Hippocrates and Aristotle recognized that blood clots

Basic Science for Clinicians Thrombin Generation in Hemorrhage Control and Vascular Occlusion Kenneth G. Mann, PhD Downloaded from http://circ.ahajournals.org/ by guest on April 20, 2017 Hippocrates and Aristotle recognized that blood clots outside the body, but it was not until 1720 that John Louis Petit recognized that control of hemorrhage after amputation was associated with the blood clotting process. 1 One hundred thirty-eight years later, Rudolph Virchow formulated his postulates regarding clots in venous thrombosis. 2 The association of blood clots with acute arterial occlusion was advanced by James B. Herrick 3 in 1912, but the significance of blood clotting in acute arterial events was only resolved by studies in the 1980s. 4 6 As a consequence, our knowledge base has largely been driven by studies of the hemostatic process that have been extrapolated to describe the pathological occlusive clotting events in venous and arterial thrombosis. Vascular integrity and blood fluidity are maintained by complex interplay between procoagulant and anticoagulant properties provided by the blood, the vasculature, and subvascular elements. Our knowledge of the inventory and connectivity between the blood-supplied components of the hemostatic and anticoagulant matrix was initially provided by genetic accidents that produced hemostatic and thrombotic defects, most of which have been ratified by experiments conducted with transgenic mice. Additional blood and vascular elements were discovered by use of in vitro assays that identified new entities and required additions to the coagulation/anticoagulation circuits. Pathways for the clotting process were described that were dependent on the plasma coming into contact with a foreign surface (the intrinsic pathway) 7 9 or that were associated with the introduction of tissue components (now identified as membrane displayed tissue factor [TF]) into the plasma (the extrinsic pathway; Figure 1A). 10,11 However, the absence of bleeding pathology with individuals or transgenic mice that display molecular abnormalities in the factor (F) XII 12 and high-molecularweight kininogen 13 components of the contact enzyme (dotted box in Figure 1) led to the conclusion that this catalyst is not in the primary pathway that maintains hemostasis. Thus, although the contact activation catalyst most likely does not have a role in hemostasis, recent data obtained with FXII knockout animals 12 and in human inflammatory syndromes 14 suggest this pathway may be relevant in some thrombotic disorders. The coagulation process is strictly regulated by stoichiometric and dynamic inhibitory processes; the former are primarily a consequence of antithrombin and tissue factor pathway inhibitor (TFPI), the latter a consequence of the dynamic protein C (PC) system, the function of which is directly linked to the generation of thrombin (Figure 1B). Antithrombin inhibits all the serine proteases of the coagulation system, with its function accelerated by heparin and by heparan sulfate proteoglycans 15 expressed on the vascular endothelium. TFPI is a Kunitz-type inhibitor 16 that can inhibit both FXa and FVIIa-TF independently; however, its primary target is the FXa-FVIIa-TF product complex. 17 TFPI is a very high-affinity inhibitor, but is present in blood at very low concentrations and on the vascular endothelium, from which it is secreted by heparin. 18 The dynamic PC system integrates endothelial cell thrombomodulin 19,20 and its cofactor, the endothelial PC receptor (EPCR), with thrombin generation. 21,22 The thrombomodulin- EPCR-thrombin vascular membrane bound catalyst activates plasma PC to the enzyme-activated protein C. 21 The anticoagulant activated PC cleaves and inactivates FVa and FVIIIa. 23,24 Antithrombin acts in synergy with TFPI and the PC system to provide a more potent anticoagulant effect. 25,26 The combination of the stoichiometric and dynamic inhibitors produces go/no-go thresholds for the clotting process, which ensures that the triggering insult is of sufficient magnitude to warrant initiation of a potentially thrombotic response. Hemostasis and Vascular Occlusion From the biochemical perspective, common molecular and cellular events are associated with thrombin generation whether involved in protective or pathological clotting processes. However, it is also clear that the biomechanics of flow and the vascular architecture and composition are not equivalent in the venous and arterial circuits. Furthermore, in hemorrhage control, the source of tissue factor is extravascular, whereas it is intravascular in thrombosis. Nonetheless, for all coagulation processes, the essential enzyme, produced by the choreography of the blood and vascular components, is thrombin, which is produced from prothrombin as a consequence of 3 surface-bound catalysts (Figure 1A). In the From the Department of Biochemistry, University of Vermont, Colchester, VT. The online-only Data Supplement is available with this article at http://circ.ahajournals.org/cgi/content/full/124/2/225/dc1. Correspondence to Kenneth G. Mann, PhD, Department of Biochemistry, Colchester Research Facility Room 235, University of Vermont, Colchester, VT 05446. E-mail kenneth.mann@uvm.edu (Circulation. 2011;124:225-235.) 2011 American Heart Association, Inc. Circulation is available at http://circ.ahajournals.org DOI: 10.1161/CIRCULATIONAHA.110.952648 225

226 Circulation July 12, 2011 Downloaded from http://circ.ahajournals.org/ by guest on April 20, 2017 Figure 1. A, Diagram illustrating the surface-bound complex enzymes of the intrinsic and extrinsic coagulation pathways. The surface-bound complex of the intrinsic pathway is outlined by a dashed line. Amplification by thrombin feedback activations of factor (F) V, FVIII, FVII, and FXI is also illustrated. B, Coagulation system regulation by the stoichiometric inhibitors (antithrombin and tissue factor pathway inhibitor), which downregulate the system by binding the serine proteases, and the dynamic activated protein C (APC) system, which causes proteolytic inactivation the cofactors (FVa and FVIIIa). HMW indicates high molecular weight; PC, protein C; AT, antithrombin; and TFPI, tissue factor pathway inhibitor. Reproduced from Mann 10 with permission of the publisher. Copyright 2003, American College of Chest Physicians. present review, the initial focus is on the process of hemorrhage control, with more speculative extensions to clotting in venous and arterial circuits. Good Clots: Hemorrhage Control Hemorrhage control involves extravascular thrombin generation that leads to a stable fibrin-platelet dam that stops blood flow. The environment of the clot is primarily extravascular tissue that elicits thrombin formation after a vascular perforation by platelet adhesion, secretion, and aggregation via interactions with connective tissue collagen and bloodderived von Willebrand factor. 27,28 Thrombin production is initiated with the presentation of plasma FVIIa, a biologically inactive serine protease, 29 to extraluminal subendothelial TF as a consequence of the vascular perforation (Figure 2A). The FVIIa-TF complex that generates the initial burst of FXa is primarily regulated by TFPI. The FVIIa-TF complex activates 2 substrates, FX and FIX, to form their respective products, FXa and FIXa 31 33 (Figure 1A). Small amounts of FXa in combination with platelet and tissue membrane surfaces activate a small amount of prothrombin to produce thrombin. 34 Thrombin amplifies its own generation in the adverse environment of overwhelming inhibitor concentrations by activating additional platelets 35,36 and the procofactors (FV and FVIII) 37,38 to produce the cofactors (FVa and FVIIIa) essential to the formation of these membrane-bound

Mann Good and Bad Clots 227 Downloaded from http://circ.ahajournals.org/ by guest on April 20, 2017 Figure 2. Schema of a 2-compartment model of the regulation of tissue factor (TF) initiated blood coagulation. A cross section of a blood vessel showing the luminal space, endothelial cell layer, and extravascular region is presented at the site of a perforation. The blood coagulation process in response is depicted in 4 stages. TF VIIa indicates TF-factor VIIa complex; Xa Va, prothrombinase complex; VIIIa IXa, intrinsic factor Xase; HS ATIII (IIa or Xa), ATIII endothelial cell heparan sulfate proteoglycan complex bound to thrombin or factor Xa; and TM IIa PC, protein C bound to thrombomodulin-thrombin. A, Perforation results in delivery of blood, and with it circulating factor VIIa and platelets, to an extravascular space rich in membrane-bound TF. Platelets adhere to collagen and von Willebrand factor associated with the extravascular tissue, and TF binds factor VIIa, which initiates the process of factor IX and factor X activation. Factor Xa activates small amounts of prothrombin to thrombin, which activates more platelets and converts factor V and factor VIII to factor Va and factor VIIIa. B, The reaction is propagated by platelet-bound intrinsic factor Xase and prothrombinase, with the former being the principle factor Xa generator. Initial clotting occurs, and fibrin begins to fill the void in cooperation with activated platelets. C, A barrier composed of activated platelets laden with procoagulant complexes and enmeshed in fibrin scaffolding is formed. The reaction in the now filled perforation is terminated by reagent consumption, which attenuates further thrombin generation, but functional procoagulant enzyme complexes persist because they are protected from the dynamic inhibitory processes found on the intravascular face. D, View downstream of the perforation. Enzymes escaping from the plugged perforation are captured by antithrombin-heparan complexes, and the protein C system is activated by residual thrombin binding to endothelial cell thrombomodulin, which initiates the dynamic anticoagulant system. These intravascular processes work against occlusion of the vessel despite the continuous resupply of reactants across the intravascular face of the thrombus. Reprinted from Orfeo et al30 with permission of the publisher. Copyright 2005, American Society for Biochemistry and Molecular Biology catalysts (Figure 2B). The membrane binding sites for the intrinsic factor Xase (FVIIIa-FIXa),39 which becomes the major FX activator and prothrombinase (FVa-FXa), include those expressed on the activated platelets, damaged cells at the site of injury, and other peripheral blood cells.40,41 The complex catalysts are 105-fold to 107-fold more active than their constituent serine proteases, and their membrane binding localizes their reactivity to the site of vascular injury.40,42 The formation of these surface-bound catalysts leads to local explosive generation of thrombin in the blood leaked into extravascular space. These catalysts anchored at the wound site are protected from inactivation by antithrombin. The catalysts continue to build up in the wound site as more platelets and plasma substrates are delivered by blood leaking through the site. The -thrombin end product of the coagulation reaction system cleaves fibrinopeptides A and B from fibrinogen, which leads to expanding fibrin clot formation that is stabilized by the concomitant thrombin activation of FXIII to FXIIIa, which produces cross-links between the aggregated fibrin monomers. The dynamics of fibrin formation aggregation and cross-linking are tightly integrated and lead to a stable clot of sufficient mechanical strength to prevent blood loss.43 45 The reaction continues to proceed as long as more reactants are delivered to the wound site. The intravascular/extravascular 2-compartment reaction system will produce thrombin, fibrin, and aggregated platelets until the extravascular compartment becomes starved of reactants or after closure of the wound site (Figure 2C) by the

