ÚJ GÉNSEBÉSZETI MÓDSZEREK A NÖVÉNYI GÉNEK ÉS GENOMOK CÉLZOTT SZERKESZTÉSÉBEN

ÚJ GÉNSEBÉSZETI MÓDSZEREK A NÖVÉNYI GÉNEK ÉS GENOMOK CÉLZOTT SZERKESZTÉSÉBEN Dudits Dénes Növénybiológiai Intézet, MTA Szegedi Biológiai Kutatóközpont Szeged dudits.denes@brc.mta.hu A GMO-k (Genetikailag Módosított Szervezetek) kapcsán folytatott viták hevében gyakran találkozhatunk kényszeredett kifogásokkal mint azzal a kritikával, hogy az eddig használt tradicionális génbeépítési módszerekkel genetikai transzformáció nem lehet irányítani a transzgének beépülésének helyét. Az elfogultak szerint ez a bizonytalanság megkérdőjelezi a géntechnológiával végzett nemesítés létjogosultságát és az eddig előállított GM fajták mint félkész termékek használhatóságát. Az aggodalmaskodó GMOellenzők szemet hunynak a felett, hogy a hagyományos nemesítési módszerek, mint a keresztezés vagy a mesterséges mutációk használata során sincs mód specifikus genetikai változások előre megtervezett kialakítására. A genomi folyamatok véletlenszerűen zajlanak, és csak utólag, a növények tulajdonságainak értékelésével lehet kiválasztani a kívánt genetikai eseményt. Lényegében hasonló, de nagyságrendekkel célzottabb beavatkozásra ad lehetőséget az izolált génekkel végzett génnemesítés. Ilyenkor a GM növény több tízezer génje közé épül be egyetlen, a kívánt hatást biztosító transzgén, ezzel szemben keresztezést követően a szülői gének tízezrei kombinálódnak ellenőrizhetetlenül. A transzgenikus technológia nyújtotta nagyobb irányítottság ellenére intenzív kutatás és fejlesztés folyik annak érdekében, hogy egy kiválasztott célgént specifikusan lehessen módosítani és ezzel javítani a növények tulajdonságait. Mint oly gyakran az innováció világában, a zöld biotechnológia területén is tanúi lehetünk annak, hogy a tudományt nem lehet határok közé szorítani, ezért születhetnek rendre az újabb és újabb technológiák. A European Commission's Joint Research Centre (JRC) Institute részletes tanulmányt készített: Lusser és mtsai (2011): New Plant Breeding Techniques: State-of-the-Art and Prospects for Commercial Development címmel. Az Új nemesítési módszerek előtérbe kerülését indokolja, hogy az élelmiszerigény jelentős növekedésével kell számolni. Tester és Langridge (2010) elemzése szerint a gabonafélék termésének évi növekedési üteme 2010 előtt 32 millió tonna volt. Ahhoz, hogy a 2050-ig terjedő időszakban a 37%-os szükségletnövekedést ki lehessen elégíteni, a növekedés mértékét 44 tonna/év szintre kell emelni. A termésbiztonság genetikai alapjának kialakítása mellett, ehhez a termesztési technológiák fejlesztésére és a használt fajták termőképességének folyamatos növelésére van szükség. A JRC tanulmány a következő nyolc módszert tekinti kiemelten fontosnak: 1. Cink-ujj nukleáz technológia 2. Szintetikus oligonukleotidokkal indukált helyspecifikus mutagenezis 3. A faj saját (ciszgenikus), illetve a befogadó fajjal keresztezhető faj génjeinek átvitele 4. RNS-függő DNS-metiláció 5. GM alanyra történő oltás 6. Elit heterozigóta növények reprodukálása fordított nemesítéssel 7. Agrobacterium-infiltrációval időleges génkifejeztetés 8. Szintetikus genomikával mesterséges biológiai rendszerek, elsősorban mikroorganizmusok létrehozása A fenti módszerek közül az 1. cink-ujj nukleáz technológia és a 2. szintetikus oligonukleotidokkal indukált helyspecifikus mutagenezis ad lehetőséget egy kiválasztott gén- vagy DNS-szakasz célzott szerkesztésére. A jelen elemzés részletesen ezeket a megközelítéseket mutatja be kiegészítve két újabb technológiával, amelyek a TALE nukleázokra, illetve a CRISPR/Cas 1

rendszerre épülnek. Az 1. és 2. módszer leírásakor felhasználjuk a korábban készített elemzésünket, amelyeket a Zöld GMO-k (Dudits Dénes és Györgyey János, Akadémiai Kiadó 2014) című könyvben ismertettünk. 1. A cink-ujj nukleázok felhasználása a génspecifikus genetikai beavatkozásokban A cink-ujj nukleázok ( Zinc-finger nucleases, ZFN) olyan mesterségesen kialakított fúziós fehérjék, amelyek kétféle feladatot betöltő egységgel rendelkeznek (1 ábra). A cink-ujj fehérjestruktúrák felismernek egy meghatározott DNS-szekvenciát, és kötődésük szelektivitását több, általában 3-4 cink-ujj fehérjeegység együttese biztosíthatja. Egy kiválasztott célgén DNS-szekvenciáját informatikai programok analizálják, hogy meghatározzák azt a 9-12 bázisnyi DNSrégiót, amelyhez a cink-ujj egységek megbízhatóan kapcsolódni képesek. Mint a 1/A ábra szemlélteti, a komplexhez tartozik a FokI endonukleáz. Ez az enzim képes a DNS-molekula mindkét szálán törést okozni. Az ábra azt is bemutatja, hogy a ZFN-komplexek egy jobb és egy bal oldali egységből állnak. Ezek között található egy 5-7 bázis nagyságú elválasztó szakasz, amely lehetővé teszi, hogy a két nukleázalegység öszszekapcsolódhasson, és kialakulhasson a hasításra képes fehérjeszerkezet. Minden egyes célgén esetében külön-külön tervezik meg a cink-ujj egységeket, hogy a DNS felnyitása a kívánt helyen következzen be. A nukleázenzim által okozott DNS-hasítás működésbe hozza a sejtek kijavító folyamatait. A két DNS-szálon bekövetkezett hiba kijavítása többféle módon játszódhat le. Ezek a folyamatok alapvetően különböző DNS-szerkezetet alakíthatnak ki (1/B ábra). A C cink-ujj fehérjeegységek N 5' 3' 5' 3' B N cink-ujj fehérjeegységek C Célgén Kettős szálú törés Beépítendő DNS Eredmény A kijavítás típusa - nem homológ mutáció génbeépülés nem homológ végek összekapcsolása célgénnel homológ génkijavítás allélkicserélés homológ rekombináció 1. ábra A cink-ujj nukleázok kiválasztott szekvenciaszakaszokon okoznak törést a DNS-molekulában, így a hiba javítása során génspecifikus mutációk keletkeznek, illetve irányítható az idegen DNS-molekula beépülésének helye (Davis és Cui 2010 nyomán) A: A cink-ujj fehérjeegységek biztosítják a DNS-szekvencia-szakasz felismerését, míg a FokI nukleáz törést okoz a DNSmolekula mindkét szálában B: Mutáció, illetve DNS-szakasz beépülése történhet a törési hiba kijavítása során 2

