Biológiai membránok és membrántranszport Szántó G. Tibor 2015.XI.2. TK. 88. 94. oldal TK. 276. 284. oldal
A citoplazma membrán fő funkciói IC és EC térrész elválasztása elektromos szigetelés (ellenállás és kapacitás is egyben) diffúziós barrier korlátozott (szabályozott) anyagtranszport a. Egyszerű diffúzió (magas cc. -> alacsony cc.): H 2 O, O 2, CO 2, etanol b. Facilitált diffúzió (magas cc. -> alacsony cc.) transzport proteinek segítségével: ionok, cukrok stb. c. Pumpa mechanizmusok proteinjei, melyek az ion-gradienseket tartják fenn: alacsony cc. -> magas cc. cukrok, aminosavak sejtbe juttatása koncentráció gradiens ellenében is. d. Endocitózis és exocitózis, stb
A citoplazma membrán fő funkciói II. Elektromos és kémiai jelek detektálása és továbbítása szignál transzdukció: külső jelek fogadása és továbbítása (receptorok, ioncsatornák, másodlagos hírvivők). Pl.: ösztrogén hidrofób karaktere miatt képes átjutni a membránon; más anyagok hatásához receptorhoz való kötődés szükséges, mely másodlagos hírvivőket generál. A jel a sejtmagi szintig is eljuthat és befolyásolhatja a génexpressziót. Sejt-sejt kommunikáció közvetítése sejt specifikus makromolekulák (pl.:mhc, vércsoport antigének), sejtadhéziós molekulák (pl.: immun válasz, gyulladás)
A membrán szerkezete lipidek (40-60 %) foszfolipidek, glikolipidek, koleszterin amfipa kus molekulák lipid ke ősréteg (kb.5 nm) fehérjék (30-50 %) integrális (a membránt teljesen átívelő ) és perifériás fehérjék, illetve lipidekhez kötött membrán proteinek: kovalens kötés a lipiddel számos biológiai tevékenységért felelősek: sejt-sejt kontaktus, jelátvitel, enzimaktivitás, transzport stb. szénhidrátok (10%) glikolizáció kizárólag a membrán extracelluláris oldalán perifériás fehérje transzmembrán fehérje integrális fehérje
A membrán szerkezete: a foszfolipidek apoláris farokrész : 14-22 szénatomos zsírsav-láncok, észterkötéssel kapcsolódnak a glicerinhez poláris fejrész : foszfátcsoport, melyhez további molekulák kapcsolódhatnak (foszfatidiletanolamin, foszfatidil-szerin, foszfatidil-kolin stb.) R: szerin etanolamin kolin inozitol szfingolipidek: a glicerint amino-alkohol helyettesíti foszfokolin olajsav (zsírsav-oldallánc) szfingozin
A membrán szerkezete: a foszfolipidek II. poláris feji rész (hidrofil) Foszfolipidek aggregációja vizes közegben Liposzóma kettős kötés apoláris farokrész (hidrofób) Micella kettősréteg cisz-helyzet: nagyobb távolság a zsírsavláncok között
