DOKTORI ÉRTEKEZÉS TÉZISEI FIZIOLÓGIÁS ÉS PATOLÓGIÁS SZINKRONIZÁCIÓK MECHANIZMUSAI A VIZUÁLIS RENDSZERBEN EÖTVÖS LORÁND TUDOMÁNYEGYETEM BIOLÓGIA DOKTORI ISKOLA MOLEKULÁRIS SEJT- ÉS NEUROBIOLÓGIA PROGRAM A Doktori iskola vezetője: Dr. Erdei Anna Programvezető: Dr. Sass Miklós Témavezető: Dr. Juhász Gábor Lőrincz László Magor MTA-ELTE Neurobiológiai Kutatócsoport Eötvös Loránd Tudományegyetem Budapest, 2006
BEVEZETÉS Jóllehet valamely neuronhálózat működésének tulajdonságait a benne levő neuronok biofizikai tulajdonságai határozzák meg, neuronhálózat szintjén az alkotóelemek kapcsoltságának sokfélesége hozzájárul a működés komplexitásához, aminek eredményeképpen azonos tulajdonságokkal rendelkező alapelemekből felépülő rendszerek eltérő sajátosságokkal rendelkeznek. Az EEG ritmusok vagy oszcillációk sajátosságai alvás-ébrenléti állapottól való függésük, illetve keletkezésük alapelve: a neuronális szinkronizáció. Az EEG szempontjából a szinkronitás ritmikus, nagy amplitúdójú mezőpotenciálon alapuló elektorfiziológiai jelenséget jelöl, ami nagyszámú idegsejt egyidejű ritmikus kisülésének, illetve szinaptikus potenciáljainak tér-és időbeni összegzésének eredménye. Ezzel ellentétben az EEG deszinkronizációja a nagy amplitúdójú lassú hullámok gyors, alacsony amplitúdójúvá alakulását jelenti. Az említett ritmusok egy része a thalamo-kortikális rendszerben keletkezik, ezek létrejöttében a thalamusznak az agykéreggel alkotott bonyolult és kétoldali kapcsoltsága mellett fontos szerepet játszanak a lokális (intrakortikális és intrathalamikus) neuronhálózatok, valamint számos diffúz afferentáció. A thalamo-kortikális szinkronizációs jelenségeket két csoportra oszthatjuk aszerint, hogy mekkora területre terjednek ki, így beszélhetünk lokális (például nyugodt ébrenléti állapotra jellemző okcipitális α ritmus) illetve globális (például petit mal epilepsziás rohamokkor regisztrálható tüske-hullám kisülések) oszcillációkról. E ritmusok számos fiziológiai és patológiai szerepe a percepciótól a bonyolult memória folyamtokig kihat. A thalamo-kortikális oszcillációk intenzív kutatásában régi feltételezés, hogy az α ritmusok keletkezésében a thalamusz kiemelt szerepet játszik, azonban ennek celluláris mechanizmusai kísérleteink megkezdésekor ismeretlenek voltak. Ezért thalamo-kortikális sejtek illetve a lokális neuronhálózat szerepét vizsgáltuk az okcipitális α ritmus genezisében. Szabadon mozgó
macskák thalamo-kortikális sejtjeinek extracelluláris akcióspotenciáljait elvezetve néhány fiziológiai és farmakológiai kísérlet során kiderült, hogy ezek a sejtek valószínűleg a kortiko-thalamikus terminálisok által aktivált metabotróp glutamát receptor aktiváció hatására aktívan részt vesznek az elektroencefalogramban regisztrálható α ritmusok genezisében. Továbbá a tüske-hullám kisülésekként ismert globális szinkronizációs stádiumok és a vizuális rendszer kapcsolatát vizsgáltuk a petit mal epilepszia állatmodelljében, WAG/Rij patkányokban. Kiderült, hogy a tüske-hullám kisülések thalamo-kortikális rendszerben történő keletkezésüket követően egyéb struktúrákra is kiterjednek, mint például az agytörzsi nucleus raphe dorsalis-ra, módosítva az itt található idegsejtek elektromos aktivitását, illetve a lokális neuronhálózat szinkronitását. Az agytörzsi nucleus raphe dorsalis, a szerotoninerg rendszer legfontosabb magjaként efferens rostokkal idegzi be a retinát, de e rostok élettani szerepe nem bizonyított. Valószínűleg ezzel a tüskehullám kisülések által módosult raphe aktivitással magyarázható az epilepsziás rohamok alatt tapasztalt vizuális rendszeri érzékenységkülönbség. CÉLKITŰZÉSEK 1. α és θ hullámok celluláris mechanizmusainak vizsgálata szabadon mozgó macskák thalamuszában a következő szempontok szerint: Találhatók-e a macskák thalamuszának vizuális régiójában α/θ hullámokkal korreláló sejtek? Milyen farmakológiai eszközökkel befolyásolható a thalamikus és okcipitális α/θ oszcilláció? Hogyan befolyásolja a lokális metabotróp glutamát receptorok aktivitása a thalamusz sejtjeinek aktivitását és az α/θ oszcillációt?
