A 16-3 bakteriofág receptorának elemzése

1 DIPLOMAMUNKA A 16-3 bakteriofág receptorának elemzése DEÁK VERONIKA biológus hallgató Témavezető: DR. PUTNOKY PÉTER Pécsi Tudományegyetem Biológiai Intézet Genetikai és Molekuláris Biológiai Tanszék Pécs, 2004.

2 TARTALOMJEGYZÉK 1. BEVEZETÉS 3 2. IRODALMI ÁTTEKINTÉS 4 2.1. Nitrogénfixáló organizmusok 4 2.2. A rhizobiumok endoszimbiózisának kialakulása 5 2.3. A S. meliloti sejtfelszíni poliszacharidjai és szimbiózisban betöltött szerepük 7 2.3.1. Exopoliszacharidok 7 2.3.2. Kapszuláris poliszacharidok 8 2.3.3. Lipopoliszacharidok 9 2.4. Bakteriofág receptorok típusai 10 2.4.1. Fehérjetermészetű fágreceptorok 10 2.4.2. Poliszacharid jellegű fágreceptorok 14 2.5. A 16-3 fág mint a legrészletesebben tanulmányozott rhizobium fág 15 3. A MUNKA ELŐZMÉNYEI 16 3.1. Spontán mutáns baktérium törzsek izolálása, szelekciós rendszer 16 4. CÉLKITŰZÉSEK 19 5. ANYAGOK ÉS MÓDSZEREK 20 5.1. Baktériumok, bakteriofágok, plazmidok 20 5.2. A baktériumok növesztése 21 5.3. Fágok szaporítása 21 5.4. A baktériumok keresztezése 21 5.5. Fágérzékenységi teszt 21 5.6. Összes DNS izolálás 22 5.7. Plazmid DNS izolálás 22 5.8. Restrikciós emésztés 23 5.9. Agaróz gélelekroforézis 23 5.10. Fragmentizolálás 23 5.11. In vitro transzpozonos mutagenezis 24 5.12. Ligálási reakció 24 5.13. Kompetens sejt készítés 24 5.14. Transzformálás 25 5.15. Polimeráz láncreakció (PCR) 25 5.16. DNS-szekvencia meghatározás 26 6. EREDMÉNYEK ÉS MEGVITATÁSUK 27 6.1. A receptormutáció az rkp-3 régión belül található 27 6.2. Az rkp-4046 az rkpm gén mutáns allélja 28 6.3. A S. meliloti 41 vad típusú törzs rkpm alléljának DNS-szekvencia meghatározása 30 6.4. Az RkpM fehérje feltételezett funkciói 31 6.5. Komplementációs kísérletek az RkpM receptoralkotó funkciójának bizonyítására 35 6.5.1. Genetikai komplementáció a pbbr::rkpm 4046 plazmiddal 35 6.5.2. Genetikai komplementáció a psem91::rkpm 4046 plazmiddal 37 7. ÖSSZEFOGLALÁS 42 8. FELHASZNÁLT IRODALOM 43 9. RÖVIDÍTÉSEK 49

3 1. BEVEZETÉS Az élőlények nagy mennyiségű nitrogént igényelnek szervezetük felépítéséhez és életfolyamataikhoz. A növények számára általában csak a talajban oldott, szervetlen ionok (NO 3, - NH + 4 ) formájában előforduló nitrogénforrás hasznosítható, ami viszont nem mindig áll rendelkezésre kellő mennyiségben. A talaj természetes nitrátutánpótlása többféle módon történhet. A lebontó szervezetek a szerves molekulákban kötött nitrogént elsősorban ammónia formájában szabadítják fel (ammonifikáció), mely a nitrifikáló organizmusok tevékenysége folytán nitrit illetve nitrát formába kerül (nitrifikáció). A légkör 78%-át kitevő nirogéngáz kis részben kémiai úton (például villámlás), nagyobb arányban pedig ( kb. 72%) biológiai úton redukálódik (Burns and Hardy, 1975). Biológiai nitrogénkötésre csupán egyes prokarióta szervezetek képesek. A diazotróf organizmusok leghatékonyabb formáját az endoszimbiózisban élő nitrogénfixálók képviselik, mint például a Rhizobiaceae családba tartozó talajbaktériumok, melyek gazdanövényei kizárólag a pillangósvirágúak (Fabaceae) családból kerülnek ki (Allen and Allen, 1981). A rhizobiumok (Rhizobium, Azorhizobium, Bradyrhizobium, Mezorhizobium, Sinorhizobium nemzetségekbe tartozó fajok) a biológiailag megkötött nitrogén háromnegyed részét állítják elő évente. Nagy előnyt élveznek tehát azok a növények, melyek ilyen módon képesek egy állandó nitrogénforráshoz jutni, hiszen fejlődésüket ezáltal függetleníteni tudják a talaj szabad nitrogéntartalmától. E bonyolult, több kommunikációs lépésen alapuló együttélés tanulmányozása nemcsak az alapkutatás számára fontos, hanem ökológiai és gazdasági vonatkozásai is vannak, hiszen rendkívüli jelentőségű lenne, ha háttérbe szorulna a környezetterhelő és költséges műtrágyázás.

4 2. IRODALMI ÁTTEKINTÉS 2.1. Nitrogénfixáló organizmusok A légköri nitrogéngáz hasznosítására képes szervezeteket csak a prokarióták körében találunk. Szabadonélő nitrogénkötők előfordulnak a Klebsiella, Clostridium, Azotobacter, Azomonas nemzetségekben, továbbá a kemotróf baktériumok (Thiobacillus ferrooxidans), illetve a fototróf cyano- (Nostoc, Oscillatoria, Plectonema) és bíborbaktériumok (Rhodospirillum rubrum) között. Sok fonalas cyanobaktériumban a nitrogénfixálás speciális sejtekben, a heterocisztákban megy végbe (Haselkorn, 1978). A fonalak sejtjeinek egy része akkor alakul át cisztává, amikor nitrát és ammónia nem áll rendelkezésre. Léteznek olyan nitrogénfixáló prokarióták, melyek már kapcsolatot alakítanak ki növényekkel, ez az együttélés azonban nem szoros. Az Asospirillum talajbaktériumok például a pázsitfűfélék rhizoszférájában dúsúlnak fel, egy laza asszociációt képezve, ahol a partnerek között metabolitcsere zajlik (Jordan, 1981). Az Anabaena cyanobaktérium az Azolla vízipáfrány levelében található heterocisztákban él extracellulárisan (Peters et al., 1980). A szimbiotikus diazotrófok között szép számban fordulnak elő cyanobaktériumok, melyek a legkülönbözőbb növénycsoportok képviselőivel élhetneknek nitrogénfixáló szimbiotikus kapcsolatban, mint például Blasia mohákkal a Chlorogloeopsis sp. (Nyree and David, 1997), a zárvatermők közül Gunnera fajokkal a Nostoc sp. számos képviselője (Zimmerman and Bergman, 1990). A nyitvatermők közül több Cycas faj, a gombák közül pedig a Lichens sp. egyes fajai rendelkeznek Cyanophyta szimbionta partnerrel (Lindblad and Bergman, 1990). Jelentősek a Gram-pozitív Actinomyceták csoportjába sorolható Frankia sp. fajai, mivel egy sor zárvatermő növénnyel (Alnus, Eleagnus, Hyppophae, Myrica stb.) képesek szimbiotikus nitrogénfixálásra (Benson and Silvester, 1993). A Rhizobiaceae családba tartozó talajbaktériumok jellegzetessége, hogy szabadon élő formában nem képesek nitrogénkötésre, csakis a gazdanövénnyel kialakuló szoros együttélésben, az ún. endoszimbiózisban. A rhizobiumok kizárólag a pillangósvirágú (Fabaceae) növényekkel hoznak létre szimbiózist, mely mindkét fél számára kölcsönösen hasznos együttélést jelent (Allen and Allen, 1981). A baktérium és növény közti kapcsolat igen specifikus. A Sinorhizobium meliloti (régebbi nevén Rhizobium meliloti), melyen vizsgálatainkat végezzük, a lucerna (Medicago), a lepkeszeg (Trigonella) és a somkóró (Melilotus) fajok szimbiotikus partnere.

5 2.2. A rhizobiumok endoszimbiózisának kialakulása A rhizobiumok szimbiotikus nitrogénfixálása egy specifikus, csakis erre a funkcióra hivatott, újonnan kialakuló növényi szervben, a gyökérgümőben zajlik, melynek feladata a nitrogén redukálása, és annak bekapcsolása a növényi anyagcserébe. Ez az együttélés egy bonyolult fejlődési program eredménye, melyben a baktérium és a gazdanövény kölcsönösen befolyásolják egymás életfolyamatait. Ennek hátterében összetett génexpressziós mintázatok állnak, amelyek összehangolásához elengedhetetlen a két partner közötti folyamatos szignálcsere. A szimbiózis kialakulásának primer inducerei a növényi másodlagos anyagcseretermékekhez sorolható különféle flavonoid és izoflavonoid típusú vegyületek, melyeket a növény a gyökereken keresztül a talajba szekretál (Redmond et al., 1986). Ez pozitív kemotaxist vált ki (Currier and Strobel, 1974), minek hatására a baktériumsejtek feldúsulnak a növény rhizoszférájában. A növényi jel felfogásáért a bakteriális NodD fehérje felelős (Mulligan and Long, 1985; Rossen et al., 1985), mely a nodulációs (nod) gének általános transzkripciós aktivátora. Konzerválódott DNS szekvencia részekhez, az ún. nod-boxokhoz kapcsolódva biztosítja a gének szabályozott expresszióját (Rostas et al., 1986 ), aminek eredményeként a baktérium a növény felé kiválaszt egy diffúzibilis szignált, a Nod faktort, mely kémiai természetére nézve egy lipo-kitooligoszacharid molekula (Roche et al., 1991). Az alapváz a legtöbb rhizobium fajban azonos felépítésű, szintéziséért az ún. közös nod gének (nodabc) felelősek, melyek erősen konzerválódtak (Fisher et al., 1985). A gazdaspecifitásért az alapvázat módosító eltérő szubsztitúciós mintázatok felelősek, melyek kialakításában egy sor további az egyes fajokban eltérő nod gén vesz részt (Kondorosi et al., 1984; Truchet et al., 1985). A Nod faktor a gazdanövényben indukál egy szignáltranszdukciós útvonalat, mely döntő jelentőségű a szimbiotikus gümő fejlődésében (Catoira et al., 2000). Hatására a gyökér belső kéregsejtjei között dedifferenciáció és mitózisok során egy új osztódószövet alakul ki, a gümőmerisztéma (Dudley et al., 1987), mely a szimbiotikus gümő szövetét hozza létre. A nod génekben mutáns baktériumok nem képesek a gümőképződés elindítására (Nod fenotípus). A baktériumok a gyökérszőrökön keresztül hatolnak be a gümő belsejébe. A gyökérszőrökhöz való tapadás a sikeres infekció egyik előfeltétele (Mills and Bauer, 1985). Ebben a lépésben a különféle bakteriális poliszacharidok játszanak szerepet (2.3.fejezet), amelyek a növényi szénhidrátkötő és felismerő glikoproteinhez, a lektinhez kapcsolódnak specifikusan (Diaz et al., 1989). A fertőzési pont környezetében a gyökérszőrsejtek deformálódása, jellegzetes pásztorbotszerű meggörbülése figyelhető meg, mely a Nod faktor által indukált, egyen-

6 lőtlen sejtfalnövekedés következménye (Dudley et al., 1987). Végül, a gyökérszőr körülnövi a baktériumot, így az bekerül a növény belsejébe (Turgeon and Bauer, 1982). Mindezek után, a baktériumoknak át kell hatolniuk a több sejtrétegnyi külső kéregzónán, hogy eljuthassanak az újonnan differenciálódó gümősejtekig. Ezt a folyamatot a növény sejtjei az ún. infekciós fonal kialakításával segítik, mely a lebomlott régi sejtfal anyagaiból felépülő, cső alakú belső struktúra (Robertson and Lyttleton, 1982). Az infekciós fonal fokozatosan növekszik a belső kéreg irányába, majd a gümősejtek zónájában többszörösen elágazódik. A baktériumok ennek a különleges, fonálszerű képletnek a belsejében haladnak a nitrogénkötés színhelye felé. A szimbiózis kialakulásának ebben a stádiumában döntő jelentőségűek a baktérium különféle felszíni poliszacharidjai (infekciós fonal képzés, a növény saját védekező mechanizmusainak gátlása), illetve a növényi környezet okozta stresszek kivédésében szerepet játszó mechanizmusok (Pellock et al., 2000; Santos et al., 2000). Az infekcióban hibás (Inf ) baktérium mutánsok el tudják indítani a gümőfejlődést, de nem képesek bejutni a belsejébe, üres gümők keletkeznek. Az invazív baktériumok az infekciós fonal végénél a gümősejtek cytoplazma membránjához kötődnek, majd a növényi sejt endocytózis útján felveszi a baktériumsejteket (Mellor and Werner, 1987). Ennek megfelelően, a gümősejtekbe került baktériumok membránnal (peribakteroid membrán) határoltak, fiziológiailag és morfológiailag megváltoznak, ún. bakteroiddá differenciálódnak. A bakteroid forma mozgásképtelen, alakja és membránösszetétele megváltozik, mérete többszöröse a szabadon élő sejteknek. Az endocytózis és a bakteroid-differenciáció genetikai szabályozottsága még kevésbé tisztázott, a BacA fehérje kivételével, mely egy belső membránprotein, és valószínűleg befolyásolja a sejtfelszín összetételét. A S. meliloti baca mutánsok bejutnak ugyan az infekciós fonal belsejébe, de hamar elöregednek, még bakteroiddá differenciálódásuk előtt, valószínűleg azért, mert fokozottan érzékenyek a stresszekre (Ferguson et al., 2002; Glazebrook et al., 1993). A bakteroiddá való differenciálódás után aktiválódnak a nitrogénkötésben, valamint a bakteroid metabolizmusban fontos gének. E késői szimbiotikus gének nagy részének expresszióját elsősorban a csökkent oxigéntenzió, másodsorban pedig a kötött nitrogén koncentrációja szabályozza. A nitrogenáz enzimkomplex (Fe-Mo protein) savlabilis ként tartalmaz, ezért erősen oxigénérzékeny. A nitrogénfixáláshoz nélkülözhetetlen mikroaerob körülményeket elsősorban a növényi gümőspecifikus fehérje, a leghemoglobin biztosítja (Powell and Gannon, 1988). A bakteroid növény szimbiózisban a kölcsönös előnyöket elsősorban a partnerek egymás számára szolgáltatott anyagcseretermékeik jelentik. A bakteroidok és a növény között szállítónyalábokon keresztül áramlanak a különböző produktumok (Newcomb, 1981). A nitrogenáz működése során képződött ammónia, a növény citoplazmájába jutva,

7 glutaminsavba épül, majd transzaminálás útján egyéb szerves vegyületbe. A ilyen formában kötött nitrogén a szállítónyalábokon keresztül eljut a növény többi részébe. A növény fotoszintetizáló szöveteiből pedig különböző fotoszintátok érkeznek a gümőbe, és a peribakteroid membránon keresztül a bakteroidba transzportálódnak. 2.3. A S. meliloti sejtfelszíni poliszacharidjai és szimbiózisban betöltött szerepük A rhizobiumok különféle sejtfelszíni poliszacharidjai a szimbiózis kialakulásának több lépésében is kulcsfontosságúak, mint például a növény inváziójában, az infekciós fonal növekedésében, továbbá megvédik a baktériumokat a környezeti ártalmakkal szemben. Már régóta ismert, hogy a patogén baktériumok sejtfelszíni poliszacharidjai a patogenitást nagymértékben befolyásolják, erős antigén tulajdonságukból adódóan pedig a baktériumok szerotípusait határozhatják meg. A S. meliloti sejtfelszíni szénhidrátjai az exopoliszacharidok, kapszuláris poliszacharidok és lipopoliszacharidok (Kannenberg and Brewin, 1994). 2.3.1. Exopoliszacharidok A S. meliloti egy EPSI nevű szukcinoglükán heteropoliszacharidot választ ki a környezetébe, mely hét glükóz és egy galaktóz molekulát tartalmazó oktoszacharid alegységekből épül fel (Reuber and Walker, 1993). Az alegységeken szukcinil, acetil és piruvil módosításokat tartalmaz, melyek savas jelleget kölcsönöznek a molekulának. A heteropoliszacharidok szintézise négy lépésre osztható, melyek az exo gének által szabályozottak. Először UDPglükóz és UDP-galaktóz szintézis történik (pl. exob,c,n), majd, második lépésként, az ismétlődő oktoszacharid alegység szintézise a nukleotid-cukrokból, egy sejtmembránba ágyazott lipidhordozó felszínén (exof,j,a,l,m,n,o,u). Következő lépésben az alegységek módosítása (szukcinil exoh, acetil exoz, piruvil exov), végül az oktoszacharid alegységek polimerizációja, és a sejtfelszínre való transzfere (exop,t,q) történik (Leigh and Walker, 1994). Sok S. meliloti törzs azért nem képes a növény inváziójára, mert az exopoliszacharid termelésében hibás. Ilyenkor az infekciós fonalak idő előtti abortálódása, és a gümő normális fejlődésének elmaradása tapasztalható (Müller et al., 1988). Ismeretes egy másik típusú, a S. meliloti 1021 törzsben azonosított, EPSII néven leírt exopoliszacharid, mely glükóz és galaktóz tartalmú diszacharid egységekből felépülő galaktoglükán (Glazebrook and Walker, 1989). Az EPSII bioszintéziséért az exp gének felelősek (Becker et al., 1997).

