SERÉS PETESEJTEK IN VITRO ÉRÉSÉNEK SZINKRONIZÁLÁSA

TÉZISEK 1 DOKTORI (Ph.D.) ÉRTEKEZÉS TÉZISEI - SOMFAI TAMÁS - SERÉS PETESEJTEK IN VITRO ÉRÉSÉNEK SZINKRONIZÁLÁSA Témavezetők: Dr. Dr. habil. Iváncsics János Dr. Farkasné Dr. Bali Papp Ágnes Doktori Iskola: Az állati termék előállítás biológiai, technológiai, ökológiai, takarmányozási és ökonómiai kérdései A Doktori Iskola Vezetője: Dr. Schmidt János Alprogram: Az állati termék termelés nemesítési és tartástechnológiai vonatkozása Alprogram Vezető: Kovácsné Dr. Gaál Katalin NYUGAT-MAGYARORSZÁGI EGYETEM MEZŐGAZDASÁG ÉS ÉLELMISZERTUDOMÁNYI KAR MOSONMAGYARÓVÁR 2004

TÉZISEK 2 1. CÉLKITŰZÉS Sertés petesejtek in vitro maturációs (IVM) és fertilizációs technikája (IVF) számos tekintetben jelentős fejlődésen ment át az elmúlt tíz évben, azonban hatékonysága még mindig elmarad a szarvasmarha IVM/IVF rendszerekétől. A gyakran fellépő polispermia mellett a sejtmagi és citoplazmatikus érés hiányosságai alacsony termékenyülési és blasztociszta arányt eredményeznek. A sejtmagi (meiotikus) és a citoplazmatikus érés sikeressége tehát az IVM/IVF rendszerek hatékonyságának egyik kulcspontja. Éretlen (germinális vezikulum: GV állapotában lévő) petesejtek gyűjtése és in vitro kultiválása során - a petesejteket a follikulusból eltávolítva a sejtmagi (meiotikus) érési folyamatok spontán elkezdődnek (Pincus és Enzmann, 1935). Mivel néhány petesejt előbb kezdi meg az érést mint mások, a érlelés végére a kultivált populáció a petesejtek érettségi állapota és idősödése szempontjából heterogén, ami a rendellenes termékenyülések (pl polyspermia) gyakoriságának emelkedésével járhat (Funahashi és mtsai, 1997a). Ennek elkerülése érdekében a petesejtek sejtmagi érésének szinkronizálása szükségszerű. A meiózis megkezdése előtt a follikulus magas camp szintet tart fenn a petesejten belül, ami GV állapotban tartja a petesejteket (Bornslaeger és mtsai, 1986). A spontán érés azért következik be, mert a petesejtek kinyerése során megszakad a follikulus és a petesejt közötti anyagcsere kapcsolat, így a petesejten belüli camp szint lecsökken (Schultz és mtsai, 1983). Az in vitro maturáltatás első felében a petesejten belüli camp szint mesterséges emelésével (szinten tartásával) elvileg megelőzhető az idő előtti érési folyamatok beindulása, igy a