Hogyan befolyásolja lokális szinkronizáció a thalamusz sejtjeinek aktivitását és az α/θ oszcillációt? 2. Globális szinkronizációk terjedésének mechanizmusait és következményeit a humán petit-mal epilepszia egyik legelfogadottabb állatkísérleti modelljén, a WAG/Rij patkánytörzs állatain vizsgáltuk. Kérdéseink a következők voltak: Milyen struktúrák vesznek részt, illetve milyen mechanizmusok által valósul meg az agyi szinkronizáció közvetítése? Van-e hatása az agyi szinkronizációnak a retina működésére? ALKALMAZOTT MÓDSZEREK Kísérleti állatok Vizsgálatainkat felnőtt, saját tenyésztésű WAG/Rij patkányokon, valamint felnőtt macskákon végeztük. A laboratóriumi állatok tartása, illetve a velük való bánásmód megfelelt a magyar (243/1998-as Állatvédelmi Törvény) és az európai (86/609 EEC) előírásoknak. In vivo vizsgálatok EEG mérése. Mindkét kísérleti állatfaj esetén az EEG mérésére rozsdamentes epidurális csavarelektródokat használtunk. Az elektromos jeleket Grass 8-10B típusú EEG készülék segítségével regisztráltuk. Vizuális kiváltott potenciálok mérése. Szabadon mozgó patkányok retinájáról, látóideg kereszteződéséből, illetve elsődleges látókérgéről
regisztráltunk kiváltott potenciálokat. A retrobulbáris ingerlést koponyacsontra cementezett fénykibocsátó dióda biztosította. Akut patkányok extracelluláris egysejtaktivitásának mérése. Megfelelő mennyiségű neuroleptikum és analgétikum beadását követően az állatok fejét sztereótaktikus készülékben rögzítettük, majd a koponyacsont átfúrását követően saját készítésű elektrolitikusan kihegyezett wolfram mikroelektródokat juttatunk a kívánt struktúrákba. Szabadon mozgó macskák extracelluláris egysejtaktivitásának regisztrálása. Saját készítésű, 8 db. 25 µm átmérőjű platina-irídium szálakból összeragasztott elektródkötegeket helyeztünk az állatok thalamuszába. Az elektródok pontos és egyenletes előrehaladását egy saját készítésű, koponyacsonthoz cementezett henger-dugattyú típusú mikromozgató biztosította. Mikrodialízis. Szabadon mozgó állatokon extracelluláris egysejtaktivitásának regisztrációjával egyidejűleg a lokális mikrokörnyezet farmakológiai befolyásolásának céljából mikrodialízis technikát használtunk. A saját készítésű mikrodialízis mintavevőket a mérőelektródkötegek közvetlen közelébe helyeztük. Intrakardiális perfúzió. Kísérleteink végén az állatokat túlaltattuk, ezt követően 0 C-os fiziológiás sóoldattal és 4%-os paraformaldehiddel perfúziósan fixáltuk, majd 12 órán keresztül 10%-os szacharózos paraformaldehid oldatban posztfixáltuk. Szövettani módszerek Metszés. A patkányagyakból 30 µm vastagságú sorozatmetszeteket készítettünk fagyasztó mikrotómon. Elektródok lokalizációja. A mérőelektródok hegyének pontos helyzetét metszeteinken krezil-ibolyával való festés, vagy Gallyas-féle ezüst impregnáció segítségével jelenítettük meg.