8 2.3.2. Kapszuláris poliszacharidok Vannak olyan rhizobiumok, mint például a S. meliloti 41 törzs exob mutánsa, melyek nem termelnek exopoliszacharidot, mégis szimbiózist tudnak létrehozni bármely gazdanövényükkel. Ennek oka az, hogy ezek a baktériumok olyan rhizobiális kapszuláris poliszacharidot (KPS) termelnek, mely helyettesíteni tudja az exopoliszacharidokat a gümőfejlődés során (Putnoky et al., 1990; Petrovics et al., 1993). Ezek a poliszacharidok szorosan kapcsolódnak a baktérium felszínéhez, és erős immunológiai sajátságuknak köszönhetően K-antigéneknek is nevezik őket. Széleskörben elterjedtek a legkülönbözőbb humán- és növénypatogén baktériumfajok körében. Rhizobiumokban elsőként a R. fredii USDA205, és a S. meliloti 41 törzsekben mutatták ki a kapszuláris poliszacharid jelenlétét, és a további elemzésekből kiderült, hogy adott rhizobium faj különböző törzsei eltérő szerkezetű molekulaváltozatokat termelnek (Reuhs, 1997). A különféle K-antigének felépítésében általános elemek a hexóz és 1-karboxy-2-keto-3- deoxy cukrokból álló ismétlődő egységek, vagy a 3-deoxy-D-manno-2-oktulozonsav (Kdo). A specifitásért a kapcsolódó oldalláncok eltérő mintázata, térszerkezetbeli, valamint molekulaméretbeli különbözőségek felelősek (Forsberg and Reuhs, 1997). A S. meliloti 41 törzs K R 5 antigén néven ismert kapszuláris poliszacharidot termel, mely szerkezetében az E. coli, patogenitásban fontos, II-es típusú K-antigénjeivel analóg (Reuhs et al., 1993). A K R 5 antigén diszacharid alegységei egy glükuronsavból és egy 5,7-diamino- 3,5,7,9-tetradeoxi nonulozonsavból (pszeudaminsav, Pse) állnak, melyen 7-N-acetil és 5-N-βhidroxibutiril módosítások találhatók (Reuhs, 1997). Az elmúlt években 3 régiót azonosítottak, melyek a K R 5 antigén bioszintéziséért felelősek (rkp-1, rkp-2, rkp-3 régiók). Az rkp-1 régióban 10 gén található (rkpa-j), (Putnoky et al., 1990; Kiss et al., 1997; Petrovics et al., 1993). A gének nagy része olyan fehérjéket kódol, melyek hasonlóak a különbözö zsírsavszintézisben, valamint lipidmolekulák módosításában részt vevő génekkel (Reuhs et al., 1993). Ez a génrégió a KPS szintézishez szükséges lipidhordozó előállítását kódolja. Ha bármelyik említett génben mutáció történik, akkor a KPS nem jelenik meg a baktérium felszínén. Az rkp-1 régióban nincsenek olyan gének, melyeknek a cukoralegységek bioszintézisében vagy a KPS polimerizációjában lenne szerepe. Az rkp-2 régióban két gént azonosítottak. Az lpsl által kódolt fehérje egy UDPglükuronsav epimeráz, mely a lipopoliszacharid bioszintézisében fontos. A másik, az rkpk gén egy UDP-glükóz dehidrogenáz enzimet kódol, amely katalizálja az UDP-glükóz UDPglükuronsavvá oxidálását. Ez utóbbi molekula alapvegyület az LPS és a KPS szerkezetében is (Kereszt et al., 1998).

9 Az rkp-3 régióban 10 gént (rkpl-z) azonosítottak (Kiss et al., 2001), melyek pontos funkciója még nem ismert. Az rkp-1 és rkp-2 régió általánosan előfordul a Sinorhizobium genusban, ezzel szemben az rkp-3 régió csak a S. meliloti 41 törzsben található meg. Az itt fellelhető gének feltehetően a K R 5 antigén bioszintézisért, és a sejtfelszínre való exportálásáért felelősek. Vannak közöttük olyan gének, melyek homológiát mutatnak különféle transzferáz enzimet kódoló génekkel (például: rkpm, rkpo, rkpp), transzporter fehérjéket kódoló génekkel (például: rkps, rkpt, rkpr). Az RkpZ fehérje homológ az E. coli KpsC fehérjéjével, melyről tudjuk, hogy befolyása van a termelt KPS méretére és exportjára (Reuhs et al., 1995). 2.3.3. Lipopoliszacharidok A lipopoliszacharidok a külső membránba ágyazottan helyezkednek el. A Gram-negatív baktériumok sejtfelszínének fontos alkotóelemei. Ezek a makromolekulák is több szerkezeti egységre tagolhatók. A külső membránba lipida egység segítségével rögzülnek. Ehhez kapcsolódik egy úgynevezett core oligoszacharid, melyhez a törzsspecifikus O-antigén kötődik (Kannenberg and Brewin, 1994). A S. meliloti LPS mutánsok szimbiózisra képesek a gazdanövénnyel, de a szimbiotikus kapcsolat lassabban alakul ki, mint a vad típusú baktériumok esetében (Lagares et al., 1992). Vannak olyan baktérium törzsek is (pl. S. meliloti 41 törzs), melyeknél az LPS nem játszik fontos szerepet a fertőzésben. Más rhizobium fajoknál azonban előfordul, hogy csak az LPS bizonyul kulcsfontosságúnak a szimbiózisban, míg a többi poliszacharid (KPS, EPS) nem (Kannenberg and Brewin, 1994). Az előzőekben ismertetett bakteriális sejtfelszíni poliszacharidok szerkezete nagymértékben különbözik, mégis azonos szerepet töltenek be a szimbiózisban. Ismeretes, hogy a baktérium és a gazdanövény közötti kapcsolat igen specifikus a poliszacharidok tekintetében is. Az, hogy alapvetően eltérő szerkezetű poliszacharidok helyettesíteni képesek egymást az invázió folyamatában arra utal, hogy a növény több független mechanizmussal is felismerheti a baktériumot.

10 2.4. Bakteriofág receptorok típusai A különféle bakteriális sejtfelszíni komponensek fontos szerepet töltenek be a biológiai felismerési folyamatokban, nemcsak a szimbiotikus kapcsolatok kialakulásában, hanem a baktérium bakteriofág felismerésekben, valamint a prokarióta eukarióta patogén mechanizmusokban is. Közös molekuláris elemek fedezhetők fel például a rhizobiumok pillangósvirágúak szimbiózisában, valamint számos Brucella és Bartonella baktériumfaj patogénezisében (LeVier et al., 2000). A bakteriofágok a molekuláris biológia eszköztárának fontos elemei. A röviden fágoknak is nevezett baktérium vírusok egy rendkívül szerteágazó csoportot alkotnak, mivel csaknem minden baktériumfaj, illetve törzs rendelkezik legalább egy specifikus bakteriofággal. Tudományos jelentőségük abból adódik, hogy könnyű tanulmányozhatóságuk miatt kiváló modellorganizmusként szolgálnak, így a molekuláris biológia, genetika, biokémia számos alapvető mefigyelése a bakteriofágok vizsgálata során teljesedett ki. Mint minden vírus, a bakteriofágok is a fertőzött sejt biokémiai rendszerét kényszerítik rá saját maguk megsokszorozására. A fágok szaporodása a gazdasejthez való specifikus kötődéssel kezdődik. A megtapadásra, illetve a genom beinjektálására a fágok számos stratégiát dolgoztak ki. A fágreceptorok a legkülönfélébb sejtfelszíni komponensekből tevődhetnek öszsze, melyekkel a fág által kódolt receptorkötő fehérje lép interakcióba. Az alábbiakban összefoglaltak a legáltalánosabban elterjedt, illetve leginkább tanulmányozott bakteriofág receptor típusok, különös tekintettel a Gram-negatív baktériumcsoportra. 2.4.1. Fehérjetermészetű fágreceptorok Az egyik legjelentősebb prokarióta modellorganizmus az E. coli, melynek ma már több tucat bakteriofágja ismert. Döntő többségük külső membránproteint, illetve a külső és belső membránt átérő polipeptid transzportapparátust használja ki a gazdasejt megfertőzéséhez. Sok esetben, ezek egyéb sejtfunkciókat ellátó transzportrendszerek, a legtöbbször valamilyen specifikus szubsztrát felvételéért felelősek. Az egyik legrészletesebben tanulmányozott baktérium bakteriofág rendszer az E. coli Κ12 törzs és λ fágja. A fág receptora a maltóz és maltodextrinek transzportjáért felelős csatornaformáló trimer külső membránfehérje, a MalB, régebbi elnevezés szerint LamB (Randall-Hazelbauer and Schwartz, 1973). Ezzel közvetlen kölcsönhatásban a λ fág farkirost J fehérjéje áll. A malb génben történő, fágrezisztenciát eredményező missense pontmutációkra a rajtuk izolálható host range fágmutánsok szintén egy-egy missense mutációval reagálnak, melyek mind a j génnek a farkirost C terminálisát kódoló részére esnek,

11 azaz a receptorkötésért ez a fehérjerész felelős (Werts et al., 1994; Charbit et al., 1994; Wang et al., 1998; Wang et al., 2000). A MalB fehérjén kívül, további két, mannóztranszportban részt vevő, citoplazmatikus integrál membránprotein (II-C Man, II-D Man ) szükséges a λ-dns penetrációjához. Kísérletesen bizonyított, hogy a Bacillus subtilis-nél hasonló funkciót ellátó fruktóz-specifikus permeáz helyettesíteni tudja E.coli-ban az utóbbi két mannóz-permeáz komponenst a λ fág infekcióban. A MalB fehérje receptorként szolgál több más fág számára is, melyek egyike sem igényel egyéb mannóz-transzporter elemeket az infekcióhoz (Charbit and Hofnung, 1985). Az E. coli külső membránjába ágyazott Tsx nukleozid-specifikus csatornafehérje receptorként szolgál néhány bakteriofág (T6, Ox1, H3), valamint a kolicink számára (Bremer et al., 1990). A receptorfunkció kialakításáért a fehérje mintegy 25 aminosavnyi szegmense felel, ugyanis a többszörösen fágrezisztenseknél a mutációk (missense mutációk, deléciók, duplikációk) mind az ennek megfelelő DNS-szakaszra estek (Schneider et al., 1993). Az OmpA szintén a külső membránban elhelyezkedő fehérje, mely nyolc transzmembrán doménjével úgy ágyazódik a membránba, hogy négy nagy extracelluláris hurkot képez. Az E. coli számos bakteriofágjának (K3, K4, K5, AC3, Ox2, Ox3, Ox4, Ox5, M1 stb.) a receptora, és az egyes fágok a fehérje különböző részeit ismerik fel specifikusan (Morona et al., 1985). Az OmpA fehérje további feladata az F-konjugáció stabilizálása a recípiens sejt által (Koebnik, 1999). Az, hogy periplazmatikus, valamint belső membránprotein szerepet játsszon egy fág adszorpciójában, nem túl gyakori, de előfordul. Ilyen multigén-adszorpcióra példa az E. coli N4 fágja, mely genomjának baktériumsejtbe juttatásához igényel egy külső (NfrA) és egy belső (NfrB) membránproteint (Kiino and Rothman-Denes, 1989), valamint két további fehérjét, melyek közül az egyik még nem eléggé karakterizált (NfrD), a másik pedig (NfrC) a citoplazmában helyezkedik el (Kiino et al., 1993). A FhuA egy multifunkcionális külső membránreceptor, mely eddigi ismereteink szerint, a ferrikróm, kolicinb és -M, albomicin, mikrocin 25 felvételben játszik szerepet, továbbá elengedhetetlen a T5 bakteriofág, valamint az ún. TonB-dependens fágok (T1, Φ80) adszorpciójához (Hancock and Braun, 1976). A T5 fáginfekció kivételével, valamennyi felsorolt transzport energiaigényes folyamat, és mindegyik a TonB ExbB ExbD rendszert igényli, ahol a citoplazmamembrán elektrokémiai potenciálja átalakul konformációs energiává, melyet a TonB periplazmatikus fehérje közvetít a FhuA receptor felé (Braun, 1995). A T5 fág a gazdasejt energiaszolgáltatása nélkül képes nyitni a csatornát (Bonhivers et al., 1996). Hasonló eredmények születtek az E. coli K12 törzsére specifikus C1 fág receptorának elemzése során is. A sikeres infekcióhoz itt, a külső membránreceptoron (BtuB) kívül, még

12 további két fehérje szükséges. Az egyik egy periplazmatikus fehérje, a DcrB melynek funkciója, feltehetően, megegyezik a TonB fehérjével, a másik pedig a DcrA belső membránfehérje (Likhacheva et al., 1996). A DcrA fehérje régebbi elnevezése SdaC, és legelsőként megismert funkcióját tekintve, egy erősen specifikus szerin transzporter (Shao et al., 1994). Vannak olyan eredmények, mely szerint a BtuB receptor nemcsak a DcrB energia transzformáló fehérjével léphet interakcióba, hanem a TonB-vel is (Cadieux et al., 2000). Így kerül felvételre például a B12 vitamin, további két belső membránfehérje (BtuD, BtuC) közreműködésével (Simon et al., 1995). Mindezeken kívül, a BtuB receptorként szolgál a BF23 fág számára is (Bradbeer et al., 1976), melynek infekciója viszont nem függ sem a DcrB, sem a TonB fehérjétől (Simon et al., 1995). Bizonyos esetekben, a fáginfekciót nem csupán egy sejtfelszíni receptor kontrollálja, hanem a target sejt felszínének több sajátsága együttesen fontos. Az AR1 bakteriofág kizárólag az E. coli O157:H7 szerotípusba sorolható izolátumait képes fertőzni. A specifitásban fontos szerepe van az OmpC receptorfehérjének, mely elsődleges szerkezetében különbözik az E. coli K12 törzsétől. A fehérjék a 176-226 aminosavak között mutatják a legtöbb eltérést (Yu et al., 1998). Spontán fágrezisztens mutánsok elemzése is alátámasztotta, hogy az AR1 fág gazdaspecifitását ez a fehérjerész befolyásolja. Azt is kimutatták, hogy ép lipopoliszacharid (LPS) hiányában az OmpC gyengébben köti a fágot. Ugyanilyen gyenge kötődés tapasztalható, amikor az eredeti receptort a K12 törzsből származó OmpC-vel helyettesítik. Az AR1 fág maximális kötődéséhez tehát az OmpC fehérje és az LPS együttesen szükséges (Yu et al., 2000). Az LPS funkciója ebben még nem tisztázott. Elképzelhető, hogy direkt kötődéssel könnyíti a fágadszorpciót, vagy indirekt járul hozzá, a külső membrán fehérjeössszetételének befolyásolása által. Ugyancsak az E. coli O157:H7 törzsre specifikus a PP01 bakteriofág, melynek gazdasejthez kötődéséért, a legújabb eredmények szerint, az ép LPS felelős elsődlegesen, és minden alternatív szerkezetű LPS mintegy barrierként szolgál, megakadályozva, hogy a fág hozzáférjen az OmpC fehérjéhez (Mizoguchi et al., 2002). A fehérje természetű fágreceptoroknak különleges formái a Gram-negatív baktériumokra jellemző ún. IVSP (type IV pathway system), multikomponensű, a teljes felszínt átérő transzportrendszer, mely proteinek és nukleoprotein komplexek transzlokációját biztosítja a donor sejtből (F + ) a recipiens sejtbe (F - ) a bakteriális konjugáció során. A transzportrendszerhez kapcsolódik a sejt felszínén található F-pílus, mely a konjugációban részt vevő baktériumsejtek kapcsolódását segíti elő. A komplex modelljét a 2.1. ábra mutatja be (Cao and Saier, 2001).