TÉZISEK 3 petesejtek érése szinkronizálható. Állati sejtekben a camp szint emelése különböző vegyszerekkel megoldható, pl membrán permeábilis camp analógokkal (dibutyryl cyclic AMP (dbcamp)) (Funahashi és mtsai, 1997b), adenilát- cikláz enzimmel (iac) vagy 3- izobutyl 1-methylxanthine (IBMX) alkalmazásával (Luciano és mtsai, 1999). Mindamellett nem minden kultivált petesejt képes befejezni a sejtmagi érést és eljutni a metafázis-ii (M-II) állapotba. Némelyik GV állapotban marad vagy végleg megreked metafázis-i (M-I) állapotban (Kikuchi és mtsai, 1999a). Számos IVM/IVF rendszerben kumulusz sejtekkel birított petesejteket termékenyítenek, mivel a kumulusz sejtek jelenléte elősegíti a spermiumok akroszóma reakcióját, így a termékenyülés folyamatát (Van Soom és mtsai, 2002). Ebben az esetben azonban nemcsak az érett, de az éretlen állapotban megrekedt petesejtek is termékenyítésre kerülnek (mivel az érett petesejtek szelektálása csak a kumulusz állomány eltávolítása után lehetséges). Bár ismert, hogy M-I állapotban megrekedt egér és sertés petesejtek képesek pronukleuszt képezni, ilyen petesejtek embrionális fejlődési képességéről még nem született tanulmány. Ismert, hogy a kumulusz sejtek fontos szerepet játszanak a petesejtek sejtmagi érésének szabályozásában, mivel az érési folyamatok előtti, a petesejt magas camp szintjét fenntartó gátló jel, a kumulusz sejteken át jut a petesejtbe, a gap junction-okon keresztül (Dekel és Beers, 1980). A testi sejteket tekintve nem csak a kumulusz sejtek hatnak a petesejtek érésére; a granulóza sejtek érést szabályozó hatása is ismert (Motlik és mtsai, 1991). Sertés kumulusz-petesejt komplexek (COC) in vitro kultiválása során a kumulusz állomány morfológiája (lokalizáció, szín és expandáltság mértéke) alapján a COC-kat négy különböző

TÉZISEK 4 kategóriába lehet besorolni. A kumulusz morfológiai eltérése miatt feltételezhető azok funkcionális különbözősége, igy a petesejtek érettségi állapotának eltérése is. Célkitűzés 1. Első célunk volt, hogy megvizsgáljuk, milyen hatással van az intercelluláris camp szint mesterséges emelése a petesejtgyűjtés, illetve in vitro maturáltatás során a sertés petesejtek érési folyamataira, termékenyülésére és embrionális fejlődési képességeire. 2. A tanulmány első részében, a meiózis szinkronizálása nélkül jelentős mennyiségű petesejt maradt megrekedve M-I állapotban. Vizsgálataink második célja arra irányult, hogy kiderítsük, vajon képesek e az éretlen (M-I) állapotban megrekedt petesejtek megtermékenyülni és az embrionális fejlődés során hólyagcsíra állapotig eljutni? 3. Harmadik kísérletsorozatunk azt vizsgálta, hogy van-e összefüggés a kumulusz sejtek morfológiája és a petesetjek sejtmagi és citoplazmatikus érése között az in vitro maturáció során.

TÉZISEK 5 2. ANYAG ÉS MÓDSZER 2.1 A meiotikus érés szinkronizálása az intercelluláris camp szint emelésével Éretlen petesejteket gyűjtöttünk prepuberális állatok vágóhídi petefészkeiből és azokat in vitro érleltük. Petesejtgyűjtésre illetve az in vitro maturáció első 20 órájában camp aktivitást fokozó vegyszerekkel kiegészített tápközeget használtunk: A gyűjtésre használt tápközeget (NCSU 37) 0.1 µg/ml iac-val és 0.5 mm IBMXel egészítettük ki. A maturációs tápközeghez (NCSU 37) dbcamp-t adagoltunk 1mM koncentrációban. Hogy az átmeneti camp szint emelés petesejt érésre gyakorolt hatását vizsgáljuk, COC-ket gyűjtöttünk és maturáltatunk camp aktivitást fokozó vegyszerek jelenlétében vagy azok nélkül. camp kezelés a maturáció 22. órájáig tartott, ezt követően a kultivációt camp stimulátorok nélkül folytattuk. A sejtmag állapotát orceines festéssel határoztuk meg a maturáció 12. 22. 36. és 46. órájában Motlik és Fulka (1976) alapján. Az érés szinkornizálásának termékenyülésre gyakorolt hatását vizsgálandó, petesejteket érleltünk 22 órás camp kezeléssel (lásd fent) vagy anélkül és 46 óra maturáltatást követően azokat 1 10 5 /ml mélyhűtött spermával termékenyítettük. A termékenyülést az inszeminálást követő 10. órában történő fixálással és orceines festéssel fáziskontraszt mikorszkóp segítségével bíráltuk el. Csak azokat a petesejteket tekintettük termékenyültnek, melyekben legaláb egy hím pronukleusz vagy dekondenzált spermium fej illetve az ahhoz tartozó spermium farok látható volt. Csak azokat a petesejteket tekintettük normál monospermiás zigótának, melyekben

