Acetil-kolin észteráz Két izoenzim, különböző enzim aktivitással: vörösvértestben és trombocitákban valódi acetil-kolin észteráz; nagy sebességgel hidrolizálja az acetil-kolint, bizonyos acetil-kolin koncentráció felett szubsztrát gátlás lép fel plazmában pszeudo-kolin észteráz az acetil-kolint li t kisebb aktivitással itá hidrolizálja, az acetil-kolin szubsztrát gátlást nem okoz α 2 β 2 Átviteli szám: 25000 1/sec Acetil-kolin szerepe az idegingerület átvitelben Nyugalmi állapot visszaállítását acetil kolin észteráz végzi Aktív centrumban reaktív szerin oldallánc donepezil hidroklorid (Aricept )reverzibilis Inhibitor Alzheimer's kór használt
Valódi egy szubsztrátos enzimek az izomerázok: A B liázok A B + C Hidrolázok : A B+ H2O A-OH + BH Multiszubsztrátos enzimek: Oxidoreduktáz: d Ox 1 + Red 1 Ox 2 +R Red 2 (Kofaktort igénylők: NAD(H), FAD(H), fémion) Transzferáz: A + BX A X + B (pl. glikozil transzferáz, kináz) Ligáz X + Y + ATP XY +ADP + P i
Termék gátlás előfordulhat Bi Bi mechanizmus A P B Q E EA E E P E E B EQ Példa: flavoenzimek működése 1. Reduktív félreakció: FMN+ NADH H + FMNH 2 + NAD + 2. Oxidatív félreakció: FMNH 2 +S ox FMN + P red NADH NAD+ Sox Pred
A kötődik először, elreagálva mint termék távozik, majd a B szubsztrát kötődik és Q Q termékként távozik, visszaalakítja az enzimet a kiindulási aktív állapotba
Szekvenciális: A és B szubsztrát mindkettő bekötődik, mielőtt a P és Q termék eltávozik Random szekvenciális: véletlenszerű a reaktánsok bekötődése és a termékek távozása Meghatározott sorrendű szekvenciális: reaktáns kötődés és termék távozás sorrendje meghatározott
Többszubsztrátos reakció : szekvenciális mechanizmus meghatározott sorrend
RANDOM SORREND
Irreverzibilis Inaktiváció + E + S ES E + P + I Enzyme inaktivátor EI E----I (Inaktív kovalensen módosított enzim) Csoport specifikus reagensek Affinjelölők Mechanizmus csapdák
1.Csoport specifikus reagensek Ciszteil oldallánc jódacetamid Inaktivált enzim
2. Affinjelölők szubsztrát analógok, amelyek kovalensen módosítják a katalitikusan aktív oldalláncokat specifikusak az enzim aktív helyén levő oldalláncokra Kimotripszin természetes szubsztrátuma Specificitást meghatározó csoport aktív zsebbe történő kötődést meghatározó csoport Tosil-L-fenilalanin klórmetilketon (TPCK) reaktív szubstrát analóg Reaktív csoport Az aktív helyhez kötődik és reagál az ott lévő hisztidinnel
Acetilkolin észteráz Szeril oldallánc Diizopropil-foszfofluoridát DIPF (ideggáz) Szerin proteázok (pl. kimotripszin, acetilkolin észteráz) gátlószere kovalens módosítás aktív szeril oldalláncon keresztül
Mechanizmus csapda- suicide inhibition a legspecifikusabb irreverzibilis inhibítorok, kovalens módosítók, amelyeket az enzim olyan intermedierré alakít amely kovalensen kötődik a reaktív csoporthoz és inaktiválja az enzimet Példák: 1.Monoaminoxidáz (MAO)dezaminálja a neurotranszmittereket az agyban pl. dopamint, szerotonint Az N,N-Dimetilpropargilamin a monoaminoxidáz FAD kofaktorát kovalensen módosítja az első oxidációs lépés után 2. A reaktív ß-laktám gyűrűt tartalmazó penicillin kovalens kötést képez a bakteriális glikopeptid transzpeptidáz katalitikusan aktív szeril oldalláncával Pentaglicin lánc N-term. +D-ala-D-ala C-term Kereszt kötés + D-ala