13 Több baktériumfaj esetében fedeztek már fel píluson, illetve a hozzá kapcsolódó transzportapparátuson keresztül fertőző, ún. donor-specifikus bakteriofágokat. Ilyen például az E. coli PRD1 fágja, mely a P2 fehérje által, a gazdasejt IncP plazmidján, összesen 11 gén által kódolt Mpf (mating pair formation) komplexet igényli a megtapadáshoz, mely valószínűleg a fág-dns beinjektálását is biztosítja (Grahn et al., 1997). 2.1. ábra: A IVSP komplex javasolt sematikus ábrázolása (Cao and Saier, 2001) A modell figyelembe vesz minden eddigi ismeretet a IVSP transzportrendszerrel kapcsolatban, több baktériumfajon végzett kísérleti munkán, valamint filogenetikai elemzéseken alapszik. Az E. coli más bakteriofágjai (pl. f1és fd fágok) kapcsán leírták, hogy az adszorpcióhoz, az F-píluson kívül, egy ún. koreceptorra, a TolQRA komplexre van szükség. A bakteriofágok a pílus depolimerizálása által átjutnak a külső membránon, és a periplazmatikus térben a koreceptor TolA komponensének C-terminális részéhez kapcsolódnak, majd a vírus-dns eddig még ismeretlen mechanizmussal transzlokálódik a gazdasejt citoplazmájába (Jacobson, 1972; Click and Webster, 1997; Riechmann and Holliger, 1997). Az interakcióhoz a fág g3p burokfehérjéje szükséges, mely két glicin-gazdag kapcsoló régió által három doménre tagolódik (Armstrong et al., 1981), melyek közül az egyik N-terminális domén (N1) az F- pílushoz, a másik (N2) pedig a TolA fehérjéhez való kapcsolódást biztosítja (Nilsson et al., 2000). Az előzőekkel nagy hasonlóságot mutat a kolera toxint kódoló CTXΦ és a Vibrio cholerae gazdasejt közötti interakció, ahol az ún. TCP (toxin coregulated type IV pilus), valamint az E. coli TolQRA génjeivel erősen homológ gének nélkülözhetetlenek a fágfertőzéshez. Mindez bizonyítja, hogy a pílus-specifikus bakteriofágok gazdasejt penetrációjának mechanizmusa konzerválódott a különböző baktériumfajok esetében (Heilpern and Waldor, 2000).

14 2.4.2. Poliszacharid jellegű fágreceptorok A különféle poliszacharidok a baktériumsejtek felszínének fontos antigénjei, és gyakran bakteriofágok megtapadását is biztosítják. Az egyik legkorábban megismert bakteriofág az állati patogén Streptococcus (Ccsoport) törzsek C 1 fágja, melynek ma már a teljes genom DNS-szekvenciája ismert (Nelson et al., 2003). Nem fogékonyak viszont a C 1 fágfertőzésre a humán patogén Streptococcus (Acsoport) törzsek, valamint az ún. A-variáns Streptococcus csoport képviselői sem. Továbbá, a pronáz, trypszin és chymotripszin kezelt C-streptococcusok érzékenyek maradnak a C 1 fáginfekcióra, ami arra utal, hogy a fág nem protein természetű receptorhoz kötődik (Nelson et al., 2003). Feltehetően, az említett három Streptococcus csoport sejtfelszíni szénhidrátjainak szerkezetében fellelhető különbözőségek okozzák a fággal szemben mutatott eltérő fenotípust. A közös polirhamnóz gerinchez a C-csoportban két N-acetil-galaktózamin (GalNAc), az A-csoportban pedig egy N-acetil-glükózamin (GlcNAc) oldallánc kapcsolódik, míg az A-variáns streptococcusoknál teljesen hiányoznak az oldalláncok (Coligan et al., 1978). Ezek alapján, a GalNAc, monomer vagy dimer formában, fontos eleme a fágreceptornak (Nelson et al., 2003). A ΦYeO3-12 fág a humánpatogén Yersinia enterocolitica O:3 szerotípusra specifikus. A fág receptora a felszíni lipopoliszacharid O-oldallánca (O-antigén), mely egy 6-deoxy-Laltropyranóz egységekből álló homopolimer. Mindezt igazolja, hogy a Y. enterocolitica O:3 szerotípus E. coliban klónozott O-antigénje fággal szembeni érzékenységet okoz, továbbá a spontán fágrezisztens Y. enterocolitica O:3 mutánsok mindegyikében hiányzott az O-antigén (Al-Hendy et al., 1991). A fágfertőzés különleges formái, amikor a fág farkirost fehérjéje mind az adszorpcióban, mind a gazdasejt penetrációjában fontos szerepet játszik, ugyanis, a kapszuláris poliszacharidhoz (K-antigén) történő specifikus tapadás után, a farkirost poliszacharid depolimerizációs aktivitása által enzimatikusan degradálja a K-antigént oligoszacharidjaira. Erre a különféle K-antigénnel rendelkező E. coli törzsek és az ún. kapszula-specifikus fágjaik szolgáltatnak példákat. A K5A bakteriofág gazdája kizárólag a K5 antigént [-4) βglca-(1,4)- αglcnac-(1-] termelő E. coli törzs, ahol a fág KflA (capsular polisaccharide lyase) enzimje által, β-eliminációval hasítja a poliszacharidot (Hänfling et al., 1996). Ezzel ellentétben, a K1E fág farkirostja N-acetil-neuraminidáz (endozialidáz) enzimet tartalmaz, mely csakis a K1 típusú kapszula α-2,8 kötéssel kapcsolt, poli-n-acetil-neuraminsav polimer hasadását katalizálja, következésképp, csak a K1 poliszacharidot termelő E. coli törzsön képes szaporodni (Tomlinson and Taylor, 1985). Az előzőekkel összefüggésben, egyedülálló a K1-5 fág

15 gazdaspecifitása, ugyanis mind a K1, mind a K5 poliszachariddal rendelkező E. coli törzseket képes fertőzni. Ennek oka, hogy a fágnak mindkét előbbi farkirost fehérjéje megvan. Ezek két átfedő ORF-ben kódoltak, melyek közül az első a K5-liáz, a második pedig az endozialidáz enzimfehérje génje, melyek erős homológiát mutatnak a K5 és K1E fágok farkirostot kialakító génjeivel (Scholl et al., 2001). Számos egyéb K-antigént termelő (K3, K7, K12, K13, K20) E. coli tözsre specifikus bakteriofágot leírtak, melyek feltehetően szintén valamilyen poliszacharid-depolimerizációs aktivitással rendelkeznek (Nimmich et al., 1992). Hasonló mechanizmus alapján fertőzi az A7 bakteriofág a Pseudomonas aeruginosa AK1401 sejtjeit. Receptorként itt a felszíni lipopoliszacharid D-rhamnóz összetételű cukoroldallánca szolgál, melyet a fág a termelt rhamnanáz enzimje által hidrolizálni képes, felfedve ezáltal az infekciót elősegítő core-lipidet (Rivera et al., 1992). 2.5. A 16-3 fág mint a legrészletesebben tanulmányozott rhizobium fág A rhizobiumok számos bakteriofágja ismert, melyek közül a legtöbbet a S. meliloti 41 törzs temperált 16-3 fágjáról tudunk. Alakjában és több molekuláris biológiai sajátságában is emlékeztet a λ fágra, és ahhoz hasonlóan, egy speciális transzdukáló fág. Kromoszómája kétszálú, lineáris, 60,8 kb nagyságú DNS-molekula (Dallman et al., 1979). Ismert a fággenom részletes genetikai-fizikai térképe, és több fontos lókusz molekuláris biológiai elemzése is megtörtént. Ilyen például a fő represszor fehérjét kódoló c gén (Dallmann et al., 1987), a helyspecifikus rekombinációban szerepet játszó int és xis gének (Semsey et al., 1999), valamint az immx régió (Csiszovszki et al., 2003). Azonosították a fág és a baktérium kromoszómáján lévő att régiókat, és tanulmányozták a fág integrációjának mechanizmusát. Ennek eredményeként egy vektorcsaládot is kifejlesztettek, mely a fág int génjét és attp régióját hordozza, és segítségével bármely gén célzottan beépíthető a S. meliloti 41 kromoszóma attb helyére (Elo et al., 1998). A szélesebb körben való alkalmazhatóságot elősegítheti a fág fágreceptor kölcsönhatás megismerése, melynek kapcsán egyetlen rendelkezésre álló irodalmi adat egy ún. host range mutáció izolálása és térképezése (Orosz and Sik, 1970).

16 3. A MUNKA ELŐZMÉNYEI A növény inváziójához szükséges bakteriális gének megismerése érdekében számos infekcióban hibás (Inf - ) S. meliloti mutánst jellemeztek már, melyek nem képesek bejutni a növény belsejébe, így a szimbiózis kialakulása a gümőfejlődés korai szakaszában elakad. Ezen mutánsok segítségével sikerült kimutatni, hogy a szimbiózis kialakulásának ebben a fázisában a baktérium különböző poliszacharidjainak fontos szerep jut. Kimutatták, hogy az EPS ill. KPS valamelyikének jelenléte nélkülözhetetlen a funkcionális gümő képződéséhez (Walker, 1992). A S. meliloti AK631 törzs például EPS-t nem termel, mégis képes szimbiózist kialakítani a gazdanövényeivel. Ennek oka az, hogy a törzs által termelt KPS helyettesíteni tudja az exopoliszacharidokat a gümőfejlődés során (Putnoky et al., 1990; Petrovics et al., 1993). Egyre több S. meliloti törzs vizsgálata arra utal, hogy a KPS-nek akár elsődleges szerepe is lehet az infekciós folyamatban. Csoportunkban, többek között, a KPS szimbiózisban betöltött szerepének tanulmányozása folyik. Ebbe a kutatásba kapcsolódtam be én is. Munkánk kezdetekor a KPS gazdaspecifitására vonatkozóan szerettünk volna minél többet megtudni. Arra voltunk kíváncsiak, hogy a KPS esetében létezik-e olyan funkcionális molekularészlet, bioszintézisében bekövetkező utólagos módosítás, melynek hiányában a szimbiózis az infekciós lépésben elakad. Erre kísérletes bizonyíték az EPS esetében már van (Leigh et al., 1985). A kapszuláris poliszacharid szerkezetének gazdaspecifikus vonatkozásait olyan mutáns baktériumtörzsek izolálása révén szerettük volna megismerni, melyek felszínén a KPS kismértékben módosult változatban van jelen. Ezen fenotípust okozó genetikai mutáció(k) helyének pontos behatárolásával a feltételezett gazdaspecifitásért felelős gén(ek) meghatározhatók. 3.1. Spontán mutáns baktérium törzsek izolálása, szelekciós rendszer Elsőként tehát, olyan baktériummutánsokra volt szükség, melyek felszínén a KPS módosult formában van jelen. Ehhez olyan mutánsizolálási eljárást elevenítettünk fel, melynek során a 16-3 bakteriofágot alkalmaztuk szelekciós eszközként. Ebben a munkában többen is részt vettek tanszékünkről, de mivel a jelen dolgozatban szereplő kísérletek alapjául is szolgált, ezért a továbbiak jobb érthetősége érdekében, a mutánsizolálási eljárás elveit az alábbiakban összefoglaltam. Előzetes információk szerint, több Inf - S. meliloti mutáns rezisztenciát mutatott a 16-3 fággal szemben (Putnoky et al., 1988). Az esetek nagy részében, a rezisztenciát a fág adszorpciójának elmaradása okozta. A vizsgált baktériumtörzsek egyike sem termelt

17 exopoliszacharidot. Az Inf + törzsek esetében a növényi invázióra való képességet, nagy valószínűséggel, a sejtfelszíni kapszuláris poliszacharid biztosította, míg egyes Inf - törzsek invázióképtelenségét és feltehetően, a fággal szemben mutatott rezisztenciáját is a KPS hiánya vagy hibája okozta (3.1.táblázat). 3.1. táblázat : S. meliloti törzsek viselkedése a szimbiózisban és a 16-3 fággal szemben Az Inf + S. meliloti törzseket a 16-3 fág képes volt fertőzni, míg az Inf - mutánsok egy része rezisztenciát mutatott a fággal szemben. Mivel a vizsgált törzsek nem termeltek exopoliszacharidot, feltehetően a kapszuláris poliszacharid jelenléte ill. hiánya/hibája okozta az adott fenotípust. S. meliloti törzs szimbiózisban mutatott fenotípus 16-3 fággal szemben mutatott fenotípus KPS a sejtfelszínen vad típus Inf + szenzitív jelen van mutáns Inf - rezisztens nincs jelen vagy módosult Ezek szerint, a poliszacharid bioszintézise és a fágreceptor jelenléte, nagy valószínűséggel, összefügg. Ezen információk alapján feltételezték azt, hogy a KPS-molekula egyúttal receptorként szolgálhat a 16-3 fág számára (Petrovics et al., 1993; Putnoky et al., 1990). Ha a feltevés igaz, a mutánsizolálás a 16-3 fág alkalmazásával is elképzelhető. Ehhez az ún. host range jelenséget használhatjuk ki. A host range (gazdaspecifitási) mutáció a fág baktériumfelszínt felismerő fehérjéjét kódoló gén mutációja révén alakul ki. Ha egy fágra rezisztenssé vált baktérium mutánson lehetséges host range fágmutánst izolálni, akkor a baktérium mutáns felszínén a fágreceptor feltehetően módosult formában, de jelen van. A receptor mutációnak finom szerkezetbeli változást kell okoznia, ami még lehetővé teszi a host range fágmutánsok adszorpcióját. Ahhoz, hogy a felszínen jelen lévő, de módosult szerkezetű fágreceptorral rendelkező baktérium mutánst tudjunk izolálni, az alábbi feltételeknek kell teljesülniük, melyeket az izolálás lépéseinél szem előtt tartottunk: 1) az izolált mutáns fágrezisztens legyen Spontán fágrezisztens mutánsok izolálásához a S. meliloti 41 törzset és a 16-3 bakteriofágot használtuk. A baktérium szuszpenziót nagy titerű (10 9 ) fággal fertőzve tizes nagyságrendű spontán fágrezisztens kolóniát kaptunk lemezenként.

18 2) az izolált spontán fágrezisztens baktérium mutáns ne adszorbeálja a fágot A fágfertőzés, a sejtek szétesése soklépcsős folyamat, mely több ponton megakadhat. A baktérium felszínének megváltozása csak egy azon lehetséges okok közül, amelyek a fágfertőzés elmaradását eredményezik. Az ún. fágkötési tesztet használtuk annak eldöntésére, hogy a fággal szembeni rezisztenciát a fág tapadásának elmaradása okozza-e. A fágkötési tesztben a spontán mutánsok háromféleképpen viselkedtek: 1. Megkötötték, inaktiválták a fágot. Ezek a mutánsok feltehetően a fág reprodukciójához szükséges bakteriális génekben voltak hibásak. 2. Lizáltak. Ezekben a törzsekben a baktériumok lizogéniája okozta a fágrezisztenciát. 3. Nem tudták inaktiválni, megkötni a fágot. Ezen mutánsoknál valószínűleg a baktérium felszíne változott meg úgy, hogy a fág nem tudott hozzákötődni. Ez a mutáns kategória érdekelt bennünket. 3 ) a vad típusú fágot kötni képtelen spontán fágrezisztens baktérium mutánson host range fágmutánst lehessen izolálni A kiválogatott fágot kötni képtelen mutánsokat ezután nagy titerű (10 9 ) fágpopulációval fertőztük. A baktérium mutánsok a fággal szemben kétféleképpen viselkedtek: 1. Teljes rezisztenciát mutattak, azaz fágplakkok egyáltalán nem jelentek meg a lemezeken. Ezeknél a mutánsoknál a fágreceptor, nagy valószínűséggel, eltűnt a felszínről. 2. A mutáns baktériumot a fágpopuláció kis töredéke mégis fertőzni tudta, így megjelentek fágplakkok, azaz host range fágmutánsokat lehetett izolálni rajtuk. Ez esetben jelen kell lennie valamilyen struktúrának a baktérium felszínén, melyhez a fág kötődni képes. Az is bizonyos, hogy ezeknél a mutánsoknál a fágreceptor valamelyest különbözik a vad típusú baktériumtörzsétől, hiszen a vad 16-3 fág nem képes azt felismerni. A fágpopulációban viszont létrejöhetnek olyan spontán mutációk a baktériumfelszínt felismerő farki rost fehérjét kódoló génben, melyek által a fág adaptálódik a megváltozott baktériumfelszínhez. Ezt a kategóriát kerestük. A felvázolt elgondolás alapján sikerült egyetlen megfelelő mutációt találnunk, körülbelül 100 függetlenül izolált fágrezisztens mutáns baktérium átvizsgálása során. Ezt GH4046 törzsnek, míg az általa hordozott mutáns allélt rkp-4046 lókusznak neveztük el, gyanítván, hogy az rkp gének valamelyike sérült ebben a mutánsban. A receptormutánson izolált host range fágmutáns (16-3 h 5 ) pedig lehetőséget biztosít arra, hogy a baktérium bakteriofág felismerési folyamatot a továbbiakban mindkét oldalról vizsgálhassuk.