TÉZISEK 6 egy női előmag melett csak egy hím előmag (és a hozzátartozó spermium farok) illetve legalább két levált sarkitest látható volt. Az embrionális fejlődésre gyakorolt hatás vizsgálatához petesejteket gyűjtöttönk és érleltünk 22 órás camp kezeléssel vagy anélkül, majd azokat 46 óra IVM-et követően in vitro termékenyítettük (lásd fent) és az embrió kultivációs médiumban (módosított NCSU 37) 6 napig neveltük. A 6. napon az embriókat - azok fixálását és orceines festését követően - elbíráltuk a hólyagcsíra állapotú embriók arányát, illetve az azokban levő sejtek számát. 2.2 Éretlen állapotban megrekedt petesejtek in vitro termékenyülése és embrionális fejlődése Éretlen petesejteket (COC) gyűjtöttünk prepubertás korú állatok vágóhídi petefészkeiből és azokat a meiózis szinkronizálása nélkül in vitro érleltük 48 órán át. Az érlelést követően a petesejteket a kumulusz sejtektől megtisztítottuk majd sztereomikroszkópos vizsgálat során az érett, sarki testtel rendelkező (PB+) illetve az éretlen, sarkitesttel nem rendelkező (PB-) petesejteket elkülönítettük. Az első lépésben orceines festést követően meghatároztuk a sarkitestes és sarkitest nélküli petesejtek sejtmagi állapotát. A petesejtek termékenyülési képességének meghatározásához 48 óra IVM-et követően in vitro termékenyítettünk sarkitestes és sarkitest nélküli petesejteket. A termékenyülést az inszeminálást követő 10. órában történő fixálással és orceines festéssel fáziskontraszt mikroszkóp segítségével bíráltuk el (lásd 2.1 pontban).

TÉZISEK 7 Az embrionális fejlődés meghatározásához sarkitestes és sarkitest nélküli petesejteket termékenyítettünk 48 óra IVM után, majd azokat embrió kultivációs médiumban 6 napig neveltük és az embriókat elbíráltuk. Meghatároztuk a hólyagcsíra állapotú embriók arányát, az embriók teljes sejtszámát illetve a trofektoderma (TE) és az embrionális sejtcsomó (ICM) sejtszámát. A bírálatot immunsavós kezelés után a sejtmagok propidium-jodiddal és Hoechst-33342-vel történő differenciál festését követően epifluoreszcens mikroszkóp alatt végeztük. 2.3 A kumulusz állomány morfológiája és a petesejtek érése közötti kapcsolat vizsgálata in vitro maturáció során Kumulusz-petesejt komplexeket (COC) illetve granulózakumulusz-petesejt komplexeket (GCOC) nyerünk ki prepubertás korú állatok vágóhídi petefészkeiből és azokat a meiózis szinkronizálása nélkül 48 órán át in vitro érleltük. A maturáció 30. órájától a komplexek 4 különböző kategóriáját különböztettük meg: 1. Típus: A COC szabadon lebeg a maturációs tápoldatban; a petesejtet világos színű, tökéletesen expandált kumulusz állomány veszi körül. 2. Típus: A COC szabadon lebeg a maturációs tápoldatban; a petesejtet sötét (barna) színű, kompakt vagy félig expandált kumulusz veszi körül. 3. Típus: A COC a kultiváló edény aljához rögzül; a petesejtet sötét (barna) színű, kompakt kumulusz veszi körül.

