A doktori értekezés tézisei A Dro ophila Atg gének vizsgálata: a F P 00/Atg17 szerepe az autofágiában Készítette: Kárpáti Manuéla Témavezető: Dr. Juhász Gábor, PhD tudományos főmunkatárs ELTE, Anatómiai, Sejt- és Fejlődésbiológiai Tanszék Biológia Doktori Iskola, Molekuláris Se - és Neurobiológia P m k Iskola vezetője: Dr. Erdei Anna Programvezető: Dr. Sass Miklós Eötvös L ránd Tudományegyetem Természettudományi K Biológia Intézet Bud e, 24.
BEVEZETÉS Az autofágia, azaz sejtes önemésztés minden eukarióta sejtben megfigyelhető, fontos önmegújító folyamat. Fő feladata a sejt saját anyagainak lebontása, hogy azok alapanyagot és energiát szolgáltassanak a felépítő folyamatoknak (De Duve 1967). Morfológia alapján három fő fajtáját különböztetjük meg, a továbbiakban a legismertebb, legjobban leírt formájáról, a makroautofágiáról (továbbiakban csak autofágia) lesz szó (Mizushima, Levine és mtsai 2008). Az autofágia első lépéseként létrejön egy kettős membránnal határolt fagofór (izoláló membrán), mely körbeöleli a citoplazma egy részletét. A membrán záródásával jön létre az autofagoszóma, mely egy lizoszómával egyesülve alkotja a lebontó organellumot, az autolizoszómát (1. ábra). Az autofágia alapszinten minden sejtben működik, ezt nevezzük bazális autofágiának. Különböző fejlődési folyamatokban azonban nagymértékben aktiválódik, segít a nagytömegű szövetek, sejtek lebontásában, ez a fejlődési autofágia. A sejtet érő tápanyag- vagy energiahiányos állapotban (például éhezés vagy hipoxia hatására) is beindul az önemésztés, hogy fenntartsa a legfontosabb sejttani funkciókat az időlegesen visszaszorítható folyamatok kárára. Ezt nevezzük stressz-indukált autofágiának. Az autofágiát olyan sejtélettani folyamatokban írták le, mint az öröklött és szerzett immunitás vagy az öregedés, illetve szerepet játszik számos betegség patomechanizmusában is, mint például a különböző neurodegenerációs, tumoros megbetegedések, miopátiák (Reggiori és Klionsky 2002, Mizushima, Levine és mtsai 2008, Yang és Klionsky 2010, Devenish és Klionsky 2012, Jiang és Mizushima 2014). Ezekben a folyamatokban sokszor az autofágia túl- vagy alulműködése okozza vagy támogatja az adott betegséget. Ebből a rövid felsorolásból is látható, hogy az autofágia sejttani szerepe igen sokrétű, így a folyamat jobb megismerése fontos és szükséges. Az autofágia génjeit és molekuláris mechanizmusát először élesztőben írták le, de a folyamat konzerváltsága miatt a legtöbb Atg (autofágia) gén illetve homológjaik ugyanúgy megtalálhatóak az emlősökben és az ecetmuslicában (Itakura és Mizushima 2010, Devenish és Klionsky 2012). A folyamat hat fő lépése a következő (1. ábra): 1.: iniciáció; 2.: az izoláló membrán/fagofór kialakulása (nukleáció); 3.: az izoláló membrán érése és az autofagoszóma kialakulása; 4.: kapcsolódás és fúzió lizoszómával; 5.: savasodás; 6.: reciklizáció. A hat lépést specifikus fehérjekomplexek vezénylik (1. ábra). Az autofágia igen finoman szabályozott. Fő regulátora a TOR (target of rapamycin) szerintreonin kináz, mely a sejtek fő tápanyag- és energiaszenzora. Mivel feladata a sejtnövekedés és -osztódás indukálása, ezért az autofágiára gátló hatást fejt ki az Atg1 kináz komplexen keresztül (Hosokawa, Hara és mtsai 2009, Yang, Rudge és mtsai 2013). 2