19 4. CÉLKITŰZÉSEK Munkám kezdetekor tehát, rendelkezésre állt egy olyan baktérium mutáns (GH4046 törzs), mely megváltozott szerkezetű fágreceptorral rendelkezik a S. meliloti 41 vad típusú törzshöz képest. Ennek alapján célul tűztük ki: az izolált mutáció(k) helyének és minőségének pontos meghatározását a mutációt szenvedett gén(ek) funkciójának bizonyítását genetikai komplementációs kísérletek segítségével. A 16-3 fág receptorára vonatkozóan irodalmi adatok nem állnak rendelkezésre. A mutáció(k) helyének pontos behatárolásával a fágreceptor szerkezetét meghatározó gén(ek) azonosíthatók, ami új információkat szolgáltatna a S. meliloti 16-3 fág felismerési folyamat tanulmányozásához. Amennyiben a fágreceptor valóban a kapszuláris poliszacharid, úgy ezzel a módszerrel még ismeretlen bioszintézis gének azonosítására is lehetőség nyílhat. A témakörhöz szorosan kapcsolódó egyéb munkák leírása Pálvölgyi Adrienn diplomadolgozatában (PTE, 2004) megtekinthetők. A GH4046 törzsön izolált host range fág ( 16-3 h 5 ) oldalán elért eredményekről Békási Krisztina, valamint Maász Anita diplomadolgozata (PTE, 2004) számol be.

20 5. ANYAGOK ÉS MÓDSZEREK 5.1. Baktériumok, bakteriofágok, plazmidok Munkám során használt baktérium és bakteriofág törzsek, valamint plazmidok jellemzőit az 5.1. táblázat tartalmazza. 5.1. táblázat: Baktériumok, bakteriofágok, plazmidok ELNEVEZÉS JELLEMZŐK REFERENCIA Sinorhizobium meliloti RM41 S. meliloti 41 vad típusú (Exo +, Nod +, Fix + ) Szende K. AK631 RM41 exob631 (Nod + Fix + ) Kondorosi Á. GH4046 RM41 16-3 fágra rezisztens, spontán mutáns Hoffmann Gy. GH4178 RM41 16-3 fágra rezisztens, spontán mutáns Hoffmann Gy. GH4180 RM41 16-3 fágra rezisztens, spontán mutáns Hoffmann Gy. AT212 AK631 rkpm::tn5(212) Km R Sm R Kiss et al., 2001 Escherichia coli JF1754 met leu his hsr - hsm + J. Friesen PP211 JF1754 (prk2013) Km R Putnoky P. helper plazmid keresztezéshez XLI-blue RecA1 enda1 gyra96 thi-1 hsdr17 supe44 rela1 Bullock et al., 1987 lacz M15 Tc R JM109 F trad36 proa + B + laci q (lacz)m15 / e14 - Yanisch et al., 1985 (McrA - ) (lac-proab) enda1 gyra96 (Nal r ) thi-1 hsdr17(r - k m + k ) glnv44 rela1 reca1 AV4186 AV4187 XL1-blue (pbs::rkpm 4046 KpnI-SalI) Amp R jelen munka AV4188 AV4245 XL1-blue (psem91::rkpm 4046 EcoRV) Km R jelen munka AV4259 XL1-blue (pav4245 Km::Cm(F-778)) Km S Cam R jelen munka Bakteriofágok 16-3 S. meliloti 41 törzsre specifikus fág Orosz L. 16-3 h 5 S. meliloti GH4046 törzsre specifikus Hoffmann Gy. host range mutáns Plazmidok ppp428 rkp-1 régiót hordozó kozmid klón Putnoky et al., 1990 pat330 rkp-2 régiót hordozó kozmid klón Kereszt et al., 1998 pat399 rkp-3 régió bal oldalát tartalmazó kozmid klón pat401 rkp-3 régió jobb oldalát tartalmazó kozmid klón pat399 orf140::tn5(174) pat399 rkpl::tn5(187) pat399 rkpm::tn5(212) Kiss et al., 2001 pat399 rkpn::tn5(107) a jelzett génben mutációt hordoz (6.1. ábra) pat399 rkpo::tn5(168) pat399 rkpp::tn5(105) pat399 rkpq::tn5(124) pbluescript II SK(+) klónozó vektor Amp R Stratagene pbbr1-mcs-3 széles gazdaspecifitású konjugatív plazmid Tc R Kovach et al., 1994 psem91 expressziós vektor Km R Semsey et al., 1999

21 5.2. A baktériumok növesztése A S. meliloti törzseket TA (Orosz et al., 1973) vagy GTS (Kiss et al., 1979) táptalajokon 32 C-on, az E. coli törzseket pedig LB (Sambrook et al., 1989) tápközegben 37 C-on növesztettük. A táptalajok a megfelelő antibiotikumot az 5.2. táblázatban feltűntetett végkoncentrációban tartalmazták. 5.2. táblázat: A tápközegekben alkalmazott antibiotikumok koncentrációi (µg/ml) Antibiotikum Rövidítés E. coli S. meliloti Tetraciklin Tc 15 15 Kanamicin Km 30 200 Kloramfenikol Cam 5 5 Ampicillin Amp 200 5.3. Fágok szaporítása A felszaporítani kívánt fág egy tarfoltját 10 ml TA folyadékba tettük, és 0,2 ml éjszakán át felnövesztett baktériumtörzs hozzáadása után a lombikot 32 C-on, 12-24 órán át rázattuk. A fáglizátumhoz néhány csepp kloroformot adtunk, majd meghatároztuk a fágszámot úgy, hogy 0,1 ml megfelelően hígított fágot, 0,2 ml éjszakán át felnövesztett baktériumot és 4ml TA fedőagart összekeverve TA lemez tetejére rétegeztünk. A lemezeket 12-24 órán át 32 Con történő inkubálás után értékeltük ki. A fáglizátumok általában 10 9 részecskét tartalmaztak milliliterenként. 5.4. A baktériumok keresztezése A keresztezni kívánt baktériumokat és a helper törzset (PP211) felnövesztettük a megfelelő antibiotikumokat tartalmazó komplett táptalajon. A keresztezést 0,9%-os NaCloldatban felszuszpendált baktériumokkal végeztük, TA lemezen összecseppentve őket. 16-24 órás 32 C-on történő inkubálás után a felnőtt baktériumokat felszuszpendáltuk, és a megfelelő szelektív lemezre kentük tömény, illetve (-2) és (-4) hígításokban, majd legalább két lépésben tisztítottunk tovább telepeket. 5.5. Fágérzékenységi teszt A baktériumok fágérzékenységét 16-3 vad típusú, 16-3 h 5 host range mutáns bakteriofágokkal szemben teszteltük. A vizsgálni kívánt baktériumot tartalmazó TA fedőagar felszínére 1 µl, körülbelül 10 6 darab fágot tartalmazó lizátumot cseppentettünk, és 24 órás inkubációs idő után vizsgáltuk, hogy bekövetkezett-e a lízis vagy sem.

22 5.6. Összes DNS izolálás 1,5 ml éjszakán át növesztett baktériumkultúrából a sejteket centrifugálással ülepítettük, és 300 µl TE oldatban (50 mm TrisHCL, 20 mm EDTA, ph 8,0) szuszpendáltuk. 100 µl 5% SDS-t tartalmazó TE oldatot és 100 µl pronáz oldatot (2,5 mg/ml pronáz TE oldatban) adtunk hozzá. 1-3 órás 37 C-os inkubálás után 500 µl fenollal ráztuk össze, majd centrifugálás után a felülúszót újabb Eppendorf csőbe pipettáztuk át. 500 µl fenol:kloroform oldattal (25 térfogat fenol : 24 térfogat kloroform : 1 térfogat izoamil-alkohol) ráztuk össze. Centrifugálás után a felülúszóhoz 500 µl kloroform oldatot (24 térfogat kloroform : 1 térfogat izoamil-alkohol) adtunk, összeráztuk és centrifugáltuk. A vizes fázist 1000 µl etanollal kicsaptuk. A kocsonyás csapadékot új, 500µl 70%-os etanol tartalmú, Eppendorf csőbe tettük át pipettahegy segítségével. Centrifugálás után a felülúszót leöntve, szárítást követően, a DNS csapadékot 100 µl desztillált vízben oldottuk fel (Meade et al., 1982 ). A psem91 plazmid vektorba történő rkpm 4046 inszert beépülésének tesztelésére gyors DNS izolálási technikát alkalmaztunk. A vizsgálni kívánt baktériumot felszuszpendáltuk 100µl steril desztillált vízben, 5 percig 95 C-on, majd 5 percig 0 C-on inkubáltuk. Ezután a mintát 5 percig centrifugáltuk, majd a felülúszót új csőbe pipettáztuk és megfelelően hígítottuk. 5.7. Plazmid DNS izolálás A plazmid DNS-t E. coli esetén 3-3 ml LB tápfolyadékban, S. meliloti esetén pedig TA tápfolyadékban, a megfelelő antibiotikum jelenlétében éjszakán át növesztett sejtekből Ish- Horowicz és Burke (Ish-Horovicz and Burke, 1981) szerint alkalikus lízissel preparáltuk. 1,5 ml kultúrát Eppendorf-csõbe tettünk és a sejteket centrifugálással ülepítettük. A sejteket 100 µl TEG oldatban (25 mm TrisHCL, 10 mm EDTA, 50 mm glükóz ph 8,0) szuszpendáltuk fel. A feltárást óvatos keverés mellett 200 µl NS oldat (0,2N NaOH, 1% SDS) hozzáadásával végeztük. A mintákat 5 percig 0 C-on inkubáltuk, majd erõs rázással 160 µl jéghideg Naacetát oldatot (3M, ph 4,8) adtunk hozzájuk. 5 perces 0 C-os inkubáció után 5 percig centrifugáltuk, és a felülúszóból 400 µl izopropanollal kicsaptuk a plazmid DNS-t. 10 perc -20 Cos inkubáció után a csapadékot lecentrifugáltuk és szárítottuk. A csapadékot 100 µl Trispufferben (50 mm TrisHCL, 100 mm Na-acetát, ph 8,0) oldottuk fel, majd 200 µl etanollal ismét kicsaptuk. 10 perc 0 C-os inkubáció után a csapadékot centrifugáltuk, szárítottuk, majd 30-50 µl RNáz-os desztillált vízben (100 µl/ml RNázA) oldottuk fel. Restrikciós emésztésekhez 1-10 µl-t használtunk fel.

23 A DNS-szekvenáláshoz, valamint a transzpozíciós reakcióhoz szükséges volt a DNSpreparátum további tisztítása. A plazmid DNS izolálálás végén 50 µl RNáz-os desztillált vízben vettük fel a csapadékot, majd 0,1 térfogat 10% SDS és 1 térfogat 7,5 M NH 4 -acetát hozzáadása után 15 percig inkubáltuk jégen. Ezután centrifugáltuk 5 percig, és a felülúszót új csőbe pipettáztuk. Ehhez 0,6 térfogat izopropanolt adtunk és -20 C -ra tettük min. 20 percre. Az inkubálás után etanolos mosás, és szárítás következett. A csapadékot 30-40 µl desztillált vízbe vettük fel. 5.8. Restrikciós emésztés A DNS minták restrikciós emésztését Maniatis és munkatársai szerint végeztük. (Maniatis et al., 1982). Kettős emésztés esetén, az első enzimreakció után a minta DNS tartalmát kicsaptuk 0,1 térfogat 3M Na-acetát (ph 7,0) és 2 térfogat et-oh (96%) hozzáadásával, és min. 20 percig inkubáltuk -20 C-on, majd 5 perc centrifugálás és 70% et-oh mosásszárítás után 30 µl desztillált vízbe vettük fel. Ez után végeztük el a második enzimreakciót. 5.9. Agaróz gélelekroforézis A DNS-fragmentek elválasztására 1%-os agaróz gélt használtunk. Az elválasztásra szánt DNS mintához, az alábbiakban leírt összetételű STOP-oldatot adtunk (5xSTOP-ból a végtérfogat 1/5-ét). A gélelektroforézist minigél esetében 60V-on, fragmentizolálásnál 40Von végeztük. Kontrollként, PstI enzimmel emésztett, λ fág DNS-t alkalmaztunk. 1%-os agaróz gél: 1 g agaróz, 100 ml 1xTBE puffer, 100 µl etidium-bromid (100 µg/ml); 5xSTOP 20 ml-hez: 2 g ficoll, 10 ml 0,5 M EDTA (ph 8,0), 40 mg brómfenolkék (BFB); 5xTBE törzsoldat: 54 g TRIS, 27,5 g bórsav, 20 ml 0,5 M EDTA (ph 8,0) / 1000 ml; 5.10. Fragmentizolálás Restrikciós emésztés, valamint polimeráz láncreakció után a minta DNS-fragmentjeit agaróz gélelektroforézis segítségével választottuk szét. Az izolálni kívánt fragment elé a gélbe Whatman DE 81 papírt tettünk és 20 perces 60V feszültség melletti elektroforézis után az izolálandó fragment a papírra került. A papírt Eppendorf csőbe tettük, és a DNS-t 100 µl 1M NaCl oldattal mostuk le, kétszer egymás után. A DNS kicsapása 20 µl 3M Na-acetát oldattal (ph 7,0) és 120 µl izo-propanollal történt. 20 perces -20 C-os inkubálás után lecentrifugáltuk, szárítottuk és 20 µl desztillált vízben oldottuk fel a csapadékot.

24 5.11. In vitro transzpozonos mutagenezis A psem91 plazmid vektor transzpozonos mutagenezisét a FINNZYMES által kifejlesztett kit (Template Generation System TM II; TGS TM II F702) segítségével végeztük el (Haapa et al., 1999). Célunk a vektoron lévő rezisztencia marker megváltozatatása (Km Cam) volt. Plazmid DNS tisztítás után megmértük a minta DNS-koncentrációját. A reakcióhoz szükséges DNS mennyiséget a target DNS hossza alapján (8,1 kb) a receptben leírtak szerint (40 ng DNS/kb) állapítottuk meg. A kívánt térfogatú DNS mintához 4µl 5x puffert, 1µl Cam (kloramfenikol) rezisztenciagént hordozó entranszpozont, 1 µl MuA transzpozáz enzimet adtunk, majd az elegyet 20 µl-re egészítettük ki desztillált vízzel. A mintát 1 órán át 30 C-on inkubáltuk, ezután 10 percig 75 C-on inaktiváltuk az enzimet, majd transzformáltunk. A transzformánsok közül két párhuzamos lemezen tesztelve válogattuk ki a megfelelő klónokat. Az egyik tápközeg csak Cam antibiotikumot, a másik pedig Cam és Km antibiotikumokat egyaránt tartalmazott. Azokkal a transzformánsokkal dolgoztunk tovább, melyek csak az első táptalajon nőttek, vagyis Cam R Km S fenotípust mutattak. Ezekből plazmid DNS preparátumot készítettünk, majd restrikciós emésztés által győződtünk meg a konstrukció helyességéről, ahol a Cam rezisztencia markert hordozó entranszpozon pontosan a psem91 vektor Km rezisztencia génjébe épült be, inaktiválva azt. 5.12. Ligálási reakció A ligálási elegyet vektor DNS oldat, fragment DNS oldat, desztillált víz és ligáz puffer (5 koncentráció: 200 mm TrisHCL, 50 mm MgCl 2, 50 mm DTT, 2,5 mm ATP, ph 7,8) felhasználásával készítettük. A reakcióhoz T4 DNS ligázt használtunk, és az elegyet legalább 2 óráig szobahőmérsékleten inkubáltuk. 5.13. Kompetens sejt készítés (XL1-blue, JM109) Kompetens sejtek készítéséhez XL1-blue, valamint JM109 E. coli törzset használtunk. 200 ml SOB táptalajban (2% Bacto trypton, 0,5% Yeast extract, 10 mm NaCl, 2,5 mm KCl, ph 7,0) éjszakán át 22 C-on növesztett baktériumkultúrát 10 percre jégre tettünk. A 10 perces centrifugálással (4000 rpm) összegyûjtött sejteket 80 ml hideg TB pufferben (10 mm PIPES, 15 mm CaCl 2, 250 mm KCl, ph 6,7) szuszpendáltuk. 10 percig jégen inkubáltuk, majd centrifugálással összegyûjtöttük a sejteket, és 20 ml jéghideg TB pufferben szuszpendáltuk. A szuszpenzióhoz 1,5 ml DMSO-t adtunk, a sejteket Eppendorf csövekbe szétosztva folyékony nitrogén segítségével fagyasztottuk és transzformációig -80 C-on tároltuk (Inoue et al., 1990).

