A TALAJ KÖRNYEZETTOXIKOLÓGIAI VIZSGÁLATA MÓDSZERTANI ÁTTEKINTÉS KÖRNYEZETTOXIKOLÓGIA ELŐADÁS 2015.10.03. Feigl Viktória, Molnár Mónika BME ABÉT vfeigl@mail.bme.hu
A TALAJ EGY KOMPLEX RENDSZER http://egeology.blogfa.com/ Stefanovics, 1999 2 Prescott et al., 1993
SZENNYEZETT TALAJ VIZSGÁLATA Kémiai analitikai módszerek: fizikaikémiai hozzáférhetőség Cél: talajhasználattal összefüggő talajfunkciók és ivóvízbázisok tisztaságának megőrzése Szennyezőanyagok feltárás után mérhető koncentrációja de pl. XRF laborgyakorlat! De: Az analitikai program csak a szennyezőanyagok kis hányadát tartalmazza Talajok pufferkapacitása! Integrált vizsgálatok szükségesek Környezettoxikológia: aktuális toxicitás, káros hatások vizsgálata http://portableas.com/ Függ a biológiai hozzáférhetőségtől 3
TALAJMINTÁK ELŐKÉSZÍTÉSE ÖKOTOXIKOLÓGIAI TESZTELÉSHEZ Talaj extraktumok Specifikus extrahálószerek, víz Ált. 1:10 talaj:extrahálószer arány Probléma Hígulás Terjedést, megoszlást nem modellezi helyesen De: csapadékkal történő bemosódásra, vízzel való terjedésre Egyensúlyi viszonyok beállítása természetes folyamatok nem egyensúlyiak Megoldás: direkt kontakt / interaktív / teljes talaj tesztek (whole soil tests) Figyelembe veszi: szennyezőanyag talajszemcse, tesztorganizmus talajszemcse (biofilm), tesztorganizmus talajszemcse szennyezőanyag kapcsolatokat Eredeti talaj vagy szárított, porított, szitált talaj, esetleg steril talaj laborgyakorlat! http://essre.rpcs.org/ https://plymouthculture.wordpress.com 4
HOZZÁFÉRHETŐSÉG: TELJES TALAJ ÉS PÓRUSVÍZ Példa: nagy agyagtartalmú talaj Talaj semlegesítő, pufferoló hatása Teljes talaj és pórusvíz közötti különbség, két görbe közötti terület Fekete: pórusvíz Piros: teljes talaj 5
TALAJ ÖKOTOXIKOLÓGIAI TESZTELÉSÉRE ALKALMAS MÓDSZEREK Saját mikroflóra, flóra és fauna mennyiségi és minőségi vizsgálata biomonitoring (passzív, in situ mérések) fajeloszlás biomarkerek bioindikáció (őrző, detektor, kiaknázó, akkumuláló fajok) Saját mikroflóra aktivitása a teljes talajból mérve légzés energiatermelés nitrifikálás enzimaktivitások A teljes talaj és/vagy a pórusvíz hatásának mérése laboratóriumi tesztorganizmusokra: ökotoxikológiai tesz, bioteszt bakteriális, növényi és állati tesztorganizmusokkal modellrendszerben, kontrollált ökoszisztémára: mikrokozmosz és mezokozmosz az ökoszisztémába kihelyezett kontrollált tesztorganizmusra: aktív biomonitoring. Laborgyakorlato k anyaga 6
BAKTERIÁLIS TESZTEK TALAJ VIZSGÁLATÁRA Biokémiai, fiziológiai változások Végpont gyakran enzimaktivitások változása: ATPáz, dehidrogenáz, foszfatáz, észteráz, luciferáz Aliivibrio fischeri biolumineszcencia gátlási teszt (laborgyakorlat) Azotobacter agile dehidrogenáz enzimaktivitás gátlási teszt Pseudomonas fluorescens toxicitási teszt Spirillum volutans mozgásképességi teszt Túlélés, pusztulás Bacillus subtilis teszt agardiffúziós módszerrel Géntoxikológiai tesztek mutáció Ames-teszt Mutatox-teszt SOS-chromotest 7
ALIIVIBRIO FISCHERI BIOLUMINESZCENCIA GÁTLÁSI TESZT I. (LABORGYAKORLAT) Aliivibrio fischeri: fényt emittáló tengeri baktérium (Vibrio fisheri, Photobacterium phosphoreum) Érzékenysége: toxikus fémekre, szerves makro- és mikro-szennyező anyagokra Mérési végpont: lumineszcencia intenzitás csökkenése Vizsgálati végpont: a minta hígítási sorából EC 20, EC 50 Szükséges műszer: luminometer Tesztelés időtartama: 30 perc Szabvány módszerek: US EPA Microtox, DIN 38412; direkt kontaktra kidolgozott változat: BME LUMAC luminométer 8