A membrán szerkezete: membránproteinek A membrán-proteinek számos funkciót tölthetnek be Enzim: Pl.: glükóz-foszfatáz (az ER-mal asszociált) és glicerinaldehid-3-foszfát dehidrogenáz (GPD), a vvt. perifériás proteinjei a vér glukóz-metabolizmusában vesznek részt. Transzport proteinek pl.: ioncsatornák, ATP-függő pumpák. Receptorok: pl.: hormonok és növekedési faktorok megkötése Egyéb: endocitózis és exocitózis; targeting, szortírozás, fehérjék módosítása az ER vagy a Golgi-ban; a sejtmembrán szerkezetének stabilizálása és alak meghatározás TRANSZPORTER KIHORGONYZÁS RECEPTOROK ENZYMEK
A membrán szerkezete: membránproteinek II. Membrán-proteinek izolálása és vizsgálata az alkalmazott detergensek a proteinek körüli foszfolipid szerkezetet utánozzák hidrofób hidrofil Na-dodecil-szulfát kiegészítés
A membrán szerkezete: szénhidrát komponensek A sejtmembrán szénhidrát komponensei funkciók: - felszíni védelem - felismerés - sejtadhézió - extracelluláris mátrix a szénhidrátok glikolipid (ritka) és glikoprotein (gyakori) formában találhatók a membránban Glikoproteinek: N-kötöttek - az Asp oldalláncának amino csoportján keresztül O-kötöttek - Ser vagy Thr hidroxil csoportjaihoz kötött szénhidrátok
A membrán szerkezete: szénhidrát komponensek II. A sejtmembrán szénhidrát komponensei a proteinekhez kapcsolódó szénhidrátok hossza: 2-60 egység gyakori felépítő elemek: galaktóz, mannóz, N-acetil-glükózamin és sziálsav a vvt. integráns proteinjének (glycophorin) szénhidrát láncainak (16 ilyen láncból 15 O-kötött és 1 N-kötött) terminális pozíciójában negatívan töltött sziálsav található ez csökkenti a vvt.-k összetapadási hajlamát és a vér viszkozitását. a glikoproteinek elsődleges szerepet töltenek be a sejtmembránok sejt-sejt felismerő funkciójában. kiegészítés
A membrán fázisállapotai gélszerű állapot alacsony hőmérséklet T<T m, gélszerű állapot a zsírsavláncok szorosabb pakolódása, korlátozott molekuláris mozgások és diffúzió magasabb hőmérséklet fluid ( szol ) állapot a kettősréteg olvad, szabadabb mozgás T>T m, folyadékszerű állapot a zsírsav láncok lazább pakolódása, intenzívebb molekuláris mozgások és szabadabb diffúzió T m : fázisátalakulási vagy olvadási hőmérséklet
A fluiditást befolyásoló tényezők a lipidek gyakran tartalmaznak egy vagy több szén-szén kettős kötést tartalmazó zsírsavakat zsírsavláncok hossza: rövidebb láncok gyengébb kölcsönhatás a láncok között - T m (nagyobb fluiditás) telítetlen zsírsavak mennyisége: kettős kötés törés a láncban gyengébb kölcsönhatás - T m koleszterin mennyisége - poláris OH-csoport révén hidrogén kötések kialakítása a szomszéd foszfolipidek oxigén atomjaival - kettős (paradox) hatás: magas hőmérsékleten csökkenti a membrán fluiditást (a rigid gyűrűk hatása) míg alacsony hőmérsékleten növeli a fluiditást (a szomszédos szénhidrogén láncok természetes elrendeződését gátolva) (Azonban a szteroidok csökkentik a lipid bilayer permeabilitását a foszfolipidek közötti teret kitöltve.)