228 Circulation July 12, 2011 Downloaded from http://circ.ahajournals.org/ by guest on April 20, 2017 Figure 3. A, Numeric simulations of the earliest events leading to catalyst formation with a tissue factor insult. The scale is logarithmic and illustrates the initial activation over time of factor (F) V, FVIII, and platelets by the thrombin initially produced (by FXa) in the reaction. B, The generation of thrombin, FVa, and FVIIIa and platelet activation over the entire course of the reaction. The thrombincatalyzed feedback amplifications that resulted in enhanced platelets and FVIII activation associated with the generation of increased amounts of thrombin by the prothrombinase complex are shown in this numeric simulation. thrombus. Coagulant enzymes that escape from the wound site by complex dissociation are inactivated by antithrombin. Thrombin downregulates its intravascular production through activation of the PC system. Thrombin binds to endothelial cell thrombomodulin, and this thrombin-thrombomodulin complex, aided by EPCR, activates plasma PC to become activated PC. Activated PC cleaves FVa and FVIIIa, which inactivates the cofactors 24,46 (Figure 2D). Systemic thrombotic occlusion does not occur because of the potent negative regulatory elements provided by the vascular wall and plasma. Thrombin also initiates secretion of plasminogen activators that initiate clot dissolution concurrent with vascular repair. 47 The procoagulant reaction is multiphasic and can be divided operationally into 3 segments (initiation, propagation, and termination), which are presented as an animated cartoon here, as well as on YouTube. 48,49 The latter occurs throughout the entire process. The events that occur during the initiation phase include activation of platelets, cofactors, and serine proteases that form the membrane assembled complexes that drive most thrombin generation during the propagation phase. The initiation-phase activation events are illustrated by a numerically modeled time course 50 (Figure 3A) that shows the dynamics of initial thrombin formation and the activation of platelets, FV, and FVIII. These processes involve thrombin cleavage of protease-activated receptors 1 and 4, 36,51 which activate platelets, and cleavage of the procofactors FV and FVIII, which release activation peptides and provide the cofactors, ie, FVa and FVIIIa. This interval of the reaction is driven by the tiny amounts (10 17 to 10 14 mol/l) of thrombin (Figure 3A) produced by FXa during the initiation phase. The activated platelets provide specific (and presently uncharacterized) receptor sites for the FVIIIa-FIXa and FVa- FXa complexes. The overall time course for presentation of the procoagulant catalysts is presented in Figure 3B. Enhanced activation occurs because of accelerated thrombin formation by prothrombinase, which is 10 5 times more active than unbound FXa, with amplification of FXa generation via FVIIIa-FIXa that results in accelerated thrombin formation. Furthermore, when bound in complex with FVIIIa and FVa, FIXa and FXa are not accessible to antithrombin. In both whole blood and plasma, fibrinogen clotting 43,52 occurs at the intersection between the initiation and propagation phases, when 5% of the prothrombin is converted to thrombin. Thus, clot-based assays, ie, the activated clotting time, the prothrombin time, and the partial thromboplastin time, exclude 95% of the reaction. Most clotting analyses are conducted in a closed system in which the reactants present at the beginning of the reaction are largely consumed in the resulting procoagulant and anticoagulant processes. In contrast, during hemorrhage, flow continues until a coagulant platelet-fibrin dam is established. Insights into the continuity of the process with flow have been provided by experiments in which new supplies of blood were made available to an apparently quiescent TFinitiated reaction after no additional thrombin-antithrombin was accumulating, ie, in resupply experiments. 53 The addition of a new blood supply/reactants to a quiescent thrombus results in rapid and more extensive thrombin generation. This overresponse is a consequence of the platelet-bound procoagulant complex enzymes resident in the original thrombus generating more products from the substrates present in the newly added blood. In hemophilia, the absence of intrinsic factor Xase (FVIIIa-FIXa) prevents this accelerated FXa generation, and lesser amounts of thrombin are produced at a slower rate. As a consequence, an imperfect cross-linked fibrin clot is formed with inadequate strength to block blood flow. 54,55 A numeric simulation of consecutive resupplies of electronic blood is illustrated in Figure 4. 30 In this case, total thrombin is plotted versus time for an experiment in which fresh aliquots of plasma are added after the initial TF reaction

Mann Good and Bad Clots 229 Figure 4. A numeric simulation of consecutive resupply of electronic plasma reactants to a quiescent thrombus at 790, 1200, and 1800 seconds, which results in a more intense thrombin generation and provides higher concentrations of prothrombinase (Xa Va). Reprinted from Orfeo et al 30 with permission of the publisher. Copyright 2005, American Society for Biochemistry and Molecular Biology Downloaded from http://circ.ahajournals.org/ by guest on April 20, 2017 becomes quiescent with respect to active thrombin. Each new resupply produces a faster rise of thrombin activity to a higher level as a consequence of the increased catalyst concentrations generated. The data show that when provided with more substrate, the catalysts present in the quiescent thrombus will generate more catalysts that provide more intense thrombin generation, a process that will continue to expand until the leak is sealed. Notably, no additional TF is required, and the reaction is no longer dependent on the initial TF trigger that began the thrombin-generating process. 53 Thus, hemorrhage control can be described as a 2-compartment model for TF-initiated blood coagulation. Vascular perforation and blood extravascular flow lead to platelet adhesion, secretion, and aggregation. Plasma FVIIa binds extravascular TF, which leads to the generation of the procoagulant complexes and thrombin. In an open system, flow will continue to supply substrates to the reactive and growing thrombus until the vascular leak is plugged or the blood supply is exhausted. The reaction system is then deprived of additional substrates, and the proteases are ultimately neutralized by antithrombin. Any reactive enzyme components that escape downstream are inactivated by the excess of stoichiometric inhibitors and vascular thrombomodulin, which combines with surplus thrombin to activate PC to activated protein C, which inactivates FVa and FVIIIa. Bad Thrombin Generation: Venous Thrombosis Virchow postulated elements that are associated with the formation of occlusive venous clots, including hypercoagulable elements within the blood, endothelial injury or dysfunction, and alterations of blood flow. 2 Clinical experience with venous thrombosis endorses the use of the anticoagulants heparin and warfarin, which serve to enhance the antithrombin neutralization process 15 or impair the biosynthesis of the procoagulant zymogens. 56 In general, platelet inhibitors are ineffective. Congenitally acquired plasma risk factors for venous thrombosis are FV Leiden and PC and protein S deficiencies. 57 59 These deficiency states are not ordinarily associated with arterial events. Thus, the venous occlusive pathologies associated with these 3 congenital deficiencies clearly suggest that the impaired inhibition of thrombin production by elements associated with the thrombomodulin-epcr-pc system is a contributor to venous thrombosis at the level of the vascular wall. 19,20,22 The endothelial cells that line the vascular wall are heterogeneous with respect to their display of anticoagulant and fibrinolytic properties. 47,60 62 Unfortunately, insufficient quantitative data are available to define the concentrations of the vascular wall anticoagulants thrombomodulin, EPCR, heparan-sulfate proteoglycan, and TFPI, all of which are major regulators of the blood clotting pathway. It has been suggested that the endothelial cell surface area per unit of blood volume would permit a first-pass estimate of the anticoagulant concentrations provided by the vasculature. 63 We have used this approach to estimate the effective thrombomodulin concentrations in different vessels. These data are shown in Figure 5A. Numeric simulations for the thrombin generation that would occur in a closed system (no flow) with these vessels with identical TF insults are presented in Figure 5B. The high concentrations of thrombomodulin present in arterioles and capillaries suggest that these vessels are protected from a TF insult even under relatively static conditions of blood flow unless impaired with respect to thrombomodulin presentation or other defects in the PC regulatory pathway. PC and protein S congenital deficiencies represent the extremes of such pathologies (lethality). 58,59 The result is purpura fulminans, a consequence of systemic microvascular thrombosis. FV Leiden represents a better tolerated and more common venous thrombosis risk factor that is also an impairment in this system (but at the substrate level). Therefore, it is reasonable to speculate that among the constellation of candidate events that likely occur in venous thrombosis are impairments of the thrombin-pc-epcrthrombomodulin system. A reduction in anticoagulation potency coupled with low-flow or stasis and a blood-borne or vascular cell source of TF would result in an intravascular triggering of the coagulation mechanism.

230 Circulation July 12, 2011 Downloaded from http://circ.ahajournals.org/ by guest on April 20, 2017 Figure 5. A, A hypothetical construct displaying the potential molar concentrations of thrombomodulin in various regions of the vasculature. An underlying assumption is that the thrombomodulin concentration of each endothelial cell is independent of the vascular source. B, Numeric simulation of thrombin generation versus time in vessels displaying the thrombomodulin concentrations estimated in Figure 5A after a tissue factor insult. Tm indicates thrombomodulin. Paradoxically, thrombin is not only a procoagulant, but also an anticoagulant. Prothrombin activation (Figure 6) involves 2 peptide bond cleavages, with the predominant reaction pathway proceeding through meizothrombin, which is subsequently cleaved to yield -thrombin. The activity of meizothrombin is preferentially anticoagulant in character (Table 65 ). In closed systems, meizothrombin is short-lived and rapidly converted to -thrombin; however, under conditions of flow, significant amounts of meizothrombin accumulate. This significant fraction ( 50%) of thrombin formed at the vessel wall under conditions of flow is primarily anticoagulant in nature. 66 Virchow postulated a circulating source of hypercoagulability that may be attributed to a source of TF within the blood. Potential mobile targets include inflammatory blood cells that express TF on their surfaces or cell-derived microparticles that bear TF. 67 70 In addition to blood-borne procoagulants, the endothelium itself may contribute. The unperturbed endothelial cell in vitro does not appear to express TF at concentration levels that would likely provoke a coagulant response 67,71,72 ; however, with inflammatory cytokine (tumor necrosis factor- ) stimulation, a variety of observations suggest that relevant levels of TF may be expressed by endothelial cells in vitro. 73 Conversely, there is no question that the leukocyte populations in blood, in particular the monocyte, when subjected to inflammatory cytokines, translocate internally stored, highly procoagulant TF to their surface. These cells are likely candidates for Virchow s mobile source of systemic hypercoagulability. Similarly, cell-derived microparticles in circulation may provide a mobile source of TF that would produce a venous clot under conditions of low flow and impaired endothelium. 74 77 ATF trigger with low flow and impaired local regulation would produce explosive thrombin generation and occlusive clot formation within the vessel. Ugly Clots: Arterial Occlusion In contrast to the 3 centuries of experience with clotting in hemorrhage control and 2 centuries of experience with venous thrombosis, clotting in the arterial circuit has been investigated intensively only in more recent times. Arterial clots differ from venous clots in a number of respects. They are highly platelet dependent (white clots), occur in vessels of high shear, and occur in response to a local intravascular presentation of TF associated with rupture of an atherosclerotic lesion. 6,78 Clinical anticoagulation in venous and arterial environments is routinely provided by warfarin anticoagulation. Although systemic antiplatelet agents are largely ineffective in venous thrombosis, they are, in contrast, highly effective for arterial thrombosis. Prophylaxis with systemic antiplatelet therapy has proven quite effective. 79,80 The basis for the higher quantities of accumulated platelets in arterial thrombi is most likely a consequence of the superposition of a high shear environment, with other aspects governing thrombin generation. Under conditions of flow, thrombin generation from prothrombinase is highly shear dependent. 81 83 When prothrombin is activated under conditions of flow with a vessel wall bound prothrombinase catalyst, the substrate, prothrombin, arrives at the wall-bound prothrombinase catalyst primarily by diffusion only from the solvent in close proximity to the vessel wall, and the reaction product is limited to the fluid volume immediately adjacent to the vessel wall. As the flow rate is increased, new solvent entering the vessel segment dilutes the thrombin that is produced at the vessel wall. In blood, that thrombin would be surrounded by high concentrations of antithrombin and blocked from function. As a consequence, as flow rates increase, decreasing concentrations of active thrombin are found in regions proceeding from the vessel wall into the vessel lumen downstream from the point of its generation. From a biomechanical standpoint, thrombin generation by immobilized prothrombinase under conditions of flow is largely under dilutional control. As flow rates increase, thrombin produced in a local region of a vessel is largely washed out by the incoming blood supply, which leads to greatly reduced thrombin concentrations in regions extend-