A BAKTERIÁLIS LUCIFERÁZ ENZIM ÁLTAL KATALIZÁLT REAKCIÓ További info az enzimrendszer működéséről: http://www.photobiology.info/lin.html 9 Részletes leírás és protokoll: laborgyakorlat anyaga + könyv 108. oldal
Kurtafarkú tintahal
AZOTOBACTER AGILE DEHIDROGENÁZ ENZIMAKTIVITÁS GÁTLÁSI TESZT Azotobacter agile: talajbaktérium, nitrogén fixáló Könyv: 117. oldal Érzékenysége: szennyezőanyagok széles skálájára. Túlságosan is érzékeny, screenelésre, a negatív minták kiszűrésére javasolható. Mérési végpont: dehidrogenáz enzim aktivitás megléte vagy hiánya, illetve csökkenése Vizsgálati végpont: hígítással EC 20, EC 50 Szükséges műszer: vizuális (alternatív elektronakceptor színének megjelenése: igen, nem), vagy fotométer (alternatív elektronakceptor színintenzitása) Tesztelés időtartama: 48 óra Szabványosított módszerek: MSZ 21978/30 (veszélyes hulladékok kivonatára), direkt kontaktra kidolgozott változat: BME 12
AZOTOBACTER AGILE DEHIDROGENÁZ ENZIMAKTIVITÁS GÁTLÁSI TESZT Módszer elve: környezeti stressz az elektrontranszport rendszer megsérülhet. Az elektrontranszport lánc első szakaszának lépéseit a dehidrogenáz enzim katalizálja. Alternatív elektronakceptor: TTC (2,3,5- trifenil-tetrazólium-klorid), mely az elektrontranszportlánc zavartalan működése esetén redukálódik, és piros színű trifenilformazánná alakul. Toxikus anyagok jelenlétében a dehidrogenáz enzimaktivitás gátolt, a piros szín nem jelenik meg, vagy intenzitása kisebb, mint a szennyezetlen kontrollé. Minta: steril talaj, hígítási sor (ha más mikrobák kerülnek a tesztoldatba, azok dehidrogenáz aktivitása meghamisítja az eredményt) http://www2.pharm.u-szeged.hu/phtech/ kutatas/kutatas_muszer_altalanos_hu.html 13
BAKTERIÁLIS TESZTEK TALAJ VIZSGÁLATÁRA Biokémiai, fiziológiai változások Pseudomonas fluorescens toxicitási teszt MSZ 21470-88:1993, talajkivonat dehidrogenáz enzimaktivitás, indikátor: TTC/INT Spirillum volutans mozgásképességi teszt http://web.mst.edu/ mozgásképesség csökkenése, kemotaxisért felelős kolinészteráz izoenzimek gátlása Pseudomonas fluorescens Spirillum volutans Scott K. Rose 14
BACILLUS SUBTILIS TESZT, AGARDIFFÚZIÓS MÓDSZERREL Tesztorganizmus: Bacillus subtilis, BME-en a gyöngyösoroszi Pb és Zn bánya területén izolált, fémekre érzékeny törzs Érzékenysége: közepesen érzékeny talajbaktérium, elsősorban toxikus fémekre, mint Zn, Cd, Cu érzékeny Mérési végpont: növekedésgátlás, kioltási zóna formájában Vizsgálati végpont: hígítási sorból EC 20, EC 50 Kiértékelés: vizuális, vonalzó Tesztelés időtartama: 48-72 óra Könyv: 115. oldal http://sites.google.com/site/scienceprofonline/cellbiologyhelp104 http://wikidoc.org/index.php/bacillus_subtilis 15
BACILLUS SUBTILIS TESZT, AGARDIFFÚZIÓS MÓDSZERREL Agaros táptalajban egyenletesen eloszlatott és lemezként kiöntött Bacillus subtilis szaporodását, a lemez felületére helyezett, agarral szilárdított talajmintakorong toxicitásától függően gátolja. A mintakorong körül kialakult kisebb denzitású zóna toxicitás Oldat: a kisebb denzitású zóna átmérője szennyezőanyag mennyisége Teljes talajminták: a módszer kvalitatív természetű (toxikus, nem toxikus) Elővizsgálat, a negatív minták kiszűrése Napi akár 500 minta A minták a következő négy csoportba sorolhatók: kioltási zóna erős gátlás toxikus minta gyengítési zóna gyenge gátlás gyengén toxikus minta nincs zóna nincs gátlás nem toxikus a minta serkentési zóna serkentő hatás nem toxikus a minta 16