A membrán dinamikája a membránok fluid állapotban vannak a fiziológiás hőmérsékleten, amely különböző mozgásokat tesz lehetővé membrán- aszimmetria: a lipidek döntő hányada egyenlőtlen arányban oszlik meg a két lipid-monolayerben - mennyiségi és minőségi eltérések Az aszimmetria a lipidek típusainak eltérőségében és a telítettség fokának különbözőségében testesül meg. Az aszimmetria a membránok biogenezise során alakul ki. kiegészítés A kialakult aszimmetria termodinamikai okoból gátolja a lipidek cseréjét a két felszín között. Lipidek mozgása a membránban: - flip-flop, vagy transzverz diffúzió - rotáció - laterális diffúzió laterális diffúzió flip-flop (kicserélődés) fehérjék: FRAP Single Particle Tracking Fluoreszcencia korrelációs spektroszkópia csapkodó mozgás (flexibilitás) rotáció lipidek: DPH fluoreszcencia polarizáció vagy anizotrópia fluiditás mérés
A membrán dinamikája II. A mobilitás kimutatása. A Frye-Edidin kísérlet. Larry D. Frye és Michael Edidin (1970): a fő hisztokompatibilitási komplex (MHC az immunológiai védekezés egyik kulcsmolekulája) fehérjék mozognak az egér- és humán sejtek egyesítése során keletkező hibrid sejtek membránjában Singer és Nicolson-féle folyadék-mozaik membrán-modell (Seymour J. Singer és Garth L. Nicolson 1972) a fehérjék véletlenszerű eloszlása és szabad diffúziója részben igaz, de valójában a membrán struktúrája ennél bonyolultabb
Lipid tutajok (raft, DIG-mikrodomének) speciális összetételű (magas szfingolipid, glikolipid és koleszterin-tartalmú), fehérjéket is magában foglaló membrándomének (detergens inszolubilis glikolipidmikrodomén) β1 integrin Kv1.3 TCR/ CD3 CD4/CD8 p56 lck hdlg K v β 2 ZIP-1/2 PKC membránfehérjék laterális szervezettségének biztosítása, bizonyos jelátviteli folyamatokhoz szükséges elemek együtt tartása, hogy kölcsönhathassanak egymással
Membrántranszport Anyagáramlás az ic. és az ec. folyadéktér között. szabad diffúzió ioncsatornán keresztül történő transzport facilitált diffúzió (karrier/transzporter mediált passzív transzport) aktív transzport (pumpák) exo- és endocitózis (vezikuláris transzport) transzepitheliális transzport Transzporterek. uniporter: egyetlen molekulát juttat át a membrán egyik oldaláról a másikra kotranszporter: két vagy több ion/molekula mozgatását teszik lehetővé. A két részecske szállítása történhet azonos irányban (szimporter), illetve ellentétesen (antiporter)
három kategória a mechanizmus típusa és energetikája alapján passzív - alacsonyabb koncentráció felé - energiát nem igényel Membrántranszport aktív - magasabb koncentráció felé - energiaigényes diffúzió elsődleges aktív közvetlen ATP felhasználás másodlagos aktív Facilitált diffúzió a célmolekula átjutását segítő transzport fehérje közvetett ATP felhasználás: egy másik molekula gradiensének energiájával szállítja a célmolekulát
Membrántranszport mechanizmusok Passzív transzport. csak kis méretű és lipidoldékony molekulák pl. szteroid hormonok, O 2 és CO 2 vvt-ben nem energiaigényes folyamat transzport a kémiai gradiens által meghatározott irányban a transzport hajtóereje a kémiai potenciálok különbsége, az anyagtranszport a magasabb kémiai potenciálú hely felől az alacsonyabb kémiai potenciálú hely felé történik (ec. illetve ic. tér). µ = µ 0 + RT ln c µ = c RT ln c ha c I > c II, akkor μ>0, az anyagtranszport az I-es térrészből a II-es térrész felé történik. a transzport akkor áll le, amikor μ=0 (c I = c II ). I II
Membrántranszport mechanizmusok II. Passzív transzmembrán diffúzió. ha a koncentráció a membránon belül egyenletesen változik, az anyagáramsűrűség leírható a Fick I. törvénnyel c v1 c m1 K>1 K<1 d c m2 megoszlási hányados (a hidrofobicitás mértéke) c v2 dc c c J = D = D = p c c dx d dm dt ( ) m2 m1 m m m m2 m1 c m2 és c m1 : konc. a d vastagságú membránban a két szélen D m : diffúziós együttható a membránban p m : membrán permeabilitási állandó c c K = = c c m1 m2 v1 v2 ( ) ( ) J = p K c c = p c c m m v2 v1 v2 v1 illetve: c v2 és c v1 : a két határoló vizes fázisban mérhető koncentráció ( c ) = pa c v2 v1 permeabilitási állandó (effektív) KDm p = = Kpm d mitől függ P értéke? K, ez függ leginkább a molekula típusától D m, (kb. egyforma ugyanakkora molekulákra) a membrán d vastagságától (kb. állandó)
Membrántranszport mechanizmusok III. Elektrodiffúzió. elektrokémiai potenciál: a kémiai potenciál és az elektrosztatikus potenciális energia összege µ e = µ 0 + RT ln c+ zfϕ extracelluláris intracelluláris az elektrosztatikus potenciális energia különbségből származó hajtóerő mindig az alacsonyabb potenciális energiájú oldal irányába mutat (negatív töltés esetén a pozitívabb, pozitív töltés esetén a negatívabb elektrosztatikus potenciálú oldal felé).