TÉZISEK 8 4. Típus: A COC a kultiváló edény aljához tapad; a petesejtet körülvevő kumulusz állomány degradálódott a teljes kumulusz veszteség a petesejt felszínének legalább 30%-át teszi ki. A megmaradó kumulusz állomány sötét színű és kompakt. Első lépésben a négy morfológiai kategória százalékos megoszlását vizsgáltuk COCk és GCOCk érlelése során a maturáció 30. 36. 42. és 48. órájában, majd a csoportonként elkülönített petesejteket a kumulusz sejtektől megtisztítottuk és sejtmagi állapotukat orceines festést követően fáziskontraszt mikroszkóppal meghatároztuk. A második kísérletben 42 órás IVM-et követően, a 4 különböző kategóriába tartozó, érett (sarkitesttel rendelkező, M-II) petesejteket parthenogenetikus aktivációnak vetettük alá, melyet 100 µsec tartamú 1.0 kv/cm erősségű elektromos impulzussal végeztünk. A stimuláció után 8 órával orceines festést követően az aktiváltságot (a női pronukleusz kialakulását) bíráltuk. Ez a petesejt citoplazmatikus érettségéről nyújt információt. A harmadik kísérletben 48 órás IVM-et követően, a 4 különböző kategóriába tartozó, érett (sarkitesttel rendelkező, M-II) petesejteket in vitro termékenyítettük és a termékenyülést a 2.1 pontban foglaltak szerint elbíráltuk. 2.4 Statisztikai analízis Valamennyi kísérletet legalább három ismétléssel végeztünk el. A maturációs adatokat variancia analízissel (ANOVA) majd Duncan-féle többszörös szórás teszttel elemeztük (P < 0.05). A partenogenetikus

TÉZISEK 9 aktiválás, az IVF és az embriófejlődési eredmények adatait Chinégyzet próbával elemeztük (P < 0.05).

TÉZISEK 10 3. EREDMÉNYEK 3.1 A meiotikus érés szinkronizálása az intracelluláris camp szint emelésével A kromatin kondenzáltságát tekintve nem volt különbség a camp-vel vagy a nélkül maturált petesejtek között 12 órás kultiválást követően, függetlenül a gyűjtő folyadék camp tartalmától. Az IVM első 22 órájában 1mM dbcamp-val történő kezelés tökéletesen megakadályozza a germinális vezikulum lebomlását, míg a kontroll petesejtek több mint 40%-a ekkorra már megkezdi a sejtmagi érést. Mindamellett a dbcamp gátló hatása teljesen reverzibilis, mivel mind a kezelt, mind a kontroll petesejteknél a meiózist megkezdett petesejtek aránya az IVM 36. órájára éri el maximumot, ami statisztikailag nem különbözik. A 22 órás meiózis blokkolást követően a kezelt csoportban a meiózist megkezdett (GVBD), illetve azt befejezett (M-II állapotú) sejtek aránya rövidebb idő alatt éri el maximumot, mint a kezeletlen petesejtek esetében. A 46 órás maturációs periódus végére statisztikailag nagyobb mennyiségű petesejt éri el az M-II állapotot a dbcamp-vel kezelt (szinkronizált) csoportban, mint a kontrollban, ahol jelentős mennyiségű petesejt tartósan megrekedt M-I állapotban. A maturáció szinkronizálása nem volt hatással az összes termékenyült petesejt arányára, azonban 22 órás dbcamp kezelést követően a monospermikus termékenyülés gyakoribb volt, mint a kontroll esetében. A gyűjtőfolyadék camp kiegészítése sem az összes, sem a monospermikus termékenyülés gyakoriságára nem volt hatással.

