Biokémia II. Biokémiai szabályozás Szarka, András

Biokémia II. Biokémiai szabályozás Szarka, András

Biokémia II.: Biokémiai szabályozás Szarka, András Szerzői jog 2014 Szarka András

Tartalom Biokémia II. - Biokémiai szabályozás... vii Előszó... viii 1. Bevezetés... 1 2. Biokatalizátorok enzimek... 4 1. 2.1. Néhány szóban az enzimkinetikáról... 5 2. 2.2. Az enzimes katalízis háttere... 7 3. Enzimszabályozás... 10 1. 3.1. Allosztérikus enzimek... 13 1.1. 3.1.1. Kooperativitás... 15 1.2. 3.1.2. A hemoglobin szerkezete és oxigénkötése... 17 2. 3.2. Fehérjék térszerkezetének, aktivitásának befolyásolása foszforiláció/defoszforiláció által 23 3. 3.3. Limitált proteolízis... 27 3.1. 3.3.1. Inaktív zimogének és aktiválódásuk... 27 3.1.1. 3.3.1.1. Pepszinogén... 27 3.1.2. 3.3.1.2. Enterális proteázok zimogénjei... 28 3.1.3. 3.3.1.3. Proteázinhibitorok... 29 4. Fehérjefolding, fehérjelebontás ubikvitin-proteaszóma rendszer... 30 1. 4.1. Poszttranszlációs módosulások... 30 1.1. 4.1.1. Fehérjefolding... 30 1.1.1. 4.1.1.1. Hősokk-fehérjék molekuláris chaperonok... 31 2. 4.2. Sérült fehérjék proteolízise... 32 2.1. 4.2.1. Proteaszóma... 32 2.1.1. 4.2.1.1. A proteaszóma felépítése... 33 2.2. 4.2.2. A halál csókja Ubikvitináció... 34 2.3. 4.2.3. Számos fehérje irányított lebontás révén szabályozott... 36 5. A génexpresszió szabályozása... 38 1. 5.1. Génexpresszió, a gén kifejeződése... 38 1.1. 5.1.1. Sejtdifferenciáció... 38 1.1.1. 5.1.1.1. Azonosságok és különbségek a sejtek között... 39 1.2. 5.1.2. A génexpresszió szabályozásának szintjei... 40 1.3. 5.1.3. A génszabályozó fehérjék DNS-kötő részei... 41 1.4. 5.1.4. DNS-felismerő fehérjeszerkezeti egységek... 42 1.4.1. 5.1.4.1. Hélix-turn-hélix részletek... 43 1.4.2. 5.1.4.2. DNS-kötő cink-ujj részletek... 45 1.4.3. 5.1.4.3. β-redő... 46 1.4.4. 5.1.4.4. Leucin-cipzár... 46 1.4.5. 5.1.4.5. Hélix-loop-hélix részlet... 47 1.5. 5.1.5. DNS-kötő fehérjék detektálása... 49 2. 5.2. A genetikai kapcsolók munka közben... 50 2.1. 5.2.1. A triptofán-represszor, mint egyszerű génkapcsoló... 51 2.2. 5.2.2. A lac-operon: transzkripciós aktiválás/represszálás... 54 3. 5.3. Az eukarióta génexpresszió szabályozása... 55 3.1. 5.3.1. Eukarióta génregulációs fehérjék... 55 3.2. 5.3.2. Eukarióta DNS-reguláló szekvenciák... 56 3.3. 5.3.3. Génaktivátor fehérjék és a transzkripció... 57 3.3.1. 5.3.3.1. A génregulációs fehérjék szinergikusan dolgoznak... 60 3.3.2. 5.3.3.2. Eukarióta represszorok... 60 3.3.3. 5.3.3.3. Inzulátor DNS-szekvenciák... 61 4. 5.4. Az X-kromoszóma inaktiválása nőkben... 62 5. 5.5. DNS-metiláció... 64 5.1. 5.5.1. DNS-metiláció a genomi mintázatban... 65 5.2. 5.5.2. CG-szigetek... 67 6. Sejtkommunikáció... 69 1. 6.1. Az extracelluláris szignálmolekulák... 69 1.1. 6.1.1. A szignálmolekulák hatótávolsága... 71 iii

Biokémia II. 2. 6.2. Autokrin szabályozás... 73 3. 6.3. Gap junction... 73 4. 6.4. Plazmamembrán-receptorok... 73 4.1. 6.4.1. Receptor-ioncsatornák... 74 4.2. 6.4.2. Hét transzmembrán szegmenssel rendelkező, G-fehérje-kapcsolt receptorok 75 4.3. 6.4.3. Protein-kinázok, foszfoprotein-foszfatázok... 78 4.3.1. 6.4.3.1. camp-dependens protein-kináz (protein-kináz-a)... 78 4.3.2. 6.4.3.2. A cgmp-dependens protein-kináz (protein-kináz-g)... 80 4.3.3. 6.4.3.3. Protein kináz-c... 80 4.4. 6.4.4. Transzmembrán protein kinázok: növekedési faktor-receptor... 80 4.5. 6.4.5. Foszfoprotein-foszfatázok... 81 5. 6.5. A camp mediátorrendszer... 81 6. 6.6. Inozitol-foszfolipid jelátviteli rendszer... 83 7. 6.7. A guanilát-cikláz és a cgmp... 85 7.1. 6.7.1. Nitrogén-monoxid... 86 7. Összetett folyamatok szabályozása... 87 1. 7.1. Éhezés jól tápláltság... 87 1.1. 7.1.1. A glikolízis glukoneogenezis szabályozása... 87 1.2. 7.1.2. A glikogén felépítés lebontás szabályozása... 89 2. 7.2. Programozott sejthalál: Apoptózis... 92 3. 7.3. Sérült fehérjeválasz (UPR) az endoplazmás retikulumban... 96 8. Utószó... 101 9. Ábraanyag... 102 10. Felhasznált és ajánlott irodalom... 106 iv