Membrántranszport mechanizmusok IV. Facilitált diffúzió. csatorna vagy karrier fehérje segítségével történő transzport a gradiensnek megfelelően pl. glükóz transzporter, ioncsatornák stb. a folyamat sebessége jelentősen nagyobb, mint a passzív diffúzióra vonatkozó Ficktörvények alapján várható nagy szelektivitás a diffúzió sebessége maximumot mutat, azaz telíthető a koncentráció növekedésével hőmérséklet-függés mindkét irányba működhet szelektíven gátolható kinetikai (!!) és nem energetikai különbség az egyszerű diffúziótól aktiválhatóság/szabályozhatóság: gating (csatorna-alegységek konformációs változása)
Membrántranszport mechanizmusok V. Facilitált diffúzió. A Michaelis-Menten egyenlet. (Leonor Michaelis, Maud L. Menten, 1913) k 1 k2 T + Sk TS T + S k 1 b v: a transzport sebessége (mol/l/s) v = M [ ] t kc T K + c v max : a transzport maximális sebessége, az a transzportsebesség, amelyet végtelen nagy szubsztrátkoncentráció mellett kapnánk c: a transzportált molekula (szubsztrát) koncentrációja (mol/l), gyakran jelölik S-el (szubsztrát) K M : Michaelis-állandó (mol/l), az a transzportált molekulakoncentráció, melynél a transzport sebessége félmaximális, v = ½v max. Minél alacsonyabb K M értéke, annál magasabb a transzporter affinitása a transzportált molekulához k: a transzport sebességi állandója (1/s) [T] t : a transzporter molekulák teljes koncentrációja (mol/l) kiegészítés
Membrántranszport mechanizmusok VI. Facilitált diffúzió. A Michaelis-Menten egyenlet levezetése. a diffúzió sebessége: k 1 k2 T + Sk TS T + S k 1 [ ] d S v = b = k2 TS dt a köztitermék koncentráció-változása: [ ] (steady-state elv: a köztitermék koncentrációváltozásának sebessége elhanyagolhatóan kicsi) a teljes transzporter koncentráció: azaz a transzport sebessége: [ ] d TS dt [ T ] = [ T ] + [ TS] [ T ] = [ T ] [ TS] t [ TS] [ ] [ ] [ ] b [ ][ ] [ ] [ ] = k S T k TS k TS = ( ) 1 k 1 2 0 t [ k ][ ] t [ ] k1 Sk T TS k t 1 S T = [ TS] = k + k k + k + k S 1 2 1 2 1 [ k ][ ] t [ ] [ ][ ] k2k1 S T k2 Sk T v = k2 [ TS] = = k 1 k k 2 k1 Sk 1 k + + + 2 + k1 k2 [ Sk ][ T ] kc[ T ] t t v = v = K + S K + c [ ] M k M [ TS] = k S T 1 [ k ][ ] k + k 1 2 t [ S ] k k kiegészítés
Membrántranszport mechanizmusok VII. Facilitált diffúzió. A Michaelis-Menten egyenlet. a Lineweaver-Burk-féle ábrázolás segítségével K M és v max értéke grafikusan meghatározható: ilyenkor 1/v-t ábrázoljuk 1/c függvényében (kettős reciprok ábrázolás), ami lineáris függvényt eredményez. Az illesztett egyenes y tengelymetszete 1/v max, x tengelymetszete -1/K M, meredeksége K M /v max értékét adja. v max = = M M [ ] v c kc T t K + c K + c kiegészítés