TÉZISEK 11 A maturáció 22 órás átmeneti blokkolása a termékenyülést követően magasabb blasztociszta formálódási arányt eredményezett, mint a szinkronizálatlan petesejtek blasztociszta rátája. Mindamellett az embriók minősége (sejtszám) nem különbözött. A gyűjtő médium camp kiegészítése nem volt hatással a vizsgált paraméterekre. 3.2 Éretlen állapotban megrekedt petesejtek in vitro termékenyülése és embrionális fejlődése 48 órás IVM-et követően a látható sarkitesttel rendelkező petesejtek nagy része (91,4 %-a) M-II stádiumban volt, a többi késői telofázis-i-ben, vagy a spontán aktiváció jeleit mutatta. A látható sarkitesttel nem rendelkező petesejtek nagy része GV állapotban maradt (41,6 %) vagy megrekedt M-I stádiumban (34 %). Mintegy 8,3 %-ot tett ki a M-II állapotú petesejtek aránya, a maradék prom-i (6,4 %) anafázisban vagy telofázisban volt (3,3 %). Az abnormális petesejtek 2,6 %-ban, a degenerált petesejtek 3,4 %- ban is képviseltették magukat. Az IVF-et követően nem volt különbség az összes, és a monospermikus termékenyülések gyakoriságában a sarkitestes illetve sarkitest nélküli petesejtek között. Szignifikánsan több sarkitesttel rendelkező petesejt fejlődött hólyagcsírává, mint a sarkitest nélküliek (34,6 % és 20,7 %). Mindamellett figyelembe véve, hogy a sarkitest nélkülieknek mindössze 8 %-a volt M-II állapotban, illetve, hogy a GV állapotú petesejtek nem képesek embrióvá fejlődni arra a következtetésre jutunk, hogy a sarkitest nélküli petesejtekből fejlődő hólyagcsírák

TÉZISEK 12 nagy része M-I állapotban megrekedt petesejtek termékenyüléséből származik! Az embriók differenciál festését követően azt találtuk, hogy a sarkitestes petesejtekből fejlődő hólyagcsírák statisztikailag több sejtet tartalmaztak az össz-sejtszámot tekintve, mint az éretlen petesejtekből fejlődők. Mindamellett, az ICM és TE sejtek egymáshoz viszonyított aránya nem különbözött a két csoport között. 2.3 A kumulusz állomány morfológiája és a petesejtek érése közötti kapcsolat vizsgálata in vitro maturáció során A lebegő, expandált kumulusszal rendelkező (1. típus) petesejtek aránya minden vizsgálati pontban nagyobb volt a GCOC csoportban, mint a COC csoportnál. A GCOC és COC petesejteket vizsgálva megállapíthatjuk, hogy a meiózist megkezdett (GVBD) illetve befejezett (M-II) petesejtek arányát tekintve egyik vizsgálati pontban sem volt különbség. Különbség volt azonban az érés dinamikáját tekintve: a GCOC-k esetében az M-II petesejtek aránya egészen a maturáltatás végéig (48 ó) szignifikánsan emelkedett, míg a COC-k esetében ez a mutató már 42 óránál elérte maximumát! Amikor különböző morfológiai kategóriába tartozó komplexek petesejtjeinek érését vizsgáltuk, azt találtuk, hogy a tenyésztő edényhez rögzülő petesejtek, melyeket kompakt (3. típus) vagy degradált (4. típus) kumulusz vesz körül, hamarabb befejezik az érést és elérik az M-II állapotot, mint a lebegő, expandált kumulusszal rendelkező petesejtek. Ez feltételezi az edényhez rögzült petesejtek

TÉZISEK 13 idő előtti idősödését, aktiválhatóságát illetve polispermiára való hajlamát. Mikor 42 óra IVM után aktiváltuk a petesejteket, az aljzathoz rögzült (3. és 4. típus) petesejtek közül sokkal több aktiválódott és női pronukleuszt formált, mint a többi morfológiai kategóriába tartozó petesejt, melyek nagy része nem aktiválódott vagy pronukleusz fejlődés nélküli (abnormális) aktiválódást mutatott (M-III), ami a későbbi citoplazmatikus érésre utal. Különböző morfológiai kategórákba tartozó petesejtek in vitro termékenyítését követően azt találtuk, hogy az aljzathoz rögzült petesejtek esetében a monospermikus termékenyülés gyakorisága szignifikánsak alacsonyabb volt, mint a többi morfológiai kategória esetében. A polispermiára való fokozott hajlam a 3. és 4. típusba tartozó petesejtek idő előtti érésének és idősödésének egyik jele.