Mann Good and Bad Clots 231 Downloaded from http://circ.ahajournals.org/ by guest on April 20, 2017 Figure 6. Pathways of prothrombin activation. The order of the 2 bond cleavages yield either the thrombin precursor prethrombin-2 or the enzyme, meizothrombin, as intermediates. Reprinted from Krishnaswamy et al 64 with permission of the publisher. Copyright 1987, the American Society for Biochemistry and Molecular Biology. ing from the vessel wall site of its production. These boundary-layer concentrations can be predicted by computational fluid dynamics model data for concentrations downstream from the point of formation (Figure 7). At venous flow rates (100 s 1 ), significant thrombin concentrations extend throughout the vessel. In contrast, at arterial flow rates, because of dilution effects by the incoming stream of fluid over the reaction site, thrombin is diluted rapidly, and high concentrations are only generated Table. Meizothrombin Activity Substrate Relative Activity (% -IIa)* Fibrinogen 7 65 Platelets 2 65 Factor V 41 34 Thrombomodulin plus protein C 93 65 Thrombomodulin plus TAFI 10 65 Antithrombin 25 65 TAFI indicates thrombin-activatable fibrinolysis inhibitor. *Based on comparison between r-wt- -IIa and r(r155a, R271A, R284A)mIIa. in very close proximity to the vessel wall. As a consequence, abnormalities that reduce flow serve to effectively reduce vessel aperture to dimensions essential to generate clot-effective thrombin concentrations in larger vessels at arterial shear rates. Flow restrictions by the vascular architecture and alterations associated with plaque and platelet accumulation are thus essential components that alter flow parameters to permit a concentration of thrombin to be produced throughout the vessel to achieve a stable platelet-fibrin clot. Platelets are essential components for hemorrhage control, as evidenced by the sensitivity of the bleeding time to their function and number. 84 In vitro, in static blood, clotting becomes sensitive to platelets at concentrations below 10 000/ L, whereas effective thrombin generation during the propagation phase requires platelet counts approaching 200 000/ L. 85 Impairment of platelet function with the platelet IIb/IIIa antagonists eptifibatide and abciximab and with aspirin has a significant influence on the rate of thrombin generation during the propagation phase of the reaction in blood, and these drugs are recognized antiocclusive pharmaceuticals 86 90 in the arterial circuit.

232 Circulation July 12, 2011 Downloaded from http://circ.ahajournals.org/ by guest on April 20, 2017 Figure 7. Computational flow dynamic model of thrombin concentrations extending from the wall site of formation at venous (100 s 1 ) and arterial (1000 s 1 ) shear rates. Figured compiled from data from Haynes et al. 66 Platelet function is required to provide the binding sites on which coagulation complexes are formed, 41,91 but in arterial flow, platelets also provide the anchor for clot location and probably contribute to flow impairment that permits extension of the clot into the lumen to produce an occlusion of the vessel. In whole blood activated with TF, the initial plateletfibrin clot forms at thrombin concentrations of approximately 2 nmol/l in a closed (no-flow) system. Thus, 2 nmol/l thrombin appears to be a reasonable concentration that must be developed locally in a flowing system to produce a fibrin clot. If we use 2 nmol/l thrombin as the platelet-fibrin clot threshold, 92 we can estimate the vertical height intruding into the vessel lumen that a clot might extend from the vessel wall as a function of shear (Figure 8). This analysis suggests that at (healthy) arterial flow rates, clot penetration into the vessel lumen would be significantly reduced by flow dilution and inhibition as the shear rate increased. Vessel diameter thus would also play a role. Therefore, on the basis of fluid mechanics and geometry, at high shear rates, a vascular obstruction or irregularity must be present to permit development of an occlusive clot in a vessel of moderate diameter. It is likely that this phenomenon and the deviation in vascular architecture associated with an atherosclerotic lesion require the accumulation of platelets to produce a white, platelet-rich clot, which is also dependent on thrombin generation and Figure 8. A hypothetical estimate of the extent of vascular occlusion that would occur 5 mm downstream from an anchored thrombin-generating catalyst (prothrombinase) in the absence of platelets. The illustration is based on a combination of fluid mechanics analyses with empirically defined enzyme kinetics studied in a flowing system. The data suggest that in smaller vessels at high shear rates, a tissue factor induced thrombin generation with plasma constituents alone would not lead to occlusion without another source of vascular obstruction (ie, a platelet thrombus).

Mann Good and Bad Clots 233 Downloaded from http://circ.ahajournals.org/ by guest on April 20, 2017 fibrin accumulation. Furthermore, it is likely that architectural features that influence the shear rate in local thrombin concentrations will also influence the biophysical properties and stability of the fibrin-platelet thrombus. 45 Summary The outcome of a blood clotting event is either desirable or undesirable. All of these events involve the generation of thrombin from plasma components, the participation of platelets, and the local conditions associated with the vascular environment. Good hemostatic clots are largely relegated to the extravascular environment, whereas pathological occlusive clots are associated with the presentation of TF within the vasculature. Although reactions in both of these environments involve platelet function, the high shear present in arterial environments requires extensive participation of platelets, and both pathologies may involve systemic inflammatory-coagulation syndromes. 93 The varying effectiveness of the nature and intensity of anticoagulant treatment for venous and arterial thrombosis is a consequence of these biochemical, cell biological, and biomechanical phenomena. Data for the contributions of the vascular anticoagulation systems, ie, thrombomodulin, EPCR, TFPI, and heparan sulfate proteoglycan, are not qualitatively or quantitatively established within the vasculature. The development of data regarding the concentrations of these anticoagulants in different vascular beds is essential to the meaningful evaluation of the dynamics that influence the susceptibility of an occlusive clot to form in different sites in the vascular anatomy. Acknowledgments I thank Drs Butenas, Brummel-Ziedins and Orfeo for their contributions to the science reported here; Laura Haynes and Dr Yves Dubief for permitting inclusion of some of their unpublished data; Matt Whelihan, Matt Gissel, and Laura Clayton for their assistance in preparing this manuscript; Drs Burt Sobel and Russell Tracy for their advice and counsel; and Stephen K. Mann, Nancy Roberts, and Kevin G. Mann for their contribution to the video. Sources of Funding Most of our research has been supported by the National Heart, Lung, and Blood Institute, most recently HL46703 and HL007594. Disclosures Dr Mann is the Chairman of the Board of Haematologic Technologies, Inc. He has received research support from Johnson and Johnson. He has also received honoraria from Johnson and Johnson, Daiichi Sankyo, Boehringer Ingelheim, and Merck. References 1. Owen CA Jr. A History of Blood Coagulation. Rochester, MN: Mayo Foundation for Medical Education and Research; 2001. 2. Virchow R. Thrombose und Embolie: Gefässentzündung und septische Infektion. In: Matzdorff AC, Bell WR, transl. Gesammelte Abhandlungen zur wissenschaftlichen Medicin. Canton, MA: Science History Publications; 1998. 3. Herrick JB. Landmark article (JAMA 1912): clinical features of sudden obstruction of the coronary arteries. JAMA. 1983;250:1757 1765. 4. DeWood MA, Spores J, Notske R, Mouser LT, Burroughs R, Golden MS, Lang HT. Prevalence of total coronary occlusion during the early hours of transmural myocardial infarction. N Engl J Med. 1980;303:897 902. 5. Hillis LD, Borer J, Braunwald E, Chesebro JH, Cohen LS, Dalen J, Dodge HT, Francis CK, Knatterud G, Ludbrook P, Markis JE, Mueller H, Desvigne-Nickens P, Passamani ER, Powers ER, Rao AK, Roberts R, Roberts WC, Ross A, Ryan TJ, Sobel BE, Williams DO, Zaret BL; and Co-Investigators. High dose intravenous streptokinase for acute myocardial infarction: preliminary results of a multicenter trial. J Am Coll Cardiol. 1985;6:957 962. 6. Davies MJ, Thomas AC. Plaque fissuring: the cause of acute myocardial infarction, sudden ischaemic death, and crescendo angina. Br Heart J. 1985;53:363 373. 7. Davie EW, Ratnoff OD. Waterfall sequence for intrinsic blood clotting. Science. 1964;145:1310 1312. 8. MacFarlane RG. An enzyme in the blood clotting mechanism and its function as a biochemical amplifier. Nature. 1964;202:498 499. 9. Davie EW, Fujikawa K, Kisiel W. The coagulation cascade: initiation, maintenance, and regulation. Biochemistry. 1991;30:10363 10370. 10. Mann KG. Thrombin formation. Chest. 2003;124:4S 10S. 11. Morawitz P. Die chemie der blutgerrinnung. Ergebn Physiol. 1905;4:307. 12. Pauer HU, Renne T, Hemmerlein B, Legler T, Fritzlar S, Adham I, Muller-Esterl W, Emons G, Sancken U, Engel W, Burfeind P. Targeted deletion of murine coagulation factor XII gene: a model for contact phase activation in vivo. Thromb Haemost. 2004;92:503 508. 13. Schmaier AH. The plasma kallikrein-kinin system counterbalances the renin-angiotensin system. J Clin Invest. 2002;109:1007 1009. 14. Butenas S, Undas A, Gissel MT, Szuldrzynski K, Zmudka K, Mann KG. Factor XIa and tissue factor activity in patients with coronary artery disease. Thromb Haemost. 2008;99:142 149. 15. Rosenberg RD, Bauer KA. The heparin-antithrombin system: a natural anticoagulant mechanism. In: Colman RW, Hirsch J, Marder VJ, Salzman EW, eds. Hemostasis and Thrombosis: Basic Principles and Clinical Practice. 3rd ed. Philadelphia, PA: Lippincott; 1994:837 860. 16. Broze GJ Jr. Tissue factor pathway inhibitor. Thromb Haemost. 1995;74: 90 93. 17. Baugh RJ, Broze GJ Jr, Krishnaswamy S. Regulation of extrinsic pathway factor Xa formation by tissue factor pathway inhibitor. J Biol Chem. 1998;273:4378 4386. 18. Maroney SA, Mast AE. Expression of tissue factor pathway inhibitor by endothelial cells and platelets. Transfus Apher Sci. 2008;38:9 14. 19. Esmon NL, Owen WG, Esmon CT. Isolation of a membrane-bound cofactor for thrombin-catalyzed activation of protein C. J Biol Chem. 1982;257:859 864. 20. Esmon CT. Thrombomodulin as a model of molecular mechanisms that modulate protease specificity and function at the vessel surface. FASEB J. 1995;9:946 955. 21. Regan LM, Stearns-Kurosawa DJ, Kurosawa S, Mollica J, Fukudome K, Esmon CT. The endothelial cell protein C receptor: inhibition of activated protein C anticoagulant function without modulation of reaction with proteinase inhibitors. J Biol Chem. 1996;271:17499 17503. 22. Esmon CT. Structure and functions of the endothelial cell protein C receptor. Crit Care Med. 2004;32:S298 S301. 23. Kalafatis M, Rand MD, Mann KG. The mechanism of inactivation of human factor V and human factor Va by activated protein C. J Biol Chem. 1994;269:31869 31880. 24. Fay PJ, Smudzin TM, Walker FJ. Activated protein C-catalyzed inactivation of human factor VIII and factor VIIIa: identification of cleavage sites and correlation of proteolysis with cofactor activity. J Biol Chem. 1991;266:20139 20145. 25. van t Veer C, Mann KG. Regulation of tissue factor initiated thrombin generation by the stoichiometric inhibitors tissue factor pathway inhibitor, antithrombin-iii, and heparin cofactor-ii. J Biol Chem. 1997;272: 4367 4377. 26. van t Veer C, Golden NJ, Kalafatis M, Mann KG. Inhibitory mechanism of the protein C pathway on tissue factor-induced thrombin generation: synergistic effect in combination with tissue factor pathway inhibitor. J Biol Chem. 1997;272:7983 7994. 27. Ruggeri ZM, De Marco L, Gatti L, Bader R, Montgomery RR. Platelets have more than one binding site for von Willebrand factor. J Clin Invest. 1983;72:1 12. 28. Brass LF. Thrombin and platelet activation. Chest. 2003;124:18S 25S. 29. Butenas S, Mann KG. Kinetics of human factor VII activation. Biochemistry. 1996;35:1904 1910. 30. Orfeo T, Butenas S, Brummel-Ziedins KE, Mann KG. The tissue factor requirement in blood coagulation. J Biol Chem. 2005;280:42887 42896. 31. Osterud B, Rapaport SI. Activation of factor IX by the reaction product of tissue factor and factor VII: additional pathway for initiating blood coagulation. Proc Natl Acad Sci U S A. 1977;74:5260 5264.

