenerg receptor blokkolók ún. uterusz szelektív hatásai (corpus relaxáció, cervix rezisztencia fokozás) új támadáspontot jelenthetnek a koraszülés terápiájában. Az altípus szelektív blokkolók tokolitikus hatását korábban kimutattuk és publikáltuk. A programnak megfelelően az altípus szelektív blokkolók hatását vizsgáltuk a cervix rezisztenciára a korábban kidolgozott in vitro módszerünk segítségével. Meghatároztuk az α 1 -adrenerg receptorok altípusainak mrns expressióját PCR technikával. Megállapítottuk, hogy az α 1A és α 1B mrns expresszió jelentős, még az α 1B expressziója elhanyagolható. Megvizsgálva az altípusszelektív antagonisták cervix rezisztenciát fokozó hatását, azt találtuk, hogy az α 1A antagonista WB4101 szignifikánsan fokozta a cervix nyújtással szembeni rezisztenciáját a terhesség 20-22. napján (9. ábra). ko n tro l W B 4 1 0 1 1.0 ns meredekség 0.9 0.8 ns 0.7 0.6 0.4 0.2 0.0 ne m te rhe s 1 8. nap 2 0. nap 2 1. nap 2 2. nap te rh e s s é g i n a p o k 9. ábra A WB4101 α 1A adrenerg receptor szelektív antagonista hatása a cervix rezisztenciára patkányban A vegyület a terhesség 20. napjától szignifikánsan fokozta a patkány cervix nyújtással szembeni rezisztenciáját.
Ezzel további bizonyítékot szolgáltattunk arra, hogy az α 1 altípus szelektív antagonisták potenciális tokolitikumok, melyek a corpus relaxációval egyidőben képesek a cervix érési folyamatait lassítani. Az α 1B és α 1D antagonisták nem bizonyultak hatásosnak e tekintetben. A hatásmechanizmussal kapcsolatban kimutattuk, hogy a WB4101 GTPγS kötési vizsgálatban fokozza az aktivált G-protein mennyiségét (10. ábra), melyet a vegyület inverz agonista hatásával magyarázhatunk. WB 4101 [ 35 S]GTP S kötés stimulációja (%) 120 110 100 22. nap 21. nap 20. nap 18. nap nem terhes basal 10-10 10-9 10-8 10-7 10-6 10-5 koncentráció (M) 10. ábra A WB4101 α 1A adrenerg receptor szelektív antagonista hatása a G-protein aktivációra patkány cervix preparátumon A vegyület a terhesség 20. napjától jelentős mértékben fokozta a keletkező aktivált G-protein mennyiségét.