Az autofágia iniciációjáért felelős komplex tagja a FIP200 (FAK family interacting protein of 200 kda) fehérje is, amely emlősökben egy nagyméretű, főként állvány (scaffold) feladatot lát el (Ganley, Lam du és mtsai 2009, Hosokawa, Hara és mtsai 2009, Mizushima 2010). Számos sejtélettani folyamatban játszik szerepet, a sejtnövekedés, a sejtosztódás, a túlélés és a migráció kapcsán is leírták. Az autofágiában először az ULK1/2 (emlős Atg1) fehérjékkel hozták kapcsolatba, azonban mára bebizonyosodott, hogy a komplex másik tagjához, az Atg13 fehérjéhez is kapcsolódik. Emlősökben az indukciós ULK1/2 komplex mind éheztetett, mind jól táplált állapotban összeszerelődött formában van jelen. Tápanyagdús körülmények között a TOR fehérje direkt köti a komplexet, míg éheztetés hatására a kötés, ily módon gátlás is megszűnik, az ULK1/2 kináz komplex képes autofágiát indukálni. A folyamat első lépése az Atg13 fehérje foszforilációs állapotának megváltozása, melyben a két kináz, az ULK1/2 és a TOR játszik szerepet (Chang és Neufeld 2009, Hosokawa, Hara és mtsai 2009, Jung, Jun és mtsai 2009). Összehasonlításképpen az élesztő Atg1 komplex az Atg13 és Atg17, valamint Atg29 és Atg31 fehérjékből áll. A komplex csak az indukciós jel hatására szerelődik össze. Ebben fontos lépés a TOR által foszforilált Atg13 szinte teljes defoszforilációja. Érdekes különbség a két fajban továbbá, hogy az Atg17 és a FIP200 fehérje között evolúciós leszármazás nincsen, csupán feladatukban egyeznek meg, tehát funkcionális analógnak tekinthetőek. Az általunk vizsgált Drosophila CG1347 jelű fehérje az összehasonlítások alapján az emlős FIP200 ortológja, így a továbbiakban FIP200-nak nevezzük (Kim, Park és mtsai 2013). Kísérleteink modellállata a Drosophila melanogaster, azaz az ecetmuslica. Ez a faj régóta a genetikai kutatások fő tárgya: gyors életciklusa, könnyű tarthatósága és szaporítása mellett számos genetikai és sejtbiológiai vizsgálómódszer teszi kiváló modellé. A muslica különösen alkalmas az önemésztés kutatására, hiszen nemcsak éheztetéssel indukálhatunk benne autofágiát, hanem teljes átalakulása során normálisan is megfigyelhető benne nagymértékű fejlődési autofágia (Baehrecke 2003, Denton, Shravage és mtsai 2009, McPhee és Baehrecke 2009). A kísérletekhez használtunk Drosophila haemocita sejttenyészetet is. Az itt kapott eredményeinket in vivo, teljes Drosophilában is igazolni tudtuk. 1. ábra: Az autofágia főbb lépései és a folyamatban szerepet játszó komplexek (Nagy Péter ábrája) 3
ALKALMAZOTT MÓDSZEREK Molekuláris klónozás és embrió injektálás A FIP200 fehérje funkciójának és lokalizációjának vizsgálatára UAS promóter kontrollálta FIP200-GFP fúziós fehérjét kifejező transzgénikus legyeket hoztunk létre. Poliklonális ellenanyagok létrehozása Az autofág folyamatok és fehérjelokalizációk vizsgálatához létrehoztunk poliklonális endogén anti-fip200, anti-atg1, anti-atg13, anti-atg8a és anti-tor patkány és/vagy nyúl ellenanyagokat. Immuncitokémia A létrehozott új ellenanyagokkal sikerült a Drosophila zsírtest- és bélszövetben az endogén Atg fehérjéket indirekt immunfluoreszcencia révén jelölni. Fény- és elektronmikroszkópos vizsgálatok Az autofág folyamatok vizsgálatára számos módszer elérhető, legklasszikusabb a sejten belüli struktúrák megfigyelése transzmissziós elektronmikroszkópiával. Ezen kívül számos fluoreszcensen jelölt fehérje és festék elérhető, melyekkel a preparált és előkészített Drosophila zsírtest- és bélmintákban kimutatható az önemésztés. Immunprecipitáció Az indukciós komplexben meglevő fehérjeinterakciók kimutatására immunprecipitációt használtunk. A kísérletet mind sejttenyészeti, mind teljes állatból nyert mintákon megismételtük és feltérképeztük a FIP200-Atg13-Atg1-Atg101 fehérjék közötti kapcsolatot. Western blot A fehérjék mennyiségének, illetve mobilitásának meghatározására számos Western blot kísérletet hajtottunk végre. Az anti-atg1 ellenanyag sajnos nem, de az anti-atg13 ellenanyag kiválóan alkalmas a fehérje foszforilációs szintjének vizsgálatára. Statisztika A mikroszkópos képeket és a Western blot kísérletek eredményeit ImageJ programmal értékeltük, majd a kontroll és mutáns minták szignifikanciaértékét meghatároztuk. 4