A nem homológ végek összekapcsolása ( nonhomologous end-joining NHEJ) során a törés két vége mintaszekvencia nélkül kapcsolódik össze. Eközben azonban gyakran vesznek el DNS-nukleotidbázisok vagy akár kisebb méretű szakaszok. Így ez a kijavítási folyamatsor a kiválasztott génben mutációt okozhat. Ennek a megközelítésnek a használhatóságát növényekkel is igazolták. Zhang és mtsai. (2010) a lúdfű alkohol dehidrogenáz enzim génjében (ADH1) hoztak létre génspecifikus mutációkat. Az ADH1 gén szekvenciájának elemzésével meghatározták a lehetséges ZNF kötőhelyeket. Ezek ismeretében meg lehetett tervezni az azokhoz kapcsolódó cink-ujj fehérjeegységeket, amelyek a nukleázalegységekkel egészülnek ki. Informatikai programok segítik az említett fehérjék szintézisét biztosító DNS-szakaszok kialakítását, amelyeket aztán a növényi transzformációs vektorba kell építeni. Az idézett kísérletben a ZFN-komplex kifejeztetése indukálható promóterrel történt. Az első generációs T1 csíranövények ADH1 génjének szekvenciaanalízise 16%-os gyakorisággal mutatta ki a különböző típusú mutációk jelenlétét ebben a génben. 1-142 bázisméretű hiányok vagy beépülések történtek. A mutációk öröklődtek az utódnövényekben. A ZFN okozta kettős szálú DNS törésének kijavítása történhet szekvenciaazonosságot mutató homológ DNS-szakaszok közötti rekombinációval (1/B ábra). Ezzel lehetővé válik a kiválasztott DNS-szakaszok vagy akár működésre képes génkonstrukciók elhelyezése a kromoszóma egy adott helyén. Erre szolgáltat példát Shukla és mtsai (2009) közleménye, amikor a ZFN technológiával irányítottan építették be a bakteriális foszfinotricin acetiltranszferáz (PAT) herbicidrezisztencia gént a kukorica IPK1 génjébe, amely kulcsszerepet játszik a fitátszintézisben és így a szemek foszforfelhalmozásában. A PAT gén beépülése folytán az IPK1 gén meghibásodik, ezért csökken a fitátmennyiség, ami mind takarmányozási, mind a környezet foszforszennyeződésének mérséklése szempontjából kedvező hatású. 2. TALE nukleázok a specifikus génmérnökségben A célzott génátalakítás elsődleges feltétele, hogy egy adott DNS-szekvenciához specifikusan, ugyanakkor variálhatóan lehessen DNS-kötést létrehozni, ami lehetővé teszi a célgén felismerését. Hasonlóan a ZFN technológiához a DNS-szekvencia-motívum felismerése más típusú megtervezett fehérjékre is alapozható, mint például a TALE ( transcription activator-like effectors) fehérjékre, amelyek a Xanthomonas növényi patogén fertőzése során számos gén kifejeződését szabályozzák. Közös jellemzője a TALE fehérjéknek, hogy nagymértékben konzervált középső régióval rendelkeznek, amelyekben 34 aminosavból álló szakaszok ismétlődnek. Ezek a szerkezeti egységek, ismétlődések egy-egy nukleotid megkötéséért felelősek, attól függően, hogy a 12. és 13. helyen milyen aminosavak találhatók. Mint a 2/A ábra szemlélteti az ismétlődések sorrendjével egy ismert DNS-szekvencia-szakaszhoz kötődő TALE fehérje építhető fel, amihez FokI endonukleáz kapcsolódik (2/B ábra). Az így kialakított rekombináns fehérje a kívánt helyen hasítja a DNS mindkét szálát és az 1/B ábrán bemutatott rekombinációs eseményekre nyílik lehetőség. A B 2. ábra A kiválasztott DNS-szakaszok felismerésében résztvevő TALE fehérjék konzervált aminosavismétlődései, és a FokI nukleáz, amely a DNS-en kettősszálú törést hoz létre. A specifikus nukleotid felismerésért felelős aminosavpárosok: aszparagin-glicin (NG) timin (T); hisztidin-aszparaginsav (HD) citozin (C); aszparagin-izoleucin (NI) adenin (A); aszparagin-aszparagin (NN) guanin (G) vagy adenin (A) TALeffector Resources Center ( www.taleffectors.com ). 3

