1 DIPLOMAMUNKA A 16-3 bakteriofág receptorának elemzése DEÁK VERONIKA biológus hallgató Témavezető: DR. PUTNOKY PÉTER Pécsi Tudományegyetem Biológiai Intézet Genetikai és Molekuláris Biológiai Tanszék Pécs, 2004.
2 TARTALOMJEGYZÉK 1. BEVEZETÉS 3 2. IRODALMI ÁTTEKINTÉS 4 2.1. Nitrogénfixáló organizmusok 4 2.2. A rhizobiumok endoszimbiózisának kialakulása 5 2.3. A S. meliloti sejtfelszíni poliszacharidjai és szimbiózisban betöltött szerepük 7 2.3.1. Exopoliszacharidok 7 2.3.2. Kapszuláris poliszacharidok 8 2.3.3. Lipopoliszacharidok 9 2.4. Bakteriofág receptorok típusai 10 2.4.1. Fehérjetermészetű fágreceptorok 10 2.4.2. Poliszacharid jellegű fágreceptorok 14 2.5. A 16-3 fág mint a legrészletesebben tanulmányozott rhizobium fág 15 3. A MUNKA ELŐZMÉNYEI 16 3.1. Spontán mutáns baktérium törzsek izolálása, szelekciós rendszer 16 4. CÉLKITŰZÉSEK 19 5. ANYAGOK ÉS MÓDSZEREK 20 5.1. Baktériumok, bakteriofágok, plazmidok 20 5.2. A baktériumok növesztése 21 5.3. Fágok szaporítása 21 5.4. A baktériumok keresztezése 21 5.5. Fágérzékenységi teszt 21 5.6. Összes DNS izolálás 22 5.7. Plazmid DNS izolálás 22 5.8. Restrikciós emésztés 23 5.9. Agaróz gélelekroforézis 23 5.10. Fragmentizolálás 23 5.11. In vitro transzpozonos mutagenezis 24 5.12. Ligálási reakció 24 5.13. Kompetens sejt készítés 24 5.14. Transzformálás 25 5.15. Polimeráz láncreakció (PCR) 25 5.16. DNS-szekvencia meghatározás 26 6. EREDMÉNYEK ÉS MEGVITATÁSUK 27 6.1. A receptormutáció az rkp-3 régión belül található 27 6.2. Az rkp-4046 az rkpm gén mutáns allélja 28 6.3. A S. meliloti 41 vad típusú törzs rkpm alléljának DNS-szekvencia meghatározása 30 6.4. Az RkpM fehérje feltételezett funkciói 31 6.5. Komplementációs kísérletek az RkpM receptoralkotó funkciójának bizonyítására 35 6.5.1. Genetikai komplementáció a pbbr::rkpm 4046 plazmiddal 35 6.5.2. Genetikai komplementáció a psem91::rkpm 4046 plazmiddal 37 7. ÖSSZEFOGLALÁS 42 8. FELHASZNÁLT IRODALOM 43 9. RÖVIDÍTÉSEK 49
3 1. BEVEZETÉS Az élőlények nagy mennyiségű nitrogént igényelnek szervezetük felépítéséhez és életfolyamataikhoz. A növények számára általában csak a talajban oldott, szervetlen ionok (NO 3, - NH + 4 ) formájában előforduló nitrogénforrás hasznosítható, ami viszont nem mindig áll rendelkezésre kellő mennyiségben. A talaj természetes nitrátutánpótlása többféle módon történhet. A lebontó szervezetek a szerves molekulákban kötött nitrogént elsősorban ammónia formájában szabadítják fel (ammonifikáció), mely a nitrifikáló organizmusok tevékenysége folytán nitrit illetve nitrát formába kerül (nitrifikáció). A légkör 78%-át kitevő nirogéngáz kis részben kémiai úton (például villámlás), nagyobb arányban pedig ( kb. 72%) biológiai úton redukálódik (Burns and Hardy, 1975). Biológiai nitrogénkötésre csupán egyes prokarióta szervezetek képesek. A diazotróf organizmusok leghatékonyabb formáját az endoszimbiózisban élő nitrogénfixálók képviselik, mint például a Rhizobiaceae családba tartozó talajbaktériumok, melyek gazdanövényei kizárólag a pillangósvirágúak (Fabaceae) családból kerülnek ki (Allen and Allen, 1981). A rhizobiumok (Rhizobium, Azorhizobium, Bradyrhizobium, Mezorhizobium, Sinorhizobium nemzetségekbe tartozó fajok) a biológiailag megkötött nitrogén háromnegyed részét állítják elő évente. Nagy előnyt élveznek tehát azok a növények, melyek ilyen módon képesek egy állandó nitrogénforráshoz jutni, hiszen fejlődésüket ezáltal függetleníteni tudják a talaj szabad nitrogéntartalmától. E bonyolult, több kommunikációs lépésen alapuló együttélés tanulmányozása nemcsak az alapkutatás számára fontos, hanem ökológiai és gazdasági vonatkozásai is vannak, hiszen rendkívüli jelentőségű lenne, ha háttérbe szorulna a környezetterhelő és költséges műtrágyázás.
4 2. IRODALMI ÁTTEKINTÉS 2.1. Nitrogénfixáló organizmusok A légköri nitrogéngáz hasznosítására képes szervezeteket csak a prokarióták körében találunk. Szabadonélő nitrogénkötők előfordulnak a Klebsiella, Clostridium, Azotobacter, Azomonas nemzetségekben, továbbá a kemotróf baktériumok (Thiobacillus ferrooxidans), illetve a fototróf cyano- (Nostoc, Oscillatoria, Plectonema) és bíborbaktériumok (Rhodospirillum rubrum) között. Sok fonalas cyanobaktériumban a nitrogénfixálás speciális sejtekben, a heterocisztákban megy végbe (Haselkorn, 1978). A fonalak sejtjeinek egy része akkor alakul át cisztává, amikor nitrát és ammónia nem áll rendelkezésre. Léteznek olyan nitrogénfixáló prokarióták, melyek már kapcsolatot alakítanak ki növényekkel, ez az együttélés azonban nem szoros. Az Asospirillum talajbaktériumok például a pázsitfűfélék rhizoszférájában dúsúlnak fel, egy laza asszociációt képezve, ahol a partnerek között metabolitcsere zajlik (Jordan, 1981). Az Anabaena cyanobaktérium az Azolla vízipáfrány levelében található heterocisztákban él extracellulárisan (Peters et al., 1980). A szimbiotikus diazotrófok között szép számban fordulnak elő cyanobaktériumok, melyek a legkülönbözőbb növénycsoportok képviselőivel élhetneknek nitrogénfixáló szimbiotikus kapcsolatban, mint például Blasia mohákkal a Chlorogloeopsis sp. (Nyree and David, 1997), a zárvatermők közül Gunnera fajokkal a Nostoc sp. számos képviselője (Zimmerman and Bergman, 1990). A nyitvatermők közül több Cycas faj, a gombák közül pedig a Lichens sp. egyes fajai rendelkeznek Cyanophyta szimbionta partnerrel (Lindblad and Bergman, 1990). Jelentősek a Gram-pozitív Actinomyceták csoportjába sorolható Frankia sp. fajai, mivel egy sor zárvatermő növénnyel (Alnus, Eleagnus, Hyppophae, Myrica stb.) képesek szimbiotikus nitrogénfixálásra (Benson and Silvester, 1993). A Rhizobiaceae családba tartozó talajbaktériumok jellegzetessége, hogy szabadon élő formában nem képesek nitrogénkötésre, csakis a gazdanövénnyel kialakuló szoros együttélésben, az ún. endoszimbiózisban. A rhizobiumok kizárólag a pillangósvirágú (Fabaceae) növényekkel hoznak létre szimbiózist, mely mindkét fél számára kölcsönösen hasznos együttélést jelent (Allen and Allen, 1981). A baktérium és növény közti kapcsolat igen specifikus. A Sinorhizobium meliloti (régebbi nevén Rhizobium meliloti), melyen vizsgálatainkat végezzük, a lucerna (Medicago), a lepkeszeg (Trigonella) és a somkóró (Melilotus) fajok szimbiotikus partnere.