Az ábrák listája 1.1. A sejt mint vegyipari üzem... 1 2.1. Az enzimek, mint biokatalizátorok... 4 2.2. Tipikus Michaelis Menten-kinetikát követő enzim szubsztrátkoncentráció-sebesség ábrázolása 7 2.3. Az enzimek legfontosabb katalitikus stratégiái... 8 2.4. A lizozim katalitikus mechanizmusa... 8 2.5. Az egyik leggyakrabban előforduló prosztetikus csoport, a hem, szerkezete... 9 3.1. A sejtben folyó biokémiai reakciók összessége... 10 3.2. Feed-back gátlás. A metabolikus út egy korai szakaszán található enzimet a metabolikus út egy későbbi szakaszának terméke gátolja... 11 3.3. Többszörösen elágazó (aminosav) metabolikus út szabályozása feed-back gátlással... 11 3.4. Pozitív allosztérikus reguláció... 13 3.5. Negatív allosztérikus reguláció... 14 3.6. Egy- és több alegységes enzimek inhibitor koncentráció relatív enzimaktivitás összefüggése 15 3.7. Két azonos alegységből álló enzim kooperatív-allosztérikus átmenete... 15 3.8. A mioglobin monomer szerkezete... 17 3.9. A hemoglobin tetramer szerkezete... 17 3.10. A hemoglobin és a mioglobin oxigéntelítési (szaturációs) görbéje... 18 3.11. A hemoglobin oxigénkötésre elszenvedett térszerkezet-változása... 19 3.12. A 2,3-biszfoszfoglicerát... 20 3.13. A hemoglobin és a 2,3-biszfoszfoglicerát kapcsolata... 21 3.14. A hemoglobin oxigéntelítési görbéje különböző ph-értéken (Bohr-effektus)... 22 3.15. Fehérje foszforiláció/defoszforiláció... 23 3.16. Szerin-/treonin- és tirozin-foszforiláció... 24 3.17. Protein kináz háromdimenziós szerkezete... 24 3.18. Kináz-kaszkád-erősítő... 25 3.19. Fehérjék aktivitásának befolyásolása foszforilációval/defoszforilációval... 26 3.20. A pepszinogén aktiválódása limitált proteolízissel... 28 3.21. Az enterolis proteázok zimogénjükből történő aktíválódása limitált proteolízissel... 28 4.1. Fehérjék transzlációjával párhuzamosan zajló folding... 30 4.2. A hsp70-család munka közben... 31 4.3. A hsp60 család szerkezeti felépítése és működése... 32 4.4. Fehérjeminőségi kontroll... 32 4.5. A proteaszóma felépítése... 33 4.6. A fehérjéhez kapcsolt ubikvitinláncok különböző szignaling jelentése... 34 4.7. A fehérjék ubikvitinációja... 35 4.8. Az ubikvitin-ligáz szabályozása... 36 4.9. Degradációs szignálok kialakulása... 36 5.1. A molekuláris biológia centrális dogmája... 38 5.2. A sejtdifferenciáció a génexpresszió megváltozása, nem a nukleotidszekvenciáé... 39 5.3. A génkifejeződés szabályozásának szintjei... 40 5.4. A DNS-kötő fehérjék kapcsolódási helye a DNS-molekula külső felszínén... 41 5.5. A nagyárok és a kisárok értelmezése a glikozidos kötések egymással bezárt szögei alapján... 42 5.6. A hélix-turn-hélix fehérjerészlet felépítése és kapcsolódása a DNS-hez... 43 5.7. A szimmetrikus DNS-regulációs szekvencia és hozzá kötődő DNS-felismerő fehérje dimer... 43 5.8. A homeodomén fehérjecsalád tagjait kódoló géneket érintő mutációk következménye (Drosophila melanogaster)... 44 5.9. A cink-ujj fehérjerészletek első csoportjának szerkezeti felépítése, illetve a klaszterképzés... 45 5.10. A leucin-cipzár fehérjerészlet szerkezete és kötődése a DNS-hez... 46 5.11. A hélix-loop-hélix fehérjerészlet szerkezete és kapcsolódása a DNS-hez... 48 5.12. Hélix-loop-hélix fehérjerészlet aktivitásának szabályozása heterodimerizációval... 48 5.13. A gél mobility shift assay (electrophoretic mobility shift assay, EMSA) működési elve... 49 5.14. A triptofán operon elemei... 51 5.15. A transzkripció lépései (1.promóter felismerése a σ-faktor által, 2.a DNS-szál felnyitása, 3. RNSszál szintézisének kezdete(iniciáció), 4. az első tíz nukleotid szintézise,5. a σ-faktor leválása a komplexről, RNS-szintézis felgyorsul (elongáció), 6. a szintézis a terminátor régióig folyik, majd a kész RNS-szál leválik a komplexről, 7. a σ-faktor ismét elfoglalja helyét az RNS-polimeráz komplexben)... 51 v

Biokémia II. 5.16. A triptofán-represszor fehérje működése... 52 5.17. A triptofán-represszor fehérje szerkezetének és DNS-kötő képességének megváltozása a két bekötődő triptofánmolekula hatására... 53 5.18. A lac-operon kettős szabályozása a lac-represszor fehérje, illetve a CAP camp-komplex által 54 5.19. A DNS hurokképzése az enhancer- és a promóterrégiók között lehetővé teszi egymástól távoli szekvenciák egymásra hatását... 56 5.20. Az eukarióta gén szabályozási régiójának elemei... 57 5.21. Nukleoszóma-remodellezés... 58 5.22. Kovalens hisztonmódosítás... 59 5.23. A szabályozó fehérjeelemek összeszerelődése különböző funkciójú regulátorkomplexekké a DNS felületén... 60 5.24. Az enhanszoszóma felépítése... 61 5.25. Az inzulátorszekvenciák elhelyezkedése és funkciója... 62 5.26. Az X-kromoszóma inaktiválódása (kondenzálódása) a női embrionális testi sejtekben... 62 5.27. Az X-kromoszóma inaktiválódásának mechanizmusa... 63 5.28. A DNS-metiláció mechanizmusa, a fenntartó metilázok működése... 64 5.29. A genomi lenyomat hatása a génexpresszióra... 66 5.30. Az Igf2-gén metilációs lenyomata... 66 6.1. A celluláris jelátvitel szintjei... 69 6.2. Sejtfelszíni receptorok... 70 6.3. Intracelluláris magreceptorok... 70 6.4. A szignálmolekulák hatótávolsága... 71 6.5. Az extracelluláris jelre adott válasz természete, reakcióideje... 72 6.6. Az acetilkolin-nikotin receptorának izom-altípusa, az alegységek (a), az alegységek transzmembránrégiói(b), illetve az acetilkolin-kötőhelyek felülnézetből(c)... 74 6.7. A G-fehérje mint jelátviteli kapcsoló... 75 6.8. A G-fehérjék szerkezeti felépítése... 76 6.9. A G-fehérjék működés közben... 77 6.10. A camp-dependens protein-kináz felépítése... 78 6.11. A camp-dependens protein-kináz regulációja... 79 6.12. A protein kináz C felépítése és aktiválódása... 80 6.13. Transzmembrán tirozin-kináz (receptor)... 81 6.14. A camp-mediátorrendszer működés közben... 82 6.15. A camp-dependens protein kináz (PKA) szerepe a génszintű szabályozásban... 83 6.16. A foszfolipáz-c aktiválása és működése... 84 6.17. Az IP3-jelátviteli útvonal... 85 7.1. A foszfofruktokináz allosztérikus regulátorai... 88 7.2. A glikolízis/glukogeogenezis hormonális szabályozása: a foszforuktokináz II foszforilációval/defoszforilációval történő szabályozása, a camp szint hatása a glikolízis, glukoneogenezis szabályozására... 89 7.3. A glikogénlebontás (felépítés) szabályozása izom- és májsejtekben... 91 7.4. A nekrótikus és az apoptotikus sejthalál közötti morfológiai és folyamatbeli különbségek... 93 7.5. A halálligandon halálreceptoron keresztül bonyolódó külsődleges (extrinszik), illetve a mitokondrium külső membrán sérülésén, a citokrom c felszabadulásán keresztül zajló, belsődleges (intrinszik) apoptotikus útvonalak... 95 7.6. Az endoplazmás retikulum stresszt és a következményes sérült fehérjeválaszt kiváltó különböző fiziológiás, patológiás, illetve kísérleti tényezők... 97 7.7. A sérült fehérjeválasz folyamatai... 98 7.8. Az endoplazmás retikulum kiváltotta UPR, illetve az UPR elbukását követő endoplazmás retikulum eredetű apoptózis folyamata... 99 vi

Biokémia II. - Biokémiai szabályozás Szarka András Budapesti Műszaki és Gazdaságtudományi Egyetem, Semmelweis Egyetem, 2014 Szarka András Typotex Kiadó, www.typotex.hu ISBN: 978-963-279-170-8 Creative Commons NonCommercial-NoDerivs 3.0 (CC BY-NC-ND 3.0) A szerző nevének feltüntetése mellett nem kereskedelmi céllal szabadon másolható, terjeszthető, megjelentethető és előadható, de nem módosítható. Készült a TÁMOP-4.1.2/A/1-11/1-2011-0079 számú, Konzorcium a biotechnológia aktív tanulásáért című projekt keretében. vii