Példaként egy nemesítési szempontból is fontos eredményt érdemes megemlíteni, amikor a TALE nukleáz technológiával a rizs bakteriális levélfoltosság elleni rezisztenciáját alakították ki (Li és mtsai 2012). A Xanthomonas oryzae pv. oryzae baktérium fertőzésekor az Os11N3 érzékenységi gén promóterének irányított megváltoztatásával lehetőség nyílt tünetmentes rizsnövények előállítása (3. ábra). Ennél a megközelítésnél az embriogén rizssejteket Agrobacterium tumefaciens segítségével kellett transzformálni ahhoz, hogy mind a TALEn, mind a szelekciós markergén beépüljön és kifejeződjön a T0 növényekben. Ezektől a transzgénektől azonban a későbbi hasadó populációkban meg lehetett szabadulni, és így azonosítottak olyan a mutáns növényeket, amelyek már nem hordoztak idegen gént, és így nem tekinthetők GM növényeknek. RNA), illetve az azzal kölcsönható váz tracrrns-ből, ami elősegíti a Cas9 fehérje célba juttatását és a DNSszálak hasítását. Mint a 4. ábra is jelzi, a cél DNSszakasznak további három nukleotiddal (NGG) is ki kell egészülnie (PAM), amiből a két utolsó guanin (G). 3. ábra Az Os11N3 gén promóterében a TALEn technológiával specifikusan létrehozott mutáció tünetmentes rizsnövényeket eredményezett (felső levelek) a Xanthomonas oryzae baktériummal történt fertőzést követően. A mutációt nem hordozó alsó levélen láthatóak a fertőzésből származó tünetek. 3. RNS-vezérelt genomszerkesztés a CRISPR/Cas technológiával A fentiekben bemutatott két módszeren túl nagy érdeklődés kíséri azt a megközelítést, amelyben RNSmolekula irányítja a célszekvencia felismerését. A CRISPR/Cas rendszer a növények esetében is lehetővé teszi az irányított mutagenezist (összefoglaló cikk: Belhaj és mtsai 2013). Mint a 4. ábra szemlélteti, a kívánt DNS-szakasz hasítását a két alegységből (HNH és RuvC) felépülő Cas9 nukleáz végzi, amely mindkét DNS-szálat elvágja. Ez a nukleáz komplexet képez az ún. egyszálú irányító RNS-molekulával (sgrns/single-guide RNA), amely két elemből tevődik össze. A 20 nukleotid nagyságú a cél DNS-szakasszal komplementer crrns-molekulából (CRISPR- 4. ábra A CRISPR/Cas9 komplex képes a crrns közvetítésével felismerni a cél DNS 20 nukleotidját, amely kiegészül az NGG nukleotidokkal (PAM). A tracrrns segíti a crrns érését, továbbá a szekvencia felismerést, illetve a Cas9 nukleáz két alegységének (HNH és RuvC) működését, amelyek a DNS mindkét szálát hasítják (Shan és mtsai 2013 nyomán). A CRISPR/Cas9 módszer használatának feltétele, hogy a Cas9 nukleáz két fehérjealegysége, illetve az sgrns a növényi sejtekben szintetizálódjon. Az 5. ábra bemutatja egy ilyen vektormolekula főbb komponenseit, amelyeket az Agrobacterium Ti plazmid két határszekvenciája (LB és RB) fog közre. Ebben a példában a Cas9 fehérje génjét egy ubiqutin promóter (PcUbi4-2) működteti. Indokolt lehet a növényi kódhasználat szerint megszintetizálni a Cas9 cdns-t és ellátni sejtmagi lokalizációs jellel, továbbá szükség van terminációs szignálra (T) is. A kiméra sgrns (crrns+tracrrns) szintézisét az RNS polimeráz III promóter (U6) biztosítja a cél és váz DNSszekvenciákról. Amennyiben stabil transzformáns előállítására kerül sor, akkor indokolt a szelekciós markergén, mint például a PAT gén kifejeztetése, amely gyomirtószer-rezisztenciát biztosít a transzformánsok számára. Sok esetben mellőzhető a GM növények felnevelése, elegendő időlegesen, a génkonstrukció beépülése nélkül kifejeztetni a Cas9 fehérjét és az sgrns-t. 4

Cas9 nukleáz T sgrns Ubi HHN U6 LB promóter promóter PAT RB 5. ábra Növényi genom szerkesztésére használható CRISPR/Cas vektormolekula főbb elemei (részletek a szövegben, Fauser és mtsai 2014 nyomán) A CRISPR/Cas technológia sikeres alkalmazására példaként szolgál Shan és mtsai (2013) kísérlete, amikor albinó rizsmutánsokat hoztak létre a fitoén deszaturázenzim génjének ( OsPDS) célzott megváltoztatásával. A 4. ábrán már bemutattuk az ebben a kísérletben használt mutagenezis alapmechanizmu- sát. A rizskalluszokba génbelővéssel jutatták be a vektormolekulákat és antibiotikum-szelekcióval azonosították a transzformánsokat. Közel 10%-os gyakorisággal hoztak létre albinó, illetve törpe mutánsokat (6. ábra). Deléciókat és beépüléseket egyaránt visszaigazolt a mutánsok DNS-ének szekvenálása. 6. ábra A rizs fitoénszintáz (OsPDS) génjében specifikusan indukált mutációk következtében albinó, illetve törpe növényeket lehetett regenerálni (Shan és mtsai 2013). A génspecifikus mutagenezisen túl a CRISPR/ Cas technológia felhasználható a kiválasztott gén kifejeződésének fokozására, illetve mérséklésére is. Ehhez olyan Cas9 fehérjevariánst használnak, amelynek nincs nukleázaktivitása, viszont rendelkezik az sgrns-en keresztül specifikus DNS-kötő képességgel. Amennyiben ezt az inaktív Cas9 fehérjét fuzionáltatjuk akár a transzkripciót aktiváló, akár gátló regulátorfehérjével, akkor lehetővé válik egy kiválasztott gén kifejeződésének szabályozása. 4. Génspecifikus mutációk indukálása szintetikus oligonukleotidokkal Hagyományos módon a DNS-szerkezet megváltoztatását ionizáló sugárkezeléssel vagy mutagén hatású vegyületekkel végzik. Ezek a beavatkozások teljesen véletlenszerűen változtathatják meg egy vagy több gén nukleotidsorrendjét. Általában a növények magjait kezelik mutagénekkel, majd az első generációs M1 növényekről utódokat gyűjtenek, aztán az M2 generáció növényein megjelenhetnek az ismeretlen gének által okozott fenotípusos változások. Bár felis- 5