TÉZISEK 14 4. ÚJ TUDOMÁNYOS EREDMÉNYEK 1. A petesejtek gyűjtése során nem történik jelentős camp esés a sejten belül így a gyűjtés folyamata nem indítja be a petesejtek spontán érését. 2. Ha a petesejtek érését a meiózis átmeneti blokkolásával, camp által szinkronizáljuk, a petesejtek érési potenciálja és ezzel együtt a normál, monospermikus termékenyülésre való hajlama megnő. Ez magasabb hólyagcsíra fejlődési arányt eredményez az IVF/IVC során. 3. A M-I állapotban megrekedt petesejtek átesnek a termékenyüléshez szükséges citoplazmatikus érésen és termékenyülés esetén képesek hólyagcsíra állapotig fejlődni. Azonban ezek az embriók alacsony sejtszámmal rendelkeznek, aminek valószínűleg a sejtek rendellenes ploidiája az oka. 4. Kumulusz-petesejt komplexek maturáltatása során a kumulusz sejtek tenyésztőedényhez való kapcsolódása kiváltja a petesejtek idő előtti érését, ami azok korai idősödésében és így polispermiára való fokozott hajlamában nyilvánul meg. 5. A granulóza sejtek megakadályozzák a kumulusz tenyésztőedényhez történő kapcsolódását és így a petesejtek idő előtti érését.

TÉZISEK 15 5. JAVASLATOK (Az eredmények elméleti és gyakorlati alkalmazhatósága) A meiotikus érés szinkronizálása az intracelluláris camp szint emelésével Eredményeink azt mutatják, hogy sertés IVP rendszerekben a petesejtek érésének mesterséges szinkronizálása javítja a rendszer hatékonyságát az előállított embriók számát tekintve. A meiózis átmeneti, reverzibilis blokkolása az általunk vizsgált vegyszereken kívül még számos anyaggal, pl. fehérjeszintézist vagy kinázaktivitást gátló szerekkel is lehetséges. Előkísérleteink, illetve más kutatócsoportok eredményei azonban azt mutatják, hogy a fehérjeszintézis átmeneti gátlása a petesejtek bizonyos mértékű károsodását eredményezheti. Mivel az általunk használt dbcamp-nek semmilyen káros mellékhatását nem figyeltük meg, úgy tűnik a vegyszer gyakorlatban is alkalmazható sertés embriók in vitro előállítása során. Éretlen állapotban megrekedt petesejtek in vitro termékenyülése és embrionális fejlődése A meiózis mesterséges szinkronizálása nélkül a petesejtek számottevő mennyisége diploid M-I állapotban megrekedt és ezek a petesejtek embrionális fejlődésre képesek, azonban az így kialakuló embriók valószínűleg rendellenes kromoszómaszámmal rendelkeznek. Természetesen ennek tisztázásához további, az embriók ploidiáját vizsgáló kísérletekhez lesz szükség. Mindamellett már jelen eredményeink alapján is indokolt a termékenyítésre szánt petesejtek szigorú előszelekciója, melyhez megfelelő támpontot ad az első