5 2.2. A rhizobiumok endoszimbiózisának kialakulása A rhizobiumok szimbiotikus nitrogénfixálása egy specifikus, csakis erre a funkcióra hivatott, újonnan kialakuló növényi szervben, a gyökérgümőben zajlik, melynek feladata a nitrogén redukálása, és annak bekapcsolása a növényi anyagcserébe. Ez az együttélés egy bonyolult fejlődési program eredménye, melyben a baktérium és a gazdanövény kölcsönösen befolyásolják egymás életfolyamatait. Ennek hátterében összetett génexpressziós mintázatok állnak, amelyek összehangolásához elengedhetetlen a két partner közötti folyamatos szignálcsere. A szimbiózis kialakulásának primer inducerei a növényi másodlagos anyagcseretermékekhez sorolható különféle flavonoid és izoflavonoid típusú vegyületek, melyeket a növény a gyökereken keresztül a talajba szekretál (Redmond et al., 1986). Ez pozitív kemotaxist vált ki (Currier and Strobel, 1974), minek hatására a baktériumsejtek feldúsulnak a növény rhizoszférájában. A növényi jel felfogásáért a bakteriális NodD fehérje felelős (Mulligan and Long, 1985; Rossen et al., 1985), mely a nodulációs (nod) gének általános transzkripciós aktivátora. Konzerválódott DNS szekvencia részekhez, az ún. nod-boxokhoz kapcsolódva biztosítja a gének szabályozott expresszióját (Rostas et al., 1986 ), aminek eredményeként a baktérium a növény felé kiválaszt egy diffúzibilis szignált, a Nod faktort, mely kémiai természetére nézve egy lipo-kitooligoszacharid molekula (Roche et al., 1991). Az alapváz a legtöbb rhizobium fajban azonos felépítésű, szintéziséért az ún. közös nod gének (nodabc) felelősek, melyek erősen konzerválódtak (Fisher et al., 1985). A gazdaspecifitásért az alapvázat módosító eltérő szubsztitúciós mintázatok felelősek, melyek kialakításában egy sor további az egyes fajokban eltérő nod gén vesz részt (Kondorosi et al., 1984; Truchet et al., 1985). A Nod faktor a gazdanövényben indukál egy szignáltranszdukciós útvonalat, mely döntő jelentőségű a szimbiotikus gümő fejlődésében (Catoira et al., 2000). Hatására a gyökér belső kéregsejtjei között dedifferenciáció és mitózisok során egy új osztódószövet alakul ki, a gümőmerisztéma (Dudley et al., 1987), mely a szimbiotikus gümő szövetét hozza létre. A nod génekben mutáns baktériumok nem képesek a gümőképződés elindítására (Nod fenotípus). A baktériumok a gyökérszőrökön keresztül hatolnak be a gümő belsejébe. A gyökérszőrökhöz való tapadás a sikeres infekció egyik előfeltétele (Mills and Bauer, 1985). Ebben a lépésben a különféle bakteriális poliszacharidok játszanak szerepet (2.3.fejezet), amelyek a növényi szénhidrátkötő és felismerő glikoproteinhez, a lektinhez kapcsolódnak specifikusan (Diaz et al., 1989). A fertőzési pont környezetében a gyökérszőrsejtek deformálódása, jellegzetes pásztorbotszerű meggörbülése figyelhető meg, mely a Nod faktor által indukált, egyen-
6 lőtlen sejtfalnövekedés következménye (Dudley et al., 1987). Végül, a gyökérszőr körülnövi a baktériumot, így az bekerül a növény belsejébe (Turgeon and Bauer, 1982). Mindezek után, a baktériumoknak át kell hatolniuk a több sejtrétegnyi külső kéregzónán, hogy eljuthassanak az újonnan differenciálódó gümősejtekig. Ezt a folyamatot a növény sejtjei az ún. infekciós fonal kialakításával segítik, mely a lebomlott régi sejtfal anyagaiból felépülő, cső alakú belső struktúra (Robertson and Lyttleton, 1982). Az infekciós fonal fokozatosan növekszik a belső kéreg irányába, majd a gümősejtek zónájában többszörösen elágazódik. A baktériumok ennek a különleges, fonálszerű képletnek a belsejében haladnak a nitrogénkötés színhelye felé. A szimbiózis kialakulásának ebben a stádiumában döntő jelentőségűek a baktérium különféle felszíni poliszacharidjai (infekciós fonal képzés, a növény saját védekező mechanizmusainak gátlása), illetve a növényi környezet okozta stresszek kivédésében szerepet játszó mechanizmusok (Pellock et al., 2000; Santos et al., 2000). Az infekcióban hibás (Inf ) baktérium mutánsok el tudják indítani a gümőfejlődést, de nem képesek bejutni a belsejébe, üres gümők keletkeznek. Az invazív baktériumok az infekciós fonal végénél a gümősejtek cytoplazma membránjához kötődnek, majd a növényi sejt endocytózis útján felveszi a baktériumsejteket (Mellor and Werner, 1987). Ennek megfelelően, a gümősejtekbe került baktériumok membránnal (peribakteroid membrán) határoltak, fiziológiailag és morfológiailag megváltoznak, ún. bakteroiddá differenciálódnak. A bakteroid forma mozgásképtelen, alakja és membránösszetétele megváltozik, mérete többszöröse a szabadon élő sejteknek. Az endocytózis és a bakteroid-differenciáció genetikai szabályozottsága még kevésbé tisztázott, a BacA fehérje kivételével, mely egy belső membránprotein, és valószínűleg befolyásolja a sejtfelszín összetételét. A S. meliloti baca mutánsok bejutnak ugyan az infekciós fonal belsejébe, de hamar elöregednek, még bakteroiddá differenciálódásuk előtt, valószínűleg azért, mert fokozottan érzékenyek a stresszekre (Ferguson et al., 2002; Glazebrook et al., 1993). A bakteroiddá való differenciálódás után aktiválódnak a nitrogénkötésben, valamint a bakteroid metabolizmusban fontos gének. E késői szimbiotikus gének nagy részének expresszióját elsősorban a csökkent oxigéntenzió, másodsorban pedig a kötött nitrogén koncentrációja szabályozza. A nitrogenáz enzimkomplex (Fe-Mo protein) savlabilis ként tartalmaz, ezért erősen oxigénérzékeny. A nitrogénfixáláshoz nélkülözhetetlen mikroaerob körülményeket elsősorban a növényi gümőspecifikus fehérje, a leghemoglobin biztosítja (Powell and Gannon, 1988). A bakteroid növény szimbiózisban a kölcsönös előnyöket elsősorban a partnerek egymás számára szolgáltatott anyagcseretermékeik jelentik. A bakteroidok és a növény között szállítónyalábokon keresztül áramlanak a különböző produktumok (Newcomb, 1981). A nitrogenáz működése során képződött ammónia, a növény citoplazmájába jutva,
7 glutaminsavba épül, majd transzaminálás útján egyéb szerves vegyületbe. A ilyen formában kötött nitrogén a szállítónyalábokon keresztül eljut a növény többi részébe. A növény fotoszintetizáló szöveteiből pedig különböző fotoszintátok érkeznek a gümőbe, és a peribakteroid membránon keresztül a bakteroidba transzportálódnak. 2.3. A S. meliloti sejtfelszíni poliszacharidjai és szimbiózisban betöltött szerepük A rhizobiumok különféle sejtfelszíni poliszacharidjai a szimbiózis kialakulásának több lépésében is kulcsfontosságúak, mint például a növény inváziójában, az infekciós fonal növekedésében, továbbá megvédik a baktériumokat a környezeti ártalmakkal szemben. Már régóta ismert, hogy a patogén baktériumok sejtfelszíni poliszacharidjai a patogenitást nagymértékben befolyásolják, erős antigén tulajdonságukból adódóan pedig a baktériumok szerotípusait határozhatják meg. A S. meliloti sejtfelszíni szénhidrátjai az exopoliszacharidok, kapszuláris poliszacharidok és lipopoliszacharidok (Kannenberg and Brewin, 1994). 2.3.1. Exopoliszacharidok A S. meliloti egy EPSI nevű szukcinoglükán heteropoliszacharidot választ ki a környezetébe, mely hét glükóz és egy galaktóz molekulát tartalmazó oktoszacharid alegységekből épül fel (Reuber and Walker, 1993). Az alegységeken szukcinil, acetil és piruvil módosításokat tartalmaz, melyek savas jelleget kölcsönöznek a molekulának. A heteropoliszacharidok szintézise négy lépésre osztható, melyek az exo gének által szabályozottak. Először UDPglükóz és UDP-galaktóz szintézis történik (pl. exob,c,n), majd, második lépésként, az ismétlődő oktoszacharid alegység szintézise a nukleotid-cukrokból, egy sejtmembránba ágyazott lipidhordozó felszínén (exof,j,a,l,m,n,o,u). Következő lépésben az alegységek módosítása (szukcinil exoh, acetil exoz, piruvil exov), végül az oktoszacharid alegységek polimerizációja, és a sejtfelszínre való transzfere (exop,t,q) történik (Leigh and Walker, 1994). Sok S. meliloti törzs azért nem képes a növény inváziójára, mert az exopoliszacharid termelésében hibás. Ilyenkor az infekciós fonalak idő előtti abortálódása, és a gümő normális fejlődésének elmaradása tapasztalható (Müller et al., 1988). Ismeretes egy másik típusú, a S. meliloti 1021 törzsben azonosított, EPSII néven leírt exopoliszacharid, mely glükóz és galaktóz tartalmú diszacharid egységekből felépülő galaktoglükán (Glazebrook and Walker, 1989). Az EPSII bioszintéziséért az exp gének felelősek (Becker et al., 1997).