merhetők az új tulajdonságok, a mutációs programokban nem lehet tudni, hogy melyik gén megváltozása felelős annak kialakulásáért. Régi álma a mutációs megközelítést használó genetikusoknak és növénynemesítőknek, hogy célzottan, egyetlen kiválasztott génben hozzanak létre egy meghatározott szekvenciaszakaszon nukleotidbázis-cserét, ami aminosav-változást eredményez a kódolt fehérjében. A genomszekvenálási programoknak köszönhetően tervezhetővé váltak a gén- és helyspecifikus beavatkozások, a fehérjék struktúrájának alakítása és ezzel a kívánt funkció létrehozása. Míg alsóbb rendű szervezetekben a homológ DNS-szakaszok közötti rekombináció megbízhatóan alkalmazható, a növények esetében nincs igazán lehetősége a megfelelő hatékonyságú célzott mutagenezis megvalósításának. Ezért a szintetikus oligonukleotidok által irányított mutagenezis ( Oligo Directed Mutagenesis, ODM) módszerének kidolgozása kiemelt figyelmet érdemel, mint azt összefoglalják Breyer és mtsai (2009). Az első közleményben Beetham és mtsai (1999) szintetikus RNS/DNS kiméramolekulát lőttek be tenyészett dohánysejtekbe azért, hogy az acetolaktáz-szintáz enzim génjében okozott nukleotidcserével az enzimet rezisztenssé alakítsák a klórszulfuron herbiciddel szemben. Mint a 7. ábra bemutatja szintetikus egyszálú DNS-oligonukleotid (single stranded DNA oligonucleotid, SDO) molekulával is megvalósítható egyetlen nukleotid kicserélése, amivel megváltoztatható egy gén működése vagy a kódolt fehérjében egyetlen új aminosav jelenik meg. A génben kialakított stopkód a gén kikapcsolásához vezethet. Az aminosav kicserélése jelentős hatással lehet a fehérje működésére. Az SDO fragmentnukleotid szekvenciája komplementer (összekapcsolódásra képes) a célgén valamelyik DNS-szálának szekvenciájával, és a közöttük kialakuló kötés biztosítja a célgén felismerését. Ugyanakkor a SDO szintézise során beépíthető az az új nukleotid, amelyre ki kívánjuk cserélni a célgén kiválasztott nukleotidját. A 7. ábra azt is szemlélteti, hogy a gazdasejt DNS-ének replikációja során kialakuló átmeneti D-hurok struktúra ad lehetőséget arra, hogy az SDO hibridizáljon a célgén komplementerszakaszával. A nukleotidcseréhez szükség van sejt DNS-ének replikációs apparátusára, illetve a hibajavító folyamatok működésére. A SDO-molekulákat a nukleázok degradálják, míg a kialakított új génszekvencia stabil és öröklődik a sejtek osztódása során. 50-80 nukleotidból álló szintetikus egyszálú DNS Szensz T vagy Antiszensz A Párosodás Célszekvencia G C Párosodás G T C G A C DNS-kijavító vagy -átmásoló rendszer 7. ábra Szintetikus oligonukleotid beépítésével létrehozott nukleotidcsere a célgén szekvenciájában. (Bottka Sándor nyomán) T A 6

Az ODM módszer széles körű használatához jelentősen növelni kell a jelenleg ismert hatékonyságot, ami több tényező optimalizálásával érhető el. Az SDO-molekulák kémiája egy fontos faktor. Leghatékonyabbak a 30-60 nukluotidból felépülő molekulák. Ezeket a sejtekben meg kell védeni a nukleázoktól. A stabilitást növeli a 3' végen foszforotioát internukleotid kötés kialakítása. A zárt nukleinsav ( Locked Nucleic Acid LNA) struktúra N-alkil nukleotidokkal javíthatja a kettős DNS-szál, a duplex képződését. A hatékonyság szempontjából meghatározó szerepe van annak, hogy milyen módszerrel juttatjuk be az SDO-molekulákat a sejtekbe, illetve a sejtmagokba. Erre a célra gyakran haszálnak génpuskát (9/B ábra), de a mesterséges membrángolyókba, az ún. liposzómákba csomagolt DNS-molekulák a növényi protoplasztokkal a sejtfaluktól megfosztott növényi sejtekkel történt fúzióval is bevihetők a sejtekbe. Ezt láthatjuk a 8. ábrán, ahol fluoreszcens jelöléssel ellátott SDO sejtmagi jelenlétét igazolja a citológiai felvétel lucernasejtekben. 8. ábra Fluoreszcens jelölést hordozó szintetikus DNS-molekulák kimutatása a lucernasejtek sejtmagjában liposzóma közvetítette felvétel után (Fodor és mtsai, nem közölt eredmény) Az ODM módszer tökéletesítését segítheti egy olyan tesztrendszer kidolgozása, amellyel könnyen követhető az irányított mutációk bekövetkezése. Erre kínál lehetőséget a zöld fluoreszcens fehérje ( Green Fluorescent Protein, GFP) használata, amelynek mutáns változata nem fluoreszkál. Ha ezt a hibát korrigáljuk SDO-molekulával, akkor zölden fluoreszkáló sejteket kaphatunk. Ezek száma adja a specifikus mutációk gyakoriságát. Az alábbi összeállítás bemutatja a vad típusú GFP aminosav- és nukleotidszekvenciáját, a hibát eredményező nukleotidszekvenciát, ami STOP jelként működik, illetve megadja a GFP-SDO nukleotidsorrendjét. Vad típusú GFP fehérje M V S K G E E L P T G V Vad típusú GFP gén... CCACC ATG GTG AGC AAG GGC GAG GAG CTG TTC ACC GGG GTG... GFP-SDO 5' CCACC ATG GTG AGC AAG GGC GAG GAG CTG TTC ACC GGG GTG-3' Mutáns GFP gén... CCACC ATG GTG AGC AAG GGC GAG TAG CTG TTC ACC GGG GTG... Mutáns GFP fehérje M V S K G E STOP L P T G V A kísérleti rendszer kialakításának első lépéseként olyan kukorica-sejtvonalat kellett létrehozni, amely hordozza a mutáns GFP gént. Ezért Dr. Tiricz Hilda szerkesztett egy transzformációs vektort, ami a mgfp génen kívül rendelkezik a bar rezisztenciagénnel, mint azt a 9/A ábra szemlélteti. Az ábrán látható a génpuska, amellyel a pahc25 vektort be lehetett lőni kukoricasejtekbe, majd a foszfinotricin herbiciddel kiszelektálni a transzformált szöveteket (9. ábra C), amelyek sejtjei hordozzák a mutáns GFP gént is. 7