25 5.14. Transzformálás Egy transzformáláshoz 100-200 µl kompetens sejtet használtunk fel. A sejteket -20 Cról jégre tettük, és 15 perc elteltével hozzáadtuk a transzformációhoz használt DNS-t (5 µl). 30 percig jégen inkubáltuk, majd 3 perces 37 C-os hősokkot alkalmaztunk. A hősokk után 400 µl SOC oldatot (2% Bacto trypton, 0,5% Yeast extract, 10 mm NaCl, 2,5 mm KCl, 20 mm glükóz, ph 7,0) adtunk a sejtekhez. Egy óra 37 C-os inkubáció után a sejteket szelektív táptalajra kentük. pbluescript használata esetén a táptalajba 40 µl IPTG (100 mm) és 40 µl X- gal oldatot (2% dimetil-formamidban) tettünk, és a transzformánsokat kék-fehér teszt segítségével detektáltuk (Inoue et al., 1990). 5.15. Polimeráz láncreakció (PCR) Az rkpm gént magába foglaló, illetve ennek egy részét tartalmazó DNS-szakaszt sokszoroztuk meg polimeráz láncreakció segítségével. A felhasznált oligonukleotidokat a 5.3. táblázat tartalmazza. DNS szekvencia meghatározáshoz az rkpm allélt magába foglaló DNS szakaszt (1625 bp) az RM-15 és RM-13 primerekkel, valamint az alábbiakban részletezett RKP-M program alkalmazásával amplifikáltuk. A klónozáshoz használt rkpm 4046 allél felsokszorozásához ugyanezen primereket, és a valószínűsíthetően jobb hatásfokkal tompa végeket létrehozó Pfu DNS-polimerázt, valamint az RKP-M1 PCR-programot alkalmaztuk. A psem91 plazmid vektorba történő rkpm 4046 inszert beépülésének tesztelésére két belső primert (RM-23, RM-25) használtunk fel, melyekkel 1% agaróz gélen is könnyen detektálható (558 bp) fragmentet kaptunk. Az alábbi PCR-programokat alkalmaztuk: RKP-M RKP-M1 RKP-M2 1. 1 min. 94 C 1. 1 min 95 C 1. 1 min. 94 C 2. 30 sec. 94 o C 2. 1 min 95 C 2. 30 sec. 94 o C 3. 30 sec. 62 o C 3. 30 sec. 62 o C 3. 30 sec. 59 o C 4. 1 min. 72 o C 4. 3 min 72 o C 4. 1 min. 72 o C 5. 34 a második lépésre 5. 34 a második lépésre 5. 34 a második lépésre 6. 30 sec. 20 o C 6. 5 min 72 o C 6. 30 sec. 20 o C 7. End 7. 1 min 20 o C 7. End 8. End

26 5.16. DNS-szekvencia meghatározás Az izolált PCR fragmenteket, DNS-szekvencia meghatározás céljából a MTA Szegedi Biológiai Központ DNS Szekvenáló Laboratóriumába küldtük el. A szekvenálási reakcióhoz felhasznált oligonukleotidok fő jellemzőit a 5.3. táblázat foglalja össze. 5.3. táblázat: A PCR és a szekvenálási reakcióhoz felhasznált oligonukleotidok Oligonukletid neve Nukleotidszekvencia Számított Tm ( o C) RM-15 primer 5 - GCATTAGGCCCGGGGAGAAGC -3 62,4 RM-13 primer 5 - CAGGCCGAAGGAACGGAACCTC -3 62,0 RM-25 primer 5 - CGAGCCAAGGTGGACTTCGTT -3 59,4 RM-23 primer 5 - CAGGCCGGAATAGCTGTCAGG -3 59,5 RM-35 primer 5 - CTGGCTCGGCGATATGATAAG -3 54,9 RM-33 primer 5 - AGCGAAATGCACGAGCACAAC -3 59,0

27 6. EREDMÉNYEK ÉS MEGVITATÁSUK Munkánk kezdetekor rendelkezésre állt egy olyan S. meliloti mutáns baktériumtörzs (GH4046), melynek felszínén, nagy valószínűséggel, módosult a 16-3 fág receptora. Elsőként azt kellett meghatároznunk, hogy mely gén sérült ebben a tözsben, és a mutáció milyen sejtfelszíni változásokat okozott. 6.1. A receptormutáció az rkp-3 régión belül található A mutáns gén azonosításához, első lépésben meg kellett állapítanunk, hogy az rkp-4046 mutáció már ismert, vagy eddig még nem azonosított rkp gént érint-e. Ennek eldöntésére genetikai komplementációs kísérleteket végeztünk. A GH4046 törzsbe, konjugáció segítségével, egyenként bejuttattuk az rkp-1 (ppp428), rkp-2 (pat330), rkp-3 (pat399, pat401) régiókat hordozó kozmid klónokat. A fágérzékenység helyreállását vad típusú 16-3 fággal teszteltük. A 16-3 fág nem tud szaporodni a GH4046 törzsön, komplementáció esetén viszont képes lesz rá, ha a bejutott vad allél expressziójával az eredeti fágreceptor megjelenik a baktérium felszínén. Kontrollként a 16-3 h 5 fágot alkalmaztuk, mely a GH4046 és az RM41 törzset is képes felismerni. Az eredményeket az 6.1. táblázat foglalja össze. 6.1. táblázat: A komplementációs kísérlet eredményeinek összefoglalása A GH4046 törzs a vad típusú 16-3 fágra rezisztens (R), a 16-3 h 5 fággal szemben pedig szenzitív (S). Ez a fenotípus megmaradt az rkp-1 és az rkp-2 régiók, illetve az rkp-3 régió egyik felének bejuttatása után is. Az rkp-3 régió másik részét tartalmazó kozmid klón (pat399) segítségével vissza tudtuk állítani a vad fenotípust, vagyis a 16-3 fággal szembeni érzékenységet. A 16-3 h 5 fág fertőzni képes a mutáns és a vad típusú baktériumtörzset is. a GH4046 törzsbe bejuttatott kozmid transzkonjugáns fenotípus (fágfertőzés) komplementáció 16-3 16-3 h 5 R S ppp428 (rkp-1) R S nincs pat330 (rkp-2) R S nincs pat399 (rkp-3 bal oldala) S S van pat401 (rkp-3 jobb oldala) R S nincs A kísérletben az rkp-1 és rkp-2 régiók bejuttatásával nem tudtuk helyreállítani a vad fenotípust. A teljes rkp-3 régiót két átfedő kozmid klón tartalmazta (6.1. ábra), mivel a régió több, mint 50 kb kiterjedésű. Ezek közül a pat401 nem, míg a pat399 képes volt a vad

28 fenotípus helyreállítására. Tehát, a kísérleti eredmények alapján, az rkp-4046 mutáció az rkp-3 régión belül, annak bal oldali szakaszán található. 6.2. Az rkp-4046 az rkpm gén mutáns allélja Az rkp-3 régióban a gének elhelyezkedése és teljes nukleotidszekvenciája már ismert (Kiss et al., 2001). Az eredmények alapján, a régiót számos a kapszuláris poliszacharidbioszintézisben részt vevő rkp gén alkotja (6.1. ábra). 6.1. ábra: Az rkp-3 régió szerkezete (Kiss et al., 2001) fent: Feltüntettük a pat399 és a pat401 kozmid klónokban található inszertek által lefedett részeket. A régión belül néhány restrikciós enzim hasítóhelyét is jelöltük. lent: A függőleges vonalak Tn5 transzpozonok beépülési helyeit mutatják. A vonalak hossza és eltérő színeik az inszerció hatását jelzik a 16-3 fág fertőzőképességére és a szimbiotikus tulajdonságokra. Nyilakkal az azonosított gének helyét, pirossal a komplementáló régión belül elhelyezkedő géneket, és irányultságukat jelöltük. A továbbiakban azt kerestük, hogy az rkp-3 régió komplementáló részén belül mely gén sérült allélja az rkp-4046. Ennek megállapítására újabb komplementációs kísérleteket végeztünk. Ezúttal olyan kozmid klónokat juttattunk be a GH4046 törzsbe, melyek ismert pozíciójú Tn5 transzpozon inszerciót hordoztak egy-egy érintett rkp génben (6.1.ábra). A komplementáló DNS szakasz eddig azonosított lókuszai az rkpl-q. Az rkp-4046 mutációt ezekben a génekben kerestük. A komplementáció hiányát vagy megtörténtét ismét fágteszt segítségével állapítottuk meg.

29 Ha a bejuttatott kozmid klónban a transzpozon nem ugyanazt a gént érinti, mint a GH4046 törzsben lévő rkp-4046 mutáció, akkor minden bioszintézis gén legalább egy hibátlan kópiája jelen van a sejtben, vagyis komplementáció történik. Ennek eredményeként a vad típusú fágreceptor megjelenik a felszínen, s ezt a 16-3 fág képes felismerni. Mindezt a baktériumpázsit feltisztulása jelzi a fágfertőzési tesztben. Ha viszont a Tn5 mutációt az a gén tartalmazza a kozmid klónban, mely a GH4046 törzsben is sérült, akkor a gén vad típusú allélja hiányában, nem történik komplementáció. Ez esetben a 16-3 fág továbbra sem képes felismerni a bakteriális sejtfelszínt, a fágfertőzési tesztben tarfolt nem keletkezik. A kísérlet eredményeit a 6.2. táblázat foglaja össze. 6.2. táblázat: A komplementációs kísérlet eredményeinek összefoglalása A GH4046 törzs a vad típusú 16-3 fágra rezisztens (R), a 16-3 h 5 fággal szemben pedig szenzitív (S). A vad típusú baktériumot mindkét fág fertőzi. A kísérlet eredményei alapján, csak a pat399rkpm::tn5(212) kozmid nem tudta helyreállítani a vad fenotípust. a GH4046 törzsbe bejuttatott kozmid transzkonjugáns fenotípus (fágfertőzés) komplementáció 16-3 (vad típus) 16-3 h 5 R S pat399 (vad típus) S S van pat399 orf140::tn5 (174) S S van pat399 rkpl::tn5 (187) S S van pat399 rkpm::tn5 (212) R S nincs pat399 rkpn::tn5 (107) S S van pat399 rkpo::tn5 (168) S S van pat399 rkpp::tn5 (105) S S van pat399 rkpq::tn5 (124) S S van Eredményeink szerint, csak a pat399rkpm::tn5(212) klón nem tudta helyreállítani a vad fenotípust, a többi kozmid klón viszont komplementált. Ez azt jelenti, hogy az rkp-4046 mutáció az rkpm génben van, tehát a GH4046 baktériumtörzs az rkpm egy mutáns allélját hordozza. Ezt rkpm 4046 allélnak neveztük el. A komplementációs kísérletek némileg meglepő eredményt hoztak. A régió nukleotidszekvenciájának ismeretében ugyanis valószínűsíthető volt, hogy az érintett rkpl Q gének egy promóterről íródnak át. Ennek alapján várható volt, hogy érvényesül a transzpozon beépülésének poláris hatása, azaz a tőle down-stream elhelyezkedő összes gén átíródásának

30 blokkolása. Ez esetben, ha a transzpozon a bejuttatott kozmidokban a keresett GH4046 törzsben lévő mutáns gén területére, illetve tőle up-stream lévő génekbe esik, akkor nem áll helyre a vad fenotípus. A keresett géntől down-stream lévő inszerció viszont nem befolyásolja annak transzkripcióját, vagyis ekkor a vad típusú allél komplementál. A 6.2. táblázatban összefoglat eredmények mutatják, hogy a Tn5 transzpozon poláris hatása ebben az esetben nem érvényesül. Feltehetően a beépült Tn5 transzpozonon van olyan promóter-szerű szekvencia, mely elegendő az inszerció után elhelyezkedő gének expressziójához, vagy eleve az rkp régió tartalmaz ilyen szekvenciákat. 6.3. A S. meliloti RM41 vad típusú törzs rkpm alléljának DNS-szekvencia meghatározása A csoportunkban időközben kapott eredmények alapján (6.4. fejezet) indokoltnak tűnt meghatározni, hogy az rkpm 4046 allélban pontosan milyen változás történt, ugyanis minden jel arra utalt, hogy egy speciális mutációval állunk szemben. Ehhez szükséges volt a S. meliloti RM41 törzs rkpm alléljának DNS-szekvencia meghatározása, mivel a GH4046 mutáns izolálásakor ezt a vad típust használtuk kiindulásként. A DNS-szekvencia adatbázisokban a S. meliloti AK631 törzsből származó rkp3-régió, illetve a benne foglalt rkpm 631 allél nukleotid szekvenciája található meg (AJ245666 Kiss et al., 2001). Ennek alapján lehetséges volt az rkpm 41 allél felsokszorozásához, illetve szekvenálásához szükséges oligonukleotidok tervezése (6.2. és 6.3. ábrák). 6.2. ábra: A PCR és a szekvenálási reakciókhoz felhasznált oligonukletidok elhelyezkedése A PCR reakcióhoz az Rm-15 és az Rm-13 primereket alkalmaztuk. A DNS-szekvencia meghatározásához az előbbieken kívül szükség volt még négy oligonukleotidra (Rm-25; Rm-35; Rm-23; Rm- 33; pontos szekvenciájukat az 5.3. táblázat tartalmazza).

31 Az RM41 törzs össz-dns preparátumából polimeráz láncreakció (PCR) segítségével a kívánt DNS-szakaszt megsokszoroztuk, majd izoláltuk ezt a fragmentet, agaróz gélelektroforézis alkalmazásával. A PCR-fragment 1625 bázispár hosszúságú, míg a magába foglalt rkpm 41 allél 1161 bázispárnyi. Ezért, az allél DNS-szekvenciájának meghatározásához a PCR-primereken kívül szükség volt még négy oligonukleotid tervezésére, hogy az egymással átfedő leolvasások a nukleotidsorrend biztonságos meghatározását mindkét szálon lehetővé tegyék (6.2. és 6.3. ábrák). Az izolált PCR-fragment DNS-szekvenciáját a tervezett oligonukleotidok segítségével, szubklónozás nélkül, direkt úton határozhattuk meg. A részszekvenciák összeillesztése után megállapítottuk, hogy az rkpm 41 allél egy bázispárban eltér a DNS-szekvencia adatbázisokban megtalálható rkpm 631 allél nukleotidsorrendjétől. A különbség oka, hogy a gén 3 végének közelében lévő TTC triplet helyett az RM41 törzsben GTC található, mely transzlációkor fenilalanin (F 315 ) helyett valin (V 315 ) beépülést okoz a fehérje adott pozíciójába (6.3. ábra). Ez a missense mutáció tekinthető a két törzs közötti polimorfizmusként, hiszen fenotípusukban legalábbis a KPS-termelést tekintve nem különböznek. 6.4. Az RkpM fehérje feltételezett funkciói Csoportunkban időközben megállapították, hogy az általunk vizsgált GH4046 mutáns törzs egyáltalán nem termel kapszuláris poliszacharidot. Ebből a szempontból pontosan úgy viselkedik, mint az előzőleg már jellemzett AT212 rkpm::tn5(212) mutáns. Ez arra utalt, hogy kezdeti feltételezésünkkel ellentétben, a 16-3 fág receptora valószínűleg nem a KPS. Ugyanakkor, nem lehetett teljesen kizárni, hogy a host range fágmutánsok esetében az elsődleges receptorként szolgáló KPS hiányában egy másik sejtfelszíni poliszacharid veheti át annak szerepét. Ha ez igaz, akkor minden rkp mutánson, de legalább az rkpm::tn5(212) mutációt hordozó baktériumon, lehetséges volna host range fágmutánsok izolálása. Ezt több független kísérletben is megpróbáltuk, de minden alkalommal csak a kontrollként alkalmazott GH4046 törzsön kaptunk plakkokat. Tehát közvetett bizonyíték mutatott arra, hogy a fágreceptor nem a KPS és hogy az rkpm 4046 allél egy különleges mutációt hordoz, mely egy megváltozott szerkezetű fágreceptort eredményez. Kézenfekvő volt ezek után a feltételezés, hogy az RkpM maga fágreceptoralkotó fehérje, és az rkpm 4046 allél valószínűleg csak egyetlen aminosavcserét eredményező, ún. missense mutációt tartalmaz. Az rkpm 4046 allél DNS-szekvencia meghatározásáról Pálvölgyi Adrienn diplomadolgozata (Pécs, 2004) számol be. Eredményeink alapján megállapítható, hogy az rkpm 4046 allél egy missense mutációt tartalmaz az rkpm 41 allélhoz képest. Ez a változás szintén a gén 3 ' vé-