EREDMÉNYEK A Drosophila CG1347 jelű gén termékét az emlős FIP200 fehérje homológjaként azonosítottuk. A fehérje funkciójának vizsgálatához FIP200-/- nullmutáns állatokat, FIP200-GFP fúziós fehérjét expresszáló transzgén legyeket, és az endogén FIP200 fehérje elleni poliklonális ellenanyagot hoztunk létre. Genetikai mozaik állatokban és teljes zsírtesten is megmutattuk, hogy a FIP200-/- mutáns illetve a FIP200-géncsendesített állatokban sérül az indukált autofágia. A kimutatáshoz számos autofág markert, LTR (LysoTracker Red) savas sejtalkotókat jelölő festéket, valamint mcherry-atg8a fúziós fehérjét és anti-atg8a jelölést használtunk. A FIP200 mutáns sejtekben semmilyen autofág struktúrát nem találtunk. Elektronmikroszkóppal megvizsgáltuk az éheztetett FIP200-/- és a kontroll állatok zsírtestét. A kontrollal ellentétben, mely nagy számban tartalmazott mind autofago-, mind autolizoszómákat, a FIP200 mutáns állatokban nem láttunk ilyeneket. Western blottos és fénymikroszkópos felvételekkel kimutattuk, hogy a FIP200-/- sejtekben felhalmozódott az autofágia szelektív szubsztrát fehérjéje, a p62. A p62 felhalmozódása a lebontás hiányára utal. Episztázis analízist végeztünk a FIP200-Atg1 hierarchia felállítására. FIP200- géncsendesített állatokban nem alakultak ki mcherry-atg1-pozitív struktúrák. Ha viszont FIP200-/- háttéren túltermeltetjük az Atg1 fehérjét, indukálódik az autofágia, tehát az Atg1 downstream helyezkedik el a FIP200-tól. Megvizsgáltuk a FIP200 fehérje elvesztésének hatását a fejlődési autofágiára, illetve a muslicák teljes átalakulására is. FIP200-/- állatokban nem tapasztalható fejlődési autofágia. Az ilyenkor a kontrollban lebomló lárvális szövetek, mint a középbél és a nyálmirigy, a mutánsokban még késői báb korban is megfigyelhetők, tehát a FIP200 hiánya gátolja a fejlődési autofágiát is. Elektronmikroszkópos módszerekkel megvizsgáltuk a FIP200-/- mutáns állatok idegsejtjeit, melyekben (hasonlóan a többi Atg mutánshoz) membránnal nem határolt fehérjeaggregátumok alakultak ki. A különböző autofág fehérjék és a FIP200 lokalizációjának vizsgálatát is elvégeztük. Mind a fúziós riporter, mind pedig az endogén FIP200 kolokalizált az ismert PAS 5
markerekkel, tehát az autofágia legkorábbi lépéseiben szerepel. A fehérje nagymértékben kolokalizált a sejtekben megfigyelhető p62 aggregátumokkal is. Érdekes, hogy a FIP200 fehérje apró citoplazmás granulumokban helyezkedik el, mely struktúrák a lizoszómák mellett helyezkednek el. A FIP200 fehérje túltermeltetésének hatására már jól táplált állatokban is megjelentek a különböző autofág struktúrák, köztük a legkorábbiak is. Ezekben a sejtekben az indukálódott autofágia Atg1 fehérje hiányában nem alakul ki, tehát a FIP200 indukciós hatása ennek a fehérjének a jelenlététől függ. Immunprecipitációs kísérleteket végeztünk, hogy megmutassuk, hogy a FIP200 fehérje az Atg1 kináz komplex tagja. Mind sejttenyészeten, mind állatokban sikerült kimutatnunk kapcsolatot az Atg1, az Atg13, az Atg101 és a FIP200 fehérje között. Feltérképeztük az Atg1-Atg13, valamint az Atg13-FIP200 kötésért felelős Atg13 régiókat. A fehérjét három darabra osztottuk. Eredményeinkből az látszik, hogy az Atg1 interakcióhoz elég az Atg13 C-terminális része, míg a FIP200 kötéshez a fehérje második kétharmadára van szükség. Az Atg13 fehérjeinterakciók vizsgálatakor megfigyeltük, hogy a fehérje Atg1-el kölcsönható régióját is tartalmazó minták alacsonyabb mobilitású formákat is tartalmaznak. Foszfatáz kezeléssel, valamint különböző autofágia gátló és