AMES MUTAGENITÁSI TESZT TALAJRA A teszt típusa: egy fajt alkalmazó, reverz mutagenitási teszt, géntoxicitás kimutatására Tesztorganizmus: Salmonella typhimurium mesterségesen hisztidin auxotróffá tett törzsei Végpont: a hisztidin termelő képesség visszanyerése: hisztidin-mentes táptalajon revertáns telepek megjelenése Időigény: 48 72 óra Szabvány: ISO 16240:2005 szabvány vízminősítésére, OECD 471 vegyi anyagok tesztelésére, BME-n direkt kontaktra http://es.wikipedia.org 17
AMES MUTAGENITÁSI TESZT TALAJRA Hisztidin + biotin oldat + (S. typhimurium törzs) Telepek kis mennyiségű hisztidint tartalmazó táptalajon: reverz mutánsok mutagén hatás (minimál glükóz agar) Mutagén anyag nélküli kontroll: spontán revertánsok Érzékenységvizsgálat: 4-nitro-fenilén-diamin 18
BAKTERIÁLIS TESZTEK TALAJ VIZSGÁLATÁRA Géntoxikológiai tesztek Mutatox-teszt Aliivibrio fischeri nem világító variáns, mutagén hatásra lumineszcencia SOS-chromotest genetikailag módosított E. coli: SOS operon egy β- galaktozidáz operonnal összeépítve, X-Gal szubsztráttal kék szín, spektrofotometriás detektálás 19 http://www.ebpi.ca/
NÖVÉNYI TESZTORGANIZMUSOK Fehér mustár Algák elsősorban víztoxikológiában Magasabb rendű növények Többnyire egynyári növények és fűfélék Pusztulás csírázásgátlás nem mindig elég érzékeny, mag belső tartalékainak hasznosítása Növekedés gyökér- és szárnövekedés gátlása, biomassza mennyisége Fotoszintetikus enzimaktivitások klorofill mérése Metabolikus enzimaktivitások pl. peroxidáz, szuperoxid-dizmutáz, galutation-s-transzferáz Szimbiotikus nitrogén-megkötés Bioakkumuláció Angolperje Kerti zsázsa http://www.kertvarazsmagazin.hu/ 20 http://www.landw.uni-halle.de/
NÖVÉNYTESZT SZABVÁNYOK Szabvány módszerek: US EPA (1982), OECD (1984), US FDA (1987), MSZ 21976 (1993) stb. Tesztorganizmusok: káposzta, sárgarépa, kukorica, uborka, saláta, hagyma, angolperje, zab, szójabab, kínai kel, zsázsa, mustár, retek, repce, rizs, paradicsom stb. Magok száma/edény: 10 50 db Ismétlések száma: 3 6 Időtartam: 3 14 nap Mérési végpont: csírázás, gyökérnövekedés, biomassza tömeg Vizsgálati végpont: kontrollhoz viszonyított gátlás, EC 50 21
SINAPIS ALBA (FEHÉR MUSTÁR) GYÖKÉR- ÉS SZÁRNÖVEKEDÉS GÁTLÁSI TESZT (LABORGYAKORLAT) Könyv: 123. oldal Sinapis alba érzékenysége: a szennyezőanyagok széles skálájára érzékeny Mérési végpont: csírázásgátlás szár- és gyökérnövekedés nedves és száraz biomassza tömeg Vizsgálati végpont: Gátlás százalékban megadva a kontrollhoz képest ED 20 és ED 50 a minták hígítási sorozatából Szükséges műszer: vonalzó, vizuális értékelés Tesztelés időtartama: 72 óra Szabványosított módszerek: MSZ 21976-88 kivonatra, direkt érintkezésre kidolgozott változat: BME 22
ÁLLATI TESZTORGANIZMUSOK Egysejtűek Protozoák: Tetrahymena pyriformis (laborgyakorlat vízi tesztorganizmusok), Colpoda cullus, Paramecium aurelia Tetrahymena pyriformis Paramecium aurelia http://protist.i.hosei.ac.jp/ 23