Előszó A Biokémia II. Biokémiai szabályozás című tankönyv másodéves biomérnök hallgatók számára készült, akik a Biokémia I. tantárgy során már elsajátították a biokémiai, molekuláris biológiai alapismereteket. Ezeket alapul véve, ezekre építkezik a tankönyv, amely kiemelten a biokémiai szabályozásokkal foglalkozik. A szabályozástechnika, legyen az biológiai vagy más természetű, mindig a legnagyobb kihívást jelentő területek egyike. A tankönyvet igyekeztünk úgy felépíteni, hogy a részelemek ismertetését követően egyszerűbb, majd egyre összetettebb problémák felé haladjunk. Reméljük, sikerült mindezt világos gondolatmenet mentén megtennünk, és legalább akkora örömet jelent a tankönyv olvasása, a sejtünk titkaiba való bevezetés, mint a tankönyv kigondolása és megírása jelentett a szerző számára. Budapest, 2013. nyár Szarka András viii

1. fejezet - Bevezetés A tankönyv elején érdemes tisztázni, hogy mivel is foglalkozik a biokémiai szabályozástechnika. A kérdés megválaszolásához vegyük a következő példát. Tekintsünk úgy a sejtre, mint egy vegyipari üzemre. Nézzük meg, milyen hasonlóságok és analógiák vonhatók az üzem és a sejt között: üzem fal különböző specializálódott egységek sejt sejtmembrán sejtorganellumok, kompertimentumok például: energiaellátó központ mitokondrium (kloroplaszt-növényekben) raktár gépgyártó sor végszerelde központi irányítás, információszolgáltatás, elosztás 1.1. ábra - A sejt mint vegyipari üzem vakuólum (bizonyos értelemben az ER is) riboszómák endoplazmás retikulum (ER) sejtmag 1

Bevezetés Az üzemet nyilvánvalóan el kell látni energiával. A sejt esetében ez az energia leggyakrabban a glükózból származik. A hulladék anyagokat is el kell távolítani a sejt (üzem) zavartalan működéséhez. Ilyen hulladék a CO 2, illetve egyéb toxikus vegyületek, amelyek a sejt működése során keletkeznek. Az üzem életének szigorúan szabályozott körülmények között kell folynia: a. Szigorúan meghatározott mennyiségű gépet, terméket kell előállítania. Sem a túltermelés, sem a hiány nem megengedett. b. Az egyes gyártási lépések között sem tolerálható a köztes anyagok hiánya, feleslege. c. Az energiafelhasználás (anyagfelhasználás) optimalizálására törekszünk. Ezek együttesen biztosítják az optimális gépmennyiséget. d. Fontos az egészséges munkakörülmények biztosítása, a külső vagy belső gyártás során keletkező mérgek, szennyezőanyagok eliminálása. Mindezek biztosításához szigorúan össze kell hangolni a részlépéseket, munkafolyamatokat, az egyes alapanyagok, köztitermékek, késztermékek transzportfolyamatait. A sejt esetében ezen folyamatokkal foglalkozik a biokémiai szabályozástechnika. Tanulmányaink során: 1. megismerjük a sejt gépeit, az enzimeket (mi az enzimek szerepe, milyen fontos tulajdonságokkal bírnak) 2. a biokémiai alapfolyamatokat több szinten szabályozhatjuk (a sejt működési hatásfoka [intenzitása], valamint a sejt gépeinek száma is szabályozható) a. az enzimaktivitás szabályozásának lehetőségei: i. gátlások ii. szabályozások 1. allosztérikus enzimek 2. proteolitikus hasítás 3. foszforiláció a fehérjék születése: transzláció poszttranszlációs módosulások a fehérjék aktív állapota a fehérjék bukása ubikvitizáció lebomlások, proteaszóma b. a gépek számának változtatása az enzimmennyiségek változtatása, szabályozása i. sejtdifferenciáció és génexpresszió szabályozása ii. a génexpresszió szabályozásában résztvevő DNS-t kötő fehérjék: 1. hélix-turn-hélix 2. cink-ujj fehérje 3. leucin-cippzár 2

Bevezetés 4. hélix-loop-hélix iii. a DNS-t felismerő fehérjeszakaszok azonosítása iv. a gének ki- és bekapcsolása 1. lac-operon 2. triptofán-represszor 3. eukarióta sejtek transzkripciós szabályozása a. transzkripciós faktorok b. promóterek c. génregulációs szekvenciák d. génregulációs fehérjék v. sejtdifferenciálódás vi. poszttranszkripciós szabályozások vii. a sejtszintű információáramlás: szignál-transzdukció 1. általános kitekintés: receptorok, ligandok 2. extracelluláris jeltovábbítás: paraszimpatikus és endokrin lehetőségek 3. sejtmag receptorok: szteroid receptorok 4. sejtfelszíni receptorok: a. ioncsatorna-kapcsolt b. G-fehérjéhez kapcsolt c. enzimkapcsolt viii. célsejt adaptáció receptor leszabályozás ix. összetett folyamatok 1. glikolízis, glikogén lebontás/felépítés, vércukorszint-szabályozás 2. apoptózis, sérült fehérjeválasz (UPR) 3

2. fejezet - Biokatalizátorok enzimek Az enzimek szabályozásával kapcsolatos ismeretek megértéséhez szükségünk van bizonyos termodikai alaptudásra. Nézzük a következő reakciót: papír + O 2 füst + hamu + hő + CO 2 + H 2O A papír elég, hőenergiát juttat az atmoszférába, valamint vizet és széndioxidot, viszont a füst és a hamu ezekkel a dolgokkal és a melegített levegővel sohasem képes papírrá visszaalakulni. Amikor a papír elég, kémiai energiája, mint hőenergia disszipálódik. Ezzel egy időben a papír atomjai, molekulái szétszóródnak, rendezetlenek lesznek. A termodinamika nyelvén mondva szabadenergia-veszteség, szabadenergia-csökkenés következik be. Ezt az energiát használjuk fel munkavégzésre vagy kémiai reakciók végrehajtására. Általánosan elmondhatjuk: a kémiai reakciók mindig a szabadenergia-csökkenés irányába mennek végbe. Vagyis a reakciók spontán iránya az energetikailag kedvezőbb irány. Normál körülmények között a szén energetikailag legstabilabb formája a széndioxid és a hidrogéné a víz. Az élő szervezetek mégsem válnak széndioxidköddé és a papír sem kezd el lángolni kezeink között. Ennek oka, hogy az élő szervezet és a füzet molekulái egy viszonylagos stabil állapotban találhatóak és ahhoz, hogy alacsonyabb energiaszintre kerüljenek, energiát kell befektetni. Magyarul a molekuláknak aktivációs energiára van szükségük ahhoz, hogy egy jóval stabilabb (alacsonyabb energiájú) állapotba kerüljenek (2.1. ábra). Az égő füzet (papír) esetében az aktivációs energiát egy meggyújtott gyufa jelenti. A vizes oldatban található molekulák számára az energiagáton történő átjutást a szomszédos molekulákkal történő ütközés teremti meg (amely a hőmérséklet emelkedésével egyre gyakrabban következik be). 2.1. ábra - Az enzimek, mint biokatalizátorok Az energiagát átugrását az élő szervezetben az enzimek segítik. Ez az energiagát-csökkentés annyira jelentős mértékű lehet, hogy az enzimek akár (több)milliószorosára is gyorsíthatják a reakciókat. Emiatt szabályozásuk 4