Jelelemzés és statisztikai módszerek. Az elektromos jeleket CED mk2 készülékkel történő analóg-digitális konverziónak vetettük alá, majd személyszámítógép merevlemezén tároltuk. Az adatok elemzése Spike2, Offline Sorter, Neuroexplorer, Origin7, Sigmaplot és Matlab programok segítségével történt. Az eredményeket átlag ± SEM feltüntetésével ábrázoltuk. A statisztikai szignifikancia megállapítása két csoport esetén t-próbát, több csoport esetén varianciaanalízist (ANOVA) használtunk. A post-hoc összehasonlításokra a Tukey-féle tesztet alkalmaztuk. A szignifikancia határát p<0.05-nél húztuk meg. EREDMÉNYEK ÉS MEGVITATÁSUK 1. Thalamikus ritmusok keletkezésének mechanizmusai szabadon mozgó macskák vizuális rendszerében 1.1 A corpus geniculatum laterale thalamo-kortikális sejtjeinek aktivitása α és θ hullámok alatt Szimultán okcipitális EEG-t és CGL mezőpotenciálokat regisztrálva megfigyelhetjük, hogy a regisztrált ritmusok állapotfüggők. Nyugodt ébrenlét esetén, amikor az állatokat jellegzetes (ún. szfinx ) testtartás jellemzi, szemük lehunyását követően 8-13 Hz frekvenciájú, néhány másodperces időtartamú α orsók jelennek meg az okcipitális EEG-n illetve a CGL-ben regisztrált mezőpotenciálokban. Szabadon mozgó macskák CGL-jében sikerült olyan thalamo-kortikális sejtek elektromos aktivitását regisztrálni, amelyek az α és θ hullámokkal korreláltak. E sejtek akciós potenciáljai α és θ hullámok alatt kisüléssorozatokba rendeződtek. Ugyanazon sejtek lassú hullámú alvás alatt is korreláltan tüzeltek a CGL lokális mezőpotenciálokkal, de az a kisülés-sorozataik eltérő tulajdonságokkal rendelkeztek, ami alapján azt feltételezzük, hogy a kétféle kisülés-sorozat mögött eltérő mechanizmusok állnak.
1.2 A metabotróp glutamátreceptorok szerepei szabadon mozgó macskák α és θ ritmusainak keletkezésében Szisztémás és lokális anyagbeadással egyaránt kimutatható, hogy a metabotróp glutamátreceptorok fontos szerepet játszanak a nyugodt ébrenlét alatt keletkező thalamokortikális ritmusok keletkezésében. 1.3 Elektromos szinapszisok szerepei szabadon mozgó macskák α és θ ritmusainak keletkezésében A nyugodt ébrenlétre jellemző α és θ ritmusok keletkezésében fontos szerepe van a thalamo-kortikális sejtek között található elektromos szinapszisoknak, ugyanis általuk valósul meg az említett ritmusok kialakulásához szükséges thalamo-kortikális sejtek közötti szinkronizáció. 2. Globális szinkronizáció terjedésének mechanizmusa és jelentősége a vizuális rendszerben 2.1 Tüske-hullám kisülések átterjedése WAG/Rij patkányok mediális prefrontális kérgére és nucleus raphe dorsalisába Szabadon mozgó WAG/Rij patkányok különböző agyterületeinek spontán elektromos aktivitását regisztráltuk iktális és interiktális szakaszokban. Kiderült, hogy a thalamo-kortikális generátor struktúrák mellett a tüske-hullám kisülések a mediális prefrontális kérgen keresztül átterjednek az agytörzsi raphe magvakra. Arra a kérdésre, hogy a tüske-hullám kisülések alatti mediális prefrontális kéreg, valamint a nucleus raphe dorsalis mezőpotenciálok változást mi okozhatta, egysejt-aktivitásokat regisztrálva kaphatunk választ. A mediális prefrontális kéregben és az agytörzsi raphe magvakban regisztrált sejtek többségére iktális szakaszokban nagyobb tüzelési frekvencia jellemezte, mint az interiktális szakaszokban.
2.2 Nucleus raphe dorsalis-ból eredő retinopetális rostok hatása a retina működésére Az agytörzsi raphe magból eredő retinopetális rostok szerepét ingerlésválasz paradigma segítségével vizsgáltuk. A raphe magvak lokális ingerlését követően a látóideg-kereszteződésből sikerült kiváltott válaszokat regisztrálni. Az nrd ingerlést követően az elektroretinogram b-hullámának és az oszcillatórikus potenciáloknak a latenciája csökkent, míg az oszcillatórikus potenciálok amplitúdója megnőtt. Eredményeink funkcionális, az nrd-ből eredő retinopetális rostok létezését igazolják, illetve ezeknek a retina működésére gyakorolt hatását ismertetik. 2.3 Vizuális kiváltott válaszok ébrenlét illetve tüske-hullám kisülések alatt WAG/Rij patkányokban Szabadon mozgó WAG/Rij patkányok vizuális kiváltott válaszait tanulmányozva azt tapasztaltuk, hogy az iktális és interiktális szakaszokban mért válaszok már a retina szintjén is eltérést mutatnak. Az nrd és retina közötti funkcionális kapcsolat, illetve az nrd sejtek iktális szakaszokban tapasztalt aktivitásmódosulása alapján azt feltételezzük, hogy az iktális szakaszokban regisztrált kiváltott válaszok módosulása az nrd-ből eredő retinopetális rostokon keresztül valósul meg.