A HindIII HindIII SacI EcoRI BamHII EcoRI B ubi nos ubi bar nos C pahc25 9. ábra A mutáns GFP (mgfp) gént hordozó kukorica-sejtvonal előállítása az ODM korrekciós kísérletekhez. (Dr. Tiricz Hilda és munkatársai kísérlete, nem közölt) A. A transzformációs vektor a mgfp és a bar szelekciós markergénnel B. A génpuska, amit használhatunk mind a transzgén, mind a SDO-molekulák sejtbe juttatására C. A mgfp és bar géneket hordozó rezisztens kukorica-kalluszszövet (jobb oldalon) a foszfinotricin herbicid szelekció során. A bal oldali szenzitív szövetben nincsenek meg a transzgének. Az ODM technológia működőképességét tesztelni lehetett azzal, ha a korrigáló SDO-molekulákat a mgfp gént hordozó transzgenikus kukoricasejtekbe génbe- lövéssel bejuttatjuk és zölden fluoreszkáló sejteket kapunk. Ilyen eseményeket mutat be a 10. ábra. 10. ábra A mutáns GFP gén korrekciója folytán zölden fluoreszkáló sejtek azonosíthatók az SDO-molekulák GM kukoricasejtekbe történt belövése után. (Tiricz és mtsai nem közölt eredmény) A: Kontroll kukorica tenyészett sejtek; B, C, D.: Működő GFP fehérjét szintetizáló sejtek a mutáns GFP gén korrekciója után 8

Tekintettel a 7. ábrán vázolt folyamatokra az ODM technológia hatékonyságának növelését eredményezheti, ha a DNS-replikáció fázisában lévő sejtekbe juttatjuk be a SDO-molekulákat. A kromatin szerkezetének fellazítása szintén megnövelheti a célszekvencia megtalálását, illetve a homológ szekvenciák közötti kicserélődést. A korábban említett tanulmány, amelyet az European Commission's Joint Research Centre (JRC) Institute készített New Plant Breeding Techniques: State-of-the-Art and Prospects for Commercial Development címmel (2011) nagyszámú (22) ODM technológiával kapcsolatos szabadalmat sorol fel. Ezek elsősorban gyomirtószer-ellenálló növények előállításával kapcsolatosak. 5. Kitekintés A fenti tanulmányban bemutatott lehetőségek elég meggyőzően tanúsítják, hogy igen jelentős előrehaladás történt a növényi gének, genomok irányított szerkesztésében (Puchta and Fauser 2013). Nehéz megjósolni, hogy melyik módszer fog elsősorban elterjedni a növénybiológiai kutatásban és természetesen a növénynemesítésben. A CRISPR/Cas technológia bizonyos előnyt élvez, mivel a rendszer egyszerűbb. Az egyes módszerek jövőbeni használata erősen függ attól, hogy az uniós szabályozás melyik technológiával előállított növényeket mentesíti a GMO státusztól, és így a bonyolult és költséges engedélyezési eljárástól. Breyer és mtsai (2009) részletesen elemzik, hogy például az ODM technológia miért más, mint az EU irányelvekben definiált folyamat, ami GMO-kat eredményez. Lényeges szempont, hogy a bemutatott eljárások termékeit nem lehet megkülönböztetni azoktól a növényektől, amelyeket keresztezéssel vagy hagyományos mutagenezissel állítottak elő. Mint oly gyakran az EU-ban, bizottságok sora elemzi az új helyzetet és a döntés nehezen születik meg. Az azonban kétségtelen, hogy ezek a bemutatott új technológiák igen jelentős szerepet töltenek be mind a tudományos kutatásban, mind a biotechnológiában és a növények nemesítésében. Felhasznált irodalom Beetham PR, Kipp PB, Sawycky XL, Arntzen CJ, May GD (1999) A tool for functional plant genomics: chimeric RNA/DNA oligonucleotides cause in vivo gene-specific mutations. Proc Natl Acad Sci USA 96: 8774 8778. Belhaj K, Chaparro-Garcia A, Kamoun S, Nekrasov V. (2013) Plant genome editing made easy: targeted mutagenesis in model and crop plants using the CRISPR/Cas system. Plant Methods 9(1): 39. Breyer D, Herman P, Brandenburger A, Gheysen G, Remaut E, Soumillion P, Van Doorsselaere J, Custers R, Pauwels K, Sneyers M, Reheul D (2009) Genetic modification through oligonucleotide-mediated mutagenesis. A GMO regulatory challenge? Environmental Biosafety Research 8(2): 57 64. Davis GD, Cui X. (2010) Zinc finger nucleases for genome editing. GEN Genetic Engineering and Biotechnology News 30 (13): 1 2. Fauser F, Schiml S, Puchta H. (2014) Both CRISPR/Casbased nucleases and nickases can be used efficiently for genome engineering in Arabidopsis thaliana. Plant Journal 79(2): 348 359. Li T, Liu B, Spalding MH, Weeks DP, Yang B. (2012) Highefficiency TALEN-based gene editing produces diseaseresistant rice. Nature Biotechnology 30(5): 390 392. Lusser M, Parisi C, Plan D, Rodríguez-Cerezo E. (2011) New Plant Breeding Techniques: State-of-the-Art and Prospects for Commercial Development European Commission's JointResearch Centre (JRC) Institute Puchta H, Fauser F (2013) Gene targeting in plants: 25 years later. The International Journal of Deveopmental Biology 57(6-8): 629 637. Shan Q, Wang Y, Li J, Zhang Y, Chen K, Liang Z, Zhang K, Liu J, Xi JJ, Qiu JL, Gao C (2013). Targeted genome modification of crop plants using a CRISPR-Cas system. Nature Biotechnology (8): 686-688. Shukla VK, Doyon Y, Miller JC, DeKelver RC, Moehle EA, Worden SE, Mitchell JC, Arnold NL, Gopalan S, Meng X, Choi VM, Rock JM, Wu YY, Katibah GE, Zhifang G, McCaskill D, Simpson MA, Blakeslee B, Greenwalt SA, Butler HJ, Hinkley SJ, Zhang L, Rebar EJ, Gregory PD, Urnov FD. (2009) Precise genome modification in the crop species Zea mays using zinc-finger nucleases. Nature 459: 437 441. Tester M, Langridge P (2010) Breeding technologies to increase crop production in a changing world. Science. 12: 327 (5967) Zhang F, Maeder ML, Unger-Wallace E, Hoshaw JP, Reyon D, Christian M, Li X, Pierick CJ, Dobbs D, Peterson T, Joung JK, Voytas DF (2010) High frequency targeted mutagenesis in Arabidopsis thaliana using zinc finger nucleases. Proc Natl Acad Sci USA 107(26):12028 12033. 9