Biokatalizátorok enzimek kiemelt fontossággal bír a sejt életében, metabolizmusában. A reakció végén maguk változatlanok maradnak. Ezért tekinthetjük őket biokatalizátoroknak. Hasonlóan bármely katalizátorhoz, kizárólag termodinamikailag lehetséges reakciókat katalizálnak, mivel csak az aktivációs energiát csökkentik, ezáltal hihetetlenül megnövelve a reakcióba lépő molekulák számát (2.1. ábra); tekintve, hogy általában fehérjemolekulák, reakcióra és/vagy szubsztrátra specifikusak; (Hasonlóan bármely katalizátorhoz) Maguk nem változnak a reakció során. A hasonló reakciókat katalizáló enzimeket egyazon funkcionális csoportba soroljuk. 1. Oxidoreduktázok pl.: etanol + NAD + acetaldehid + NADH + H + 2. Transzferázok pl.: glukóz + ATP glukóz-6 foszfát + ADP 3. Hidrolázok pl.: glukóz-6-foszfát + H 2O glukóz + P i 4. Liázok pl.: 2-foszfoglicerát foszfoenolpiruvát + H 2O 5. Izomerázok pl.: glukóz-6-foszfát fruktóz-6 foszfát 6. Ligázok pl.: glutamát + NH 3 + ATP glutamin + ADP + P i A csoporton belül minden enzim specifikus, csak egy adott reakciót katalizál viszonylag szűk szubsztrát tartományon belül (gyakran csak egyetlen meghatározott molekula [szubsztrát] átalakítására képes). Például: A hexokináznak a D-glukóz szubsztrátja, de az L-glukóz már nem szubsztrátja. A trombin a fibrinben csak egy adott arginin és a szomszédos glicin között hasít, máshol nem. Természetesen ez a specifikusság különböző mértékű lehet, előfordul, hogy egy adott reakciótípusra, vagy adott funkciós csoportra korlátozódik csak, de ismertek kizárólag egyszubsztrátos enzimek is. Az enzimek hálózatot alkotnak. Az egyik enzim terméke igen gyakran egy másik szubsztrátja és így tovább. Ennek eredménye az anyagcsere utak hálózata, az energiaellátás biztosítása és a különböző molekulák szintézise. 1. 2.1. Néhány szóban az enzimkinetikáról Az enzimes reakciókkal kapcsolatos, alapvető reakciókinetikai összefüggéseket, törvényszerűségeket a következő egyszerű, egyszubsztrátos enzimes reakción szeretnénk bemutatni: Az adott idő alatt az enzim által megkötött és átalakított szubszrátmolekulák száma behatárolt. Ha növeljük a szubsztrátok számát, egy maximum értékig növekszik az átalakított szubsztrát/keletkezett termék mennyisége. Ebben a pontban az enzimünk telítődött szubsztrátjával és a reakció sebessége (V max) csak attól 5

Biokatalizátorok enzimek függ, hogy milyen gyorsan képes az enzim a szubsztrátot átalakítani. A maximális sebességet az enzim koncentrációjával osztva megkapjuk az enzim átviteli számát, mely az angolszász irodalomban turnover number néven ismeretes. Ennek értéke egy és tízezer között szokott lenni, általában ezer körüli. Az enzimműködés kvantitatív jellemzése elengedhetetlen az enzimek megismerése során, illetve széleskörű, irányított ipari felhasználásukhoz. Tekintsük ismételten a következő egyszubsztrátos reakciót: A reakcióval kapcsolatban a következő egyszerűsítéseket tesszük: Feltételezzük, hogy az enzim (E) és a termék (P) között annyira ritkán játszódik le enzim-szubsztrát komplexet (ES) eredményező reakció, hogy ezt el is hanyagolhatjuk. Ekkor az EP komplexet nem szükséges megjelenítenünk és a reakció előrehaladását, azaz a sebességét a következőképp fejezhetjük ki: V = kcat [ES] Ebben az esetben [ES] az enzim-szubsztrát komplex koncentrációja, k cat, az átviteli szám, ami megadja, hogy egy enzimmolekula egy másodperc alatt hány szubsztrátmolekulát alakít át. Az ES komplex koncentrációja az enzim és szubsztrát molekulák összekeverését követően hirtelen nő, míg el nem éri az egyensúlyi állapotot (steady state). Ebben az állandósult állapotban koncentrációja jó közelítéssel állandónak vehető: ES fogyás = ES képződés k -1[ES] + k cat [ES] = k 1 [E][S] A szabad enzim koncentrációja: [E] = [E 0] - [ES] Behelyettesítve: Vezessük be a Km Michaelis-konstanst: Ekkor Illetve visszaírva: V = k cat [ES] Megkapjuk a híres Michaelis Menten-egyenletet: Ha növeljük a szubsztrát mennyiségét, egy maximum értékig növekszik az átalakított szubsztrát/keletkezett termék mennyisége. Ebben a pontban az enzimünk telítődött szubsztrátjával (tehát minden enzimmolekula szubsztrátot köt) és a reakció sebessége V max. Ezt a sebességet abban a pontban érjük el, ahol: V = V max = k cat [E 0] 6

Biokatalizátorok enzimek Ez alapján a Michaelis Menten-egyenlet általános formája a következő: Az egyenletet grafikusan ábrázolva egy hiperbolát kapunk. A grafikus ábrázolás segítségével meghatározhatóak az enzim kinetikai paraméterei a v max és a K m. A K m értéke egyszerűen megkapható, mint a v max/2 sebességhez tartozó szubsztrátkoncentráció (2.2. ábra). 2.2. ábra - Tipikus Michaelis Menten-kinetikát követő enzim szubsztrátkoncentrációsebesség ábrázolása 2. 2.2. Az enzimes katalízis háttere Az enzimek különösen nagymértékben gyorsítják meg a reakciókat. Ez számos különböző tényezőnek tudható be. Lássuk, melyek ezek: 1. Az enzimek a katalitikus hely környezetében megnövelik a lokális szubsztrátkoncentrációt (azáltal, hogy megkötik őket), valamint a reakció megkívánta helyes orientációban tartják a megfelelő atomokat. 2. Talán a legfontosabb, hogy a kötési energia (szubsztrát kötés) hozzájárul a közvetlen katalízishez. A szubsztrátmolekuláknak számtalan különböző geometriájú és elektron-eloszlású köztes állapoton kell keresztülmenniük, mielőtt a reakció végét jelentő formába jutnak. A legstabilabb átmeneti állapot felvételéhez szükséges szabadenergia-mennyiség az aktivációs energia. Igazából ez határozza meg a reakció sebességét. Az enzimek jóval nagyobb affinitással bírnak az átmeneti állapotú szubsztrát, mint a stabil forma irányába. Ez a szoros kötés nagymértékben csökkenti az aktivációs energiát, így jelentősen meggyorsítja a reakciót. Az enzimek tehát többféle generális stratégiát vetnek be a katalízis során. A legfontosabbak: a. az enzim megköti és pontosan orientálja egymáshoz a szubsztrátokat b. a szubsztrát megkötésével az enzim átrendezi annak elektroneloszlását, részlegesen + és - részeket eredményezve 7