ÖSSZEFOGLALÁS I) Igazoltuk, hogy szabadon mozgó macskák CGL-jében a thalamokortikális sejtek egy része korreláltan tüzel az EEG α/θ ritmusokkal. E sejtek α/θ hullámok alatti kisülés-sorozatos tüzeléses mind megnyilvánulásában, mind mechanizmusában gyökeresen eltér az alvásra jellemző, az irodalomból ismert kisülés-sorozatos tüzeléstől. II) Igazoltuk, hogy a macskák vizuális rendszerében a kortikothalamikus terminálisok közelében levő metabotróp glutamátreceptorok modulációja beadása hatással van a thalamikus és okcipitális α/θ ritmusokra. III) Kísérleteink kiemelt szerepet tulajdonítanak a vizuális thalamusznak az α/θ hullámok genezisében. Mindezek ellenére nem kizárt, hogy számos általunk nem vizsgált struktúra szintén kiemelt szerepet játszhat keletkezésükben. IV) A petit mal epilepszia egyik legelfogadottabb állatmodellje, a WAG/Rij törzsbe tartozó patkányok tüske hullám kisülései képesek a vizuális rendszer receptor szintjének működését befolyásolni. A jelenség mechanizmusában különös szerepe van a globális szinkronizáció agytörzsi magvakba való átterjedésének, itt ugyanis megváltozik a lokális neuronhálózat szinkronizációja, amely a retinopetális rostok közvetítése által képes megváltoztatni a retina fényválaszait.
KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS Köszönet illeti elsősorban témavezetőmet: Dr. Juhász Gábort, akinek szakmai és emberi támaszára munkám során bármikor számíthattam. A dolgozatom egy részét kitevő kísérleteket kollaborációban végeztük Prof. Vincenzo Crunelli-vel és Dr. Stuart Hughes-szal a cardiffi egyetem kutatóival, nekik is köszönettel tartozom. Külön köszönettel tartozom Oláh Mártának és Baracskay Péternek a kísérleti munkában nyújtott segítségükért. Továbbá köszönöm kollégáimnak: Dr. Ábrahám Istvánnak, Balog Júliának, Barabás Klaudiának, Dr. Czurkó Andrásnak, Kaszás Attilának, Dr. Kékesi Katalinnak, Nyilas Ritának, Dr. Nyitrai Gabriellának, Orbán Gergőnek, Szegő Évának, Dr. Salfay Orsolyának, Slézia Andreának, Szepesi Zsuzsának, Dr. Szilágyi Nórának, Takács Eszternek, Dr. Zsolnay Krisztinának azt a kellemes, baráti légkört, amelyben nap mint nap dolgozhattam. Végül, de nem utolsó sorban köszönet szüleimnek és Hajninak türelmükért, szeretetükért, bizalmukért és odaadásukért.
PUBLIKÁCIÓK AZ ÉRTEKEZÉS TÉMAKÖRÉBEN Hughes SW, Lőrincz M, Cope DW, Blethyn KL, Kekesi KA, Parri HR, Juhasz G, Crunelli V (2004): Synchronized Oscillations at Alpha and Theta Frequencies in the Lateral Geniculate Nucleus. Neuron. 42(2):253-68. Galambos R, Juhász G, Lőrincz M, Szilágyi N (2005): The Human Retinal Functional Unit. Int J Psychophysiol.; 57(3):187-94. Lőrincz M, Oláh M, Juhász G: Phisyological Consequences of Retinopetal Fibers Originating in the Brainstem Dorsal Raphe Nucleus (2006) International Journal of Neuroscience (közlésre elfogadva), Paper Reference: # 109-06. Lőrincz M, Oláh M, Baracskay P, Szilágyi N, Juhász G: Propagation of Spike and Wave Activity to the Medial Prefrontal Cortex and Dorsal Raphe Nucleus of WAG/Rij Rats (2006) Physiology and Behavior (közlésre elfogadva) Ms. Ref. No.: PHB-D-06-00287R1.