European Biotechnology News 2014. június 17. http://www.european-biotechnology-news.com/news/news/2014-02/ gmo-allowing-the-prohibition.html GMO: A tilalom engedélyezése Az Európai Unió tagállamai az egész unióra érvényes irányelvet fogadtak el a genetikailag módosított növények engedélyezési eljárásáról megadva a kimaradás lehetőségét az egyes országoknak. E terv szerint az egyes országok korlátozhatják vagy tilthatják az EU szintjén engedélyezett GM növények termesztését. Tonio Borg biztos ezt az eredményt kiegyensúlyozottan kompromisszumos szövegnek nevezte, és így kommentálta: Elragadtatva jelentem be, hogy a Környezetvédelmi Tanácsnak sikerült kimozdítania a holtpontról a GMO termesztési javaslatot [ ]. A mai politikai egyezség e- leget tesz a tagállamok 2009 óta ismételt, egybehangzó felhívásának, amelyben több rugalmasságot és jogbiztonságot követeltek ahhoz, hogy saját területükön vagy annak egy részén nemzeti szinten dönthessenek a termesztésről. Borg elismerően nyilatkozott a görög elnökségről azért, hogy sikerült megtalálnia a közös pontot az eltérő nézetek és aggályok között. A genetikailag módosított organizmusok problémája azonban továbbra is érzékeny kérdés marad, amely vitákat gerjeszt az Európai Unió tagállamai között. Ha a jó kompromisszum azt jelenti, hogy mindkét fél elégedetlen, akkor az eredmény majdnem tökéletes: a GMO-k támogatói és ellenzői egyaránt kritizálták az egyezményt. Bart Staes, az Európai Zöldpárt élelmiszer-biztonsági szóvivője a kompromisszumot trójai falónak nevezte, amely beengedi a GM növényeket az EU jelenleg nagyrészt GM mentes területére. Staes hozzátette: Az EU GMO engedélyezési eljárásának felülvizsgálatára vonatkozó kompromisszum azt kockáztatja, hogy végül egész Európa megnyílik a genetikailag módosított szervezetek előtt, a nagyközönség tömeges ellenállása ellenére. A GM növények termesztésére vonatkozó döntés részben nemzeti hatáskörbe való visszautalása [ ] teljesen elhibázott megközelítés. Lehetőséget nyújtana a Bizottságnak, hogy gyorsabban és könnyebben áterőltesse az EU-szintű GMO termesztési engedélyeket azáltal, hogy engedélyezi a tilalmat a tagállamok vagy régiók szintjén. Rámutatott arra is: aggályos, hogy a Lowdown via Wikimedia Commons tilalmak jogilag vitathatók lennének, és így az egyes tagállamoknak egyedül kellene megvédeni az álláspontjukat. Staes szerint az egyezmény figyelmen kívül hagyja a növények keresztszennyeződésének nyilvánvaló és létező veszélyét és az ezzel együttjáró milliónyi problémát. Ezzel egyidőben az EuropaBio bírálta a GMO-kkal kapcsolatos döntéshozatal újból nemzeti hatáskörbe helyezésére hozott döntést. Az európai biotechnológiai cégek szövetsége sajtóközleményében kijelentette: Ez az egyezség jól mutatja, hogy az EU intézményei és tagországai nem akarják korrekt módon végrehajtani a GM növények engedélyezésére jelenleg érvényes szabályozási jogrendszert, amelyet saját maguk állítottak fel. André Goig, az EuropaBio elnöke hozzátette: Egy közös Európai Uniós eljárásmódnak nem objektív alapon nemzeti hatáskörbe való visszautalása negatív precedenst teremt, és szembemegy az egységes piac szellemével különösen azért, mert megengedné a tagállamoknak, hogy egy technológiát nem tudományos alapon, formálisan elutasítsanak, amivel veszélyes precedenst teremtenek, és negatív jelzést küldenek az innovatív iparnak arra vonatkozólag, hogy érdemes-e Európában működnie. Úgy tűnik, hogy a holtpontról való elmozdulás nem jelenti a GMO vita végét. 10