234 Circulation July 12, 2011 Downloaded from http://circ.ahajournals.org/ by guest on April 20, 2017 32. Bom VJ, Bertina RM. The contributions of Ca2, phospholipids and tissue-factor apoprotein to the activation of human blood-coagulation factor X by activated factor VII. Biochem J. 1990;265:327 336. 33. Komiyama Y, Pedersen AH, Kisiel W. Proteolytic activation of human factors IX and X by recombinant human factor VIIa: effects of calcium, phospholipids, and tissue factor. Biochemistry. 1990;29:9418 9425. 34. Orfeo T, Brufatto N, Nesheim ME, Xu H, Butenas S, Mann KG. The factor V activation paradox. J Biol Chem. 2004;279:19580 19591. 35. Coughlin SR. Protease-activated receptors in hemostasis, thrombosis and vascular biology. J Thromb Haemost. 2005;3:1800 1814. 36. Kahn ML, Zheng YW, Huang W, Bigornia V, Zeng D, Moff S, Farese RV Jr, Tam C, Coughlin SR. A dual thrombin receptor system for platelet activation. Nature. 1998;394:690 694. 37. Nesheim ME, Mann KG. Thrombin-catalyzed activation of single chain bovine factor V. J Biol Chem. 1979;254:1326 1334. 38. Fay PJ. Subunit structure of thrombin-activated human factor VIIIa. Biochim Biophys Acta. 1988;952:181 190. 39. Fay PJ, Koshibu K. The A2 subunit of factor VIIIa modulates the active site of factor IXa. J Biol Chem. 1998;273:19049 19054. 40. Walsh PN, Ahmad SS, Ashby B, Walsh PN. Kinetics of coagulation factor X activation of platelet-bound factor IXa. Biochem. 1990;29: 2606 2611. 41. Tracy PB, Nesheim ME, Mann KG. Coordinate binding of factor Va and factor Xa to the unstimulated platelet. J Biol Chem. 1981;256:743 751. 42. Nesheim ME, Taswell JB, Mann KG. The contribution of bovine Factor V and Factor Va to the activity of prothrombinase. J Biol Chem. 1979; 254:10952 10962. 43. Brummel KE, Butenas S, Mann KG. An integrated study of fibrinogen during blood coagulation. J Biol Chem. 1999;274:22862 22870. 44. Liu W, Carlisle CR, Sparks EA, Guthold M. The mechanical properties of single fibrin fibers. J Thromb Haemost. 2010;8:1030 1036. 45. Weisel JW. Biomechanics in hemostasis and thrombosis. J Thromb Haemost. 2010;8:1027 1029. 46. Kalafatis M, Mann KG. Role of the membrane in the inactivation of factor Va by activated protein C. J Biol Chem. 1993;268:27246 27257. 47. Shatos MA, Orfeo T, Doherty JM, Penar PL, Collen D, Mann KG. Alpha-thrombin stimulates urokinase production and DNA synthesis in cultured human cerebral microvascular endothelial cells. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 1995;15:903 911. 48. Mann KG. Coagulation Explosion, Part 1: Initiation [video]. http://www. youtube.com/watch?v RP1eLdkdJKg. Accessed December 31, 2010. 49. Mann KG. Coagulation Explosion, Part II: Propagation [video]. http:// www.youtube.com/watch?v oj9e33bzmsi. Accessed December 31, 2010. 50. Hockin MF, Jones KC, Everse SJ, Mann KG. A model for the stoichiometric regulation of blood coagulation. J Biol Chem. 2002;277: 18322 18333. 51. Coughlin SR, Vu TK, Hung DT, Wheaton VI. Characterization of a functional thrombin receptor: issues and opportunities. J Clin Invest. 1992;89:351 355. 52. Falvo MR, Gorkun OV, Lord ST. The molecular origins of the mechanical properties of fibrin. Biophys Chem. 2010;152:15 20. 53. Orfeo T, Brummel-Ziedins KE, Gissel M, Butenas S, Mann KG. The nature of the stable blood clot procoagulant activities. J Biol Chem. 2008;283:9776 9786. 54. Brummel-Ziedins KE, Branda RF, Butenas S, Mann KG. Discordant fibrin formation in hemophilia. J Thromb Haemost. 2009;7:825 832. 55. Wolberg AS, Allen GA, Monroe DM, Hedner U, Roberts HR, Hoffman M. High dose factor VIIa improves clot structure and stability in a model of haemophilia B. Br J Haematol. 2005;131:645 655. 56. Suttie JW. The biochemical basis of warfarin therapy. Adv Exp Med Biol. 1987;214:3 16. 57. Bertina RM, Koeleman BP, Koster T, Rosendaal FR, Dirven RJ, de Ronde H, van der Velden PA, Reitsma PH. Mutation in blood coagulation factor V associated with resistance to activated protein C. Nature (London). 1994;369:64 67. 58. Griffin JH, Evatt B, Zimmerman TS, Kleiss AJ, Wideman C. Deficiency of protein C in congenital thrombotic disease. J Clin Invest. 1981;68: 1370 1373. 59. Schwarz HP, Fischer M, Hopmeier P, Batard MA, Griffin JH. Plasma protein S deficiency in familial thrombotic disease. Blood. 1984;64: 1297 1300. 60. Campbell JE, Brummel-Ziedins KE, Butenas S, Mann KG. Cellular regulation of blood coagulation: a model for venous stasis. Blood. 2010; 116:6082 6091. 61. Hockin MF, Kalafatis M, Shatos M, Mann KG. Protein C activation and factor Va inactivation on human umbilical vein endothelial cells. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 1997;17:2765 2775. 62. Turner N, Nolasco L, Tao Z, Dong JF, Moake J. Human endothelial cells synthesize and release ADAMTS-13. J Thromb Haemost. 2006;4: 1396 1404. 63. Busch C, Cancilla PA, DeBault LE, Goldsmith JC, Owen WG. Use of endothelium cultured on microcarriers as a model for the microcirculation. Lab Invest. 1982;47:498 504. 64. Krishnaswamy S, Church WR, Nesheim ME, Mann KG. Activation of human prothrombin by human prothrombinase: influence of factor Va on the reaction mechanism. J Biol Chem. 1987;262:3291 3299. 65. Cote HC, Bajzar L, Stevens WK, Samis JA, Morser J, MacGillivray RT, Nesheim ME. Functional characterization of recombinant human meizothrombin and Meizothrombin(desF1): thrombomodulin-dependent activation of protein C and thrombin-activatable fibrinolysis inhibitor (TAFI), platelet aggregation, antithrombin-iii inhibition. J Biol Chem. 1997;272:6194 6200. 66. Haynes LM, Dubief YC, Orfeo T, Mann KG. Dilutional control of prothrombin activation at physiologically relevant shear rates. Biophys J. 2011;100:765 773. 67. Sovershaev MA, Egorina EM, Gruber FX, Olsen JO, Osterud B. High tissue factor-expressing human monocytes carry low surface CD36: application to intersubject variability. J Thromb Haemost. 2007;5: 2453 2460. 68. Eilertsen KE, Osterud B. The role of blood cells and their microparticles in blood coagulation. Biochem Soc Trans. 2005;33:418 422. 69. Tracy PB, Robinson RA, Worfolk LA, Allen DH. Procoagulant activities expressed by peripheral blood mononuclear cells. Methods Enzymol. 1993;222:281 299. 70. Egorina EM, Sovershaev MA, Bjorkoy G, Gruber FX, Olsen JO, Parhami-Seren B, Mann KG, Osterud B. Intracellular and surface distribution of monocyte tissue factor: application to intersubject variability. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2005;25:1493 1498. 71. Breider MA, Yang Z. Tissue factor expression in bovine endothelial cells induced by Pasteurella haemolytica lipopolysaccharide and interleukin-1. Vet Pathol. 1994;31:55 60. 72. Yang HL, Lu FJ, Wung SL, Chiu HC. Humic acid induces expression of tissue factor by cultured endothelial cells: regulation by cytosolic calcium and protein kinase C. Thromb Haemost. 1994;71:325 330. 73. Camera M, Giesen PL, Fallon J, Aufiero BM, Taubman M, Tremoli E, Nemerson Y. Cooperation between VEGF and TNF-alpha is necessary for exposure of active tissue factor on the surface of human endothelial cells. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 1999;19:531 537. 74. Del Conde I, Shrimpton CN, Thiagarajan P, Lopez JA. Tissue-factorbearing microvesicles arise from lipid rafts and fuse with activated platelets to initiate coagulation. Blood. 2005;106:1604 1611. 75. Antoniak S, Boltzen U, Eisenreich A, Stellbaum C, Poller W, Schultheiss HP, Rauch U. Regulation of cardiomyocyte full-length tissue factor expression and microparticle release under inflammatory conditions in vitro. J Thromb Haemost. 2009;7:871 878. 76. Langer F, Spath B, Haubold K, Holstein K, Marx G, Wierecky J, Brummendorf TH, Dierlamm J, Bokemeyer C, Eifrig B. Tissue factor procoagulant activity of plasma microparticles in patients with cancerassociated disseminated intravascular coagulation. Ann Hematol. 2008; 87:451 457. 77. Morel O, Pereira B, Averous G, Faure A, Jesel L, Germain P, Grunebaum L, Ohlmann P, Freyssinet JM, Bareiss P, Toti F. Increased levels of procoagulant tissue factor-bearing microparticles within the occluded coronary artery of patients with ST-segment elevation myocardial infarction: role of endothelial damage and leukocyte activation. Arteriosclerosis. 2009;204: 636 641. 78. Falk E. Plaque rupture with severe pre-existing stenosis precipitating coronary thrombosis: characteristics of coronary atherosclerotic plaques underlying fatal occlusive thrombi. Br Heart J. 1983;50:127 134. 79. Mehta SR, Bassand JP, Chrolavicius S, Diaz R, Eikelboom JW, Fox KA, Granger CB, Jolly S, Joyner CD, Rupprecht HJ, Widimsky P, Afzal R, Pogue J, Yusuf S. Dose comparisons of clopidogrel and aspirin in acute coronary syndromes. N Engl J Med. 2010;363:930 942. 80. Wiviott SD, Antman EM, Gibson CM, Montalescot G, Riesmeyer J, Weerakkody G, Winters KJ, Warmke JW, McCabe CH, Braunwald E. Evaluation of prasugrel compared with clopidogrel in patients with acute coronary syndromes: design and rationale for the TRial to assess Improvement in Therapeutic Outcomes by optimizing platelet InhibitioN