indukáló fehérjékkel bebizonyítottuk, hogy ezek a formák különböző foszforilációs állapotokat rejtenek. Jól táplált állatokban is megfigyelhető kis mennyiségű lassabban migráló Atg13, autofágia indukciójakor azonban ugrásszerűen megnő az alacsonyabb mobilitású, hiperfoszforilált formák mennyisége. A FIP200 fehérje hatását is megvizsgáltuk az Atg13 foszforilációs szintjére. Azt tapasztaltuk, hogy FIP200 hiányában az Atg13 hiperfoszforilált formája az alapszint alá csökken. FIP200 túltermeltetése esetén azonban a táplálékellátottságtól függetlenül nagymértékben megnő a hiperfoszforilált Atg13. FIP200 túltermeltetése mellett domináns negatív, tehát foszforilációra képtelen Atg1[DN] fehérjét is termeltettünk a sejtekben. Ekkor az Atg13 foszforilációjának szintje a kontroll értékre csökkent vissza, tehát a FIP200 az Atg1 fehérjén keresztül fejti ki hatását az Atg13-ra. 6
TÉZISEK 1. A Drosophila CG1347 az emlős FIP200 ortológja. 2. FIP200 hiányában nem működik a bazális és az indukált autofágia, már a legkorábbi autofág struktúrák sem jelennek meg. 3. A FIP200 fehérje a hierarchiában az Atg1 felett (upstream) hat. 4. A FIP200 szükséges a fejlődési autofágiához, hiányában nem bomlanak le megfelelően a Drosophila lárvális szervei. 5. FIP200 mutáns állatok idegsejtjeiben fehérjeaggregátumok jelennek meg. 6. A FIP200 fehérje sejten belüli lokalizációja a lizoszómák mellett található, a fehérje kolokalizál a p62 aggregátumokkal. 7. A FIP200 túltermeltetése autofágiát indukál Atg1-függő módon. 8. A Drosophila FIP200 az Atg1 kináz komplex tagja. Köti a Drosophila Atg1, Atg13 és Atg101 fehérjéket is. 9. A FIP200 in vivo aktiválja az Atg1 fehérjét, ennek hatása az Atg13 foszforilációjában nyilvánul meg. 7
KÖVETKEZTETÉSEK Ebben a dolgozatban kimutattuk, hogy az ismert modellszervezetben, a Drosophila melanogasterben a Drosophila FIP200 az autofágia indukciójáért felelős Atg1-kináz komplex tagja. A FIP200 fehérje, emlős ortológjához hasonlóan a komplex legnagyobb méretű tagja, valószínűleg állvány (scaffold) funkciót (is) tölthet be. Bemutattuk, hogy a FIP200 szükséges a bazális, az indukált, valamint a fejlődési autofágiához is. Túltermeltetése a tápanyagellátottságtól függetlenül a sejtes önemésztés beindulását okozza. Megvizsgáltuk a FIP200 fehérje lokalizációját is. A FIP200 éheztetett körülmények között citoplazmás pöttyök formájában helyezkedik el a lizoszómák körül, melyek egybeesnek a p62 aggregátumokkal. Valószínűleg ezek a PAS, vagyis a preautofág struktúra alkotói, hasonlóan az élesztőhöz, ahol az autofágia lépései a vakuólumhoz közel zajlanak le. Ezzel a felfedezéssel közelebb kerültünk az indukciós komplex működési mechanizmusának pontosabb leírásához, mely a mai napig várat magára. Részletesebben megvizsgáltuk az indukciós komplex működését és hierarchikus viszonyait, melyben az élesztő és a humán Atg1/ULK1-kináz komplex jócskán eltér nemcsak egymástól, hanem a Drosophilától is. A dolgozatban bemutattuk, hogy a Drosophila melanogasterben a genetikai hierarchia csúcsán a FIP200 fehérje áll és alatta (downstream) helyezkedik el az Atg1. Az Atg13 fehérjék között több foszforilációs állapotot találtunk, melyek korrelálnak az autofágiával, mivel indukciós hatásra megnőtt a hiperfoszforilált fehérje mennyisége. Ez a foszforiláció FIP200 és Atg1 függő. A jól táplált állatokban is találtunk kis mennyiségű hiperfoszforilált, tehát autofágia szempontjából aktív Atg13-t, mely valószínűleg a bazális autofágia miatt lehet. Ennek alapján felállítottunk egy modellt, mely a bazális, kismértékű és az indukált, nagymértékű autofágia során mutatja be a Drosophila Atg1-komplex tagjainak állapotát. (2. ábra) 2. ábra: Hipotetikus modell az Atg13 fehérje viselkedésére bazális és indukált autofágia során (Nagy Péter ábrája) 8