32 gének közelében található, ahol a vad típusú allél leucint (L 252 ) meghatározó kodonjának (TTG) egyik bázisa változott meg (TTC), amely már fenilalanint (F 252 ) kódol (6.3. ábra). Ezen eredmények alapján újabb kérdések vetődtek fel, például, hogy csak az RkpM fehérje alkotja-e a fágreceptort, illetve annak mely részei vesznek részt a felismerésben. Hogy közelebb kerüljünk a válaszhoz, tanszékünkön újabb mutánsokat izoláltak, hasonló módszerekkel a már leírtakhoz (3.1. fejezet). Ezek az rkp-4178 és az rkp-4180 mutációkat hordozó törzsek, melyek rkpm alléljának DNS-szekvenciáját a 6.3. fejezetben leírtak alapján szintén meghatároztuk (Pálvölgyi Adriennel végzett közös munka). Kimutattuk, hogy az rkp-4178 mutáció teljesen megegyezik az előzőekben vizsgált rkpm 4046 mutációval. Tehát, egy teljesen független mutánsizolálás és szekvencia meghatározás megerősítette előző eredményeinket. Mindezek alapján az a következtetés vonható le, hogy az RkpM fehérje C-terminális része funkcionálisan fontos szerepet tölt be a fággal való kapcsolat kialakításában. Az rkp-4180 mutáció vizsgálata azonban más eredményt hozott. Itt az rkpm allélban nem találtunk semmilyen eltérést a vad típusú allélhoz képest. Előzetes komplementációs eredmények szerint, a mutáció ez esetben az rkp-3 régió más génjének területére esik, ami arra enged következtetni, hogy az RkpM fehérjén kívül más alkotója is van a fágreceptornak. Feltételezésünket alátámasztja a host range fágok vizsgálata is. A 16-3 h 5 fág esetében a h génben történt missense mutáció lehetővé teszi, hogy az RkpM 4046 fehérjét expresszáló baktériumokon a host range mutáns fág szaporodhasson. Tehát, egy baktériumfehérje egyetlen aminosavának megváltozása következtében megszűnt felismerési folyamatot a fág egy fehérjéjének egyetlen aminosavában bekövetkezett megváltozása helyre tudta állítani. Újabb host range fágok vizsgálatából született eredmények pedig arra utalnak, hogy a fág részéről szintén szükséges legalább egy további komponens, a H fehérjén kívül, a fág megtapadásához (Békási Krisztina, valamint Maász Anita diplomadolgozata, 2004). Az RkpM fehérjén három transzmembrán domén (50-70, 73-93, 123-143 aminosavaknál) prediktálható, melyek által, nagy valószínűséggel, úgy épül be a fehérje a plazmamembránba, hogy 243 aminosavból álló C-terminális része a periplazmatikus tér felé orientálódik. Az azonosított mutáció ez utóbbi fehérjeszakaszra esik. Mindezek alapján elképzelhető, hogy a 16-3 fág receptorfelismeréséért és a fággenom beinjektálásáért egy teljes sejtfelszínt átérő fehérjekomplex felel, mely egy transzportapparátust formál, s ennek egy eleme az RkpM. Hasonló példákat szolgáltatnak az E. coli és több fágja között kialakult felismerési rendszerek (2.4.2. fejezet). Az RkpM fehérje receptoralkotó funkcióján kívül, feltehetően a KPS bioszintézisének, és/vagy a KPS sejtfelszínre történő transzportjának egyik központi eleme, ugyanis az

33 általunk vizsgált rkpm 4046 allélban lévő egyetlen pontmutáció elegendő a KPS-termelés blokkolásához. Ugyanezt a fenotípust mutatja az rkpm nullmutáns (AT212) törzs is. A GH4046 mutánsban viszont az rkpm::tn5(212) inszerciót tartalmazó törzzsel ellentétben a fágreceptor szerkezete alapvetően érintetlen maradt. Érdekes módon, a legtöbb rkp gén mutációja szintén a fágreceptor funkcióvesztését eredményezi (Kiss et al., 2001; Petrovics et al., 1993), mely az rkp-gének transzkripciójának esetleges negatív regulációjára utal. Számítógépes elemzések azt mutatják, hogy az RkpM erős homológiát mutat a DegT/DnrJ/EryC/StrS fehérjecsalád tagjaival. E fehérjék egy részénél a biológiai funkció már bizonyított. Zömmel piridoxál-foszfát igényű aminotranszferáz enzimek, különböző molekuláris funkciókkal. Főként poliszacharidok, antibiotikumok szintézisében vesznek részt, némelyiküknek pleiotropikus regulátor szerepet is tulajdonítanak. A 6.3. táblázat néhány példát sorol fel a fehérjecsalád tagjai közül. 6.3. táblázat: A hipotetikus RkpM fehérje néhány homológja A DegT/DnrJ/EryC1/StrS családba számos fehérjét sorolnak. Az alábbiakban a családba tartozó fehérjék néhány jellegzetes funkcióját és előfordulását neveztük meg. Az RkpM ezekkel az enzimfehérjékkel nagyfokú hasonlóságot mutat. homológ fehérjét termelő szervezet homológ fehérje homológ fehérje szerepe Streptomyces griseus Pseudomonas aeruginosa StrS WbpE aminotranszferáz Helicobacter pylori C poliszacharid szintézis Salmonella typhimurium RfbH lipopoliszacharid szintézis Bacillus stearotermophilus Synechocystis sp. DegT DegT pleiotropikus regulátor Az rkpm részletesebb számítógépes feldolgozása található meg Pálvölgyi Adrienn diplomadolgozatában (Pécs, 2004).

34 6.3. ábra: Az ábrán a DNS-szekvencia adatbázisokban megtalálható rkpm 631 allél nukleotidsorrendje, valamint az általa meghatározott aminosav szekvencia látható. Feltüntettük a GH4046, GH4178 és GH4180 baktériumtörzsek mutáns alléljának megsokszorozásához és DNS-szekvencia meghatározásához, valamint a klónozási kísérletek során alkalmazott oligonukleotidok (Rm-13, Rm-15, Rm-23, Rm-25, Rm-33, Rm-35) elhelyezkedését. A zöld négyzettel jelölt TTC kodon mutatja az rkpm 41 allélban azonosított DNS-szekvencia eltérés helyét, ahol ezen a ponton GTC triplet található, mely fenilalanin (F 315 ) helyett valint (V 315 ) kódol. A piros négyzettel kiemelt TTG kodon a GH4046 és GH4178 törzsekben azonosított mutáció helyét jelöli, ahol ez TTC kodonra változott. A mutáció eredményeként leucin (L 252 ) helyett fenilalanin (F 252 ) épül be a fehérje adott pozíciójába.

35 6.5. Komplementációs kísérletek az RkpM receptoralkotó funkciójának bizonyítására A következő kísérletekben tovább szerettük volna erősíteni a feltevésünket, miszerint az RkpM fehérje a fágreceptor alkotórésze. Ennek bizonyítására komplementációs kísérleteket terveztünk. A vad típusú (rkpm 41 ), illetve a mutáns (rkpm 4046 ) allélokat olyan S. meliloti törzsbe szerettük volna bejuttatni bakteriális konjugáció segítségével, mely Tn5 transzpozon inszerciót tartalmaz az rkpm génben, aminek következtében egyáltalán nem termel kapszuláris poliszacharidot, és feltehetően a 16-3 fág receptora sincs jelen a sejtfelszínen. Ilyen törzs az AT212 rkpm-nullmutáns (rkpm::tn5), amelyet sem a vad típusú 16-3 fág, sem a 16-3 h 5 host range mutáns nem képes fertőzni. Azt reméltük, a komplementációs kísérletek eredményeként helyreáll a fággal való fertőzhetőség, a vad típusú alléllal történő komplementáció esetén mindkét, mutáns allél esetén pedig a 16-3 h 5 bakteriofággal szemben. A vad típusú allél klónozása és ehhez kapcsolódó komplementációs kísérletek Pálvölgyi Adrienn diplomadolgozatában (Pécs, 2004) találhatók meg. 6.5.1. Genetikai komplementáció a pbbr1::rkpm 4046 plazmiddal A komplementációs kísérletek elvégzéséhez szükség volt olyan plazmid vektor származék konstruálására, mely az rkp-3 régióból csak az rkpm gént tartalmazza. Elsőként pbbr1- MCS-3 széles gazdaspecifitású konjugatív vektor KpnI-PstI helyére építettük be az rkpm 4046 allélt. A megfelelő restrikciós enzim hasítóhely létrehozásához, először pbluescript vektorba helyeztük az rkpm 4046 allélt magába foglaló DNS-szakaszt. A klónozás lépéseit a 6.4.ábra mutatja be. A GH4046 törzsből össz-dns preparátumot készítettünk, majd az Rm-13 és Rm-15 primerek alkalmazásával (6.2. és 6.3. ábrák), polimeráz láncreakcióval megsokszoroztuk az rkpm 4046 allélt magába foglaló DNS-szakaszt, és KpnI-SalI restrikciós emésztés után pbluescript plazmid vektoron létrehozott KpnI-SalI helyre ligáltuk, mely által irányított inszertbeépülést tudtunk biztosítani. A rekombináns plazmidszármazékot XL1-blue kompetens sejtbe transzformáltuk. A transzformánsokat Amp antibiotikumot tartalmazó táptalajon növesztve szelektáltuk, majd plazmid DNS preparátumot tisztítottunk a sejtekből, és EcoRI emésztéssel kiválogattuk a megfelelő klónokat, melyekből az inszertet KpnI-PstI fragmentként izoláltuk, és ismét irányítottan építettük be pbbr1-mcs-3 vektor KpnI-PstI helyére, majd transzformáltuk JM109 kompetens sejtbe. A transzformánsokat Tc antibiotikumot tartalmazó táptalajon növesztve, valamint kék-fehér tesztet alkalmazva válogattuk ki. Fehér telepekből plazmid DNS preparátumot készítve, EcoRI emésztéssel ellenőrízve, a megfelelő konstrukciókat ki tudtuk válogatni.

36 6.4. ábra: Az rkpm 4046 allél klónozása pbbr1-mcs-3 konjugatív vektorba Az ábrán a munka egyes lépései láthatók. Az rkpm 4046 allélt PCR segítségével sokszoroztuk, pbluescript II SK(+) vektor KpnI-SalI helyére, majd pbbr1-mcs-3 vektor KpnI-PstI helyére ligáltuk.

37 Miután rendelkezésünkre álltak az rkpm 4046 allélt magába foglaló vektorral rendelkező E. coli sejtek, genetikai komplementációs kísérleteket végeztünk. A transzformáns baktériumot kereszteztük az rkpm::tn5(212) mutánssal, a komplementáció sikerét fágteszttel vizsgáltuk. A kísérletben nem sikerült komplementálni az rkpm::tn5(212) mutáns törzset, azaz nem állt helyre a 16-3 h 5 bakteriofággal szembeni fertőzhetőség. A vad típusú rkpm 41 alléllal történő hasonló kísérlet sem volt eredményes (Pálvölgyi Adrienn diplomadolgozata, 2004). Az rkp3 régió pontos nukleotid-szekvenciájának ismeretében feltételezhető volt, hogy az rkpl-q gének egy policisztronos egységbe tartoznak, és egy promóterről íródnak át. Ezen meggondolásból, az első komplementációs kísérletnél (6.2. fejezet), ahol a GH4046 törzsben lévő mutáció pontos helyét határoztuk meg, azt vártuk, hogy érvényesül a transzpozon beépülésének poláris hatása, de az eredményeink alapján erre semmi sem utalt. Ebből arra következtettünk, hogy vagy a beépült Tn5 transzpozonon van olyan promóter-szerű szekvencia, mely elegendő az inszerció után elhelyezkedő gének expressziójához, vagy eleve az rkp régió tartalmaz ilyen szekvenciákat. Jelen komplementációs kísérlet eredményei arra utalnak, hogy az rkpm gén előtt a klónozott DNS-szakasz nem tartalmaz ilyen promoter jellegű szekvenciát, vagy hatása túl gyenge ahhoz, hogy a transzformánsokkal történő komplementáció során megnyilvánuljon. 6.5.2. Genetikai komplementáció a psem91::rkpm 4046 plazmiddal Az előző kísérlet nem hozta meg a várt eredményt, ezért egy újabb klónozást végeztünk, ahol az rkpm 4046 allélt a psem91 expressziós vektorba építettük be úgy, hogy az inszerttől 5 irányba egy rhizobiumban is jól működő erős promóter régió található. A klónozás lépéseit a 6.5. ábra szemlélteti. Kontrollként az rkpm vad típusú alléllal is elvégeztük a kísérletet (Pálvölgyi Adrienn diplomadolgozata, 2004). Elsőként, az előbbi klónozási kísérlet menetéhez hasonlóan, polimeráz láncreakciót végeztünk a megfelelő DNS-szakasz megsokszorozására, de ebben nem az általánosan használt Taq polimeráz enzimet használtuk, hanem a fragmenten valószínűsíthetően jobb hatásfokkal tompa végeket létrehozó Pfu polimerázt. A PCR-fragment izolálása után, pbluescript vektor EcoRV, tompa végeket adó, klónozóhelyére ligáltuk az inszertet. A transzformálás XL1-blue kompetens sejtekbe történt, kék-fehér teszt alkalmazásával. A fehér telepekből plazmid DNS-t tisztítottunk. Mivel itt nem irányított inszertbevitel történt, meg kellett állapítani, hogy mely klónok tartalmazzák az rkpm 4046 allélt a megfelelő orientációban. Ennek kiderítésére SalI, valamint EcoRI restrikciós emésztéseket végeztünk.

38 A továbbiakban a plazmid DNS-t SmaI enzimmel emésztettük, és fragmentizolálás után, a psem91 vektor EcoRV helyére ligáltuk. Az inszertet tartalmazó plazmidot XL1-blue sejtbe transzformáltuk, és Km antibiotikum alkalmazásával szelektáltuk a transzformánsokat. Az inszertbeépülés ellenőrzésére, a transzformánsokból gyors DNS preparálás után, polimeráz lácreakciót végeztünk két olyan belső primerrel (RM-23, RM-25), melyek az rkpm génből, pozitív reakció esetén, egy 0,5 kilobázisnyi szakaszt sokszoroznak fel. Pozitív kontrollként az előző klónozások során létrehozott pav4186 (pbs::rkpm 4046 ) és a pav4190 (pbs::rkpm) plazmidok szolgáltak. Azokon az izolált plazmidokon, melyeknél a PCR reakció kimutatta az inszert jelenlétét, restrikciós emésztést végeztünk SalI enzim segítségével, hogy a vektoron lévő promóterhez képest az rkpm 4046 allélt helyes orientációban tartalmazó konstrukciókat ki tudjuk válogatni. Két megfelelő klónt sikerült találni, 150 transzformáns átvizsgálása során. Ezeket az E. coli sejteket AV4245/A és AV4245/B törzsként jegyeztük be a törzsgyűjteménybe. A kísérlet során felmerült az a probléma, mely szerint a komplementációban recípiensként alkalmazandó AT212(rkpM::Tn5) törzs szintén Km rezisztencia markerrel rendelkezik, akárcsak a psem91 vektor, és így nem tudnánk kiszelektálni azokat a S.meliloti rkpm::tn5 sejteket, melyekbe a konjugáció során bejutott az rkpm 4046 allélt tartalmazó psem91 plazmid. Ennek elhárítására, a vektor Km rezisztencia génjébe, in vitro transzpozonos mutagenezissel, egy Cam rezisztenciagént hordozó entranszpozont építettünk be, elrontva ezáltal a Km rezisztenciáért felelős gént. Transzformálás után tehát olyan sejteket kerestünk, melyek Cam R Km S fenotípust mutattak. Ezekből plazmid DNS preparátumot készítettünk, majd SalI restrikciós emésztés által győződtünk meg a konstrukció helyességéről, ahol a Cam rezisztencia markert hordozó entranszpozon pontosan a psem91 vektor Km rezisztencia génjébe épült be, inaktiválva azt. A kísérlet során tehát egy olyan E. coli baktériumtörzset (AV4259) hoztunk létre, mely tartalmazta a psem91 expressziós vektorban az rkpm 4046 allélt és Cam rezisztenciát mutatott.