Mann Good and Bad Clots 235 with prasugrel Thrombolysis In Myocardial Infarction 38 (TRITON-TIMI 38). Am Heart J. 2006;152:627 635. 81. Billy D, Speijer H, Willems G, Hemker HC, Lindhout T. Prothrombin activation by prothrombinase in a tubular flow reactor. J Biol Chem. 1995;270:1029 1034. 82. Hall CL, Taubman MB, Nemerson Y, Turitto VT. Factor Xa generation at the surface of cultured rat vascular smooth muscle cells in an in vitro flow system. J Biomech Eng. 1998;120:484 490. 83. Haynes LM, Dubief Y, Orfeo T, Mann KG. The effects of flow on the activation of bovine prothrombin by prothrombinase at physiologically relevant shear rates. FASEB J. 2010;24(suppl):835.4. 84. Beutler E. Platelet transfusions: the 20,000/microL trigger. Blood. 1993; 81:1411 1413. 85. Butenas S, Branda RF, van t Veer C, Cawthern KM, Mann KG. Platelets and phospholipids in tissue factor-initiated thrombin generation. Thromb Haemost. 2001;86:660 667. 86. Mazzaferri EL Jr, Young JJ. Abciximab: a review and update for clinicians. Expert Rev Cardiovasc Ther. 2008;6:609 618. 87. Butenas S, Cawthern KM, van t Veer C, DiLorenzo ME, Lock JB, Mann KG. Antiplatelet agents in tissue factor-induced blood coagulation. Blood. 2001;97:2314 2322. 88. Shah I, Khan SO, Malhotra S, Fischell T. Eptifibatide: the evidence for its role in the management of acute coronary syndromes. Core Evid. 2010; 4:49 65. 89. Undas A, Brummel K, Musial J, Mann KG, Szczeklik A. Blood coagulation at the site of microvascular injury: effects of low- dose aspirin. Blood. 2001;98:2423 2431. 90. Undas A, Brummel-Ziedins KE, Mann KG. Antithrombotic properties of aspirin and resistance to aspirin: beyond strictly antiplatelet actions. Blood. 2007;109:2285 2292. 91. Swords NA, Mann KG. The assembly of the prothrombinase complex on adherent platelets. Arterioscler Thromb. 1993;13:1602 1612. 92. Brummel KE, Paradis SG, Butenas S, Mann KG. Thrombin functions during tissue factor-induced blood coagulation. Blood. 2002;100: 148 152. 93. Undas A, Szuldrzynski K, Brummel-Ziedins KE, Tracz W, Zmudka K, Mann KG. Systemic blood coagulation activation in acute coronary syndromes. Blood. 2009;113:2070 2078. KEY WORDS: arteries hemorrhage thrombosis veins Downloaded from http://circ.ahajournals.org/ by guest on April 20, 2017

Thrombin Generation in Hemorrhage Control and Vascular Occlusion Kenneth G. Mann Downloaded from http://circ.ahajournals.org/ by guest on April 20, 2017 Circulation. 2011;124:225-235 doi: 10.1161/CIRCULATIONAHA.110.952648 Circulation is published by the American Heart Association, 7272 Greenville Avenue, Dallas, TX 75231 Copyright 2011 American Heart Association, Inc. All rights reserved. Print ISSN: 0009-7322. Online ISSN: 1524-4539 The online version of this article, along with updated information and services, is located on the World Wide Web at: http://circ.ahajournals.org/content/124/2/225 Data Supplement (unedited) at: http://circ.ahajournals.org/content/suppl/2011/07/13/124.2.225.dc1 http://circ.ahajournals.org/content/suppl/2016/04/13/124.2.225.dc2 Permissions: Requests for permissions to reproduce figures, tables, or portions of articles originally published in Circulation can be obtained via RightsLink, a service of the Copyright Clearance Center, not the Editorial Office. Once the online version of the published article for which permission is being requested is located, click Request Permissions in the middle column of the Web page under Services. Further information about this process is available in the Permissions and Rights Question and Answer document. Reprints: Information about reprints can be found online at: http://www.lww.com/reprints Subscriptions: Information about subscribing to Circulation is online at: http://circ.ahajournals.org//subscriptions/

Mindennapi tudomány Rovatcím klinikusok számára A trombinképződés szerepe a vérzéscsillapításban és az érelzáródásban Már Hippokratész és Arisztotelész is megfigyelte, hogy a vér a testen kívül megalvad, de csak 1720-ban John Louis Petit fedezte fel, hogy az amputációt követő vérzéscsillapítás a véralvadási folyamattal függ össze. 1 Százharmincnyolc évvel később Rudolph Virchow megalkotta feltevését a vénás trombózisról. 2 A vérrögök és az akut artériás elzáródás közötti kapcsolatot James B. Herrick 3 írta le 1912-ben, de csak az 1980-as években sikerült tisztázni a véralvadás szerepét az akut artériás történésekben. 4 6 Így mai tudásunk nagyrészt olyan hemosztatikus folyamatok vizsgálatán alapul, amelyeket a vénás és artériás trombózisban leírt kóros érelzáródásokból származtatunk. Az erek integritását és a vér folyékony állapotban tartását a vér, az érhálózat és a környező képletek prokoagulációs és antikoagulációs mechanizmusainak bonyolult együttműködése tartja fenn. A hemosztatikus és véralvadást gátló mátrix vérből származó összetevőire és a közöttük kialakult kapcsolatokra kezdetben hemosztatikus és trombotikus betegségeket okozó génhibák utaltak, amelyek többségét transzgenikus egereken végezett vizsgálatokkal is igazolták. További vér- és vascularis alkotókat fedeztek fel in vitro assay-vel, amelyek új entitásokat azonosítottak, és további ismeretekkel gyarapították a koagulációs-antikoagulációs folyamatokat. A véralvadás kétféle útját írták le: az intrinszik út során a plazma egy idegen felülettel kerül kapcsolatba, 7 9 míg az extrinszik úton (1A ábra) a környező szövetekből származó anyagokkal (a sejtmembránon elhelyezkedő szöveti faktorral [TF, tissue factor]) érintkezik. 10,11 Ugyanakkor a kontaktfaktorok, a XII. faktor 12 és a nagy molekulatömegű kininogén 13 (az 1. ábrán szaggatott vonallal jelöltük) molekuláris rendellenességeit mutató betegekben és transzgenikus egerekben a vérzéses kórképek hiányát figyelték meg. Ez a tény arra enged következtetni, hogy nem ez az elsődleges katalizátor, amely a hemosztázis fenntartásáért felelős. Így bár a kontaktaktiváció katalizátora nagy valószínűséggel nem vesz részt a hemosztázisban, XII. faktorknockout állatokkal 12 a közelmúltban végzett vizsgálatok és humán gyulladásos tünetegyüttesek 14 alapján ez az útvonal helytálló lehet bizonyos trombotikus rendellenességekben. A véralvadási folyamat sztöchiometrikus és dinamikus gátlómechanizmusok szigorú szabályozása mellett zajlik; az előzőek elsősorban az antitrombin és a szöveti faktor által beindított alvadási út inhibitorának (TFPI, tissue factor pathway inhibitor) befolyása alatt állnak, míg az utóbbit a dinamikus protein C (PC) rendszer szabályozza, amely közvetlenül a trombinképződéshez kapcsolódik (1B ábra). Az antitrombin a véralvadási kaszkád valamennyi szerinproteázát gátolja, ez Kenneth G. Mann, PhD irányú működését a heparin és az érfal endotheliuma által expresszált heparán-szulfát proteoglikánok 15 stimulálják. A TFPI egy Kunitz-féle inhibitor, 16 amely önmagában mind a Xa, mind a VIIa-TF komplexet képes gátolni, habár elsődleges célpontja a Xa-VIIa-TF komplex. 17 A TFPI nagy affinitással bíró inhibitor, de csak igen kis koncentrációban van jelen a vérben, valamint az érfal endotheliumában, ahonnan heparin hatására szekretálódik. 18 A dinamikus PC-rendszerben kapcsolódik össze az endothelsejtek trombomodulinja 19,20 és kofaktora, az endothelialis PC-receptor (EPCR) a trombinnal. 21,22 A trombomodulin- EPCR-trombin alkotta érfalhoz kötött katalizátor aktiválja a plazmában található PC-t enzim aktiválta protein C-vé. 21 A véralvadásgátló tulajdonságú aktivált PC hasítja és inaktiválja az Va és VIIIa faktort. 23,24 Az antitrombin a szöveti faktor által beindított alvadási út inhibitorával és a PC-rendszerrel szinergizmusban működik, így sokkal hatékonyabb véralvadásgátló hatást fejt ki. 25,26 A sztöchiometrikus és dinamikus inhibitorok egyensúlyi küszöböt tartanak fenn az alvadási folyamat során, vagyis a kiváltó ingernek kellően súlyosnak kell lennie ahhoz, hogy egy potenciálisan trombotikus válasz kialakuljon. Hemosztázis és érelzáródás Biokémiai szempontból a trombinképződés során a szokásos molekuláris és celluláris események zajlanak le, attól függően, hogy védekező vagy kóros alvadásban vesnek-e részt. Ugyanakkor az is nyilvánvaló, hogy az áramlás biomechanikája, az érszerkezet és annak összetétele eltér a vénás és artériás keringésben. Továbbá, a vérzéscsillapításban a szöveti faktor az extravascularis, míg trombózisban az intravascularis térből származik. Mindazonáltal minden véralvadási folyamat nélkülözhetetlen enzime a trombin, amely a vér- és érösszetevőknek megfelelően termelődik, és három, felülethez kötött katalizátor segítségével protrombinból alakul át (1A ábra). Ebben a tanulmányban a fő hangsúlyt a vérzéscsillapításra helyeztük, de betekintést nyújtunk a vénás és artériás keringésben lezajló rögképződésbe is. A jó rögök: a homeosztázis Homeosztázis alatt az érrendszeren kívüli trombintermelődést értjük, működése révén kialakul egy stabil fibrin-vérlemezke gát, amely megállítja a vérzést. A rög környezete extravascularis szövet, amely az érsérülés nyomán trombinképződést indít el: a vérlemezkék a von Willebrand-faktor segítségével kita- Munkahelyi háttér: A szerző a Department of Biochemistry, University of Vermont, Colchester, Vermont munkatársa. A cikkhez tartozó, csak elektronikusan elérhető függelék a http://circ.ahajournals.org/cgi/content/full/124/2/225/dc1 internetes oldalon található. Levelezési cím: Kenneth G. Mann, PhD, Department of Biochemistry, Colchester Research Facility Room 235, University of Vermont, Colchester, VT 05446, USA. E-mail: kenneth.mann@uvm.edu (Eredeti megjelenés: Circulation. 2011;124:225 235.) 2011 American Heart Association, Inc. 1. évfolyam, 4. szám, 2011. december Circulation Magyar Kiadás 228 237 228