Membrántranszport mechanizmusok VIII. Ionofórok. kis, hidrofób molekulák, melyek ionokat képesek lipidoldékony komplexbe vinni a transzportált ionok töltését leárnyékolva teszik lehetővé az ionok membránon való átjutását az iontranszport az elektrokémiai potenciál által meghatározott irányban játszódik le erősen hőmérsékletfüggő folyamat mozgékony ionkarrierek: - gyűrűszerű molekulák, melyek kívül hidrofóbak és belül kötik az iont valinomycin (erős K + -szelektivitás), nonactin, nigericin, ionomycin (Ca 2+ -ionofór). csatornaképző ionofórok (gramicidin-a) polién antibiotikumok (nystatin) } a membránba épülve csatornákat hoznak létre az ionok számára
Membrántranszport mechanizmusok IX. Aktív transzport. közvetlen ATP felhasználás elsődleges aktív: a pumpafehérje ATP hidrolízisből nyert energiával juttat át ionokat a membránon a gradienssel szemben pl. Na + /K + pumpa, Ca 2+, H + pumpák ABC transzporterek (lsd. sejtbiológia..) közvetett ATP felhasználás: egy másik molekula gradiensének energiájával szállítja a célmolekulát másodlagos aktív: egy elsődleges aktív mechanizmus által létrehozott gradiensben tárolt energiát használja egy másik molekula gradienssel szemben történő transzportjához pl. Na + -glükóz szimporter (2 Na + be, 1 glükóz be) vagy Na + /Ca 2+ antiporter (3 Na + be, 1 Ca 2+ ki) közvetlen energiaforrás a Na + gradiens hajtóereje
Membrántranszport mechanizmusok X. A Na + /K + pumpa. hozzájárulás a nyugalmi membránpotenciál kialakításához (elektrogén pumpa: 3 Na + ki/2 K + be (direkt hozzájárulás), az egyenőtlen ioneloszlás fenntartása (indirekt hozzájárulás, iongradiens kell a diffúziós potenciál kialakulásához) ozmotikus nyomás csökkentése a sejten belül energia másodlagos aktív transzporthoz (Na + -gradiens által) szelektív gátlóanyag: szívglikozidok (Digoxin, Ouabain) Digitalis lanata gyapjas gyűszűvirág pumpa gátlása ic. [Na + ] gátolt Na + /Ca 2+ exchanger ic. [Ca 2+ ] nő a kontrak litás és a membránpotenciál
Membrántranszport mechanizmusok XI. A Na + /K + pumpa. az ATP-áz az intracelluláris oldalon Na + -ionokat köt meg egy ATP-molekula hidrolízise és a fehérje ehhez kapcsolódó foszforilálása során nyert energia felhasználásával a fehérje konformációja megváltozik a konformációváltozás következtében a fehérje Na + -kötőhelyéről a Na + -ionok az extracelluláris oldalon disszociálnak, így a fehérjében kialakul a K + -kötőhely a K + -ionok kötődése, majd a fehérje defoszforilációja újabb konformációváltozást eredményez a kötött K + az intracelluláris térrészen disszociál, és ismét kialakul a Na + -kötőhely.
Membrántranszport mechanizmusok XII. Glükóz felvétel a bél lumenéből. SGLT: Na-glucose linked transporter (Robert K. CRANE) a bélhámsejtek apikális (bél ürege felé néző) felszínén található Na + /glükóz ko-transzportert a 2:1 arány jellemzi, azaz 2 mol Na + felvételéhez 1 mol glükóz felvétele társul a bél üregéből.