39 6.5. ábra: Az rkpm 4046 allél klónozása psem91 expressziós vektorba Az ábra a klónozási folyamat egyes lépéseit szemlélteti. PCR segítségével megsokszoroztuk az rkpm 4046 allélt, pbluescript II SK(+) vektor EcoRV helyére, majd psem91 vektor szintén EcoRV helyére ligáltuk. In vitro transzpozíciós mutagenezissel, a plazmid Km rezisztencia génjét inaktiváltuk, Cam rezisztenciagént hordozó entranszpozon beépítése által.

40 A klónozás során létrehozott pav4259 plazmidot, bakteriális konjugáció segítségével, bejuttatuk az AT212 (rkpm::tn5), illetve kontrollként az AK631 és GH4046 törzsekbe. Az AK631 törzset mind a 16-3 vad típusú, mind a 16-3 h 5 mutáns bakteriofág képes fertőzni, ezzel szemben a GH4046 törzs csak 16-3 h 5 fággal szemben mutat érzékenységet, míg az AT212 baktérium mutáns midkét fágra rezisztens (6.4. táblázat). A kísérlet során azt vártuk, hogy az AT212 (rkpm::tn5) törzsbe plazmidon bejuttatott rkpm 4046 allél érzékenységet eredményez a 16-3 h 5 fággal szemben. Az eredményeket a 6.4. táblázat foglalja össze. 6.4. táblázat: A komplementációs kísérlet eredményeinek összefoglalása A konjugációban donorként az AV4259 törzset alkalmaztuk. A kísérlet során különböző rkpm alléllal rendelkező S. meliloti törzsbe juttattuk be a psem91::rkpm 4046 plazmidszármazékot, majd cseppteszt segítségével vizsgáltuk a transzkonjugánsok érzékenységét a 16-3 vad típusú, valamint 16-3 h 5 mutáns fágokkal szemben. A (+++) tiszta, a (+) pedig opálos plakkot jelöl. recípiens törzsek recípiens törzsek rkpm allélja plazmidon (pav4259) transzkonjugáns fenotípus (fágfertőzés) bejuttatott allél 16-3 16-3 h 5 AK631 rkpm 631 +++ +++ AK631 rkpm 631 rkpm 4046 + + GH4046 rkpm 4046 +++ GH4046 rkpm 4046 rkpm 4046 + AT212 rkpm::tn5(212) AT212 rkpm::tn5(212) rkpm 4046 A kísérletben az rkpm::tn5 mutációt nem sikerült komplementálni az rkpm 4046 allélt tartalmazó plazmidszármazékkal (pav4259), ahogyan a kontrollként alkalmazott vad típusú rkpm allélt tartalmazó klónnal sem. Ez utóbbi viszont komplementálta a GH4046 törzs rkpm 4046 pontmutációját, azaz a 16-3 fágfertőzési tesztben tarfolt keletkezett (Pálvölgyi Adrienn diplomadolgozata, 2004). Valószínűnek látszik, hogy a két recípiens törzs (GH4046, AT212) rkpm-mutációjának minőségi különbözőségéből adódnak az eredmények közötti eltérések. A Tn5 transzpozon esetleges poláris hatását az előzőekben már fejtegettük (6.2. fejezet), miszerint az rkpm gén átírását nem gátolja a tőle up-stream (rkpl génben) elhelyezkedő transzpozon inszerció. Jelen eredményeink alapján pedig úgy tűnik, hogy az rkpm génbe épült transzpozon kifejti poláris hatását, az utána elhelyezkedő rkpn rkpq gének transzkripciójának elnyomása által, és valószínűleg, ezen géntermékek hiányában, nem áll össze a fágreceptorfunkciót betöltő sejtfelszíni fehérjekomplex. A GH4046 mutáns esetében az RkpM kivételével az összes szükséges géntermék jelen van, a transzkonjugánsoknál pedig a bejuttatott expressziós vektorban átíródik a vad típusú rkpm allél, következésképp, kialakulhat a funkcióképes

41 fágreceptor komplex, és a sejt érzékennyé válik a 16-3 fággal szemben. Ezek alapján valószínű, hogy nem a Tn5 transzpozon, hanem maga az rkp-3 régió tartalmaz promóter-szerű szekvenciákat az rkpm lókusz előtt, mely viszont kívül esik a pbbr1-mcs-3 vektorba klónozott DNS-fragmenten, ezért ott, a megfelelő promóter hiányában, nem expresszálódik az rkpm gén (6.5.1. fejezet). Egy konzerválódott prokarióta promóter prediktálással, az érintett régió legerősebb promótere valóban az rkpm lókusztól 5, és az rkpl génben lévő Tn5 inszerciótól 3 irányba helyezhető el. A feltevés igazolására további kísérletes munkára van szükség. Jelen komplementációs kísérlet egy további kérdést is felvet, ugyanis a plazmidon bejuttatott rkpm 4046 allél mindkét kontroll esetén (AK631, GH4046) szignifikánsan gyengítette a fágfertőzést (opálos plakk), ezzel szemben, az rkpm vad típusú allélnak nem volt ilyen repressziós hatása (Pálvölgyi Adrienn diplomadolgozata, 2004). A jelenség következetesebb körüljárásához további kísérletekre van szükség. A transzkonjugáns baktériumok kapszuláris poliszacharid termelését a jövőben szintén tervezzük megvizsgálni.

42 7. ÖSSZEFOGLALÁS A Rhizobium baktériumok és a pillangósvirágú növények szimbiózisában a baktérium feladata a légköri nitrogéngáz redukálása. A szimbiózis létrejöttéhez szükséges, hogy a növény felismerje a baktériumot. Az azonosításban fontos szerepe van a bakteriális kapszuláris poliszacharidnak (KPS). Munkánk megkezdésekor célunk az volt, hogy olyan baktérium mutánsokat izoláljunk, melyek módosult szerkezetű kapszuláris poliszachariddal rendelkeznek, hogy ezáltal pontosabban megértsük a KPS szerepét a S. meliloti lucerna kapcsolatban. Előzetes adatok alapján, feltételezhető volt, hogy a KPS receptorként szolgál a 16-3 bakteriofág számára. Ennek ismeretében, a 16-3 fágot szelekciós eszközként alkalmazva, olyan baktérium mutánst tudtunk izolálni, melynek felszínéről a fágreceptor nem tűnt el, csak módosult (GH4046 törzs). Komplementációs kísérletekkel kiderítettük, hogy az izolált mutáció a KPS bioszintézisért felelős rkp-3 régióban, ezen belül is az rkpm génben van. Időközben megtudtuk, hogy a vizsgált baktérium mutáns egyáltalán nem termel kapszuláris poliszacharidot. Ebből arra következtettünk, hogy kezdeti feltételezésünkkel ellentétben a fág receptora nem a KPS. Meghatároztuk az rkpm 41 vad típusú allél bázissorrendjét. Kiderült, hogy a DNSszekvencia adatbázisokban fellelhető rkpm 631 alléltól egy bázispárban különbözik, mely egy aminosav eltérést jelent a fehérje elsődleges szerkezetében. Azonosítottuk az rkpm 4046 allél mutációját, mely egy aminosav cserét okozó missense mutáció a fehérje C-terminális részén. A függetlenül izolált GH4178 receptormutáns törzs vizsgálatából kiderült, hogy ugyanazt a mutáns rkpm allélt hordozza, mint az eddigiekben jellemzett GH4046 törzs. Eredményeink a baktérium fág kapcsolat kialakulásának fehérje fehérje kölcsönhatására utalnak, melynek egy eleme az RkpM. Újabb host range baktérium mutáns (GH4180) előzetes jellemzése azt mutatja, hogy nem minden mutáció esik az rkpm gén területére, tehát az RkpM fehérje C-terminális részén kívül még más alkotója is van a fágreceptornak. Az RkpM fehérje fágreceptor alkotó funkciójának bizonyítására genetikai komplementációs kísérleteket végeztünk. Ehhez az rkpm 41 vad típusú és az rkpm 4046 mutáns allélokat tartalmazó plazmid származékokat hoztunk létre, melyeket különböző rkpm alléllal rendelkező S. meliloti törzsekbe juttattunk be bakteriális konjugáció segítségével. A vad típusú rkpm 41 allélt tartalmazó klón komplementálta a GH4046 törzs rkpm 4046 pontmutációját. Ez az eredmény újabb bizonyítékot szolgáltatott az RkpM fehérje szerepére vonatkozóan a 16-3 fágfertőzésben. A komplementációs kísérletekből kapott egyéb eredmények újabb kérdéseket vetnek fel, melyek körüljárásához további kísérletekre van szükség.

43 8. FELHASZNÁLT IRODALOM Al-Hendy, A., Toivanen, P. and Skurnik, M., 1991. Expression cloning of the Yersinia enterocolitica O:3 rfb gene cluster in Escherichia coli K12. Microb Pathog. 10, 47-59. Allen, O. N. and Allen, E. K., 1981. The Leguminosae: A source book of characteristics, uses, and nodulation The University of Wisconsin Press, Madison. Armstrong, J., Perham, R. N. and Walker, J. E., 1981. Domain structure of bacteriophage fd adsorption protein. FEBS Lett. 135, 167-172. Becker, A., Rüberg, S., Kuster, H., Roxlau, A. A., Keller, M., Ivashina, T., Cheng, H., Walker, G. C. and Puhler, A., 1997. The 32-kilobase exp gene cluster of Rhizobium meliloti directing the biosynthesis of galactoglucan: genetic organization and properties of the encoded gene products. J Bacteriol. 179, 1375-1384. Benson, D. R. and Silvester, W. B., 1993. Biology of Frankia strains, actinomycete symbionts of actinorhizal plants. Microbiol Rev. 57, 293-319. Bonhivers, M., Ghazi, A., Boulanger, P. and Letellier, R., 1996. FhuA, a transporter of the Escherichia coli outer membrane, is converted into a channel upon binding of bacteriophage T5. EMBO J. 15, 1850-1856. Bradbeer, C., Woodrow, M. L. and Khalifah, L. I., 1976. Transport of vitamin B12 in Escherichia coli: common receptor system for vitamin B12 and bacteriophage BF23 on the outer membrane of the cell envelope. J Bacteriol. 125, 1032-1039. Braun, V., 1995. Energy-coupled transport and signal transduction through the gram-negative outer membrane via TonB-ExbB-ExbD-dependent receptor proteins. FEMS Microbiol Rev. 16, 295-307. Bremer, E., Middendorf, A., Martinussen, J. and Valentin-Hansen, P., 1990. Analysis of the tsx gene, which encodes a nucleoside-specific channel-forming protein (Tsx) in the outer membrane of Escherichia coli. Gene. 96, 59-65. Bullock, W. O., Fernandez, J. M. and Short, J. M., 1987. Xl1-blue: A High Efficiency Plasmid Transforming RecA Es. Biotechniques. 5, 376-379. Burns, R. C. and Hardy, R. W. F., 1975. Nitrogen fixation in bacteria and higher plants. Springer Verlag, New York. Cadieux, N., Bradbeer, C. and Kadner, R. J., 2000. Sequence changes in the Ton box region of BtuB affect its transport activities and interaction with TonB protein. J Bacteriol. 182, 5954-5961. Cao, T. B. and Saier, M. H., Jr, 2001. Conjugal type IV macromolecular transfer systems of Gramnegative bacteria: organismal distribution, structural constraints and evolutionary conclusions. Microbiology. 147, 3201-3214. Catoira, R., Galera, C., de Billy, F., Penmetsa, R., Journet, E., Maillet, F., Rosenberg, C., Cook, D., Gough, C. and Denarie, J., 2000. Four genes of Medicago truncatula controlling components of a nod factor transduction pathway. Plant Cell. 12, 1647-1666. Charbit, A. and Hofnung, M., 1985. Isolation of different bacteriophages using the LamB protein for adsorption on Escherichia coli K-12. J Virol. 53, 667-671. Charbit, A., Werts, C., Michel, V., Klebba, P. E., Quillardet, P. and Hofnung, M., 1994. A role for residue 151 of LamB in bacteriophage lambda adsorption: possible steric effect of amino acid substitutions. J Bacteriol. 176, 3204-3209. Click, E. M. and Webster, R. E., 1997. Filamentous phage infection : required interactions with the TolA protein. J Bacteriol. 179, 6464-6471. Coligan, J. E., Kindt, T. J. and Krause, R. M., 1978. Structure of the streptococcal groups A, A-variant and C carbohydrates. Immunochemistry. 15, 755-760.

Currier, W. M. and Strobel, G. A., 1974. Chemotaxis of a Rhizobium spp to a glucoprotein produced by birdsfoot trefoil roots. Science. 196, 434-436. Csiszovszki, Z., Buzas, Z., Semsey, S., Ponyi, T., Papp, P. and Orosz, L., 2003. immx immunity region of Rhizobium phage 16-3: Two overlapping cistrons of repressor function. J Bacteriol. 185, 4382-4392. Dallman, G., Orosz, L. and Sain, B., 1979. Restriction mapping of DNA of temperate Rhizobium meliloti phage 16-3 : Comparision of genetic and physical maps indicates a long genetically silent chromosomal arm. MGG. 176, 439-448. Dallmann, G., Papp, P. and Orosz, L., 1987. Related repressor specificity of unrelated phages. Nature. 330, 398-401. Diaz, C. L., Melchers, L. S., Hooykaas, P. J. J., Lugtenberg, B. J. J. and Kijne, J. W., 1989. Root lectin as a determinant of host-plant specificity in the Rhizobium legume symbiosis. Nature. 338, 579-581. Dudley, M. E., Jacobs, T. W. and Long, S. R., 1987. Microscopic studies of cell divisions induced in alfalfa roots by Rhizobium meliloti. Planta. 171, 289-301. Elo, P., Semsey, S., Kereszt, A., Nagy, T., Papp, P. and Orosz, L., 1998. Integrative promoter cloning plasmid vectors for Rhizobium meliloti. FEMS Microbiol Letters. 159, 7-13. Ferguson, G. P., Roop, R. M. and Walker, G. C., 2002. Deficiency of a Sinorhizobium meliloti baca mutant in alfalfa symbiosis correlates with alteration of the cell envelope. J Bacteriol. 184, 5625-5632. Fisher, R. F., Tu, J. K. and Long, S. R., 1985. Conserved nodulation genes in Rhizobium meliloti and Rhizobium trifolii. Appl Environ Microbiol. 49, 1432-1435. Forsberg, L. S. and Reuhs, B. L., 1997. Structural characterization of the K antigens from Rhizobium fredii USDA257: evidence for a common srtuctural motif, with strain-specific variation, in the capsular polysaccharides of Rhizobium spp. J Bacteriol. 179, 5366-5371. Glazebrook, J., Ichige, A. and Walker, G. C., 1993. A Rhizobium meliloti homolog of the Escherichia coli peptide-antibiotic transport protein SbmA is essential for bacteroid development. Genes Dev. 7, 1485-1497. Glazebrook, J. and Walker, G. C., 1989. A novel exopolysaccharide can function in place of the Calcofluor-binding exopolysaccharide in nodulation of alfalfa by Rhizobium meliloti. Cell. 56, 661-672. Grahn, A. M., Haase, J., Lanka, E. and Bamford, D. H., 1997. Assembly of a functional phage PRD1 receptor depends on 11 genes of the IncP plasmid mating pair formation complex. J Bacteriol. 179, 4733-4740. Haapa, S., Suomalainen, S., Eerikäinen, S., Airaksinen, M., Paulin, L. and Savilahti, H., 1999. An efficient DNA sequencing strategy based on the bacteriophage Mu in vitro DNA transposition reaction. Genome Res. 9, 308-315. Hancock, R. W. and Braun, V., 1976. Nature of the energy requirement for the irreversible adsorption of bacteriophages T1 and φ80 to Escherichia coli. J Bacteriol. 125, 409-415. Hänfling, P., Shashkov, A. S., Jann, B. and Jann, K., 1996. Analysis of the enzymatic cleavage (β elimination) of the capsular K5 polisaccharide of Escherichia coli by the K5-specific coliphage: a reexamination. J Bacteriol. 178, 4747-4750. Haselkorn, R., 1978. Heterocysts. Annu Rev Plant Physiol. 29, 319-344. Heilpern, A. J. and Waldor, M. K., 2000. CTXφ infection of Vibrio cholerae requires the tolqra gene products. J Bacteriol. 182, 1739-1747. Inoue, H., Nojima, H. and Okayama, H., 1990. High efficiency transformation of Escherichia coli with plasmids. Gene. 96, 23-28. 44