Biokatalizátorok enzimek c. az enzim megfeszíti a megkötött szubsztrátmolekulát, ezzel az átmeneti állapot felé tolva 2.3. ábra - Az enzimek legfontosabb katalitikus stratégiái Katalitikus antitestek Az orientációs hatás jelentőségét segítenek megérteni az ún. katalitikus antitestek. Ezek, az enzimhez hasonló térszerkezetük révén, stabilizálják az átmeneti állapotú molekulákat, így meggyorsítva az alapreakciót, igaz, nem az enzimhez hasonló mértékben (kb. 10 000- szeresére). Természetesen az enzimek más úton-módon is hozzájárulnak a reakció minél gyorsabb végbemeneteléhez. Pl. pontosan pozícionált atomokat tartalmaznak, amelyek képesek a szubsztrát (átmeneti állapotú molekula) elektronszerkezetét deformálni. A következőkben a lizozim segítségével nézzünk meg egy konkrét példát az enzimes katalízisre. A lizozim tulajdonképpen egy természetes antibiotikum. Megtalálható a tojásfehérjében, a nyálban, a könnyben, illetve egyéb szekrétumokban. A bakteriális sejtfal poliszacharidjait bontja, egészen pontosan az 1-4-es glikozidos kötéseket az N-acetil-muraminsav és az N-acetilglukózamin között. Ennek hatására a baktériumok nem képesek ellenállni a turgornyomásnak és szétdurrannak. Az enzimet még Fleming fedezte fel és nevezte el 1922-ben. Kisméretű (14602 Da), könnyen izolálható. Így nem csoda, hogy ez volt az első enzim, amelynek röntgendiffrakciós szerkezete ismertté vált. 2.4. ábra - A lizozim katalitikus mechanizmusa A lizozim által katalizált reakció, poliszacharidláncok hidrolízise, egy energetikailag kedvező, tehát szabadenergia-csökkenéssel járó reakció. Az enzim távollétében azonban vígan elvannak ezek a poliszacharid láncok még vizes közegben (oldatban) is, bármilyen észrevehető bomlás, hidrolízis nélkül. Ez érthető, hisz a korábban említett energiagát jelen esetben is érezteti hatását. A két cukormolekulát összekötő kötés kizárólag abban az esetben hasad fel a hozzá ütköző vízmolekula hatására, ha a poliszacharidlánc adott szerkezeti torzuláson megy keresztül, felveszi az átmeneti állapotot, amelyben a kötés körüli atomok geometriája és elektroneloszlása megváltozik. Ez random módon csak igen ritkán következik be, azonban jelentősen megváltozik a helyzet, amennyiben az oldat lizozimet is tartalmaz. A lizozim aktív helye, tekintve, hogy szubsztrátja egy polimer, egy hosszanti árok, amely egyszerre hat egymáshoz kapcsolt cukrot tud megkötni. A lizozim sajátságos módon tartja a szubsztrátját, úgy, hogy kifordítsa a kötésben részt vevő cukrok egyikét, kitörve a stabilis konformációjából. A felhasítandó kötést úgy pozícionálja, hogy közel kerüljön az aktív hely két savas karakterű aminosavához (egy glutamáthoz és egy aszpartáthoz) (2.5. ábra). Az enzim az enzim- 8

Biokatalizátorok enzimek szubsztrát komplexben a bal oldali cukrot kifeszített, egyenes konformációban tartja, miközben a 35-ös glutamáttal mint savval támadja a cukor-cukor kötést, protont donálva a jobb oldali cukornak, illetve ellensúlyként az 52-es aszpartáttal támadja a C1-szénatomon (2.5. ábra). Ennek következtében kialakul egy kovalans kötés az 52-es aszpartát és a cukormolekula C1-szénatomja között. Mindeközben a 35-ös glutamát egy vízmolekulát (pirossal jelölve) polarizál, hogy annak oxigénatomja megtámadhassa a C1-szénatomot, így kiváltva az 52-es aszpartátot. A vízmolekula (pirossal jelölve) reakciója befejezvén a hidrolízist, visszaállítja az enzim eredeti állapotát, miközben létrejön az enzim-termék komplex (2.5. ábra). Az enzimek működésükhöz nem fehérje és nem aminosav részeket is igényelnek. Ezek egy része kovalensen kapcsolódik az anya fehérjelánchoz. Ezeket nevezzük prosztetikus csoportoknak. A fehérjeláncokhoz kapcsolódó nem aminosav alkotók lehetnek fémionok vagy szerves molekulák (koenzimek, lipidek, cukrok) (2.6. ábra). 2.5. ábra - Az egyik leggyakrabban előforduló prosztetikus csoport, a hem, szerkezete Az enzimek megfelelő működésének alapja a szubsztráthoz való megfelelő hozzáférés. Ha egy reakció diffúziólimitálttá válik és/vagy az egyik enzimreakció terméke a másik kiindulási anyaga, multienzimkomplexek jönnek létre. Ez hatékonyabb működést (magasabb szubsztátkoncentrációt) eredményez. Magasabb szubsztátkoncentráció kompartmentalizáció révén is biztosítható. 9

3. fejezet - Enzimszabályozás A korábbiakban láttuk, hogy egy-egy enzim több milliószorosára, akár milliárdszorosára képes az általa katalizált reakció sebességét megnövelni. Ha figyelembe vesszük, hogy egy élő sejt az enzimek ezreit tartalmazza a kis citoszolban vagy más kis térfogatú kompartimentumban, továbbá, hogy ezek egy összetett metabolikus hálózatot alkotnak, melyben igen gyakran az egyik enzim terméke a másik szubsztrátja, továbbá, hogy ez a hálózat az elágazási pontok tömkelegét tartalmazza, beláthatjuk, hogy mindezek következtében pontos, precíz szabályozásra van szükség a problémamentes anyagcsere, sejtműködés lebonyolításához. Az anyagcsere összetettségéről és a szabályozási feladat által képviselt kihívásról képet kaphatunk, ha a 3.1. ábrára tekintünk, melyen néhány unatkozó biokémikus összefoglalta a sejtben folyó biokémiai reakciókat. 3.1. ábra - A sejtben folyó biokémiai reakciók összessége A sejt életfolyamatainak szabályozása tehát igen jelentős mértékben az azokat katalizáló enzimek mennyiségének, illetve aktivitásának szabályozására vezethető vissza. A szabályozás több szinten valósulhat meg: 1. Befolyásolható az enzimmolekulák száma ez majdnem kizárólagosan a génexpresszió szabályozása révén történik. 2. A sejt specializált kompertimentumokba telepíti a folyamatokat (enzimeket), itt a szubsztrátkoncentrációt a citoszoltól eltérően alakíthatja. 3. Célzott fehérjelebontással az enzim (fehérjék) féléletidejét befolyásolhatja. 4. A leggyorsabb és legáltalánosabb módszer a reakció sebességének befolyásolására az enzimaktivitás közvetlen és reverzibilis befolyásolása speciális molekulák segítségével, amelyek végső soron a fehérje térszerkezetének változásán keresztül fejtik ki hatásukat. A szabályozási szintek tárgyalását a legáltalánosabb 4. pontban ismertetett esettel, a már elkészült fehérjemolekulák aktivitásának befolyásolásával kezdjük. Kulcsmondatunk a következő lesz: A fehérjék térszerkezete és funkciója szinonim fogalom. 10

Enzimszabályozás Ez a mondat igen jól összefoglalja a fejezet lényegét, amennyiben befolyásoljuk, megváltoztatjuk egy fehérje térszerkezetét, akkor, az maga után vonja annak funkció- és aktivitásváltozását is! Az ilyen jellegű szabályozás igen gyakran feed-back gátlás formájában valósul meg. Feed-back gátlás során az enzimet, amely a metabolikus út egy korai szakaszán található, egy a metabolikus út későbbi szakaszának terméke gátolja. Így amikor a termék elkezd felgyülemleni, az gátolja az első enzimet, limitálva (megakadályozva), hogy további szubsztrátmolekulák lépjenek be a metabolikus útvonalba (3.2. ábra). 3.2. ábra - Feed-back gátlás. A metabolikus út egy korai szakaszán található enzimet a metabolikus út egy későbbi szakaszának terméke gátolja Amikor az útvonalak elágaznak vagy egymást keresztezik, akkor többszörös szabályozópontok alakulnak ki, amelyeket a következő végtermékek kontrollálnak, mindegyik saját szintézisét befolyásolva (3.3. ábra). 3.3. ábra - Többszörösen elágazó (aminosav) metabolikus út szabályozása feed-back gátlással 11