Mann és mtsai A trombinképződés szerepe a vérzéscsillapításban és az érelzáródásban 229 1. ábra. A: Az ábra az intrinszik és extrinszik véralvadási utak felülethez kötött enzimkomplexeit szemlélteti. Az intrinszik út felülethez kötött komplexeit szaggatott vonallal emeltük ki. Az ábrán azt is feltüntettük, hogy az V., VIII., VII. és XI. faktor aktivációjával a trombin képződése megsokszorozódik a visszacsatolásnak köszönhetően. B: A sztöchiometrikus inhibitorok (antitrombin és szöveti faktor által beindított alvadási út inhibitora) szabályozzák a véralvadási rendszert, amelyek a szerinproteázokhoz és a kofaktorok (Va és VIIIa faktor) proteolitikus inaktiválását végző dinamikus aktivált protein C rendszerhez (APC) kötődve csökkentik azok működését. Rövidítések: HMW = (high molecular weight) nagy molekulatömegű; PC = protein C; AT = antitrombin; TFPI = (tissue factor pathway inhibitor) szöveti faktor által beindított alvadási út inhibitora. Az ábrát Manntól 10 vettük át, a szerző engedélyével. Szerzői joggal védett 2003, American College of Chest Physicians. padnak a kötőszöveti kollagénrostokhoz, majd megindul a szekréció és az aggregáció. 27,28 A plazmában található biológiailag inaktív szerin-proteáz, 29 a VIIa faktor jelenlétében megindul a trombintermelődés a szöveti faktor hatására, amely a vérrel nem érintkező sejtek membránján helyezkedik el, de az érsérülés következtében kapcsolatba kerül a VIIa faktorral (2A ábra). Elsősorban a TFPI szabályozza az FVIIa-TF komplexet, amely a kezdeti gyors Xa faktor felszabadulásáért felelős. Az FVIIa-TF komplex két szubsztrátot aktivál, a X. és IX. faktort 31 33 (1A ábra). Kis mennyiségű Xa faktor a vérlemezkékkel és a szöveti membrán felszínével komplexálódik, majd kis mennyiségű protrombint alakít trombinná. 34 A trombin felerősíti saját termelődését abban a környezetben, ahol nagy koncentrációban vannak jelen az inhibitorok. Ezt további vérlemezkék 35,36 és a membránhoz kötött katalizátorok kialakulásához szükséges prokofaktorok (V. és VIII. faktor) kofaktorokká (Va és VIIIa faktor) aktiválása útján éri el (2B ábra). Az intrinszik tenázmembrán kötőhelyei (FVIIIa-FIXa), 39 amelyek a fő X. faktor-aktivátorrá és protrombinázzá (FVa-FXa) válnak, aktivált vérlemezkéken, a sérülés helyén lévő károsodott sejteken

230 Circulation Magyar Kiadás 2011. december 2. ábra. A szöveti faktor (TF, tissue factor) indukálta véralvadás szabályozásának kétkompartmentes modellje. Az ér keresztmetszeti képén az ér lumene, az endothelsejtréteg és az extravascularis területek láthatóak az érsérülés helyén. A véralvadási folyamatot négy lépésben mutatjuk be. Rövidítések: TF VIIa jelöli a szöveti faktor és VIIa faktor komplexét; Xa Va: protrombinázkomplex; VIIIa IXa: intrinszik tenáz; HS ATIII (IIa vagy Xa): trombinhoz vagy Xa faktorhoz kötött ATIII (antitrombin III) és endothelsejt-eredetű heparán-szulfát proteoglikán komplex; TM IIa PC: trombomodulin-trombin komplexhez kötött protein C. A: Az érsérülés következtében a vér a benne keringő VIIa faktorral és vérlemezkékkel kikerül az extravascularis térbe, ahol nagy mennyiségű membránhoz kötött szöveti faktor található. A vérlemezkék a von Willebrand-faktor segítségével a környező szövetek kollagénjéhez kapcsolódnak, a VIIa faktor a szöveti faktorhoz kötődik, majd aktiválja a IX. és X. faktorokat. A Xa faktor kis mennyiségű protrombin trombinná alakulását segíti elő, ami további vérlemezkéket von be a folyamatba és aktiválja az V. és VIII. faktorokat. B: A reakciót a vérlemezkékhez kötött intrinszik tenáz és protrombináz fokozza, előbbi a Xa faktor első számú termelője. Kialakul a fehér thrombus, amelyben a fibrin és az aktivált vérlemezkék szigetelik az érsérülést. C: Prokoaguláns komplexekkel fedett aktivált vérlemezkegát jön létre, amelyet fibrinháló borít be. A szubsztrátok felhasználásával lezárul a reakció, ezzel megszűnik a további trombinképződés, de a prokoaguláns enzimkomplexek még mindig jelen vannak, mert ezeket az érpályán belüli dinamikus gátlófolyamatok védik. D: Az érsérülés helyétől távolodó kép. A sérüléstől eltávolodó enzimeket antitrombin-heparán komplexek semlegesítik, az endothelsejtek trombomodulinjához kötődik a maradék trombin, így aktiválódik a protein C rendszer, és működésbe lép a dinamikus antikoaguláns mechanizmus. Ezek a folyamatok hivatottak megakadályozni az ér elzáródását, habár folyamatosan újabb szubsztrátok érkeznek a thrombus érlumen felőli oldalához. Az ábrát Orfeo és munkatársaitól 30 vettük át, a szerző engedélyével. Szerzői joggal védett 2005, American Society for Biochemistry and Molecular Biology. és más perifériás vérsejteken expresszálódnak. 40,41 A katalizátorkomplexek 105 107-szer aktívabbak, mint az őket alkotó szerin-proteázok, de membránkötődésük miatt csak az érsérülés helyén válnak reaktívvá. 40,42 A felülethez kötött katalizátorok létrejötte hirtelen nagy mennyiségű trombin keletkezéséhez vezet az érsérülés helyén. Ezek a katalizátorok a sérülés helyén lokalizálódnak, így védetté válnak az inaktiváló hatásától az antitrombin által. A katalizátorok felszaporodnak a sérülés helyén, amint egyre több vérlemezkét és plazmaszubsztrátot szállít a kiszivárgó vér. A véralvadási kaszkád végterméke, az α-trombin lehasítja a fibrinogénből a fibrinopeptid A-t és B-t, így kialakul a fibrinrög, miközben a trombin aktiválja a fibrinstabilizáló XIII. faktort, ami keresztkötéseket hoz létre az aggregálódott fibrinmonomerek között. A fibrinképződés dinamikája, az aggregáció és a keresztkötések szoros egységet képeznek, így megfelelő mechanikai szilárdsággal bíró stabil rög jön létre, ami képes megakadályozni a további vérvesztést. 43 45 A reakció addig folytatódik, amíg a vér szubsztrátokat szállít a sérülés helyére. Az intravascularis és extravascularis tér alkotta kétkompartmentes rendszerben addig tart a trombin, fibrin és az aggregálódott vérlemezkék kialakulása, amíg az extravascularis kompartmentben el nem fogynak a szubsztrátok vagy amíg a sérülés helyét el nem zárja a thrombus (2C ábra). A komplex felbomlásával a sérülés helyéről elkerülő prokoagu-