8 2.3.2. Kapszuláris poliszacharidok Vannak olyan rhizobiumok, mint például a S. meliloti 41 törzs exob mutánsa, melyek nem termelnek exopoliszacharidot, mégis szimbiózist tudnak létrehozni bármely gazdanövényükkel. Ennek oka az, hogy ezek a baktériumok olyan rhizobiális kapszuláris poliszacharidot (KPS) termelnek, mely helyettesíteni tudja az exopoliszacharidokat a gümőfejlődés során (Putnoky et al., 1990; Petrovics et al., 1993). Ezek a poliszacharidok szorosan kapcsolódnak a baktérium felszínéhez, és erős immunológiai sajátságuknak köszönhetően K-antigéneknek is nevezik őket. Széleskörben elterjedtek a legkülönbözőbb humán- és növénypatogén baktériumfajok körében. Rhizobiumokban elsőként a R. fredii USDA205, és a S. meliloti 41 törzsekben mutatták ki a kapszuláris poliszacharid jelenlétét, és a további elemzésekből kiderült, hogy adott rhizobium faj különböző törzsei eltérő szerkezetű molekulaváltozatokat termelnek (Reuhs, 1997). A különféle K-antigének felépítésében általános elemek a hexóz és 1-karboxy-2-keto-3- deoxy cukrokból álló ismétlődő egységek, vagy a 3-deoxy-D-manno-2-oktulozonsav (Kdo). A specifitásért a kapcsolódó oldalláncok eltérő mintázata, térszerkezetbeli, valamint molekulaméretbeli különbözőségek felelősek (Forsberg and Reuhs, 1997). A S. meliloti 41 törzs K R 5 antigén néven ismert kapszuláris poliszacharidot termel, mely szerkezetében az E. coli, patogenitásban fontos, II-es típusú K-antigénjeivel analóg (Reuhs et al., 1993). A K R 5 antigén diszacharid alegységei egy glükuronsavból és egy 5,7-diamino- 3,5,7,9-tetradeoxi nonulozonsavból (pszeudaminsav, Pse) állnak, melyen 7-N-acetil és 5-N-βhidroxibutiril módosítások találhatók (Reuhs, 1997). Az elmúlt években 3 régiót azonosítottak, melyek a K R 5 antigén bioszintéziséért felelősek (rkp-1, rkp-2, rkp-3 régiók). Az rkp-1 régióban 10 gén található (rkpa-j), (Putnoky et al., 1990; Kiss et al., 1997; Petrovics et al., 1993). A gének nagy része olyan fehérjéket kódol, melyek hasonlóak a különbözö zsírsavszintézisben, valamint lipidmolekulák módosításában részt vevő génekkel (Reuhs et al., 1993). Ez a génrégió a KPS szintézishez szükséges lipidhordozó előállítását kódolja. Ha bármelyik említett génben mutáció történik, akkor a KPS nem jelenik meg a baktérium felszínén. Az rkp-1 régióban nincsenek olyan gének, melyeknek a cukoralegységek bioszintézisében vagy a KPS polimerizációjában lenne szerepe. Az rkp-2 régióban két gént azonosítottak. Az lpsl által kódolt fehérje egy UDPglükuronsav epimeráz, mely a lipopoliszacharid bioszintézisében fontos. A másik, az rkpk gén egy UDP-glükóz dehidrogenáz enzimet kódol, amely katalizálja az UDP-glükóz UDPglükuronsavvá oxidálását. Ez utóbbi molekula alapvegyület az LPS és a KPS szerkezetében is (Kereszt et al., 1998).
9 Az rkp-3 régióban 10 gént (rkpl-z) azonosítottak (Kiss et al., 2001), melyek pontos funkciója még nem ismert. Az rkp-1 és rkp-2 régió általánosan előfordul a Sinorhizobium genusban, ezzel szemben az rkp-3 régió csak a S. meliloti 41 törzsben található meg. Az itt fellelhető gének feltehetően a K R 5 antigén bioszintézisért, és a sejtfelszínre való exportálásáért felelősek. Vannak közöttük olyan gének, melyek homológiát mutatnak különféle transzferáz enzimet kódoló génekkel (például: rkpm, rkpo, rkpp), transzporter fehérjéket kódoló génekkel (például: rkps, rkpt, rkpr). Az RkpZ fehérje homológ az E. coli KpsC fehérjéjével, melyről tudjuk, hogy befolyása van a termelt KPS méretére és exportjára (Reuhs et al., 1995). 2.3.3. Lipopoliszacharidok A lipopoliszacharidok a külső membránba ágyazottan helyezkednek el. A Gram-negatív baktériumok sejtfelszínének fontos alkotóelemei. Ezek a makromolekulák is több szerkezeti egységre tagolhatók. A külső membránba lipida egység segítségével rögzülnek. Ehhez kapcsolódik egy úgynevezett core oligoszacharid, melyhez a törzsspecifikus O-antigén kötődik (Kannenberg and Brewin, 1994). A S. meliloti LPS mutánsok szimbiózisra képesek a gazdanövénnyel, de a szimbiotikus kapcsolat lassabban alakul ki, mint a vad típusú baktériumok esetében (Lagares et al., 1992). Vannak olyan baktérium törzsek is (pl. S. meliloti 41 törzs), melyeknél az LPS nem játszik fontos szerepet a fertőzésben. Más rhizobium fajoknál azonban előfordul, hogy csak az LPS bizonyul kulcsfontosságúnak a szimbiózisban, míg a többi poliszacharid (KPS, EPS) nem (Kannenberg and Brewin, 1994). Az előzőekben ismertetett bakteriális sejtfelszíni poliszacharidok szerkezete nagymértékben különbözik, mégis azonos szerepet töltenek be a szimbiózisban. Ismeretes, hogy a baktérium és a gazdanövény közötti kapcsolat igen specifikus a poliszacharidok tekintetében is. Az, hogy alapvetően eltérő szerkezetű poliszacharidok helyettesíteni képesek egymást az invázió folyamatában arra utal, hogy a növény több független mechanizmussal is felismerheti a baktériumot.