SAJTÓKÖZLEMÉNY A biotechnológiai ipar elégedetlen a GM növények termesztésére vonatkozó döntések ésszerősítését célzó miniszteri egyezséggel A döntés ellentétes az EU közös piacának szellemével Brüsszel, 2014. június 12. Az EuropaBio-nak, a biotechnológiai iparágak európai szövetségének csalódást okozott az EU környezetvédelmi minisztereinek ma kötött egyezsége, amelynek tárgya a GM növények termesztésének szabályozását nemzeti hatáskörbe utaló javaslat. Az egyezség jól mutatja, hogy az EU intézményei és tagországai nem akarják korrekt módon végrehajtani a GM növények engedélyezésére jelenleg érvényes szabályozási jogrendszert, amelyet saját maguk állítottak fel. Egy közös Európai Uniós eljárásmódnak nem objektív alapon nemzeti hatáskörbe való visszautalása negatív precedenst teremt, és szembemegy az egységes piac szellemével mondta André Goig, az EuropaBio elnöke. Különösen azért, mert megengedné a tagállamoknak, hogy egy technológiát nem tudományos alapon formálisan elutasítsanak, amivel veszélyes precedenst teremtenek, és negatív jelzést küldenek az innovatív iparnak arra vonatkozólag, hogy érdemes-e Európában működnie tette hozzá Goig. Végső soron a gazdáknak kellene eldönteniük, hogy mit akarnak termeszteni a szántóföldjükön. Az EU GM növények termesztésére vonatkozó, eredetileg 2001-ben elfogadott jogszabályrendszerét (2001/18/EC irányelv) soha nem hajtották végre korrekt módon. A GM növények termesztése nem kerül rendszeresen a tagállamok elé szavazásra, ahogy a törvény előírja. Az EuropaBio megismétli felhívását, hogy az EU tudományos alapokon nyugvó kockázatbecslési követelményeit kielégítő termékek további késlekedés nélkül kapják meg a termesztési engedélyt. Világszerte több mint 15 éve nagyban termesztenek GM növényeket számos országban, és a rendelkezésre álló bizonyítékok alapján a GM növények legalább olyan biztonságosak, mint hagyományos megfelelőik. A biotechnológiai ipar szilárdan meg van győződve arról, hogy az EU saját legjobb tudományos kutatása támogatásának elmulasztása nagyban károsítja a növekedést, az innovációt, a beruházási klímát, sőt a fogyasztók bizalmát is. A döntéshozóknak most arra kellene összpontosítaniuk, hogy megoldást találjanak a vetőmagban és az élelmiszerekben található GMO-nyomok kimutatására és az ehhez szükséges mintavételre, ahogy ezt a tagországok már 2006 óta ismételten kérték, mivel ez a probléma az érintett területek sok szereplőjének gazdasági veszteséget okoz, és olyan árucikkek kereskedelmi áramlását veszélyezteti, amelyek igen fontosak az EU számára. Mind Belgium, mind Luxemburg tartózkodott a szavazáson. Információ sajtómédiumok számára: Rosalind Travers kommunikációs igazgató, EuropaBio r.travers@europabio.org Tel. 32-2-739-1173 Mobiltelefon: +32-(0)-478-680-301 VAGY Nilsy Desaint kommunikációs igazgató, Európai Zöld Biotechnológia, EuropaBio n.desaint@europabio.org 11

Reuters Brüsszel, 2014. május 28. http://uk.reuters.com/article/2014/05/28/us-eu-gmos-idukkbn0e81az20140528 Az EU-tagországok támogatják a GM növények termesztésének engedélyezésére vonatkozó kompromisszumot Barbara Lewis BRÜSSZEL (Reuters) Az Európai Unió a genetikailag módosított növények ügyében fennálló mély megosztottság megoldására kompromisszumos egyezséget hozott tető alá, amely várhatóan megkönnyíti majd e növények engedélyezését, egyúttal viszont lehetővé teszi, hogy egyes országok tiltsák azokat. Bár az amerikai kontinensen és Ázsiában széles körben termesztenek GM növényeket, Európában e növények termesztése megosztotta a közvéleményt, és számos országban, így Franciaországban és Németországban is erős ellenállást váltott ki. Nagy-Britannia üdvözölte az egyezséget, amely reményei szerint lerövidíti majd a GM növények európai engedélyezési folyamatát, és Franciaország is kedvezően nyilatkozott. Ez az egyezség segíthet akadálymentesíteni a GM növények termesztésének engedélyezésére szolgáló, jelenleg működésképtelen európai eljárást áll Nagy-Britannia mezőgazdasági és környezetvédelmi minisztériumának közleményében. Olyan rendszert akarunk, amely egy beható, tudományosan megalapozott biztonságossági vizsgálat lefolytatása után engedélyezi a GM növények termesztését. A francia mezőgazdasági minisztérium szintén üdvözölte a jó hírt, amely időben egybeesett a francia alkotmánybíróságnak a GM kukorica hazai tiltását jóváhagyó döntésével. Németország, az Unió vezető tagállama dicsérte az egyezséget a kimaradás lehetővé tételéért, mondván, hogy ezzel megteremtődött a formális betiltás lehetősége Németországban. Az európai emberek véleménye igen különböző ebben a kérdésben, és ezt tiszteletben kell tartani szögezte le közleményében Christian Schmidt német mezőgazdasági miniszter. A diplomaták elmondása szerint a szerdai, zárt ajtók mellett folytatott megbeszélésen a kompromisszum majdnem egybehangzó támogatást kapott (csak Belgium tartózkodott). Ez azt jelenti, hogy az EU minisztereinek jövő havi, luxemburgi találkozóján a javaslat formális jóváhagyást fog kapni. Ezután, az év hátralévő részében még meg kell kapnia az újonnan választott európai parlament támogatását is. Frederic Vincent bizottsági szóvivő szerint a Bizottság óvatosan optimista volt, és hozzátette, hogy az új törvény az év hátralévő részében vagy a jövő év elején nyerhet hivatalos jóváhagyást. TÚL SOK HATALOM? A törvényjavaslat szerint a GM növények termesztését ellenző tagországoknak ahelyett, hogy közvetlenül a cégekhez fordulnának, kérniük kell a Bizottságot, hogy kérje meg a cégeket: hagyják ki őket az új növények jóváhagyási kérelméből. A kompromisszumos szöveget előterjesztő, az EU elnöki tisztét éppen betöltő Görögország szóvivője szerint az a követelmény, hogy a tagországoknak a Bizottság útján kell kérésüket eljuttatniuk a cégekhez, maximális jogbiztonságot biztosít, egyúttal mégis megadja az országoknak a lehetőséget a GM növények termesztésének tiltására. 12