A DOKTORI ÉRTEKEZÉS ALAPJÁUL SZOLGÁLÓ KÖZLEMÉNYEK *Nagy, P., *M. Karpati, A. Varga, K. Pircs, Z. Venkei, S. Takats, K. Varga, B. Erdi, K. Hegedus and G. Juhasz (2014). "Atg17/FIP200 localizes to perilysosomal Ref(2)P aggregates and promotes autophagy by activation of Atg1 in Drosophila." Autophagy 10(3): 453-467. * megosztott első szerzők Takats, S., P. Nagy, A. Varga, K. Pircs, M. Karpati, K. Varga, A. L. Kovacs, K. Hegedus and G. Juhasz (2013). "Autophagosomal Syntaxin17-dependent lysosomal degradation maintains neuronal function in Drosophila." J Cell Biol 201(4): 531-539. Takats, S., K. Pircs, P. Nagy, A. Varga, M. Karpati, K. Hegedus, H. Kramer, A. L. Kovacs, M. Sass and G. Juhasz (2014). "Interaction of the HOPS complex with Syntaxin 17 mediates autophagosome clearance in Drosophila." Mol Biol Cell 25(8): 1338-1354. REFERENCIÁK Baehrecke, E. H. (2003). "Autophagic programmed cell death in Drosophila." Cell Death Differ 10(9): 940-945. Chang, Y. Y. and T. P. Neufeld (2009). "An Atg1/Atg13 complex with multiple roles in TOR-mediated autophagy regulation." Mol Biol Cell 20(7): 2004-2014. De Duve, C. (1967). "Lysosomes and phagosomes. The vacuolar apparatus." Protoplasma 63(1): 95-98. Denton, D., B. Shravage, R. Simin, K. Mills, D. L. Berry, E. H. Baehrecke and S. Kumar (2009). "Autophagy, not apoptosis, is essential for midgut cell death in Drosophila." Curr Biol 19(20): 1741-1746. Devenish, R. J. and D. J. Klionsky (2012). "Autophagy: mechanism and physiological relevance 'brewed' from yeast studies." Front Biosci (Schol Ed) 4: 1354-1363. 9
Ganley, I. G., H. Lam du, J. Wang, X. Ding, S. Chen and X. Jiang (2009). "ULK1.ATG13.FIP200 complex mediates mtor signaling and is essential for autophagy." J Biol Chem 284(18): 12297-12305. Hosokawa, N., T. Hara, T. Kaizuka, C. Kishi, A. Takamura, Y. Miura, S. Iemura, T. Natsume, K. Takehana, N. Yamada, J. L. Guan, N. Oshiro and N. Mizushima (2009). "Nutrientdependent mtorc1 association with the ULK1-Atg13-FIP200 complex required for autophagy." Mol Biol Cell 20(7): 1981-1991. Itakura, E. and N. Mizushima (2010). "Characterization of autophagosome formation site by a hierarchical analysis of mammalian Atg proteins." Autophagy 6(6): 764-776. Jiang, P. and N. Mizushima (2014). "Autophagy and human diseases." Cell Res 24(1): 69-79. Jung, C. H., C. B. Jun, S. H. Ro, Y. M. Kim, N. M. Otto, J. Cao, M. Kundu and D. H. Kim (2009). "ULK-Atg13-FIP200 complexes mediate mtor signaling to the autophagy machinery." Mol Biol Cell 20(7): 1992-2003. Kim, M., H. L. Park, H. W. Park, S. H. Ro, S. G. Nam, J. M. Reed, J. L. Guan and J. H. Lee (2013). "Drosophila Fip200 is an essential regulator of autophagy that attenuates both growth and aging." Autophagy 9(8): 1201-1213. McPhee, C. K. and E. H. Baehrecke (2009). "Autophagy in Drosophila melanogaster." Biochim Biophys Acta 1793(9): 1452-1460. Mizushima, N. (2010). "The role of the Atg1/ULK1 complex in autophagy regulation." Curr Opin Cell Biol 22(2): 132-139. Mizushima, N., B. Levine, A. M. Cuervo and D. J. Klionsky (2008). "Autophagy fights disease through cellular self-digestion." Nature 451(7182): 1069-1075. Reggiori, F. and D. J. Klionsky (2002). "Autophagy in the eukaryotic cell." Eukaryot Cell 1(1): 11-21. Yang, H., D. G. Rudge, J. D. Koos, B. Vaidialingam, H. J. Yang and N. P. Pavletich (2013). "mtor kinase structure, mechanism and regulation." Nature 497(7448): 217-223. Yang, Z. and D. J. Klionsky (2010). "Mammalian autophagy: core molecular machinery and signaling regulation." Curr Opin Cell Biol 22(2): 124-131. 10