Mechanizmus-csapda 1. Monoaminoxidáz
Penicillin szerkezete Tiazolidin gyűrű Reaktív peptid kötés a β-laktám gyűrűn Bakteriális glikopeptid transzpeptidáz inhibítor, penicillin gátolja az utolsó lépést a sejtfal szintézisben a keresztkötések kialakítását a peptodiglikán szálak között
Staphylococcus baktérium sejtfal összetevőjének (peptidoglikán) szerkezete: glikán D-Ala-peptidlánc Bakteriális sejtfal Különlegessége, hogy D-ala aminosavakat tartalmaz Penicillin a D-ala-D-ala Egységek szerkezeti analógja pentaglicin
Glikopeptid transzpeptidáz katalizálta reakció mechanizmusa 1. Transzpeptidáz kovalens acil-enzim Köztiterméket t képez a terminális D- ala-d-ala peptidde 2. Acil-enzim köztitermék Az acil-enzim reagál a terminális glicin amino (Nu - )csoportjával
Penicillin utánozva a D-ala-D-ala szerkezetet a transzpeptidáz aktív centrumába kötődik A penicillin négy tagú feszített β-laktám gyűrűje nagyon reaktív, az enzim katalitikusan aktív szeril oldalláncával kovalens kötést képez, penicilloil-enzim komplex alakul ki, amely tovább nem reagál az enzim inaktiválódik
Az enzimaktivitások mérése A klinikai kémia talán leggyakoribb módszerei közé az enzimaktivitások itá k mérése é tartozik. t Ezt az indokolja, hogy a metabolikus folyamatok enzimei normál körülmények között is megtalálhatók a biológiai folyadékokban (vér, vizelet, nyál, bélcsatorna nedvek, tej). A kóros, általában a sejtek sérülésével járó folyamatokban a kiszabadult enzimek mennyisége megnő, ő az aktivitásuk itá k fokozódik
Enzimaktivitás mértékegységei: 1961. Nemzetközi Biokémiai Szövetség: unit 1U = 1μmol átalakult szubsztrát 1 min SI mértékegységrendszer : katal 25 ºC on standard körülmények között katal= 1 mol átalakult szubsztrát 1nanokatal = 10-9 katal 1 1U =16.67 67 nanokatal 1sec egységnyi térfogatra vonatkozó enzimaktivitás - volumenaktivitás: Specifikus aktivitás: Minta tisztasági fokának jellemzése U / l; mu/ml; nanokatal/ml U Spec.akt. = mg protein = μmol átalakult szubsztrát min mg protein
Farmakológia gyakorlatban az I 50 mérése Azt a gátlóanyag koncentrációt jelöli, amely a maximális gátlás 50%-t okozza Tisztán nem-kompetitív gátlás esetén K I = I 50 I 50 és K I közötti összefüggés reverzibilis gátlások esetén Gátlás típus I 50 kompetitív Nem-kompetitív unkompetitív vegyes (K M +[S])K I / K M K I (K M +[S])K I / [S] (K M +[S])K I K I /(K M K I +K I [S])
A belső minőség-ellenőrzés leggyakoribb paraméterei Reprodukálhatóság (precizitás, pontosság), azonos minta nagyszámú ismételt lemérése alapján kiszámíthatjuk az átlagot vagy az ahhoz tartozó szórást A specifitás azt fejezi ki, hogy az adott módszerrel valóban csak az és csakis az a paramétert határozható meg. Az érzékenységet az adott mérendő paraméter azon legkisebb mennyi- sége jellemzi, amely a mérés során reprodukálhatóan megmérhető. (A megbízhatóság (torzítás), az összehasonlító mérésekre alkalmas kontroll anyag általunk mintaként történő többszöri lemérését összevethetjük annak a kinyilvánított (deklarált) értékével. Ilyenkor a mért és deklarált különbsége adja a torzítás tényleges (abszolút) értékét (pl.: U/L-ben).)