Mann és mtsai A trombinképződés szerepe a vérzéscsillapításban és az érelzáródásban 231 V-faktor aktivációja trombin trombin V-faktor aktivációja vérlemezke-aktiváció VIII. faktor aktivációja vérlemezke-aktiváció VIII. faktor aktivációja 3. ábra. A: Numerikus szimuláció a szöveti faktor hatására keletkező katalizátorok képződéséhez vezető korai eseményekről. A logaritmikus skála az V. és VIII. faktor, valamint a vérlemezkék kezdeti aktivációját szemlélteti az idő függvényében, a reakcióban a Xa faktor termelte kezdeti trombin végzi az aktivációt. B: Trombinképződés, V., VIII. faktor és vérlemezkék aktivációja a teljes reakció során. A trombin katalizálta visszacsatolás megsokszorozza a saját termelődését, így fokozódik a vérlemezkék és a VIII. faktor aktivációja, vagyis a protrombinázkomplex egyre nagyobb mennyiségű trombint képes előállítani. láns enzimeket az antitrombin inaktiválja. A protein C-rendszer aktivációjával a trombin lecsökkenti saját intravascularis termelődését. A trombin az endothelsejtek trombomodulinjához kötődik, és ez az EPCR által elősegített trombin-trombomodulin komplex aktiválja a plazma-protein-c-t. Az aktivált protein C hasítja az Va és VIIIa faktort, ami a kofaktorokat inaktiválja 24,46 (2D ábra). Az érfal és a plazma negatív szabályozókomponensei megakadályozzák a szisztémás trombotikus elzáródást. A trombin serkenti a plazminogén aktivátorok szekrécióját, vagyis a rög feloldódását és a rekanalizációt. 47 A véralvadás folyamata több szakaszból tevődik össze, funkcionálisan három részre osztható (iniciáció, propagáció, termináció); a folyamatot egy animációs film mutatja be, amelyet itt és a Yout Tube-on tekinthetnek meg. 48,49 Az utóbbi a teljes folyamat során megfigyelhető. Az iniciáció során aktiválódnak a membránhoz kötött komplex elemei, vagyis a vérlemezkék, kofaktorok és szerin-proteázok; a propagációs fázis alatt ez a komplex termeli a legtöbb trombint. Az iniciációs fázis időbeli lefolyását a 3A ábra mutatja be egy numerikus modellen, 50 amely a kezdeti trombinképződés dinamikáját és a vérlemezkék, továbbá az V. és VIII. faktor aktivációját ábrázolja. A vérlemezkéket aktiváló 1-es és 4-es proteáz aktiválta receptorok hasítják a trombint ebben a folyamatban, 36,51 ezenkívül a prokofaktor V. és VIII. faktorból aktivációs peptideket (FVa és FVIIIa kofaktorok) szabadítanak fel. A reakció ezen szakaszát kis mennyiségű (10-17 10-14 mol/l) trombin szabályozza (3A ábra), amely a Xa faktor hatására az iniciációs szakaszban termelődik. Az aktiválódott vérlemezkék specifikus, ám jelenleg ismeretlen receptorkötő helyeket biztosítanak az FVIIIa-FIXa és az FVa-FXa komplexek számára. A prokoaguláns katalizátorok megjelenését szemlélteti a 3B ábra a teljes reakcióidő alatt. Az aktiváció a kötetlen Xa faktornál >105-szer aktívabb protrombináznak köszönhetően fokozódik, mivel felgyorsítja a trombinképződést az FVIIIa-FIXa komplexen keresztüli Xa faktor megsokszorozásával. Továbbá, ha a IXa és Xa faktor a VIIIa, illetve Va faktorral komplexet képez, akkor az antitrombin nem fér hozzájuk. Mind a teljes vérben, mind a vérplazmában a fibrinogén okozta rögösödés 43,52 az iniciációs és propagációs fázis határán következik be, amikor a protrombin 5%-a trombinná alakult. Így a rögösödésen alapuló mérések, úgymint aktivált alvadási idő, protrombinidő és parciális tromboplasztinidő, a reakció 95%-át kizárják. A legtöbb alvadási vizsgálat zárt rendszerben történik, ahol a reakció elején jelen lévő reakciópartnereket nagyrészt felhasználják a prokoaguláns és antikoaguláns folyamatok. Ezzel szemben, ha vérzés áll fenn, a vér elfolyása addig folytatódik, amíg a vérlemezke-fibrin dugó ki nem alakul. A folyamat folytonosságába azok a kísérletek nyújtottak betekintést, amelyekben a vért pótolták egy szöveti faktor indukálta, látszólag nyugvó reakcióhoz, miután további trombin-antitrombin nem halmozódott fel. Ezeket a vizsgálatokat újratápláló kísérleteknek nevezzük. 53 Ha friss vért vagy reakciópartnereket adunk egy nyugvó thrombushoz, akkor gyors és nagy mennyiségű trombinfelszabadulást tapasztalunk. Ez a felfokozott válasz egy, a vérlemezkékhez kötött prokoaguláns enzimkomplexnek köszönhető, amely az eredeti thrombusból származik, és az újonnan hozzáadott vér szubsztrátjaiból további termékeket hoz létre. Hemofíliában az intrinszik faktor tenáz (FVIIIa-FIXa) hiánya megakadályozza a felgyorsult Xa faktor képződését, így lassabb ütemben kisebb mennyiségű trombin keletkezik. Következésképpen egy nem tökéletes fibrinháló alakul ki, amely nem képes megakadályozni a vér további elfolyását. 54,55 Az elektronikus vér egyidejű újrapótlásának numerikus szimulációját mutatja a 4. ábra. 30 Ebben az esetben a teljes trombinmennyiséget ábrázoljuk az idő függvényében egy olyan vizsgálatban, ahol friss plazmát adunk a rendszerhez, miután az aktív trombinra nézve lecseng a kezdeti szövetifaktor-reakció. Minden egyes újrapótlás a trombinaktivitás gyorsabb növekedését eredményezi a megemelkedett katalizátorkoncentráció következtében. A kapott adatok alapján, ha több szubsztrátot adunk a rendszerhez, a nyugvó thrombusban jelen lévő katalizátorok még több katalizátort termelnek, ami sokkal intenzívebb trombinképződéshez vezet, és ez a folyamat egészen addig folytatódik, amíg az érsérülés el nem záródik. Megjegyezzük, hogy további szöveti faktor nem szükséges, a reakció független a kezdeti szövetifaktor-ingertől, ami elindítja a trombinképző folyamatot. 53

232 Circulation Magyar Kiadás 2011. december 4. ábra. Numerikus szimuláció az elektronikus plazma reakciópartnereinek egyidejû újrapótlásáról a nyugvó thrombushoz a 790, 1200 és 1800 s idôpontokban. Az eredmény egy jóval kifejezettebb trombintermelôdés és nagy mennyiségû protrombináz (Xa = Va). Az ábrát Orfeo és munkatársaitól 30 vettük át, a szerzô engedélyével. Szerzôi joggal védett 2005, American Society for Biochemistry and Molecular Biology. Így a homeosztázis a szöveti faktor indukálta véralvadásra kétkompartmentes modellként írható le. Az ér sérülése és a vér elfolyása az extravascularis térbe a vérlemezkék adhézióját, szekrécióját és aggregációját váltja ki. A plazmában található VIIa faktor az extravascularis szöveti faktorhoz kötődik, és elindítja a prokoagulációs komplexek és a trombin képződését. Egy nyitott rendszerben az áramló vér szubsztrátokat szállít a reaktív és egyre növekedő thrombushoz, egészen addig, amíg az érsérülés el nem záródik, vagy meg nem szűnik az utánpótlás. Ekkor a reakció nem jut további szubsztráthoz, végül az antitrombin semlegesíti a proteázokat. Ha valamely reaktív enzim mégis túlél, akkor azt a feleslegben lévő sztöchiometrikus inhibitorok vagy a vascularis trombomodulin semlegesíti, amelyek a maradék trombinnal együtt aktiválják a protein C-t, ez pedig inaktiválja az Va és VIIIa faktort. A rossz trombinképződés: vénás trombózis Virchow leírása szerint a vénás érelzáródást okozó rögök képződése olyan tényezőkkel függ össze, mint a vér fokozott véralvadásra hajlamos összetevői, az endothel sérülése vagy nem megfelelő működése, illetve a megváltozott véráramlás. 2 A vénás trombózissal kapcsolatos klinikai tapasztalatok az antikoaguláns heparin és warfarin alkalmazását támogatják, amelyek fokozzák az antitrombin semlegesítő hatását, 15 vagy megakadályozzák a prokoaguláns zimogének bioszintézisét. 56 Általában a vérlemezkegátlók hatástalanok. A vénás trombózis veleszületett kockázati tényezői a Leiden-faktor mutációja, protein C és protein S hiánya. 57 59 Ezek az állapotok nem feltétlenül párosulnak artériás eseményekkel. Ezzel a három veleszületett rendellenességgel társult vénás elzáródásos kórformák egyértelműen arra utalnak, hogy ha a trombomodulin-epcr-pc rendszerhez kapcsolt elemek nem megfelelően gátolják a trombin termelődését, akkor az érfal mentén vénás trombózis alakulhat ki. 19,20,22 Az érfalat bélelő endothelsejtek antikoaguláns és fibrinolitikus tulajdonságaik szempontjából heterogének. 47,60 62 Sajnos nincs elegendő számszerű adatunk a véralvadási folyamat legfőbb szabályozóinak, az érfal antikoagulánsainak (trombomodulin, EPCR, heparán-szulfát proteoglikán, TFPI) koncentrációjáról. Javaslat született arra, hogy az endothelsejtfelszín/egységnyi vértérfogat alapján elsődleges becslést készítsünk az érhálózat antikoaguláns koncentrációjáról. 63 Ezt a módszert használtuk a trombomodulin koncentrációjának kiszámítására különböző erekben. Az ebből nyert adatokat az 5A ábrán mutatjuk be. Az 5B ábra illusztrálja a trombinképződés numerikus szimulációját egy olyan zárt rendszerben, ahol nincs áramlás és az erek azonos szövetifaktor-expozícióval rendelkeznek. Az arteriolák és kapillárisok magas trombomodulinkoncentrációja arra utal, hogy ezek az erek védettek a szöveti faktor hatásaitól, még a viszonylagos statikus véráramlási körülmények között is, feltéve, ha nem károsodott a trombomodulin termelődése vagy a protein C szabályozómechanizmusa. A protein C és protein S veleszületett hiánya szélsőséges kórformákban nyilvánulhat meg (halálos kimenetel). 58,59 Szisztémás microvascularis trombózis következményeként, purpura fulminansban manifesztálódhat. Ennek a rendszernek a károsodása, de már a szubsztrátok szintjén a Leiden-faktor mutációja, amely jobban tolerálható és sokkal gyakoribb kockázati tényező a vénás trombózisra. Ezért joggal feltételezhetjük, hogy a vénás trombózisban egyidejűleg fennálló és nagy valószínűséggel bekövetkező eseményeket a trombin-pc-epcr-trombomodulin rendszer károsodása okozza. Intravascularis kiindulású véralvadás következik be, ha az antikoaguláns képesség csökkenése lassú véráramlással, esetleg pangással és vérsejt- vagy endotheleredetű szövetifaktor-felszabadulással társul. Paradox módon a trombin nemcsak prokoaguláns, hanem antikoaguláns is. Két peptidkötés hasításával aktiválódik a protrombin (6. ábra), amely a meghatározó reakcióúton meizotrombinná alakul, ebből újabb hasítással α-trombin jön létre. A meizotrombin elsősorban antikoaguláns hatású (Táblázat 65 ). Életideje zárt rendszerekben rövid, mert gyorsan α-trombinná alakul, ugyanakkor áramlási körülmények között jelentős mennyiségben halmozódik fel. Áramlási körülmények mellett az érfal mentén képződő trombin jelentős mennyisége (mintegy 50%-a) elsősorban antikoaguláns sajátságú. 66