Enzimszabályozás 12

Enzimszabályozás A feed-back inhibíció azonnal működésbe lép és gyorsan megszűnik, amint a termék szintje csökken. Amennyiben ez a típusú szabályozás csökkenti az enzim aktivitását, negatív szabályozásról beszélünk (3.2. ábra). Amennyiben a szabályozómolekula növeli az enzim aktivitását, pozitív szabályozásról beszélünk. Ebben az esetben a metabolikus útvonal egyik ágának terméke egy másik metabolikus útvonal enzimét aktiválja. Pl. az ADP feldúsulása aktiválja a cukor lebontásában résztvevő enzimeket, hogy az ADP ATP-vé alakulását elősegítse. Gyakran előfordul, hogy az anyagcsereút elő anyaga aktiválja a belépést katalizáló enzimet. Egymással ellentétes folyamatok esetén egy bizonyos molekula az egyik út számára allosztérikus aktivátorként, míg a visszafelé folyó út enzime számára allosztérikus inhibitorként viselkedik, így biztosítva az ellentétes utak koordinálását. 1. 3.1. Allosztérikus enzimek A szabályozás elnevezése igen találó magában hordozza, annak lényegét: Allos= másik Steros=szilárd vagy háromdimenziós (térbeli) Egy szubsztráttól különböző molekula az enzim egy regulációs helyéhez kötődik (amely hely nem azonos az aktív hellyel), ezáltal befolyásolva annak aktivitását. A szabályozómolekula alakja gyakran teljesen eltérő a szubsztráthoz képest. Tehát az aktív helyhez kötődik a szubsztrát, a regulátormolekula pedig a regulációs helyhez. A két kitüntetett helynek kommunikálnia kell, hogy a regulátormolekula bekötése befolyásolhassa az aktív helyet. Ez a kommunikáció a fehérje térszerkezet-változásán keresztül valósul meg. A bekötődő szabályozómolekula konformáció változást, ez pedig aktivitásváltozást eredményez. Úgy gondoljuk, hogy a fehérjék jelentős része allosztérikus: enzimek, receptorok, szerkezeti fehérjék, motorfehérjék. A ligandok azt a konformációt stabilizálják, amelyikhez a legerősebben kötődnek, így kellően magas ligandkoncentrációnál a fehérje ezen konformációja lesz bekapcsolva. Az alaposabb megértéshez vegyük a következő példát. Adott egy fehérje, amelynek két kötőhelye van elkülönülten. Az egyikkel a szubsztrátját, a glukózt, a másikkal egy regulátormolekulát, X-et köt. Ha a glukóz bekötődése megváltoztatja az X-kötőhely alakját, akkor a két kötőhely kapcsolt. Ha mindkét ligand ugyanazon fehérje konformációt részesíti előnyben, akkor bármelyik bekötése növeli a fehérje másik irányába mutatott affinitását. Tehát ha a zárt forma köti legjobban a glukózt és ez a zárt forma szintén kedvezőbb az X-kötőhely számára, hogy X-et kössön, akkor a fehérje szorosabban köti a glukózt, ha X jelen van, mintsem ha nincs. A szabályozás ebben az esetben pozitív szabályozás (3.4. ábra). 3.4. ábra - Pozitív allosztérikus reguláció 13

Enzimszabályozás Következésképpen a kötőhelyek összekötöttsége negatívan befolyásolja a kötődést, ha a két különböző molekula a különböző konformációkhoz szeret jobban kötődni. Ebben az esetben az első ligand bekötődése csökkenti a második (másik) ligand bekötődésének valószínűségét (3.5. ábra). 3.5. ábra - Negatív allosztérikus reguláció A kötöttség mértéke mennyiségileg oda-visszaható. Ha a glukóznak nagy hatása van X kötődésére, akkor X-nek is nagy hatása van a glukóz bekötődésére. Mivel X-molekula nem a katalitikus (aktív) helyhez kötődik, nem szükségszerű, hogy bármilyen kémiai kapcsolat legyen közte és a glukóz vagy bármelyik másik ligand között, amely az aktív helyhez kötődik. Ahogy láttuk az X-molekula egyszerűen képes bekapcsolni (+ reguláció) vagy kikapcsolni (- reguláció) az enzimet. Ezáltal az allosztérikus fehérjék általános kapcsolóként működnek, amelyek megteremtik a lehetőséget, hogy egy molekula egy másik molekula sorsát meghatározza a sejten belül. 14

Enzimszabályozás 1.1. 3.1.1. Kooperativitás Egy alegységes enzim feed-back inhibíciója során 90% aktivitásról 10%-ra szabályozódik vissza, ha az inhibitor koncentráció 100-szorosára nő. Ez nem ad lehetőséget éles szabályozásra. A legtöbb ligand által be- és kikapcsolható enzim több egymással megegyező enzimatikus alegységből áll. Ebben az elrendeződésben, ha egy ligand beköt az egyik alegységen levő kötőhelyre, kivált egy allosztérikus változást az alegységen belül, amely később átterjedhet a szomszédos alegységekre, elősegítve őket, hogy ugyanezt a ligandot megkössék. Ennek eredményeképp egy kooperatív allosztérikus átalakulás jön létre (3.6. ábrán kék vonallal jelölve), lehetővé téve, hogy a sejtben bekövetkező kisarányú ligand koncentráció-változás teljesen aktiválja, vagy teljesen inaktiválja az egész apparátust (enzimet, fehérjét). 3.6. ábra - Egy- és több alegységes enzimek inhibitor koncentráció relatív enzimaktivitás összefüggése Az első ligand bekötése nehezebb, mivel ennek során egy energetikailag kedvező kapcsolat bomlik fel az alegységek között, viszont a második ligand bekötődése jóval könnyebb, mivel ez visszaállítja a szimmetrikus molekula monomer-monomer kapcsolatát (és ezzel egyidejűleg teljesen inaktiválja az enzimet) (3.7. ábra). 3.7. ábra - Két azonos alegységből álló enzim kooperatív-allosztérikus átmenete 15

Enzimszabályozás 16

Enzimszabályozás Jóval élesebb hatás érhető el, ha a ligand egy nagyobb szerkezethez, mondjuk egy 12 polipeptid láncból álló enzimhez kötődik. A szubsztrátétól eltérő szerkezetű allosztérikus effektor hatását heterotróp hatásnak nevezzük. Több azonos alegységből álló fehérje (enzim) esetén figyelték meg az allosztéria egy sajátos változatát, a homotróp hatást. Ebben az esetben egyetlen molekula, enzimek esetén maga a szubsztrát, képes betölteni az allosztérikus ligand szerepét. Az élesebb hatás alapja ez esetben is az lesz, hogy az első ligand (szubsztrát) bekötődése nehezebb, majd a bekötéssel együtt járó konformáció változás hatására a második, harmadik, negyedik szubsztráté már sokkal könnyebb lesz. A pozitív homotróp hatás érvényesülése esetén a hiperbolikus telítési görbe torzul: szigmoid lesz. Kis szubsztrát koncentráció esetén kicsi a kötődés valószínűsége, a szubsztrát koncentráció növekedtével (és a konformáció változással) a kötődési esély megnő. Ennek eredménye lesz a szubsztrát koncentráció emelkedésével meredeken emelkedő telítési görbe. A kooperativitás egyértelmű előnye tehát a szűkebb ligand/szubsztrát koncentráció-tartományban bekövetkező éles aktivitásváltozás. Ez pedig igen komoly regulációs előnyt jelent. A kooperativitás és az allosztérikus szabályozás bemutatására a legjobb példát a hemoglobin oxigénkötése adja. Így a következőkben ezzel részletesen is foglalkozni fogunk. 1.2. 3.1.2. A hemoglobin szerkezete és oxigénkötése A hemoglobin szerkezetét és oxigénkötésének sajátságait, szabályozását egy másik oxigén kötésére képes molekula, a mioglobin szerkezetével, oxigénkötési sajátságaival együtt tárgyaljuk. Tesszük ezt azért, mert a párhuzamos tárgyalási mód igen fontos biokémiai szabályszerűségek megvilágítására ad módot. A két molekula igen hasonló szerkezettel rendelkezik, mindkettő globin fehérjeláncból és a hozzá kovalensen kapcsolódó hem prosztetikus csoportból áll. Igen fontos különbség azonban, hogy míg a mioglobin monomer, addig a hemoglobin tetramer (3.8. és 3.9. ábra). 3.8. ábra - A mioglobin monomer szerkezete 3.9. ábra - A hemoglobin tetramer szerkezete 17