ÁLLATI TESZTORGANIZMUSOK Többsejtű állatok: elsősorban talajlakó állatok Porcellio scaber wikipedia.org Cognettia sphagnetorum Földigiliszta: Eisenia fetida, Eisenia andrei Televényférgek: Cognettia sphagnetorum Ugróvillások: Folsomia candida, Folsomia fimetaria, Isotoma viridis Fonálféreg: Plectus acuminatus, Heterocephalobus pauciannulactus, Panagrellus redivius Egyenlőlábú: Porcellio scaber (érdes pinceászka) Atka: Platynothrus peltifer Puhatestűek: Helix aspersa (petteyes éticsiga), Arion ater (fekete 24 csupaszcsiga) http://biomesthird10.wikispaces.com
FOLSOMIA CANDIDA (COLLEMBOLA) MORTALITÁSI TESZT (LABORGYAKORLAT) Folsomia candida: ugróvillások rendjébe tartozó, talajlakó, ősi rovar Teszt típusa: egy fajt alkalmazó, laboratóriumi, állati, akut toxicitási teszt, lehet krónikus (reproduktivitási), elkerülési, mikrokozmosz teszt Érzékenysége: fémekre kevéssé, szerves szennyezőanyagokra érzékeny, főleg az illékonyakra és a bőrön át felszívódókra. Mérési végpont: állatok száma: letalitás, Vizsgálati végpont: hígításból LC 20 és LC 50, reproduktivitási teszt alapján NOEC Szükséges műszer: citoplaszt mikroszkóp vagy vizuális Tesztelés időtartama: akut: 5 10 nap, reprodukciós: 20 nap Szabvány: ISO 11267:1999, OECD/OCDE 232 25 Részletes leírás és protokoll: laborgyakorlat anyaga + könyv 126. oldal
PANAGRELLUS REDIVIUS (NEMATODA) SZAPORODÁS GÁTLÁSI TESZT Érzékenység: főként peszticidekre Fejlesztő: Bagi (2006), BME ABÉT Teszt típusa: reprodukciós teszt Szükséges eszköz: mikrotitrátor lemez Időtartam: 1 hét Mérési végpont: új generáció megjelenése Vizsgálati végpont: toxikus/nem toxikus minősítés 26 http://edisonleatherworks.com/2011/06/19/wormpad/
EISENIA FETIDA (FÖLDIGILISZTA) TESZT Eisenia fetida érzékenysége: Közepesen érzékeny tesztorganizmus. Az expozíciós útvonalak közül a bőrkontakt és az emésztés dominál. Akut hatásokkal szemben ellenállóbb, a krónikus toxicitás és a reproduktivitás nagyobb érzékenységet biztosít. Mérési és vizsgálati végpontok: akut és krónikus toxicitás, elkerülési teszt esetében: az állatok száma, letalitás, hígítással EC 20 és/vagy EC 50, valamint NOEC reproduktivitásnál: az utódok száma, NOEC bioakkumuláció vizsgálata esetén: koncentráció a szövetekben http://gogreennow5.blogspot.com/ http://veracruzinforma.com.mx/ 27
EISENIA FETIDA (FÖLDIGILISZTA) TESZT Szükséges műszer: állatok száma: manuális és vizuális, bioakkumuláció vizsgálata esetén a szennyezőanyagnak megfelelő analitikai műszer Időigény: szűrőpapír teszt talajkivonattal (OECD, 1984) esetén 24 és 48 óra mesterséges talajteszt OECD talajba kevert mintaszuszpenzióval (OECD, 1984; EEC, 1982) esetén 7 és 14 nap Artisol teszt szilikagélbe kevert oldattal (Ferriére et al., 1981) 7 és 14 nap 28
EISENIA FETIDA (FÖLDIGILISZTA) TESZT Talajminta: 250 g talajmintát használunk szárítás nélkül. Referencia: tiszta erdei talaj, hígításhoz OECD talaj A 750 ml-es befőttesüvegbe mért talajra mintánként 10 10 azonos korú gilisztát helyezünk, majd sötét szobában két hétig tároljuk. A két hetes akut teszt ideje alatt nem etetjük az állatokat. Reproduktivitási teszt esetében tápanyagpótlásról kell gondoskodni. Kiértékelés Az akut toxicitási teszt értékelésekor két hét elteltével a mintákat vízzel felszuszpendáljuk ügyelve, nehogy megsértsük a gilisztákat. Végül egy tálcára borítjuk a mintát és megszámoljuk az életben maradt egyedeket. A túlélő giliszták számát ábrázoljuk a koncentráció függvényében. Reproduktivitási teszt esetében minden 1 cm-nél nagyobb utódot megszámolunk. Az utódok méreteloszlását is vizsgálhatjuk. Bioakkumulációs teszt esetén a gilisztákat kiéheztetése és kiürülés után analizálják 29