Mann és mtsai A trombinképződés szerepe a vérzéscsillapításban és az érelzáródásban 233 Kis véna (0,002 0,05 cm) 0 nm Tm Nagy véna (0,06 nm Tm) Elasztikus artéria (0,1 nm Tm) Kapilláris (0,0005 0,0007 cm) Arteriola (0,002 0,02 cm) Közepes véna (0,15 1,5 cm) Közepes véna (0,15 1,5 cm) Kis véna (6,6 nm Tm) Muscularis típusú artéria/ Közepes véna (0,6 nm Tm) Kapilláris (200 nm Tm) Muscularis típusú artéria (0,1 1 cm) Arteriola (33 nm Tm) Elasztikus típusú artéria (1 2 cm) 5. ábra. A: Hipotetikus elrendezés, amely a trombomodulin lehetséges moláris koncentrációit mutatja az érhálózat különbözô területein. Alapfeltétel, hogy minden egyes endothelsejt trombomodulinkoncentrációja független attól, hogy milyen értípusból származik. B: A trombinképzôdés numerikus szimulációja az idô függvényében az 5A ábrán feltüntett trombomodulinkoncentrációkkal rendelkezô erekben szöveti faktor hatására. A Tm rövidítés a trombomodulint jelenti. Virchow azt feltételezte, hogy a fokozott alvadás forrása a vérben kering, vagyis a szöveti faktor forrása a vérben keresendő. A lehetséges mozgó célpontok közé tartoznak a gyulladásos vérsejtek, amelyek felszínükön szöveti faktort expresszálnak, és a sejtekből származó mikrorészecskék, amelyek szintén rendelkeznek szöveti faktorral. 67 70 Prokoagulánsokat nemcsak a vér szállít, azok származhatnak az endotheliumból is. In vitro körülmények között a nyugalomban lévő endothelium látszólag nem expresszál szöveti faktort olyan mennyiségben, hogy az véralvadási választ váltson ki, 67,71,72 ugyanakkor számos tanulmány igazolta, hogy gyulladásos citokinek hatására (tumornekrózisfaktor-α) ezek a sejtek jelentős mennyiségű szöveti faktort expresszálnak. 73 Ezzel szemben jól ismert, hogy gyulladásos citokinek jelenlétében a leukocyták, de különösen a monocyták felszínére kihelyeződik a belsejükben raktározott, erőteljesen prokoaguláns hatású szöveti faktor. Nagy valószínűséggel ezek a sejtek is a Virchow-féle szisztémás fokozott véralvadás mozgó forrásainak tekinthetőek. Hasonlóképpen, ha a sejtek mikrorészecskéi a keringésbe kerülnek, szintén a szöveti faktor mozgó forrásaivá válnak, lassú áramlás és károsodott endothelium mellett pedig vénás vérrögöt hoznak létre. 74 77 Ha a szöveti faktor felszabadulása lassú áramlással és károsodott helyi szabályozással társul, akkor az hirtelen nagy mennyiségű trombin képződését és az eret elzáró rög kialakulását okozhatja. A csúf rögök: artériás elzáródás Bár ismereteink a véralvadás vérzéscsillapításban betöltött szerepéről 300 évvel, a vénás trombózis tekintetében 200 évvel nyúlnak vissza, csak az utóbbi időben indultak el intenzív kutatások az artériás vérrögképződés vizsgálatának irányába. Az artériás és vénás rögök több szempontból is különböznek egymástól. Az artériás rögöket főként vérlemezkék alkotják (fehér thrombus), a nagy nyíróerőnek kitett erekben fordulnak elő, és az atheroscleroticus plakk sérülésekor az intravascularisan megjelenő szöveti faktor következtében is kialakulhatnak. 6,78 A klinikumban rutinszerűen warfarint használunk mind a vénás, mind az artériás véralvadás gátlására. Ugyanakkor, míg a szisztémás vérlemezke-aggregációt gátló szerek nagyrészt hatástalanok vénás trombózisban, artériás thrombus kezelésére alkalmasak. A szisztémás vérlemezkegátló kezelés profilaktikus alkalmazása meglehetősen hatékonynak bizonyult. 79,80 Az artériás thrombusban nagy mennyiségben felhalmozódó vérlemezkék valószínűleg a turbulens áramlás és a trombinképződést szabályozó tényezők együttesének eredménye. Áramlási körülmények között a trombin képződése protrombináz hatására elsősorban a nyíróerőtől függ. 81 83 Ha a protrombin egy érfalhoz kötött protrombinázkatalizátorral áramlási körülmények között aktiválódik, akkor a szubsztrát, vagyis a trombin az érfalhoz közeli oldószerből elsősorban csak diffúzióval jut el a katalizátorhoz, tehát a reakciótermék mennyiségét közvetlenül az érfalhoz közeli folyadékmennyiség szabja meg. Amint felgyorsul az áramlás, újabb oldószer kerül az adott érszakaszba, ami felhígítja az érfal mentén kép ződött trombint. A vérben a trombint nagy mennyiségű antitrombin veszi körül, ami megakadályozza a működését. Következésképpen, ha a véráramlás fokozódik, lecsökken az aktív trombin koncentrációja az érfaltól a lumen irányába, a trombinképződés helyétől távolodva. Biomechanikai szempontból áramlási körülmények között az immobilizált protrombináz katalizálta trombinképződést nagyrészt a hígulás szabályozza. Ha az áramlás fokozódik, az adott érszakaszon termelődött trombint többnyire kimossa a beáramló friss vér, így jelentősen lecsökken a trombin koncentrációja a képződés helyétől, az érfaltól kiindulva. A határréteg-koncentrációk numerikus áramlástani modellekkel jósolhatóak, ahol a koncentrációértékeket a képződés helyétől távolodva ábrázoljuk (7. ábra). Vénás áramlási sebesség esetén (100 s 1 ) jelentős trombinkoncentráció alakul ki a teljes érszakaszon. Ezzel szemben az artériás áramlási sebességgel mozgó vér gyorsan felhígítja a reakció helyén a trombint, így az nagy koncentrációban csak közvetlenül az érfal mellett található. Következésképpen azok a rendellenességek, amelyek csökkentik az áramlási sebességet, lecsökkentik az alacsony trombinkoncentrációjú érlument, ezzel utat engednek a rögképződésnek az artériás nyírási sebességgel rendelkező nagyerekben. Az áramlási paraméterek megváltozásában alapvető szerepet játszik az érszerkezet okozta áramláscsökkenés, a

234 Circulation Magyar Kiadás 2011. december 6. ábra. A protrombin aktiválódásának útvonalai. A protrombin két különbözô helyen történô hasításával keletkezô közti termék a trombin prekurzora, a pretrombin-2 és egy enzim, a meizotrombin. Az ábrát Krishnaswamy és munkatársaitól 64 vettük át, a szerzô engedélyével. Szerzôi joggal védett 1987, American Society for Biochemistry and Molecular Biology. plakkok kialakulása, valamint a vérlemezkék felszaporodása miatt bekövetkező változások, ezáltal megváltozik az érben termelődött trombin koncentrációja és egy stabil vérlemezkefibrin rög jön létre. A vérlemezkék alapvető szerepet töltenek be a vérzéscsillapításban, amelyet az is bizonyít, hogy mennyire függ a vérzési idő a működésüktől és a számuktól. 84 In vitro körülmények között a statikus vérben 10 000/µl alatti vérlemezke-koncentrációnál válik érzékennyé az alvadás, míg a propagációs fázisban a megfelelő trombinképződéshez megközelítőleg 200 000/µl vérlemezke szükséges. 85 A IIb/IIIa antagonista eptifibatid és Táblázat. A meizotrombin aktivitása Szubsztrát Relatív aktivitás (% α-iia)* Fibrinogén 7 65 Vérlemezkék 2 65 V. faktor 41 34 Trombomodulin és protein C 93 65 Trombomodulin éstafi 10 65 Antitrombin 25 65 TAFI = (thrombin-activatable fibrinolysis inhibitor) trombin által aktiválható fibrinolízis-inhibitor. *Az r-wt-α-iia és r(r155a, R271A, R284A)mIIa összehasonlításán alapul. abciximab, valamint az aszpirin negatívan befolyásolják a vérlemezkék funkcióját, ezzel jelentős hatással bírnak a trombinképződésre a propagációs fázisban. Ezeket a gyógyszereket az artériás érelzáródás megakadályozására használjuk. 86 90 A vérlemezkék az alvadási komplexek számára biztosítanak kötőhelyet, 41,91 de az artériás áramban a vérrögök kötődési helyéül is szolgálnak és valószínűleg az áramlást is akadályozzák, így elősegítik a rög lumenbe terjeszkedését, végső soron az ér elzáródását. Ha a teljes vér zárt, áramlástól mentes környezetben szöveti faktort tartalmaz, akkor mintegy 2 nmol/l-es trombinkoncentrációnál megkezdődik a vérlemezke-fibrin rög kialakulása. Tehát egy áramló rendszerben ez a helyi 2 nmol/l-es mennyiség már elegendő a fibrinrög létrejöttéhez. Ha a 2 nmol/l-es trombinkoncentrációt tekintjük a vérlemezke-fibrin rög kialakulási küszöbének, 92 akkor megbecsülhetjük a nyírás hatására kialakult rög függőleges magasságát, amellyel az érfaltól a lumenbe türemkedik (8. ábra). Ez az elemzés arra hívja fel a figyelmet, hogy egészséges artériás áramlás mellett az átáramló folyadék hígulása és a gátlás kialakulása jelentősen lecsökkentheti a rög lumenbe terjeszkedését, ha a nyírási sebesség növekszik. Így az erek átmérője is fontos szerephez jut. A folyadékok mechanikája és a geometria törvényei szerint nagy nyírási sebesség mellett érelzáródás vagy -rendellenesség jelenléte szükséges ahhoz, hogy egy kö-

Mann és mtsai A trombinképződés szerepe a vérzéscsillapításban és az érelzáródásban 235 7. ábra. A trombinkoncentrációk numerikus áramlástani modellje az érfaltól kiindulva vénás (100 s 1 ) és artériás (1000 s 1 ) nyírás mellett. Az ábra szerkesztéséhez Haynes és munkatársai 66 adatait használtuk fel. zepes átmérőjű érben elzáró thrombus alakuljon ki. Valószínűleg ez a jelenség és az érszerkezet eltérései az atheroscleroticus plakkal hozhatóak összefüggésbe, amelyben a vérlemezkék felszaporodása fehér thrombust hoz létre, és ez szintén a trombinképződés és a fibrin felhalmozódásának következménye. Ezenkívül a szerkezeti sajátosságok amelyek hatással vannak a nyírási sebességre a helyi trombinkoncentráció kialakulásában is befolyásolhatják a fibrin-vérlemezke thrombus biofizikai tulajdonságait és stabilitását. 45 Összefoglalás A véralvadás eredménye lehet kívánatos és nemkívánatos is. Az alvadási folyamat során a vérplazma összetevőiből trombin keletkezik, részt vesznek benne a vérlemezkék és a vascularis környezet nyújtotta körülmények. A jótékony rögöket általában az extravascularis környezet indukálja, míg kóros elzáródást okoz, ha a szöveti faktor megjelenik az érpályában. Habár mindkét esetben szükség van a vérlemezkékre, az artériás áramlás nagy nyíróereje fokozottan igénybe veszi őket, de mindkét kórfolyamat véralvadással társult generalizált gyulladásos szindrómákkal járhat. 93 A biokémiai, sejtbiológiai és biomechanikai jelenségek következményeként a vénás és artériás trombózis antikoaguláns kezelése természetében és intenzitásában is eltérő hatékonyságot mutat. A vascularis alvadási rendszerek (trombomodulin, EPCR, TFPI, heparán-szulfát proteoglikán) szerepére vonatkozó érhálózaton belüli minőségi és mennyiségi adatok nem állnak Nagy vénák (100 s 1 ) Kis artériák (1500 s 1 ) Bal arteria coronaria (460 s 1 ) Carotis communia (250 s 1 ) 8. ábra. Az érelzáródás mértékének hipotetikus becslése. Az elzáródás a helyhez kötött trombintermelő katalizátortól (protrombináz) 5 mm távolságban helyezkedik el, vérlemezkék nincsenek jelen. Az ábra áramlástani elemzések és áramló rendszerekben empírikusan meghatározott enzimkinetika kombinációján alapul. A kapott adatok alapján feltételezzük, hogy kisebb erekben nagy nyírás mellett a szöveti faktor indukálta trombinképzôdés csak a vérplazma alkotóival nem lenne képes érelzáródást okozni más, elzáródást okozó tényezők nélkül, például vérlemezkethrombus hiányában.