A környezetvédő aktivisták azonban azt állítják, hogy a törvényjavaslat túl sok hatalmat ad a cégeknek. A kormányoknak meg kell tudniuk tiltani a nem kívánt, kockázatos GM növények termesztését anélkül, hogy erre engedélyt kellene kérniük az abból hasznot húzó cégektől jelentette ki Adrian Bebb, a Föld Barátai európai ágának élelmiszerkampány-felelőse. A biotechnológiai ipar képviselői szintén elégedetlenek voltak a kompromisszummal, amely szerintük lehetővé teheti a növények nem tudományos alapon való tiltását. Egy közös eljárásmódnak nem objektív alapon nemzeti hatáskörbe való visszautalása negatív precedenst teremt, és szembemegy az egységes piac szellemével nyilatkozta André Goig, az EuropaBio (Európai Biotechnológiai Szövetség) elnöke. Az EU hatóságai eddig mindössze két GM növény kereskedelmi célú termesztését engedélyezték, és ezek közül egyikét később egy bíróság betiltotta. Idén év elején Tonio Borg európai egészségügyi biztos úgy nyilatkozott, hogy törvényben előírt kötelessége engedélyezni a DuPont és Dow Chemical cégek közösen kifejlesztett új, genetikailag módosított kukoricafajtáját, a Pioneer 1507-et. Annak ellenére, hogy a 28 EU tagország közül 19 ellenezte az engedély megadását, mégis igen valószínű, hogy az új fajta zöld utat kap, mivel az Unió súlyozott szavazási rendszere miatt ez a többség nem elegendő az elutasításhoz. A Bizottság egyik szóvivője szerdán úgy nyilatkozott, hogy a Bizottságnak még el kell döntenie, mikor kapja meg a Pioneer 1507 a jóváhagyást. *** Financial Times 2014. július 1. http://www.ft.com/intl/cms/s/0/7282b50e-005c-11e4-a3f2-00144 feab7de.html#axzz37o6joms2 A z E g y e s ü l t K i r á l y s á g k o r m á n y á n a k n é p s z e r ß s í t e n i e k e l l e n e a G M n ö v é n y e k e l n y e i t Clive Cookson tudományos szerkesztő A parlamenti képviselők azt akarják, hogy a kormány mozdítsa elő a GM növények ügyét. A brit alsóház környezetvédelmi, élelmezési és vidékügyi bizottsága szerint a genetikailag módosított növények segítségével az ország élelmiszer-szükségletének nagyobb hányadát lehetne saját földjükön megtermelni. A kormánynak hatékonyabban kellene tájékoztatnia a nagyközönséget a GM növények termesztésének lehetséges jótékony hatásairól írják a parlamenti képviselők élelmiszer-biztonsági jelentésükben. Bizonyítékokon alapuló, nyilvános vitát 13

kellene kezdeményeznie a GM növényekről, és cáfolnia kellene a GM termékek fogyasztására vonatkozó élelmiszer-biztonsági aggályokat. Anne MacIntosh, a bizottság konzervatív elnöke üdvözölte az EU minisztereinek nemrég elfogadott kívülmaradási javaslatát (amely lehetővé tenné, hogy egyes országok felgyorsítsák a GM növények engedélyezését, míg mások fenntartanák a nemzeti termesztési tilalmat), de azt mondta: az a fontos, hogy hosszú távon előmozdítsák az európai körülményeknek megfelelő, új generációs GM technológia kifejlesztésére irányuló kutatást. A rothamsteadi kísérleti állomáson és a John Innes kutatóközpontban egyesült királyságbeli tudósok vezetésével ilyen munka folyik. Helen Wallace, a GeneWatch UK (Génfigyelő) kampánycsoport igazgatója szerint az Egyesült Királyságban a közeljövőben az egyetlen termesztésre alkalmas GM növény a RoundUp Ready kukorica, amely ellenálló a Monsanto RoundUp gyomirtó szerével szemben. A bizottság jelentésében tárgyalt kísérleti GM növények nagy többségükben sikertelenek, és különben is évtizedeknek kell még eltelniük, amíg kereskedelmi forgalomba kerülhetnek mondta. Julian Little, egy ipari csoport, az Agricultural Biotechnology Council (Agrobiotechnológiai Tanács) elnöke azonban üdvözölte a jelentést. Támogatjuk a bizottság felhívását a kormány felé, hogy továbbra is munkálkodjon az EU-ban annak biztosítására, hogy a szabályozó rendszer kutatás- és tudomány alapú legyen, és lehetővé tegye a GM technológia felhasználását azon országok számára, amelyek élni kívánnak ezzel a lehetőséggel mondta. A parlamenti képviselők szerint az Egyesült Királyság mezőgazdasági önellátó képessége hanyatlóban van. Ma az angliai viszonyok között termeszthető élelmiszerek 68%-át ténylegesen az országban termesztik; húsz évvel ezelőtt ez az arány 87% volt. Bár az önellátás a gyümölcs- és zöldségtermesztés terén csökkent leginkább, a gabonaféléknél is csüggesztő a helyzet: a termesztett búzamennyiség több mint 15 éve nem emelkedett. A jelentés az élelmiszer-biztonsággal kapcsolatos kormányzati felelősség világosabb meghatározására szólít fel, és arra, hogy a környezetvédelmi, élelmezési és vidékügyi minisztérium erőteljesen lépjen fel a Whitehall teljes szélességében. A jelentés szerint a jövő legnagyobb fenyegetése az éghajlatváltozás, amely változékonyabb és szeszélyesebb időjárást hoz, terméspusztító árvizekkel és aszállyal. Bár a kormány évente 410 millió fontot költ mezőgazdasági-élelmiszeripari kutatásokra, e kutatás nagy része szétszórt, és nincs elegendő támogatás olyan farmszintű kutatásokra, amelyek fenntartható módon végezhetnének vizsgálatokat, szaporítanák az állatállományt, terjesztenék az új gazdálkodási rendszereket és a kutatási eredményeket megismertetnék a gazdálkodói közösséggel fejezi be a jelentés. Julian Little *** 14

Főszerkeszt ő: Dudits Dénes Szerkesztette: Keczánné Zsuzsa Fordította: Fejes Erzsébet Példányszám: 1000 db két havonta Borító: EDOMO MEDIA, Szeged Nyomda: TISZA PRESS, Szeged Kiadja a G BE támogatásával a Barabás Zoltán Biotechnológiai Egyesület