Enzimszabályozás Mielőtt a két oxigénkötésre képes molekula szerkezetének mélységeibe merülnénk, ejtsünk néhány szót az oxigéntárolás/szállítás szerepéről. Anyagcserénk oxigén nélkül elképzelhetetlen lenne, ez könnyen belátható, ha csak a terminális oxidáció irdatlan oxigénigényére gondolunk. A hemoglobin vitathatatlan szerepét az oxigénszállításban aláhúzza a megfigyelés, mely szerint a hemoglobinmentes vér oxigénkoncentrációja 5 ml oxigén/liter, mindez hemoglobinnal 250 ml oxigén/liter. A hemoglobin, mint minden hemoprotein, vasat (Fe[II]) és az azt koordináló protoporfirin-ix vázat tartalmaz. Ez a váz adja a hemoproteinek jellegzetes színét. A vas koordinációs kötései közül 4 a protoporfirin gyűrű N- atomjaival jön létre, 2 további kötés a hem síkjának két oldalán. Egy a globinlánc egy (proximális) hisztidinjével jön létre, ebben az irányban kiemelkedik a dezoxi-hemoglobinban a porfinváz síkjából a vasatom. A másik oldalon található az oxigén kötőhely. Itt érdemes megjegyeznünk, hogy a szén-monoxid igen veszélyes, mivel 300-szor jobban kötődik a hemoglobinhoz, mint az oxigén. Fontos tudnunk, hogy kizárólag a ferro(ii)- hemoglobin köt oxigént, a ferri (III) vagy más néven methemoglobin nem képes oxigént kötni. Ha végignézzük a hemoproteinek funkcióit, megállapíthatjuk, hogy az oxigénszállítás, kötés (Hb, Mb) Fe (II) állapotban valósul meg, azonban az elektrontranszfer-reakciókban résztvevő hemoproteinek (pl. citokrómok) esetében fontos szerepet kap a Fe (II) Fe (III) átmenet, hasonlóan a redoxireakciókhoz (pl. citokróm P450 enzimek), ahol a Fe (II) megköti az oxigént majd redukálja, miközben Fe (II) Fe (III) átmenet következik be. A rövid kitérőt követően térjünk vissza a két molekula térszerkezetéhez. A hemoglobint tehát 4 polipeptidlánc alkotja, melyek mindegyikéhez egy-egy hem tartozik. Ezekhez egy-egy oxigénmolekula kötődhet. A felnőtt hemoglobin A-t (adult) két alfa és két béta lánc alkotja (3.9. ábra). A magzati hemoglobin F (foetalis) két alfa és két gamma láncból áll. A láncokat ionos és apoláris kötések tartják össze. Ha egy pillantást vetünk a mioglobin és a hemoglobin oxigéntelítési (szaturációs) görbéjére (3.10. ábra) megállapíthatjuk, hogy azok jelentős különbséget mutatnak, míg a mioglobin klasszikus hiperbolikus telítési görbével jellemezhető, addig a hemoglobin telítési görbéje szigmoid. 3.10. ábra - A hemoglobin és a mioglobin oxigéntelítési (szaturációs) görbéje 18

Enzimszabályozás Az ábrát figyelmesebben tanulmányozva megállapíthatjuk, hogy a mioglobin alkalmatlan az oxigénszállításra, mivel a szövetekben nem képes leadni azt. Láthatjuk, hogy a hiperbolikus telítési görbe miatt a tüdőre jellemző oxigén parciális nyomáson telítődik (közel 100%-os szaturáció) oxigénnel, azonban a szövetekre jellemző parciális nyomáson még mindig igen magasan halad a görbe. A parciális nyomáskülönbségek csak igen csekély mértékű oxigén leadását tennék lehetővé (3.10. ábrán magenta nyilakkal jelölt). Nagyobb mennyiségű oxigén leadása csak igen csekély oxigén parciális nyomás mellett lehetséges. Ezzel függ össze a mioglobin fiziológiás szerepe: az izmokban történő oxigéntárolás. Oxigén tárolására kifejezetten kedvező ez a karakterisztika. A mioglobinnal szemben a hemoglobin szigmoid telítési görbével jellemezhető, így a tüdőben telítődik oxigénnel (közel 100%-os a szaturáció ebben az esetben is), a szövetekben tapasztalható alacsonyabb parciális nyomáson pedig leadja azt (3.10. ábrán kék nyíllal jelölve). A hemoglobin így ideális jelölt az oxigén szállítására. Mi állhat az eltérő karakterisztika hátterében? Ahogy azt korábban említettük, a fehérjék szerkezete és funkciója között szoros összefüggés van. A mioglobin monomer, így a szokásos hiperbolikus telítési görbével jellemezhető, a hemoglobin azonban tetramer, melynek láncai között érvényesül a kooperativitás, ami szigmoiddá teszi telítési görbéjét. Lássuk csak, hogyan támogatja a hemoglobin szerkezete a kooperativitás megvalósulását! Amennyiben a hemoglobin négy alfa vagy négy béta-láncból állna, hiperbolikus oxigéntelítési görbéje lenne. A deoxihemoglobinban (oxigént nem kötő forma) a vasatom 0,06 nm-rel kilóg a porfiringyűrű síkjából (3.11. ábra). Az oxigénkötés megváltoztatja a hemoglobin negyedleges szerkezetét. Az oxigén megkötésével a vasatom behúzódik a gyűrűbe, a vele kovalensen összekötött fehérjelánc szerkezete is megváltozik, ezért megváltoznak az alfa- és béta-láncok közötti H-híd-kötések és apoláris kölcsönhatások, valamint felszakad a deoxihemoglobint stabilizáló 8 ionpár. 3.11. ábra - A hemoglobin oxigénkötésre elszenvedett térszerkezet-változása 19

Enzimszabályozás A deoxihemoglobinban tehát ionpárok kötik össze a globinláncokat (Tense forma), míg az oxihemoglobinban (Relaxed forma) ezek felszakadnak. Így már érthető, hogy miért lesz szigmoid a hemoglobin oxigéntelítési görbéje, hisz a feszített deoxi-formát stabilizáló ionpárok akadályozzák az oxigén megkötését. (A deoximioglobin és az oximioglobin szerkezete hasonló.) Felmerül a kérdés, hogy mi stabilizálja a deoxihemoglobin negyedleges szerkezetét? A válasz megadásában segít a megfigyelés, mely szerint a hemoglobinoldatban nagyobb affinitással köti az oxigént, mint a vörösvértesten belül. Tehát a sejten belül valami lerontja a hemoglobin oxigén iránti affinitását. Ez a faktor egy glikolízis-mellékreakció során képződő, a vörösvértestben nagy mennyiségben termelődő kis molsúlyú anyag, a 2,3-biszfoszfoglicerát (3.12. ábra). 3.12. ábra - A 2,3-biszfoszfoglicerát Nézzük meg, pontosan milyen szerepet tölt be a 2,3-biszfoszfoglicerát a hemoglobin-oxigénkötés szabályozásában! A 2,3-biszfoszfoglicerát ekvimorális arányban kötődik a deoxihemoglobinhoz, 1 tetramer hemoglobin-molekula 1 molekula 2,3-biszfoszfoglicerátot (2,3-BPG) köt. A 2,3-BPG-nek fiziológiás viszonyok között 5 negatív töltése van (3.12. ábra). A hemoglobin 2,3-BPG kötőhelyét a béta-láncok 4 His, illetve 2 Lys aminosava alakítja ki. A pozitív töltésű aminosav-oldalláncok és a negatív töltésű 2,3-BPG közötti kölcsönhatások olyan kötődést hoznak léte, amely stabilizálja a deoxi-hb negyedleges szerkezetét (3.13. ábra). 20