Az enzim katalitikus aktivitásának mérése Az enzim reakciók követése: 1. Folyamatos enzim kinetikai i vizsgálat Azon fizikai paraméter időbeli változásának folyamatos követése, amely arányos a szubsztrát vagy termék koncentrációval Pl. NADH függő (enzim)rendszerek esetén a NADH csökkenést vagy növekedést detektálhatjuk spektrofotometriásan : 340nm en a NADH elnyelési maximumán követhetjük Ha proton szabadul fel az enzim reakció során, akkor követhetjük a ph változást Oxigén fogyás esetén oxigén-elektróddal mérhetjük a változást
Lambert-Beer törvény: 15 1,5 A = ε c l 1 A =: log Io/I (Io: a bejövő fény intenzitása; 0,5 I:átmenő fény intenzitása) 0 ε= molaris extinkciós koefficiens; (M -1 cm -1 ) l = a fény út hossza cm A 2 NAD + NADH + H + 250 270 290 310 330 350 370 390 hullámhossz (nm)
NH 2 O Flavin mononukleotid (FMN) Flavin adenin dinukleotid (FAD) H 2 C O O P HO O O N N OH N N O P O 5' O O CH 2 4' R = Phosphate Foszfát O O P O R Izoalloxazin gyűrű 5' O 5' CH 2 4' R = Adenine - dinukleotid Me Me 8 H O H O H O CH 2 4' 3' 2' 1' CH 2 N 10 H H H 1 9 10α 5 7 4α 6 N 4 N O Riboflavin 3 2 O NH
Flavin mononukleotid redukciója 460 nm-en követhető 460nm Absorban nce 0.2 0.1 0.0 400 500 Wavelength [nm] NADH + FMN 600
2. Nem folyamatos (szakaszos) enzim kinetikai vizsgálat Különböző időpontokban megállított enzimreakcióban határozzuk meg a szubsztrát koncentráció fogyását vagy a termék keletkezését Ha nincsen jól detektálható elnyelése egyik ágensnek sem a reakció során, akkor a reakció leállítása után valamilyen szubsztrátra ill termékre nézve speci- fikus színreakcióval állapítjuk meg a kérdéses koncentrációt Szakaszos
3. Csatolt enzim rendszerek kinetikai vizsgálat A kérdéses enzim reakcióhoz csatolunk egy jól követhető második enzim reakciót Pl glükóz + ATP hexokináz glükóz-6-foszfát+ ADP glükóz-6-foszfát dehidrogenáz glükóz-6-foszfát + NADox 6-foszfoglükonát + NADH NAD + redukciója jól követhető 340 nm-en
Gyorsreakciók követése stopped-flow spektrofotometriával A reakciómechanizmus elemi lépéseinek a felderítése Stacionárius szakasz, sebesség meghatározó lépés, é hagyományosan követhető tő szakasz Előegyensúly, gyors, stacionárius szakasz Kétfázisú reakció
Kimotripszin katalizálta hidrolízise két fázisú O -C N- H Peptid kötés kinetikát követ O Nitrofenol acetát CH 3 C O NO 2 + H 2 O Kimotripszin O -C O- Acetát O HO NO 2 CH 3 C OH Nitrofenol Észter kötés ea c ó o a á sába acetát e A reakció korai fázisában acetát nem szabadul fel, ellentétben a korai nitrofenol termeléstől
A Kimotripszin két lépésben katalizálja a fenil acetát hidrolízisét Acilezés O Nitrofenol acetát O CH 3 C O NO 2 CH 3 C O O - CH 2 CH 3 COOH O-H CH 2 O CH 2 HO NO 2 Dezacilezés (lassú lépés) é + H 2 O trofenol Ni Reakció kinetikája Kétfázisú reakció Idő (sec)
K2: Gyors, tranziens szakasz- (stopped-flow fotométerrel követhető) K 3 : Sebesség meghatározó folyamat Leglassúbb stacionárius szakasz (hagyományos módon követhető)
Enzimaktivitást befolyásoló tényezők 1. Szubsztrát koncentráció, enzim koncentráció 2. ph 3. Hőmérséklet 4. Ionerősség 5. Kofaktorok (pl. NADH; fémionok), védőanyagok (merkaptoetanol SHenzimeknél, specifikus ionok jelenléte (glikozidázok esetén Ca 2+ stabilizálja az aktív enzimkonformációt) 6. gátlószerek, aktivátorok jelenléte
Aminosavak protonálódása ph = log + + 10 (1/[H ]) = - log 10 [H ] Savi disszociációs állandó HA <-----> H + + A - ] K = + [ H ][ A [ HA] ] pk = - lg K = lg (1/K)
Hisztidin ionizációs állapotai
A fehérje protonáltsági fokát az oldalláncok minősége határozza meg
Fehérjében kötött aminosavak protonálódási állandói különbözhetnek a szabad aminosav protonálódási állandóival meghatározó fehérje környezet
Pozitívan töltött Negatívan töltött
[H + ] [OH - ] pi= 5,2