Ish-Horovicz, D. and Burke, J. F., 1981. Rapid and efficient cosmid cloning. Nucl Acids Res. 9, 2989-2998. Jacobson, A., 1972. Role of F pili in the penetration of bacteriophage f1. J Virol. 10, 835-843. Jordan, D. C., 1981. Current perspectives in Nitrogen Fixation. Aust. Acad. Sci., Canberra. Kannenberg, E. L. and Brewin, N. J., 1994. Host-plant invasion by Rhizobium : the role of cell-surface components. Trends Microbiol. 2, 277-283. Kereszt, A., Kiss, E., Reuhs, B., Carlson, R. W., Kondorosi, A. and Putnoky, P., 1998. Novel rkp gene clusters of Sinorhizobium meliloti involved in capsular polysaccharide production and the invasion of the symbiotic nodule: rkpk gene encodes for a UDP-glucose dehydrogenase. J Bacteriol. 180, 5426-5431. Kiino, D. R. and Rothman-Denes, L. B., 1989. Genetic analysis of bacteriophage N4 adsorption. J Bacteriol. 171, 4595-4602. Kiino, D. R., Singer, M. S. and Rothman-Denes, L. B., 1993. Two overlapping genes encoding membrane proteins required for bacteriophage N4 adsorption. J Bacteriol. 175, 7081-7085. Kiss, E., Kereszt, A., Barta, F., Stephens, S., Reuhs, B., L., Kondorosi, A. and Putnoky, P., 2001. The rkp-3 gene region of Sinorhizobium meliloti Rm41 contains strain-specific genes that determine K antigen structure. Molecular Plant-Microbe Interactions. 14, 1395-1403. Kiss, E., Reuhs, B., Kim, J., Kereszt, A., Petrovics, G., Putnoky, P., Dusha, I., Carlson, R. W. and Kondorosi, A., 1997. The rkpghi and -J genes are involved in capsular polysaccharide production by Rhizobium meliloti. J Bacteriol. 179, 2132-2140. Kiss, G. B., Vincze, E., Kalman, Z., Forrai, T. and Kondorosi, A., 1979. Genetic and biochemical analysis of mutants affected in nitrate reduction in Rhizobium meliloti. J Gen Microbiol. 113, 105-118. Koebnik, R., 1999. Structural and functional roles of the surface-exposed loops of the β-barrel membrane protein OmpA from Escherichia coli. J Bacteriol. 181, 3688-3694. Kondorosi, E., Banfalvi, Z. and Kondorosi, A., 1984. Physical and genetic analysis of a symbiotic region of Rhizobium meliloti: Identification of nodulation genes. MGG. 193, 445-452. Kovach, M. E., Phillips, R. W., Elzer, P. H., Roop, R. M. and Peterson, K. M., 1994. pbbr1mcs: A broad-host-range cloning vector. BioTechniques. 16, 800-802. Lagares, A., Caetano-Anolles, G., Niehaus, K., Lorenzen, J., Ljunggren, H. D., Puhler, A. and Favelukes, G., 1992. A Rhizobium meliloti lipopolysaccharide mutant altered in competitiveness for nodulation in alfalfa. J Bacteriol. 174, 5941-5952. Leigh, J. A., Signer, E. R. and Walker, G. C., 1985. Exopolysaccharide deficient mutants of Rhizobium meliloti that form inefficient nodules. Proc Natl Acad Sci USA. 82, 6231-6235. Leigh, J. A. and Walker, G. C., 1994. Exopolysaccharides of Rhizobium: Synthesis, regulation and symbiotic function. Trends Genet. 10, 63-67. LeVier, K., Phillips, R. W., Grippe, V. K., II, R. M. R. and Walker, G. C., 2000. Similar requirements of a plant symbiont and a mammalian pathogen for prolonged intracellular survival. Science. 287, 2492-2493. Likhacheva, N. A., Samsonov, V. V., Samsonov, V. V. and Sineoky, S. P., 1996. Genetic control of the resistance to phage C1 of Escherichia coli K-12. J Bacteriol. 178, 5309-5315. Lindblad, P. and Bergman, B., 1990. The cycad-cyanobacterial symbiosis. Handbook of symbiotic cyanobacteria. CRC Press, pp. 136-159. Maniatis, T., Fritsch, E. F. and Sambrook, J., 1982. Molecular cloning. A laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press., New York. Meade, H. M., Long, S. K., Ruvkun, G. B., Brown, S. E. and Ausubel, F. M., 1982 Physical and genetic characterization of symbiotic and auxotrophic mutants of Rhizobium meliloti induced by transposon Tn5 mutagenesis. J Bacteriol. 149, 114-122. 45

Mellor, R. and Werner, D., 1987 Peribacteroid membrane biogenesis in mature legume root nodules. Symbiosis. 3, 75-100. Mills, K. K. and Bauer, W. D., 1985. Rhizobium attachment to clover roots. J Cell Sci Suppl. 2, 333-345. Mizoguchi, K., Morita, M., Fischer, C. R., Yoichi, M., Tanji, Y. and Unno, H., 2002. Coevolution of bacteriophage PP01 and Escherichia coli O157:H7 in continuous culture. Appl Environ Microbiol. 69, 170-176. Morona, R., Krämer, C. and Hanning, U., 1985. Bacteriophage receptor area of outer membrane protein OmpA of Escherichia coli K-12. J Bacteriol. 164, 539-543. Mulligan, J. T. and Long, S. R., 1985. Induction of Rhizobium meliloti nodc expression by plant exudate requires nodd. Proc Natl Acad Sci USA. 82, 6609-6613. Müller, P., Hynes, M., Kapp, D., Niehaus, K. and Puhler, A., 1988. Two classes of Rhizobium meliloti inf ection mutants differ in exopolysaccharide production and in coinoculation properties with nodulation mutants. MGG. 211, 17-26. Nelson, D., Schuch, R., Zhu, S. and Tscherne, D. M., 2003. Genomic sequence of C 1, the first streptococcal phage. J Bacteriol. 185, 3325-3332. Newcomb, W., 1981 Nodule morphogenesis and differentiation. In: Giles, K. L. and Atherly, A. G. (Eds.), Biology of the Rhizobiaceae, Academic Press, New York, 13, 247-298. Nilsson, N., Malmborg, A. and Borrebaeck, C. A. K., 2000. The phage infection process: a functional role for the distal linker region of bacteriophage protein 3. J Virol. 74, 4229-4235. Nimmich, W., Krallman-Wenzel, U., Müller, B. and Schmidt, G., 1992. Isolation and characterization of bacteriophages specific for capsular antigens K3, K7, K12 and K13 of E. coli. Int J Med Microbiol Virol Parasitol Infect Dis. 276, 213-220. Nyree, J. W. and David, G. A., 1997. Phenotypic and genotypic comparison of symbiotic and freeliving cyanobacteria from a single field site. Appl Environ Microbiol, 4479-4484. Orosz, L. and Sik, T., 1970. Genetic mapping of rhizobiophage 16-3. Acta Microbiol Acad Sci Hung. 17, 185-194. Orosz, L., Svab, Z., Kondorosi, A. and Sik, T., 1973. Genetic studies on Rhizobio- phage 16-3. Genes and functions on the chromosome. MGG. 125, 341-350. Pellock, B. J., Cheng, H. P. and Walker, G. C., 2000. Alfalfa root nodule invasion efficiency is dependent on Sinorhizobium meliloti polysaccharides. J Bacteriol. 182, 4310-4318. Peters, G. A., Mayne, B. C., Ray, T. B. and Toia, R. E., 1980. Nitrogen Fixation. Medison University Park Press, Baltimore. Petrovics, G., Putnoky, P., Reuhs, B., Kim, J., Thorp, T. A., Noel, K. D., Carlson, R. W. and Kondorosi, A., 1993. The presence of a novel type of surface polysaccharide in Rhizobium meliloti requires a new fatty acid synthase-like gene cluster involved in symbiotic nodule development. Mol Microbiol. 8, 1083-1094. Powell, R. and Gannon, F., 1988. The leghaemoglobins. BioEssays. 9, 117-121. Putnoky, P., Grosskopf, E., Ha, D. T. C., Kiss, G. B. and Kondorosi, A., 1988. Rhizobium fix genes mediate at least two communication steps in symbiotic nodule development. J Cell Biol. 106, 597-607. Putnoky, P., Petrovics, G., Kereszt, A., Grosskopf, E., Ha, D. T. C., Banfalvi, Z. and Kondorosi, A., 1990. Rhizobium meliloti lipopolysaccharide and exopolysaccharide can have the same function in the plant-bacterium interaction. J Bacteriol. 172, 5450-5458. Randall-Hazelbauer, L. and Schwartz, M., 1973. Isolation of the bacteriophage lambda receptor from Escherichia coli. J Bacteriol. 116, 1436-1446. Redmond, J. W., Batley, M., Djordjevic, M. A., Innes, R. W., Kuempell, P. L. and Rolfe, B. G., 1986. Flavons induce expression of nodulation genes in Rhizobium. Nature. 323, 632-635. 46

Reuber, T. L. and Walker, G. C., 1993. The acetyl substituent of succinoglycan is not necessary for alfalfa nodule invasion by Rhizobium meliloti Rm1021. J Bacteriol. 175, 3653-3655. Reuhs, B. L., 1997. Acidic capsular polysaccharides (K antigens) of Rhizobium. Stacey, G. et al. (Eds.), Biology of Plant-Microbe Interactions. International Society for Molecular Plant- Microbe Interactions, St. Paul, pp. 331-336. Reuhs, B. L., Carlson, R. W. and Kim, J. S., 1993. Rhizobium fredii and Rhizobium meliloti produce 3- deoxy-d-manno-2- octulosonic acid-containing polysaccharides that are structurally analogous to group II K antigens (capsular polysaccharides) found in Escherichia coli. J Bacteriol. 175, 3570-3580. Reuhs, B. L., Williams, M. N., Kim, J. S., Carlson, R. W. and Cote, F., 1995. Suppression of the Fixphenotype of Rhizobium meliloti exob mutants by lpsz is correlated to a modified expression of the K polysaccharide. J Bacteriol. 177, 4289-4296. Riechmann, L. and Holliger, P., 1997. The C-terminal domain of TolA is the coreceptor for filamentous phage infection of E. coli. Cell. 90, 351-360. Rivera, M., Chivers, T. R., Lam, J. S. and McGroarty, E. J., 1992. Common antigen lipopolysaccharide from Pseudomonas aeruginosa AK1401 as a receptor for bacteriophage A7. J Bacteriol. 174, 2407-2411. Robertson, J. G. and Lyttleton, P., 1982. Coated and smooth vesicles in the biogenesis of cell walls, plasma membranes, infection threads and peribacteroid membrane in root hairs and nodules of white clover. J Cell Sci. 58, 63-78. Roche, P., Debelle, F., Maillet, F., Lerouge, P., Faucher, C., Truchet, G., Denarie, J. and Prome, J. C., 1991. Molecular basis of symbiotic host specificity in Rhizobium meliloti : nodh and nodpq genes encode the sulfation of lipooligosaccharide signals. Cell. 67, 1131-1134. Rossen, L., Shearman, C. A., Johnston, A. W. B. and Downie, J. A., 1985. The nodd gene of Rhizobium leguminosarum is autoregulatory and in the presence of plant exudate induces the expression of nodabc genes. EMBO J. 4, 3369-3373. Rostas, K., Kondorosi, E., Horvath, B., Simoncsits, A. and Kondorosi, A., 1986 Conservation of extended promoter regions of nodulation genes in Rhizobium. Proc Natl Acad Sci USA. 83, 1757-1761 Sambrook, J., Fritsch, E. F. and Maniatis, T., 1989. Molecular cloning: a laboratory manual - 2nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York. Santos, R., Herouart, D., Puppo, A. and Touati, D., 2000. Critical protective role of bacterial superoxid dismutase in Rhizobium legume symbiosis. Mol Microbiol. 38, 750-759. Schneider, H., Fsihi, H., Kottwitz, B., Mygind, B. and Bremer, E., 1993. Identification of a segment of the Escherichia coli Tsx protein that functions as a bacteriophage receptor area. J Bacteriol. 175, 2809-2817. Scholl, D., Rogers, S., Adhya, S. and Merril, C. R., 2001. Bacteriophage K1-5 encodes two different tail fiber proteins, allowing it to infect and replicate on both K1 and K5 strains of Escherichia coli. J Virol. 75, 2509-2515. Semsey, S., Papp, I., Buzas, Z., Patthy, A., Orosz, L. and Papp, P., 1999. Identification of site-specific recombination genes int and xis of the Rhizobium temperate phage 16-3. J Bacteriol. 181, 4185-4192. Shao, Z., Lin, R. T. and Newman, E. B., 1994. Sequencing and characterization of the sdacb operon in Escherichia coli K-12. Eur J Biochem. 222, 901-907. Simon, E., Hufton, R. J., Ward, R. J., Bunce, N. A. C., Armstrong, J. T., Fletcher, A. J. P. and Glass, R. E., 1995. Structure-function analysis of the vitamin B12 receptor of Escherichia coli by means of informational supression. Mol Microbiol. 15, 381-393. Tomlinson, S. and Taylor, P. W., 1985. Neuraminidase associated with coliphage that specifically depolymerizes the Escherichia coli K1 capsular polisaccharide. J Virol. 55, 374-378. 47

Truchet, G., DebellE, F., Vasse, J., Terzhagi, B., Garnerone, A. M., Rosenberg, C., Batut, J., Maillet, F. and Denarie, J., 1985. Identification of a Rhizobium meliloti 2011 region controlling the host specificity of root hair curling and nodulation. J Bacteriol. 164, 1200-1210. Turgeon, B. G. and Bauer, W. D., 1982. Early events in the infection of soybean by Rhizobium japonicum. Time course and cytology of the initial infection process. Can J Bot. 60, 152-161. Walker, G. C., 1992. Role of exopolysaccharides in nodulation. In: Khush, G. S. and E-Bennett, J. (Eds.), Nodulation and Nitrogen Fixation in Rice. Int Rice Research Inst, Manila, pp. 55-60. Wang, J., Hofnung, M. and Charbit, A., 2000. The C-terminal portion of the tail fiber protein of bacteriophage lambda is responsible for binding to LamB, its receptor at the surface of Escherichia coli K-12. J Bacteriol. 182, 508-512. Wang, J., Michel, V., Hofnung, M. and Charbit, A., 1998. Cloning of the J gene of bacteriophage lambda, expression and solubilization of the J protein: first in vitro studies on the interactions between J and LamB, its cell surface receptor. Res Microbiol. 149, 611-624. Werts, C., Michel, V., Hofnung, M. and Charbit, A., 1994. Adsorption of bacteriophage lambda on the LamB protein of Escherichia coli K-12: point mutations in gene J of lambda responsible for extended host range. J Bacteriol. 176, 941-947. Yanisch-Perron, C., Viera, J. and Messing, J., 1985. Improved M13 phage cloning vectors and host strains : nucleotid sequence of the M13mp18 and puc19 vectors. Gene. 33, 103-119. Yu, S., Ding, H., Seah, J., Wu, K., Chang, Y., Chang, K. S., Tam, M. F. and Syu, W., 1998. Characterisation of a phage specific to hemorrhagic Escherichia coli O157:H7 and disclosure of variations in host outer membrane protein OmpC. J Biomed Sci. 5, 370-382. Yu, S., Ko, K., Chen, C., Chang, Y., and Syu, W., 2000. Characterization of the distal tail fiber locus and determination of the receptor for phage AR1, which specifically infects Escherichia coli O157:H7. J Bacteriol. 182, 5962-5968. Zimmerman, W. J. and Bergman, B., 1990. The Gunnera symbiosis: DNA restriction fragment length polymorphism and protein comparison of Nostoc symbionts. Microb Ecol. 19, 291-302. 48

49 9. RÖVIDÍTÉSEK Amp Cam DNS DTT EDTA EPS kb Km KPS LPS PCR SDS Tc Tris ampicillin kloramfenikol dezoxi-ribonukleinsav dithiotreitol etilén-diamino-tetra-acetát exopoliszacharid kilobázispár kanamicin kapszuláris poliszacharid lipopoliszacharid polimeráz láncreakció nátrium-lauril-szulfát tetraciklin tris-(hidroxi-metil)-amino-metán

50 KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS Diplomamunkám alapjául szolgáló kísérleteket a Pécsi Tudományegyetem Biológiai Intézetének Genetikai és Molekuláris Biológiai Tanszékén végeztem el. Köszönöm a tanszék összes munkatársának, hogy a kísérletes munka szellemi és anyagi hátterét biztosították számomra. Különös köszönettel tartozom témavezetőmnek, Dr. Putnoky Péternek munkám irányításáért, tanácsaiért és bírálataiért, odaadó segítőkészségéért. Hálás vagyok Dr. Hoffmann Gyulának tanácsaiért, biztatásaiért és kísérleteim alapjául szolgáló mutánsok izolálásában végzett értékes munkájáért. Köszönöm Pálvölgyi Adriennek, akivel közös témánkon együtt dolgoztam, kitartását, ötleteit, a kísérletes munkához való jó hozzáállását.