Enzimszabályozás A 2,3-BPG az oxihemoglobinhoz nem kötődik, az oxigenálódás folyamán a láncok elmozdulása miatt a BPG kötőhely megváltozik, szűk lesz a 2,3-BPG számára. Így az 2,3-BPG tulajdonképpen a hemoglobin allosztérikus regulátora. 3.13. ábra - A hemoglobin és a 2,3-biszfoszfoglicerát kapcsolata A 2,3-BPG koncentrációja nagyjából 4,5 mm és szabályozott; a szabályozás pontos mechanizmusa jelenleg ismeretlen. A glikolízisben résztvevő egyes enzimek szintézisének zavarai a vörösvértestekben befolyásolják a 2,3-BPG szintet. Így hexokináz-hiányos állapotokban a 2,3-BPG szint csökken, ezért az oxigéntelítési görbe balra tolódik, a hemoglobin oxigénaffinitása nő. Piruvát-kináz hiányos állapotokban a görbe jobbra tolódik, mert a 2,3-BPG koncentráció emelkedett, a hemoglobin oxigénaffinitása csökken. A krónikus hipoxia esetén a 2,3-BPG szint megemelkedik 4,5 mm-ról 8,0 mm-ra. Magaslati levegőn (4500 m) 2 nap alatt 7,0 mm-ra emelkedik. Tulajdonképpen ezt használják ki a hegymászók és ezért építenek akklimatizációs táborokat. Ilyenkor, pár nap alatt megemelkedik a vér 2,3-BPG szintje, aminek hatására a hemoglobin oxigénkötése leromlik, így nagyobb lesz a tüdő és szövetek telítettsége közötti különbség, jobbra tolódik a hemoglobin oxigéntelítési görbéje és jóval nagyobb mennyiségű oxigént tud leadni a szövetekben. Tengerszintre visszatérve a 2,3-BPG szintje viszonylag gyorsan visszaáll. A tárolt vér 2,3-BPG tartalma folyamatosan csökken, ezért oxigén affinitása nő. Transzfúzió esetén ez előnytelen, ezért a tárolt vérhez inozint adnak, amelynek hatására 2,3-BPG képződik a glikolízis során. 21

Enzimszabályozás A hemoglobin F kisebb mértékben köti a 2,3-BPG-t, mint a Hb A, így a Hb F oxigénaffinitása nagyobb, mint a Hb A-é. A Hb F Hb A-nál nagyobb oxigénaffinitása elősegíti az oxigén bejutását az anyai keringésből a magzati vérkeringésbe. Bohr-effektus A hemoglobin és a mioglobin között további lényeges különbség az, hogy a hemoglobin protonokat és széndioxidot is köt, illetve szállít. A ph csökkenésével a hemoglobin oxigénaffinitása csökken (ph 7,6 po 2= 40 Hgmm értéknél a visszatartott oxigén 80%, míg ph 6,8 po 2= 40 Hgmm értéknél a visszatartott oxigén 45%). A keletkezett széndioxid kb. 15%-a a hemoglobinhoz kötődik. Fokozott anyagcsere (pl. izommunka) esetén több széndioxid termelődik, ilyenkor az oxigénszükséglet is fokozódik. A laktáttermelés megemelkedik, a vér ph értéke csökken, a hemoglobin oxigéntelítési görbéje jobbra tolódik (3.14. ábra). A jelenséget Christian Bohr dán fiziológus (Niels Bohr fizikus édesapja) írta le, tiszteletére Bohr-effektusnak nevezték el. A képződött széndioxidot, illetve a protonok egy részét a hemoglobin úgy köti meg, hogy a béta-lánc N-terminális aminocsoportjával karbamátot (OOC-HN-R) képez. További sókötések jönnek létre, ami tovább csökkenti a hemoglobin oxigén affinitását. A tüdőalveolusokban a hemoglobin leadja a felvett széndioxidot, illetve protonokat és oxigént vesz fel. Mindezek eredményeképpen fokozott izommunka során a szövetekben leadható oxigén mennyisége jelentősen megnő. 3.14. ábra - A hemoglobin oxigéntelítési görbéje különböző ph-értéken (Bohr-effektus) 22

Enzimszabályozás 2. 3.2. Fehérjék térszerkezetének, aktivitásának befolyásolása foszforiláció/defoszforiláció által Míg az előző fejezetben ismertetett allosztérikus szabályozás során a regulátormolekula másodrendű kötésekkel pillanatszerű asszociáció/disszociáció során kapcsolódott a fehérjéhez és így igen gyorsan bekövetkezett a térszerkezet-/aktivitásváltozás, addig a fehérjék foszforilációja kovalens módosításról lévén szó: 1. jóval lassabb, 2. tartósabb, 3. enzim-katalizált (mind a foszforiláció, mind a defoszforiláció) folyamat (3.15. ábra). A kétféle szabályozási mód (allosztérikus, foszforiláció/defoszforilációval történő) kiegészíti egymást az eukarióta sejtekben. A foszforiláció két módon is érintheti, módosíthatja a fehérjéket: 1. Minden PO 4 csoport 2 negatív töltést hordoz. Ennek következtében jelentős szerkezeti változást generálhat: pl. pozitívan töltött aminosav részleteket vonzhat magához. A foszfátcsoportot eltávolítva természetesen visszaáll az eredeti helyzet. 2. A fehérjéhez kapcsolódott foszfátcsoport egy olyan szerkezet része is lehet, amelyet más fehérjék kötőhelye ismer fel. Nagyobb fehérjékben gyakran fordulnak elő olyan kis fehérjedomének, modulok, amelyek kötőhelyül szolgálhatnak más foszforilált fehérjék részére. Egy ilyen modul az SH2-domén, amely foszfotirozint tartalmazó peptidszakaszokhoz köt, de rajta kívül még vagy 10 hasonló fehérjerészlet ismeretes. A foszforiláció ilyeténképp fehérjeszerkezetek össze- és szétszerelésében is fontos tényező. A fehérjefoszforiláció mint szabályozási mechanizmus elterjedtségét mi sem mutatja jobban, mint az a megfigyelés, mely szerint az emlőssejtek 10 000 fehérjéjének mintegy harmada található foszforilált állapotban az adott pillanatban. A PO 4 3- -csoport az ATP-terminális foszfátcsoportjának terhére történő felvitelét transzferázok, a protein kinázok katalizálják (3.15. ábra). 3.15. ábra - Fehérje foszforiláció/defoszforiláció 23

Enzimszabályozás Az ATP hidrolízis miatt a reakció egyirányú. A sejtben több száz különböző protein kináz található, amelyek a fehérjék szerin-/treonin- (Ser/Thr kinázok) vagy tirozin (Tyr kinázok) oldalláncainak hidroxilcsoportjára transzferálják a foszfátcsoportot (3.16. ábra). 3.16. ábra - Szerin-/treonin- és tirozin-foszforiláció A foszfátcsoport eltávolítását a foszfoprotein-foszfatázok katalizálják. Hasonlóan a kinázokhoz a sejt foszfoprotein-foszfatázok tömkelegét tartalmazza, amelyek specificitása jelentős különbséget mutat, némelyikük a fehérjék tágabb csoportját képes foszforilálni, vagy defoszforilálni, míg mások kizárólagosan csak egy fehérjével képesek ezt megtenni. A protein kinázok egy nagy enzimcsalád tagjai, amelynek tagjai egy nagyjából 290 aminosavas-katalitikus (kináz) doménnel rendelkeznek. A fehérjelánc további részei nagyobb változatosságot mutatnak az egyes családtagok között (3.17. ábra). Ezek felelősek a szubsztrát felismerésért, illetve a kinázaktivitás szabályozásáért. 3.17. ábra - Protein kináz háromdimenziós szerkezete 24