10 2.4. Bakteriofág receptorok típusai A különféle bakteriális sejtfelszíni komponensek fontos szerepet töltenek be a biológiai felismerési folyamatokban, nemcsak a szimbiotikus kapcsolatok kialakulásában, hanem a baktérium bakteriofág felismerésekben, valamint a prokarióta eukarióta patogén mechanizmusokban is. Közös molekuláris elemek fedezhetők fel például a rhizobiumok pillangósvirágúak szimbiózisában, valamint számos Brucella és Bartonella baktériumfaj patogénezisében (LeVier et al., 2000). A bakteriofágok a molekuláris biológia eszköztárának fontos elemei. A röviden fágoknak is nevezett baktérium vírusok egy rendkívül szerteágazó csoportot alkotnak, mivel csaknem minden baktériumfaj, illetve törzs rendelkezik legalább egy specifikus bakteriofággal. Tudományos jelentőségük abból adódik, hogy könnyű tanulmányozhatóságuk miatt kiváló modellorganizmusként szolgálnak, így a molekuláris biológia, genetika, biokémia számos alapvető mefigyelése a bakteriofágok vizsgálata során teljesedett ki. Mint minden vírus, a bakteriofágok is a fertőzött sejt biokémiai rendszerét kényszerítik rá saját maguk megsokszorozására. A fágok szaporodása a gazdasejthez való specifikus kötődéssel kezdődik. A megtapadásra, illetve a genom beinjektálására a fágok számos stratégiát dolgoztak ki. A fágreceptorok a legkülönfélébb sejtfelszíni komponensekből tevődhetnek öszsze, melyekkel a fág által kódolt receptorkötő fehérje lép interakcióba. Az alábbiakban összefoglaltak a legáltalánosabban elterjedt, illetve leginkább tanulmányozott bakteriofág receptor típusok, különös tekintettel a Gram-negatív baktériumcsoportra. 2.4.1. Fehérjetermészetű fágreceptorok Az egyik legjelentősebb prokarióta modellorganizmus az E. coli, melynek ma már több tucat bakteriofágja ismert. Döntő többségük külső membránproteint, illetve a külső és belső membránt átérő polipeptid transzportapparátust használja ki a gazdasejt megfertőzéséhez. Sok esetben, ezek egyéb sejtfunkciókat ellátó transzportrendszerek, a legtöbbször valamilyen specifikus szubsztrát felvételéért felelősek. Az egyik legrészletesebben tanulmányozott baktérium bakteriofág rendszer az E. coli Κ12 törzs és λ fágja. A fág receptora a maltóz és maltodextrinek transzportjáért felelős csatornaformáló trimer külső membránfehérje, a MalB, régebbi elnevezés szerint LamB (Randall-Hazelbauer and Schwartz, 1973). Ezzel közvetlen kölcsönhatásban a λ fág farkirost J fehérjéje áll. A malb génben történő, fágrezisztenciát eredményező missense pontmutációkra a rajtuk izolálható host range fágmutánsok szintén egy-egy missense mutációval reagálnak, melyek mind a j génnek a farkirost C terminálisát kódoló részére esnek,
11 azaz a receptorkötésért ez a fehérjerész felelős (Werts et al., 1994; Charbit et al., 1994; Wang et al., 1998; Wang et al., 2000). A MalB fehérjén kívül, további két, mannóztranszportban részt vevő, citoplazmatikus integrál membránprotein (II-C Man, II-D Man ) szükséges a λ-dns penetrációjához. Kísérletesen bizonyított, hogy a Bacillus subtilis-nél hasonló funkciót ellátó fruktóz-specifikus permeáz helyettesíteni tudja E.coli-ban az utóbbi két mannóz-permeáz komponenst a λ fág infekcióban. A MalB fehérje receptorként szolgál több más fág számára is, melyek egyike sem igényel egyéb mannóz-transzporter elemeket az infekcióhoz (Charbit and Hofnung, 1985). Az E. coli külső membránjába ágyazott Tsx nukleozid-specifikus csatornafehérje receptorként szolgál néhány bakteriofág (T6, Ox1, H3), valamint a kolicink számára (Bremer et al., 1990). A receptorfunkció kialakításáért a fehérje mintegy 25 aminosavnyi szegmense felel, ugyanis a többszörösen fágrezisztenseknél a mutációk (missense mutációk, deléciók, duplikációk) mind az ennek megfelelő DNS-szakaszra estek (Schneider et al., 1993). Az OmpA szintén a külső membránban elhelyezkedő fehérje, mely nyolc transzmembrán doménjével úgy ágyazódik a membránba, hogy négy nagy extracelluláris hurkot képez. Az E. coli számos bakteriofágjának (K3, K4, K5, AC3, Ox2, Ox3, Ox4, Ox5, M1 stb.) a receptora, és az egyes fágok a fehérje különböző részeit ismerik fel specifikusan (Morona et al., 1985). Az OmpA fehérje további feladata az F-konjugáció stabilizálása a recípiens sejt által (Koebnik, 1999). Az, hogy periplazmatikus, valamint belső membránprotein szerepet játsszon egy fág adszorpciójában, nem túl gyakori, de előfordul. Ilyen multigén-adszorpcióra példa az E. coli N4 fágja, mely genomjának baktériumsejtbe juttatásához igényel egy külső (NfrA) és egy belső (NfrB) membránproteint (Kiino and Rothman-Denes, 1989), valamint két további fehérjét, melyek közül az egyik még nem eléggé karakterizált (NfrD), a másik pedig (NfrC) a citoplazmában helyezkedik el (Kiino et al., 1993). A FhuA egy multifunkcionális külső membránreceptor, mely eddigi ismereteink szerint, a ferrikróm, kolicinb és -M, albomicin, mikrocin 25 felvételben játszik szerepet, továbbá elengedhetetlen a T5 bakteriofág, valamint az ún. TonB-dependens fágok (T1, Φ80) adszorpciójához (Hancock and Braun, 1976). A T5 fáginfekció kivételével, valamennyi felsorolt transzport energiaigényes folyamat, és mindegyik a TonB ExbB ExbD rendszert igényli, ahol a citoplazmamembrán elektrokémiai potenciálja átalakul konformációs energiává, melyet a TonB periplazmatikus fehérje közvetít a FhuA receptor felé (Braun, 1995). A T5 fág a gazdasejt energiaszolgáltatása nélkül képes nyitni a csatornát (Bonhivers et al., 1996). Hasonló eredmények születtek az E. coli K12 törzsére specifikus C1 fág receptorának elemzése során is. A sikeres infekcióhoz itt, a külső membránreceptoron (BtuB) kívül, még
12 további két fehérje szükséges. Az egyik egy periplazmatikus fehérje, a DcrB melynek funkciója, feltehetően, megegyezik a TonB fehérjével, a másik pedig a DcrA belső membránfehérje (Likhacheva et al., 1996). A DcrA fehérje régebbi elnevezése SdaC, és legelsőként megismert funkcióját tekintve, egy erősen specifikus szerin transzporter (Shao et al., 1994). Vannak olyan eredmények, mely szerint a BtuB receptor nemcsak a DcrB energia transzformáló fehérjével léphet interakcióba, hanem a TonB-vel is (Cadieux et al., 2000). Így kerül felvételre például a B12 vitamin, további két belső membránfehérje (BtuD, BtuC) közreműködésével (Simon et al., 1995). Mindezeken kívül, a BtuB receptorként szolgál a BF23 fág számára is (Bradbeer et al., 1976), melynek infekciója viszont nem függ sem a DcrB, sem a TonB fehérjétől (Simon et al., 1995). Bizonyos esetekben, a fáginfekciót nem csupán egy sejtfelszíni receptor kontrollálja, hanem a target sejt felszínének több sajátsága együttesen fontos. Az AR1 bakteriofág kizárólag az E. coli O157:H7 szerotípusba sorolható izolátumait képes fertőzni. A specifitásban fontos szerepe van az OmpC receptorfehérjének, mely elsődleges szerkezetében különbözik az E. coli K12 törzsétől. A fehérjék a 176-226 aminosavak között mutatják a legtöbb eltérést (Yu et al., 1998). Spontán fágrezisztens mutánsok elemzése is alátámasztotta, hogy az AR1 fág gazdaspecifitását ez a fehérjerész befolyásolja. Azt is kimutatták, hogy ép lipopoliszacharid (LPS) hiányában az OmpC gyengébben köti a fágot. Ugyanilyen gyenge kötődés tapasztalható, amikor az eredeti receptort a K12 törzsből származó OmpC-vel helyettesítik. Az AR1 fág maximális kötődéséhez tehát az OmpC fehérje és az LPS együttesen szükséges (Yu et al., 2000). Az LPS funkciója ebben még nem tisztázott. Elképzelhető, hogy direkt kötődéssel könnyíti a fágadszorpciót, vagy indirekt járul hozzá, a külső membrán fehérjeössszetételének befolyásolása által. Ugyancsak az E. coli O157:H7 törzsre specifikus a PP01 bakteriofág, melynek gazdasejthez kötődéséért, a legújabb eredmények szerint, az ép LPS felelős elsődlegesen, és minden alternatív szerkezetű LPS mintegy barrierként szolgál, megakadályozva, hogy a fág hozzáférjen az OmpC fehérjéhez (Mizoguchi et al., 2002). A fehérje természetű fágreceptoroknak különleges formái a Gram-negatív baktériumokra jellemző ún. IVSP (type IV pathway system), multikomponensű, a teljes felszínt átérő transzportrendszer, mely proteinek és nukleoprotein komplexek transzlokációját biztosítja a donor sejtből (F + ) a recipiens sejtbe (F - ) a bakteriális konjugáció során. A transzportrendszerhez kapcsolódik a sejt felszínén található F-pílus, mely a konjugációban részt vevő baktériumsejtek kapcsolódását segíti elő. A komplex modelljét a 2.1. ábra mutatja be (Cao and Saier, 2001).