TÉZISEK 16 sarkitest megléte. Ezáltal megelőzhető a rendellenes, dupla anyai genommal rendelkező poliploid embriók kialakulása. Mindamellett a felfedezés, hogy M-I állapotú petesejtek átesnek a szükséges citoplazmatikus érésen és embrióvá képesek fejlődni, felhívja a figyelmet az ilyen petesejtek recipiens sejtként való felhasználhatóságára sejtmag átültetéses klónozás esetén, illetve kiváló alapanyagul szolgálhatnak további, a poliploid vagy gynogenetikus embriók fejlődését kutató vizsgálatok számára. A kumulusz állomány morfológiája és a petesejtek érése közötti kapcsolat vizsgálata in vitro maturáció során. Az, hogy a kumulusz morfológiai állapotából következtetni lehet a petesejtek érettségi állapotára lehetővé teszi, hogy ennek alapján a hasonló minőségű petesejteket szelektáljunk ki további felhasználásra. Ezzel a felhasznált petesejtek minőségi heterogenitása csökkenthető. Eredményeink alapján a lebegő, expandált kumulusszal rendelkező petesejtek közel azonos érési tulajdonsággal rendelkeznek, további felhasználásra kizárólag ezeket javasoljuk különösen olyan in vitro rendszerekben, ahol a petesejtek érését mesterségesen nem szinkronizálják. A granulóza sejtek elősegítik a kumulusz expanziót az IVM során és ez felhívja a figyelmet a GCOC-k alkalmazásának, vagy a granulóza sejtekkel történő ko-kultiválás előnyeire. Azonban lényeges szempont, hogy a GCOC-k kinyerése a petefészkekből rendkívül körülményes és csak nagyon korlátozott számban lehetséges, így in vitro rendszerekben inkább a nagy tömegben kinyerhető COC-k felhasználása indokolt. Ezzel persze indokolttá válik a jelenlegi IVM rendszer további fejlesztése.

TÉZISEK 17 6. PUBLIKÁCIÓK 1. TUDOMÁNYOS FOLYÓIRATOKBAN MEGJELENŐ CIKKEK 1.1 ANGOL NYELVEN 1.1.1 Somfai T, Bodó Sz, Nagy Sz, Papp ÁB, Iváncsics J, Baranyai B, Gócza E, Kovács A (2002). Effect of swim up and percoll treatment on viability and acrosome integrity of frozen-thawed bull spermatozoa. Reproduction in Domestic Animals 37(5):285-290 1.1.2. Somfai T, Bodó Sz, Nagy Sz, Gócza E, Iváncsics J, Kovács A (2002). Simultaneous evaluation of viability and acrosome integrity of mouse spermatozoa using light microscopy. Biotechnic and Histochemistry 77(3):117-20. 1.1.3. Dinnyés A, Bagis H, Ji W, Kikuchi K, Lee J, Li X, Nagai T, Presicce GA, Somfai T, Si W, Yang X (2003). Gene banking in rare breeds and species whose gametes are difficult to cryopreserve. Állattenyésztés és Takarmányozás 52: 82-91 * 1.1.4. Somfai T, Kikuchi K, Onishi A, Iwamoto M, Fuchimoto D, Bali Papp Á, Sato E, Nagai T (2003). Meiotic arrest maintained by camp during the initiation of maturation enhances meiotic potential and developmental competence and reduces polyspermy of IVM/IVF porcine oocytes. Zygote 11: 199-206 1 * 1.1.5. Somfai T, Kikuchi K, Onishi A, Iwamoto M, Fuchimoto D, Bali Papp Á, Sato E, Nagai T (2004). Relationship between the morphological changes of somatic compartment and the kinetics of nuclear and cytoplasmic maturation of oocytes during in vitro :A doktori tézisekhez kapcsolódó publikációk