A TALAJ SAJÁT AKTIVITÁSÁNAK MÉRÉSE Talaj metabolikus aktivitásáért felelős: mikroorganizmusok, extracelluláris enzimek, mezo- és makrofauna Mikroorganizmusok kulcsszerepe: szerves anyagok bontása, tápelemek körforgása talaj termékenységének megőrzése Fontos: talaj metabolikus integritásának fenntartásában Mikrobiális aktivitás Enzimaktivitás (növényi és állati is, nem mindig aktív sejthez kötött) Főként aerob sejtek aktivitásnak vizsgálata, de: anaerob körülmények pl. vízzel elárasztott talajban: denitrifikáció, nitrát redukció, szulfát redukció 30
A TALAJ SAJÁT AKTIVITÁSÁNAK MÉRÉSÉN ALAPULÓ TESZTEK Talaj mikrobiológiai vizsgálatok (Környezeti mikrobiológia és biotechnológia, 2. előadás) Élő sejtek számának meghatározása (könyv 131. oldal) tenyésztéses technikák általános és higiénés vizsgálatok (laborgyakorlat) Szennyezőanyagot bontó sejtek számának meghatározása (könyv 132. oldal) Géntechnikák FISH Mikróbaközösség szubsztrát hasznosításának jellemzése BIOLOG EcoPlate Légzés mérés (laborgyakorlat) (Környezeti mikrobiológia és biotechnológia, 9. előadás) Átlevegőztetett rendszerben (könyv 134. oldal) Statikus rendszerben (zárt palack teszt OxiTop Control) A talaj nitrifikációja A talaj ATP-tartalma Enzimaktivitások mérése 31
A TALAJ NITRIFIKÁCIÓJA Szennyezetlen talajhoz adott vegyi anyag vagy szennyezett talaj hatására az eredeti talaj nitrifikáló képessége arányosan csökken (könyv 139. oldal) Nitrifikáció folyamata: 2NH 4 + + 3O 2 2NO 2 - + 2H 2 O + 4H + + Energia 2NO 2 - + O 2 2NO 3 - + Energia Mérési végpont: nitrit kimutatása Griess-Ilosvay reagenssel (nitrit nitráttá való oxidációját klorát hozzáadásával gátoljuk, nitrifikációt KCl-oldattal állítjuk le), Vizsgálati végpont: hígítási sorból EC 20 és EC 50 Mérés: fotometriásan (540 nm) Kalibrációs sor: NaNO 2 KCl-oldatban Mérés időtartalma: 5 óra Kidolgozva a BME-n az ISO 9509 alapján http://www.marchettigasse.at/ 32
ATP MENNYISÉGÉNEK MÉRÉSE LUMINESZCENCIÁN ALAPULÓ ELJÁRÁSSAL ATP: sejtek általános energiatároló vegyülete, ATP mennyisége sejtszám, aktivitás; toxikus hatásra ATP termelés csökken (könyv 143. oldal) Módszer: Lumac kit és BioOrbit kit, luciferáz tartalmú reagens Mérés luminométerrel 33 http://www.bmb.leeds.ac.uk/ http://www.vilaglex.hu/
DEHIDROGENÁZ-ENZIMAKTIVITÁS Légzési lánc enzimje NAD + + szubsztrát-h NADH + szubsztrát Következtetni lehet a teljes oxidációs aktivitásra Kimutatás: alternatív elektron akceptorral TTC (trifenil-tetrazólium-klorid), trifenil-formazánná redukálódik, piros szín INT [2-(p-jódfenil)-3(p-nitrofenil)-5-feniltetrazóliumklorid], jodonitrotetrazólium-kloriddá redukálódik, piros szín Spektrofotometriás detektálás 34 http://www.markergene.com/webnewsletter2.10.htm
FDA HIDROLÍZIS VIZSGÁLATA Fluoreszcein származék Lipáz, észteráz, proteázok által hidrolizálható Aktív sejtek megfestésére is alkalmas Spektrofotometriás detektálás http://www.climate-policy-watcher.org/ http://wn.com/fluorescence_of_fluorescein 35
REFERENCIÁK Gruiz Katalin, Horváth Beáta, Molnár Mónika: Környezettoxikológia, Műegyetemi Kiadó, 2001. 62 127. old. www.körinfo.hu Képtár és E-tanfolyam gyakorlati alkalmazás, talaj és felszín alatti víz, biológiai-ökológiai és környezettoxikológiai felmérés/monitoring Adatbázisok biológiai, ökotoxikológiai felmérési és monitoring módszerek 36