13 Több baktériumfaj esetében fedeztek már fel píluson, illetve a hozzá kapcsolódó transzportapparátuson keresztül fertőző, ún. donor-specifikus bakteriofágokat. Ilyen például az E. coli PRD1 fágja, mely a P2 fehérje által, a gazdasejt IncP plazmidján, összesen 11 gén által kódolt Mpf (mating pair formation) komplexet igényli a megtapadáshoz, mely valószínűleg a fág-dns beinjektálását is biztosítja (Grahn et al., 1997). 2.1. ábra: A IVSP komplex javasolt sematikus ábrázolása (Cao and Saier, 2001) A modell figyelembe vesz minden eddigi ismeretet a IVSP transzportrendszerrel kapcsolatban, több baktériumfajon végzett kísérleti munkán, valamint filogenetikai elemzéseken alapszik. Az E. coli más bakteriofágjai (pl. f1és fd fágok) kapcsán leírták, hogy az adszorpcióhoz, az F-píluson kívül, egy ún. koreceptorra, a TolQRA komplexre van szükség. A bakteriofágok a pílus depolimerizálása által átjutnak a külső membránon, és a periplazmatikus térben a koreceptor TolA komponensének C-terminális részéhez kapcsolódnak, majd a vírus-dns eddig még ismeretlen mechanizmussal transzlokálódik a gazdasejt citoplazmájába (Jacobson, 1972; Click and Webster, 1997; Riechmann and Holliger, 1997). Az interakcióhoz a fág g3p burokfehérjéje szükséges, mely két glicin-gazdag kapcsoló régió által három doménre tagolódik (Armstrong et al., 1981), melyek közül az egyik N-terminális domén (N1) az F- pílushoz, a másik (N2) pedig a TolA fehérjéhez való kapcsolódást biztosítja (Nilsson et al., 2000). Az előzőekkel nagy hasonlóságot mutat a kolera toxint kódoló CTXΦ és a Vibrio cholerae gazdasejt közötti interakció, ahol az ún. TCP (toxin coregulated type IV pilus), valamint az E. coli TolQRA génjeivel erősen homológ gének nélkülözhetetlenek a fágfertőzéshez. Mindez bizonyítja, hogy a pílus-specifikus bakteriofágok gazdasejt penetrációjának mechanizmusa konzerválódott a különböző baktériumfajok esetében (Heilpern and Waldor, 2000).
14 2.4.2. Poliszacharid jellegű fágreceptorok A különféle poliszacharidok a baktériumsejtek felszínének fontos antigénjei, és gyakran bakteriofágok megtapadását is biztosítják. Az egyik legkorábban megismert bakteriofág az állati patogén Streptococcus (Ccsoport) törzsek C 1 fágja, melynek ma már a teljes genom DNS-szekvenciája ismert (Nelson et al., 2003). Nem fogékonyak viszont a C 1 fágfertőzésre a humán patogén Streptococcus (Acsoport) törzsek, valamint az ún. A-variáns Streptococcus csoport képviselői sem. Továbbá, a pronáz, trypszin és chymotripszin kezelt C-streptococcusok érzékenyek maradnak a C 1 fáginfekcióra, ami arra utal, hogy a fág nem protein természetű receptorhoz kötődik (Nelson et al., 2003). Feltehetően, az említett három Streptococcus csoport sejtfelszíni szénhidrátjainak szerkezetében fellelhető különbözőségek okozzák a fággal szemben mutatott eltérő fenotípust. A közös polirhamnóz gerinchez a C-csoportban két N-acetil-galaktózamin (GalNAc), az A-csoportban pedig egy N-acetil-glükózamin (GlcNAc) oldallánc kapcsolódik, míg az A-variáns streptococcusoknál teljesen hiányoznak az oldalláncok (Coligan et al., 1978). Ezek alapján, a GalNAc, monomer vagy dimer formában, fontos eleme a fágreceptornak (Nelson et al., 2003). A ΦYeO3-12 fág a humánpatogén Yersinia enterocolitica O:3 szerotípusra specifikus. A fág receptora a felszíni lipopoliszacharid O-oldallánca (O-antigén), mely egy 6-deoxy-Laltropyranóz egységekből álló homopolimer. Mindezt igazolja, hogy a Y. enterocolitica O:3 szerotípus E. coliban klónozott O-antigénje fággal szembeni érzékenységet okoz, továbbá a spontán fágrezisztens Y. enterocolitica O:3 mutánsok mindegyikében hiányzott az O-antigén (Al-Hendy et al., 1991). A fágfertőzés különleges formái, amikor a fág farkirost fehérjéje mind az adszorpcióban, mind a gazdasejt penetrációjában fontos szerepet játszik, ugyanis, a kapszuláris poliszacharidhoz (K-antigén) történő specifikus tapadás után, a farkirost poliszacharid depolimerizációs aktivitása által enzimatikusan degradálja a K-antigént oligoszacharidjaira. Erre a különféle K-antigénnel rendelkező E. coli törzsek és az ún. kapszula-specifikus fágjaik szolgáltatnak példákat. A K5A bakteriofág gazdája kizárólag a K5 antigént [-4) βglca-(1,4)- αglcnac-(1-] termelő E. coli törzs, ahol a fág KflA (capsular polisaccharide lyase) enzimje által, β-eliminációval hasítja a poliszacharidot (Hänfling et al., 1996). Ezzel ellentétben, a K1E fág farkirostja N-acetil-neuraminidáz (endozialidáz) enzimet tartalmaz, mely csakis a K1 típusú kapszula α-2,8 kötéssel kapcsolt, poli-n-acetil-neuraminsav polimer hasadását katalizálja, következésképp, csak a K1 poliszacharidot termelő E. coli törzsön képes szaporodni (Tomlinson and Taylor, 1985). Az előzőekkel összefüggésben, egyedülálló a K1-5 fág
15 gazdaspecifitása, ugyanis mind a K1, mind a K5 poliszachariddal rendelkező E. coli törzseket képes fertőzni. Ennek oka, hogy a fágnak mindkét előbbi farkirost fehérjéje megvan. Ezek két átfedő ORF-ben kódoltak, melyek közül az első a K5-liáz, a második pedig az endozialidáz enzimfehérje génje, melyek erős homológiát mutatnak a K5 és K1E fágok farkirostot kialakító génjeivel (Scholl et al., 2001). Számos egyéb K-antigént termelő (K3, K7, K12, K13, K20) E. coli tözsre specifikus bakteriofágot leírtak, melyek feltehetően szintén valamilyen poliszacharid-depolimerizációs aktivitással rendelkeznek (Nimmich et al., 1992). Hasonló mechanizmus alapján fertőzi az A7 bakteriofág a Pseudomonas aeruginosa AK1401 sejtjeit. Receptorként itt a felszíni lipopoliszacharid D-rhamnóz összetételű cukoroldallánca szolgál, melyet a fág a termelt rhamnanáz enzimje által hidrolizálni képes, felfedve ezáltal az infekciót elősegítő core-lipidet (Rivera et al., 1992). 2.5. A 16-3 fág mint a legrészletesebben tanulmányozott rhizobium fág A rhizobiumok számos bakteriofágja ismert, melyek közül a legtöbbet a S. meliloti 41 törzs temperált 16-3 fágjáról tudunk. Alakjában és több molekuláris biológiai sajátságában is emlékeztet a λ fágra, és ahhoz hasonlóan, egy speciális transzdukáló fág. Kromoszómája kétszálú, lineáris, 60,8 kb nagyságú DNS-molekula (Dallman et al., 1979). Ismert a fággenom részletes genetikai-fizikai térképe, és több fontos lókusz molekuláris biológiai elemzése is megtörtént. Ilyen például a fő represszor fehérjét kódoló c gén (Dallmann et al., 1987), a helyspecifikus rekombinációban szerepet játszó int és xis gének (Semsey et al., 1999), valamint az immx régió (Csiszovszki et al., 2003). Azonosították a fág és a baktérium kromoszómáján lévő att régiókat, és tanulmányozták a fág integrációjának mechanizmusát. Ennek eredményeként egy vektorcsaládot is kifejlesztettek, mely a fág int génjét és attp régióját hordozza, és segítségével bármely gén célzottan beépíthető a S. meliloti 41 kromoszóma attb helyére (Elo et al., 1998). A szélesebb körben való alkalmazhatóságot elősegítheti a fág fágreceptor kölcsönhatás megismerése, melynek kapcsán egyetlen rendelkezésre álló irodalmi adat egy ún. host range mutáció izolálása és térképezése (Orosz and Sik, 1970).