TÉZISEK 18 * maturation of porcine follicular oocytes. Molecular Reproduction and Development megjelenés alatt 1.1.6. Iwamoto M, Onishi A, Fuchimoto D, Somfai T, Takeda K, Tagami T, Hanada H, Noguchi J, Kaneko H, Nagai T, Kikuchi K (2004). Low oxygen tension during in vitro maturation of porcine follicular oocytes improves parthenogenetic activation and subsequent development to blastocyst stage. Theriogenology közlésre elfogadva 1.1.7. Bali Papp Á, Somfai T, Tartaglione M, Varga E, Gardón JC (2004). The effect of nerve growth factor on nuclear progression of porcine oocytes during in vitro maturation and embryo development. Acta Veterinaria Hungarica közlésre elfogadva 1.1.8. Somfai T, Kikuchi K, Medvedev SY, Onishi A, Iwamoto M, Fuchimoto D, Ozawa M, Noguchi J, Kaneko H, Bali Papp Á, Sato E, Nagai T (2004). In vitro fertilization and development of porcine oocytes arrested before metaphase II stage. Biology of Reproduction elbírálás alatt 1.2 MAGYARUL 1.2.1 Somfai T, Bali-Papp Á, Iváncsics J (1999). A sertés petesejtek aspirációja és in vitro maturáltatása. Acta Agronomica Ovariensis 41(1):101-112 :A doktori tézisekhez kapcsolódó publikációk

TÉZISEK 19 1.2.2. Bodó Sz, Nagy Sz, Baranyai B, Somfai T, Gócza E, Kovács A (2000). Spermaminőség jellemzése swim up előtt és után. Állattenyésztés és Takarmányozás 49(6):581-583 2. SZÓBELI ELŐADÁSOK 2.1 Somfai T, Kikuchi K, Onishi A, Bali Papp Á, Dinnyés A, Sato E, Nagai T (2003). Effect of meiotic arrest at germinal vesicle stage by butyrolactone-i on meiotic competence, activation, fertilization and embryonic development of porcine oocytes. V. Magyar Genetikai Kongresszus, Siófok 2003. április 13-15. (összefolglaló, 58. old). * 3. POSZTER ELŐADÁSOK 3.1 ANGOL NYELVEN 3.1.1. Bali Papp Á, Somfai T, Petz B, Nánássy, L, Pécsi T, Iváncsics J (2001). How can influence the different treatment of frozen/thawed boar spermatozoa viability BOKU International Kongress, 18-21. November, Wien, Austria 181. 3.1.2. Petz B, Bali-Papp Á, Somfai T, Nánássy L, Pécsi T, Iváncsics J (2002). Effect of percoll or short time centrifugation treatment on viability and acrosome integrity of frozen/thawed boar spermatozoa. Theriogenology, 51 681 2 3.1.3. Somfai T, Kikuchi K, Onishi A, Iwamoto M, Fuchimoto D, Bali- Papp Á, Sato E, Nagai T (2003). Effects of invasive adenylate cyclase, :A doktori tézisekhez kapcsolódó publikációk

TÉZISEK 20 3-isobutyl 1-methylxanthine and dibutyryl cyclic AMP on IVM, IVF and IVC of porcine oocytes. Theriogenology, 59(1) 498 3.1.4. Dinnyés A, Kikuchi K, Watanabe A, Fuchimoto D, Iwamoto M, Kaneko H, Noguchi J, Somfai T, Onishi A, Nagai T (2003). Successful cryopreservation of in vitro-produced pig embryos by the solid surface vitrification (SSV) method. Theriogenology, 59(1) 299 3.2 MAGYARUL 3.2.1. Somfai T, Bali-Papp Á, Iváncsics J. Különböző aspirációs nyomásértéken nyert és prepuberális illetve ivarérett petefészkekből származó sertés petesejtek in vitro maturációs jellemzői. XXVIII. Óvári Tudományos Napok: Az élelmiszergazdaság fejlesztésének lehetőségei, Mosonmagyaróvár, 2000. október 5-6. 3.2.2. Baranyai B, Somfai T, Virág Gy, Laczkó L, Ri Hak Chol, Polgár Zs, Gócza E: Nyúlsperma hosszútávú tárolási lehetőségének vizsgálata.; 13. Nyúltenyésztési Tudományos Nap, Kaposvár, 2001. május 23.