K d k cat E + S ES E + P Ka Egyértékű savi disszociációs állandó: Ka EH + K d EH + S Nem-kompetitív gátlás mechanizmus analógiája alapján: v k cat [S] = [E] 0 (K M + [S]) (1+[I]/ K I ) Behelyesttesítve: [H] + -t [I] helyébe K a t K I helyébe v k = cat [S] [E] 0 (K M + [S]) (1+[H + ]/ K a ) [E] 0 K M [H + ] = (1+ t ) 1 v k cat K a [S] meredekség reciprok + (1+ [H+ ] ) 1 K a k cat tengely.- metszet
Vegyes gátlásként értelmezve: K E a K d k cat E + S ES E + P K ES a EH + K d EH + S v k = cat [S] [E] 0 [S]) (1+[H + ]/ K ES a )+K M (1+[H + ]/ K ae ) A ph függés kifejezhető: K M a pp + = K ES MK a +[H ]K M K ES a /K E a K ES a +[H + ] k cat app = k cat K a ES K a ES + [H + ] ES komplex Ionizációs állandójától függ k cat app K M app = (k cat/k M )K E a K ae + [H + ] Enzim ionizációs állandójától függ
Acetilkolin észteráz ph optimuma 9 felett: aktív centrumban : szerin
Kétértékű sav ionizációja H 2 E H 2 ES K 1 K 1 S + HE - HES - HE - + P E 2- K 2 K 2 ES 2- Ks= [EH] [S] [EHS] k cat app = k cat K 1 [H + ] k + = cat K 1+[H + +K/ + 1 K 2 +K 1 [H ]+ [H+] 2 ]/K 1 2 [H ] Mikor optimális a ph azaz maximális a k cat ha a nevező a legkisebb: 1 +[H+]/K1+ K2/ [H+] =min [H + ]opt= K 1 K 2
Papain aktivitásának ph függése His159 Reakció sebess ség Cys25
Papain katalitikusan aktív oldalláncainak ionizációja Aktív Inaktív -H + Aktív -H + Inaktív Inaktív + H + +H + pka=8.1 pk a =3.4 tiolát-imidazólium ion pár. Cisztein proton leadás
A Kimotripszin proteolízissel aktiválódik Kimotripszinogen (inaktív) 245 p-kimotripszin (aktív) R15-I16 tripszin S14-R15 L13 I16 a-kimotripszin (aktív) p-kimotripszin t i i T147-N148 Y146 A149 Diszulfid kötések Campbell (1 1999) Bioche emistry (3d) p.179
O C O - H C H N N H O CH 2 Ser 195 = Biology of th e Cell (4e) p..158 Asp 102 O C O H C C H CH 2 His 57 H C N N H aktív Ser - O CH2 Ser 195 = Alberts et al (2002) Molecular Asp 102 C C H CH 2 His 57 Töltés relé az aktív centrumban
ph hatása a Kimotripszin Aktivitására Relatív Aktivitás 5 6 7 8 9 10 11 ph Dressler & Potter (1991) Discovering Enzymes, p.162
Juang RH ( 2004) BCbasics ph 10 9 8 7 Isoelektomos pont, pi 6 5 4 3 + + 0 - A fehérje eredő töltése ph hatása a fehérje eredő töltésére
Katalitikus triád: Imidazol gyűrű protonáltsági állapota a ph függvényében ph 6 H H ph 7 H N O C O - = Asp 102 C C C H N + N H C CH 2 H H C + N H C-H H + Inaktív H O CH 2 H N Ser 195 C C C N H Ad dapted from Dressler & Po otter (2000) Discovering Enzymes, p.16 63 His 57 Alberts et al (2002) Molecular Biology of the Cell (4e) p.158
Kimotripszin proteolitikus hasítás hatására elnyeri natív szerkezetét Asp194 és a protonált Ile16 közötti sóhíd Kialakul a Katalitikus triád
Proteolitikus hasítás hatására a Kimotripszin β- láncában az Ile16 N-Terminálissá válik Relat N-term tív aktivitás L13 I16 Y146 ph 5 6 7 8 9 10 11 NH 2 Ile 16 Asp194 és a protonált Ile16 között sóhíd alakul ki pka ph 9 ph 10 CH - 2 COO + NH 3 Ile16 Dressler & Potter (1991) Discovering Enzymes, p.165
Az N-terminális Ile16 N és az Asp194 közötti ionos kölcsönhatás stabilizálja az aktív enzim 3D szerkezetét: kialakul a katalitikus triád His 57 Ser 195 Gly 193 Asp 102 Asp 194 Katalitikus Triád + NH 3 Ile 16 Nelson & Cox (2000) Lehninger Principles of Biochemistry (3e) p.112 127
Hőmérséklet hatása
Arrhenius összefüggés: A Reakciósebesség - hőmérséklet aktiválási energia kapcsolata : k = A e-ea /RT k: Sebességi állandó (arányos a reakció sebességgel) ln k/a = -E a / RT ln nk 1/T
Hőmérséklet hatása enzim reakció sebességére Arrhenius hőmérsékleti függés tartománya k = A e-ea/rt denaturáció ln(v) versus 1/T tgα =-Ea /R
Denaturáció sebessége jóval nagyobb mint az aktiváció sebessége E a = 4-20 kcal/mol d[ E] dt E d = 40-130 kcal/mol = kd[ E] A hőmérséklet növelése 30 to 40 C-ra, az enzim aktivitást 1.8-szorosára növeli, addig az enzim denaturáció sebességét 41- szeresére növeli
Enzim molekulák térszerkezete hőhatására megbomlik (rendezetlen gombolyag) - denaturálódik