16 3. A MUNKA ELŐZMÉNYEI A növény inváziójához szükséges bakteriális gének megismerése érdekében számos infekcióban hibás (Inf - ) S. meliloti mutánst jellemeztek már, melyek nem képesek bejutni a növény belsejébe, így a szimbiózis kialakulása a gümőfejlődés korai szakaszában elakad. Ezen mutánsok segítségével sikerült kimutatni, hogy a szimbiózis kialakulásának ebben a fázisában a baktérium különböző poliszacharidjainak fontos szerep jut. Kimutatták, hogy az EPS ill. KPS valamelyikének jelenléte nélkülözhetetlen a funkcionális gümő képződéséhez (Walker, 1992). A S. meliloti AK631 törzs például EPS-t nem termel, mégis képes szimbiózist kialakítani a gazdanövényeivel. Ennek oka az, hogy a törzs által termelt KPS helyettesíteni tudja az exopoliszacharidokat a gümőfejlődés során (Putnoky et al., 1990; Petrovics et al., 1993). Egyre több S. meliloti törzs vizsgálata arra utal, hogy a KPS-nek akár elsődleges szerepe is lehet az infekciós folyamatban. Csoportunkban, többek között, a KPS szimbiózisban betöltött szerepének tanulmányozása folyik. Ebbe a kutatásba kapcsolódtam be én is. Munkánk kezdetekor a KPS gazdaspecifitására vonatkozóan szerettünk volna minél többet megtudni. Arra voltunk kíváncsiak, hogy a KPS esetében létezik-e olyan funkcionális molekularészlet, bioszintézisében bekövetkező utólagos módosítás, melynek hiányában a szimbiózis az infekciós lépésben elakad. Erre kísérletes bizonyíték az EPS esetében már van (Leigh et al., 1985). A kapszuláris poliszacharid szerkezetének gazdaspecifikus vonatkozásait olyan mutáns baktériumtörzsek izolálása révén szerettük volna megismerni, melyek felszínén a KPS kismértékben módosult változatban van jelen. Ezen fenotípust okozó genetikai mutáció(k) helyének pontos behatárolásával a feltételezett gazdaspecifitásért felelős gén(ek) meghatározhatók. 3.1. Spontán mutáns baktérium törzsek izolálása, szelekciós rendszer Elsőként tehát, olyan baktériummutánsokra volt szükség, melyek felszínén a KPS módosult formában van jelen. Ehhez olyan mutánsizolálási eljárást elevenítettünk fel, melynek során a 16-3 bakteriofágot alkalmaztuk szelekciós eszközként. Ebben a munkában többen is részt vettek tanszékünkről, de mivel a jelen dolgozatban szereplő kísérletek alapjául is szolgált, ezért a továbbiak jobb érthetősége érdekében, a mutánsizolálási eljárás elveit az alábbiakban összefoglaltam. Előzetes információk szerint, több Inf - S. meliloti mutáns rezisztenciát mutatott a 16-3 fággal szemben (Putnoky et al., 1988). Az esetek nagy részében, a rezisztenciát a fág adszorpciójának elmaradása okozta. A vizsgált baktériumtörzsek egyike sem termelt
17 exopoliszacharidot. Az Inf + törzsek esetében a növényi invázióra való képességet, nagy valószínűséggel, a sejtfelszíni kapszuláris poliszacharid biztosította, míg egyes Inf - törzsek invázióképtelenségét és feltehetően, a fággal szemben mutatott rezisztenciáját is a KPS hiánya vagy hibája okozta (3.1.táblázat). 3.1. táblázat : S. meliloti törzsek viselkedése a szimbiózisban és a 16-3 fággal szemben Az Inf + S. meliloti törzseket a 16-3 fág képes volt fertőzni, míg az Inf - mutánsok egy része rezisztenciát mutatott a fággal szemben. Mivel a vizsgált törzsek nem termeltek exopoliszacharidot, feltehetően a kapszuláris poliszacharid jelenléte ill. hiánya/hibája okozta az adott fenotípust. S. meliloti törzs szimbiózisban mutatott fenotípus 16-3 fággal szemben mutatott fenotípus KPS a sejtfelszínen vad típus Inf + szenzitív jelen van mutáns Inf - rezisztens nincs jelen vagy módosult Ezek szerint, a poliszacharid bioszintézise és a fágreceptor jelenléte, nagy valószínűséggel, összefügg. Ezen információk alapján feltételezték azt, hogy a KPS-molekula egyúttal receptorként szolgálhat a 16-3 fág számára (Petrovics et al., 1993; Putnoky et al., 1990). Ha a feltevés igaz, a mutánsizolálás a 16-3 fág alkalmazásával is elképzelhető. Ehhez az ún. host range jelenséget használhatjuk ki. A host range (gazdaspecifitási) mutáció a fág baktériumfelszínt felismerő fehérjéjét kódoló gén mutációja révén alakul ki. Ha egy fágra rezisztenssé vált baktérium mutánson lehetséges host range fágmutánst izolálni, akkor a baktérium mutáns felszínén a fágreceptor feltehetően módosult formában, de jelen van. A receptor mutációnak finom szerkezetbeli változást kell okoznia, ami még lehetővé teszi a host range fágmutánsok adszorpcióját. Ahhoz, hogy a felszínen jelen lévő, de módosult szerkezetű fágreceptorral rendelkező baktérium mutánst tudjunk izolálni, az alábbi feltételeknek kell teljesülniük, melyeket az izolálás lépéseinél szem előtt tartottunk: 1) az izolált mutáns fágrezisztens legyen Spontán fágrezisztens mutánsok izolálásához a S. meliloti 41 törzset és a 16-3 bakteriofágot használtuk. A baktérium szuszpenziót nagy titerű (10 9 ) fággal fertőzve tizes nagyságrendű spontán fágrezisztens kolóniát kaptunk lemezenként.
18 2) az izolált spontán fágrezisztens baktérium mutáns ne adszorbeálja a fágot A fágfertőzés, a sejtek szétesése soklépcsős folyamat, mely több ponton megakadhat. A baktérium felszínének megváltozása csak egy azon lehetséges okok közül, amelyek a fágfertőzés elmaradását eredményezik. Az ún. fágkötési tesztet használtuk annak eldöntésére, hogy a fággal szembeni rezisztenciát a fág tapadásának elmaradása okozza-e. A fágkötési tesztben a spontán mutánsok háromféleképpen viselkedtek: 1. Megkötötték, inaktiválták a fágot. Ezek a mutánsok feltehetően a fág reprodukciójához szükséges bakteriális génekben voltak hibásak. 2. Lizáltak. Ezekben a törzsekben a baktériumok lizogéniája okozta a fágrezisztenciát. 3. Nem tudták inaktiválni, megkötni a fágot. Ezen mutánsoknál valószínűleg a baktérium felszíne változott meg úgy, hogy a fág nem tudott hozzákötődni. Ez a mutáns kategória érdekelt bennünket. 3 ) a vad típusú fágot kötni képtelen spontán fágrezisztens baktérium mutánson host range fágmutánst lehessen izolálni A kiválogatott fágot kötni képtelen mutánsokat ezután nagy titerű (10 9 ) fágpopulációval fertőztük. A baktérium mutánsok a fággal szemben kétféleképpen viselkedtek: 1. Teljes rezisztenciát mutattak, azaz fágplakkok egyáltalán nem jelentek meg a lemezeken. Ezeknél a mutánsoknál a fágreceptor, nagy valószínűséggel, eltűnt a felszínről. 2. A mutáns baktériumot a fágpopuláció kis töredéke mégis fertőzni tudta, így megjelentek fágplakkok, azaz host range fágmutánsokat lehetett izolálni rajtuk. Ez esetben jelen kell lennie valamilyen struktúrának a baktérium felszínén, melyhez a fág kötődni képes. Az is bizonyos, hogy ezeknél a mutánsoknál a fágreceptor valamelyest különbözik a vad típusú baktériumtörzsétől, hiszen a vad 16-3 fág nem képes azt felismerni. A fágpopulációban viszont létrejöhetnek olyan spontán mutációk a baktériumfelszínt felismerő farki rost fehérjét kódoló génben, melyek által a fág adaptálódik a megváltozott baktériumfelszínhez. Ezt a kategóriát kerestük. A felvázolt elgondolás alapján sikerült egyetlen megfelelő mutációt találnunk, körülbelül 100 függetlenül izolált fágrezisztens mutáns baktérium átvizsgálása során. Ezt GH4046 törzsnek, míg az általa hordozott mutáns allélt rkp-4046 lókusznak neveztük el, gyanítván, hogy az rkp gének valamelyike sérült ebben a mutánsban. A receptormutánson izolált host range fágmutáns (16-3 h 5 ) pedig lehetőséget biztosít arra, hogy a baktérium bakteriofág felismerési folyamatot a továbbiakban mindkét oldalról vizsgálhassuk.
19 4. CÉLKITŰZÉSEK Munkám kezdetekor tehát, rendelkezésre állt egy olyan baktérium mutáns (GH4046 törzs), mely megváltozott szerkezetű fágreceptorral rendelkezik a S. meliloti 41 vad típusú törzshöz képest. Ennek alapján célul tűztük ki: az izolált mutáció(k) helyének és minőségének pontos meghatározását a mutációt szenvedett gén(ek) funkciójának bizonyítását genetikai komplementációs kísérletek segítségével. A 16-3 fág receptorára vonatkozóan irodalmi adatok nem állnak rendelkezésre. A mutáció(k) helyének pontos behatárolásával a fágreceptor szerkezetét meghatározó gén(ek) azonosíthatók, ami új információkat szolgáltatna a S. meliloti 16-3 fág felismerési folyamat tanulmányozásához. Amennyiben a fágreceptor valóban a kapszuláris poliszacharid, úgy ezzel a módszerrel még ismeretlen bioszintézis gének azonosítására is lehetőség nyílhat. A témakörhöz szorosan kapcsolódó egyéb munkák leírása Pálvölgyi Adrienn diplomadolgozatában (PTE, 2004) megtekinthetők. A GH4046 törzsön izolált host range fág ( 16-3 h 5 ) oldalán elért eredményekről Békási Krisztina, valamint Maász Anita diplomadolgozata (PTE, 2004) számol be.
20 5. ANYAGOK ÉS MÓDSZEREK 5.1. Baktériumok, bakteriofágok, plazmidok Munkám során használt baktérium és bakteriofág törzsek, valamint plazmidok jellemzőit az 5.1. táblázat tartalmazza. 5.1. táblázat: Baktériumok, bakteriofágok, plazmidok ELNEVEZÉS JELLEMZŐK REFERENCIA Sinorhizobium meliloti RM41 S. meliloti 41 vad típusú (Exo +, Nod +, Fix + ) Szende K. AK631 RM41 exob631 (Nod + Fix + ) Kondorosi Á. GH4046 RM41 16-3 fágra rezisztens, spontán mutáns Hoffmann Gy. GH4178 RM41 16-3 fágra rezisztens, spontán mutáns Hoffmann Gy. GH4180 RM41 16-3 fágra rezisztens, spontán mutáns Hoffmann Gy. AT212 AK631 rkpm::tn5(212) Km R Sm R Kiss et al., 2001 Escherichia coli JF1754 met leu his hsr - hsm + J. Friesen PP211 JF1754 (prk2013) Km R Putnoky P. helper plazmid keresztezéshez XLI-blue RecA1 enda1 gyra96 thi-1 hsdr17 supe44 rela1 Bullock et al., 1987 lacz M15 Tc R JM109 F trad36 proa + B + laci q (lacz)m15 / e14 - Yanisch et al., 1985 (McrA - ) (lac-proab) enda1 gyra96 (Nal r ) thi-1 hsdr17(r - k m + k ) glnv44 rela1 reca1 AV4186 AV4187 XL1-blue (pbs::rkpm 4046 KpnI-SalI) Amp R jelen munka AV4188 AV4245 XL1-blue (psem91::rkpm 4046 EcoRV) Km R jelen munka AV4259 XL1-blue (pav4245 Km::Cm(F-778)) Km S Cam R jelen munka Bakteriofágok 16-3 S. meliloti 41 törzsre specifikus fág Orosz L. 16-3 h 5 S. meliloti GH4046 törzsre specifikus Hoffmann Gy. host range mutáns Plazmidok ppp428 rkp-1 régiót hordozó kozmid klón Putnoky et al., 1990 pat330 rkp-2 régiót hordozó kozmid klón Kereszt et al., 1998 pat399 rkp-3 régió bal oldalát tartalmazó kozmid klón pat401 rkp-3 régió jobb oldalát tartalmazó kozmid klón pat399 orf140::tn5(174) pat399 rkpl::tn5(187) pat399 rkpm::tn5(212) Kiss et al., 2001 pat399 rkpn::tn5(107) a jelzett génben mutációt hordoz (6.1. ábra) pat399 rkpo::tn5(168) pat399 rkpp::tn5(105) pat399 rkpq::tn5(124) pbluescript II SK(+) klónozó vektor Amp R Stratagene pbbr1-mcs-3 széles gazdaspecifitású konjugatív plazmid Tc R Kovach et al., 1994 psem91 expressziós vektor Km R Semsey et al., 1999
21 5.2. A baktériumok növesztése A S. meliloti törzseket TA (Orosz et al., 1973) vagy GTS (Kiss et al., 1979) táptalajokon 32 C-on, az E. coli törzseket pedig LB (Sambrook et al., 1989) tápközegben 37 C-on növesztettük. A táptalajok a megfelelő antibiotikumot az 5.2. táblázatban feltűntetett végkoncentrációban tartalmazták. 5.2. táblázat: A tápközegekben alkalmazott antibiotikumok koncentrációi (µg/ml) Antibiotikum Rövidítés E. coli S. meliloti Tetraciklin Tc 15 15 Kanamicin Km 30 200 Kloramfenikol Cam 5 5 Ampicillin Amp 200 5.3. Fágok szaporítása A felszaporítani kívánt fág egy tarfoltját 10 ml TA folyadékba tettük, és 0,2 ml éjszakán át felnövesztett baktériumtörzs hozzáadása után a lombikot 32 C-on, 12-24 órán át rázattuk. A fáglizátumhoz néhány csepp kloroformot adtunk, majd meghatároztuk a fágszámot úgy, hogy 0,1 ml megfelelően hígított fágot, 0,2 ml éjszakán át felnövesztett baktériumot és 4ml TA fedőagart összekeverve TA lemez tetejére rétegeztünk. A lemezeket 12-24 órán át 32 Con történő inkubálás után értékeltük ki. A fáglizátumok általában 10 9 részecskét tartalmaztak milliliterenként. 5.4. A baktériumok keresztezése A keresztezni kívánt baktériumokat és a helper törzset (PP211) felnövesztettük a megfelelő antibiotikumokat tartalmazó komplett táptalajon. A keresztezést 0,9%-os NaCloldatban felszuszpendált baktériumokkal végeztük, TA lemezen összecseppentve őket. 16-24 órás 32 C-on történő inkubálás után a felnőtt baktériumokat felszuszpendáltuk, és a megfelelő szelektív lemezre kentük tömény, illetve (-2) és (-4) hígításokban, majd legalább két lépésben tisztítottunk tovább telepeket. 5.5. Fágérzékenységi teszt A baktériumok fágérzékenységét 16-3 vad típusú, 16-3 h 5 host range mutáns bakteriofágokkal szemben teszteltük. A vizsgálni kívánt baktériumot tartalmazó TA fedőagar felszínére 1 µl, körülbelül 10 6 darab fágot tartalmazó lizátumot cseppentettünk, és 24 órás inkubációs idő után vizsgáltuk, hogy bekövetkezett-e a lízis vagy sem.
22 5.6. Összes DNS izolálás 1,5 ml éjszakán át növesztett baktériumkultúrából a sejteket centrifugálással ülepítettük, és 300 µl TE oldatban (50 mm TrisHCL, 20 mm EDTA, ph 8,0) szuszpendáltuk. 100 µl 5% SDS-t tartalmazó TE oldatot és 100 µl pronáz oldatot (2,5 mg/ml pronáz TE oldatban) adtunk hozzá. 1-3 órás 37 C-os inkubálás után 500 µl fenollal ráztuk össze, majd centrifugálás után a felülúszót újabb Eppendorf csőbe pipettáztuk át. 500 µl fenol:kloroform oldattal (25 térfogat fenol : 24 térfogat kloroform : 1 térfogat izoamil-alkohol) ráztuk össze. Centrifugálás után a felülúszóhoz 500 µl kloroform oldatot (24 térfogat kloroform : 1 térfogat izoamil-alkohol) adtunk, összeráztuk és centrifugáltuk. A vizes fázist 1000 µl etanollal kicsaptuk. A kocsonyás csapadékot új, 500µl 70%-os etanol tartalmú, Eppendorf csőbe tettük át pipettahegy segítségével. Centrifugálás után a felülúszót leöntve, szárítást követően, a DNS csapadékot 100 µl desztillált vízben oldottuk fel (Meade et al., 1982 ). A psem91 plazmid vektorba történő rkpm 4046 inszert beépülésének tesztelésére gyors DNS izolálási technikát alkalmaztunk. A vizsgálni kívánt baktériumot felszuszpendáltuk 100µl steril desztillált vízben, 5 percig 95 C-on, majd 5 percig 0 C-on inkubáltuk. Ezután a mintát 5 percig centrifugáltuk, majd a felülúszót új csőbe pipettáztuk és megfelelően hígítottuk. 5.7. Plazmid DNS izolálás A plazmid DNS-t E. coli esetén 3-3 ml LB tápfolyadékban, S. meliloti esetén pedig TA tápfolyadékban, a megfelelő antibiotikum jelenlétében éjszakán át növesztett sejtekből Ish- Horowicz és Burke (Ish-Horovicz and Burke, 1981) szerint alkalikus lízissel preparáltuk. 1,5 ml kultúrát Eppendorf-csõbe tettünk és a sejteket centrifugálással ülepítettük. A sejteket 100 µl TEG oldatban (25 mm TrisHCL, 10 mm EDTA, 50 mm glükóz ph 8,0) szuszpendáltuk fel. A feltárást óvatos keverés mellett 200 µl NS oldat (0,2N NaOH, 1% SDS) hozzáadásával végeztük. A mintákat 5 percig 0 C-on inkubáltuk, majd erõs rázással 160 µl jéghideg Naacetát oldatot (3M, ph 4,8) adtunk hozzájuk. 5 perces 0 C-os inkubáció után 5 percig centrifugáltuk, és a felülúszóból 400 µl izopropanollal kicsaptuk a plazmid DNS-t. 10 perc -20 Cos inkubáció után a csapadékot lecentrifugáltuk és szárítottuk. A csapadékot 100 µl Trispufferben (50 mm TrisHCL, 100 mm Na-acetát, ph 8,0) oldottuk fel, majd 200 µl etanollal ismét kicsaptuk. 10 perc 0 C-os inkubáció után a csapadékot centrifugáltuk, szárítottuk, majd 30-50 µl RNáz-os desztillált vízben (100 µl/ml RNázA) oldottuk fel. Restrikciós emésztésekhez 1-10 µl-t használtunk fel.
23 A DNS-szekvenáláshoz, valamint a transzpozíciós reakcióhoz szükséges volt a DNSpreparátum további tisztítása. A plazmid DNS izolálálás végén 50 µl RNáz-os desztillált vízben vettük fel a csapadékot, majd 0,1 térfogat 10% SDS és 1 térfogat 7,5 M NH 4 -acetát hozzáadása után 15 percig inkubáltuk jégen. Ezután centrifugáltuk 5 percig, és a felülúszót új csőbe pipettáztuk. Ehhez 0,6 térfogat izopropanolt adtunk és -20 C -ra tettük min. 20 percre. Az inkubálás után etanolos mosás, és szárítás következett. A csapadékot 30-40 µl desztillált vízbe vettük fel. 5.8. Restrikciós emésztés A DNS minták restrikciós emésztését Maniatis és munkatársai szerint végeztük. (Maniatis et al., 1982). Kettős emésztés esetén, az első enzimreakció után a minta DNS tartalmát kicsaptuk 0,1 térfogat 3M Na-acetát (ph 7,0) és 2 térfogat et-oh (96%) hozzáadásával, és min. 20 percig inkubáltuk -20 C-on, majd 5 perc centrifugálás és 70% et-oh mosásszárítás után 30 µl desztillált vízbe vettük fel. Ez után végeztük el a második enzimreakciót. 5.9. Agaróz gélelekroforézis A DNS-fragmentek elválasztására 1%-os agaróz gélt használtunk. Az elválasztásra szánt DNS mintához, az alábbiakban leírt összetételű STOP-oldatot adtunk (5xSTOP-ból a végtérfogat 1/5-ét). A gélelektroforézist minigél esetében 60V-on, fragmentizolálásnál 40Von végeztük. Kontrollként, PstI enzimmel emésztett, λ fág DNS-t alkalmaztunk. 1%-os agaróz gél: 1 g agaróz, 100 ml 1xTBE puffer, 100 µl etidium-bromid (100 µg/ml); 5xSTOP 20 ml-hez: 2 g ficoll, 10 ml 0,5 M EDTA (ph 8,0), 40 mg brómfenolkék (BFB); 5xTBE törzsoldat: 54 g TRIS, 27,5 g bórsav, 20 ml 0,5 M EDTA (ph 8,0) / 1000 ml; 5.10. Fragmentizolálás Restrikciós emésztés, valamint polimeráz láncreakció után a minta DNS-fragmentjeit agaróz gélelektroforézis segítségével választottuk szét. Az izolálni kívánt fragment elé a gélbe Whatman DE 81 papírt tettünk és 20 perces 60V feszültség melletti elektroforézis után az izolálandó fragment a papírra került. A papírt Eppendorf csőbe tettük, és a DNS-t 100 µl 1M NaCl oldattal mostuk le, kétszer egymás után. A DNS kicsapása 20 µl 3M Na-acetát oldattal (ph 7,0) és 120 µl izo-propanollal történt. 20 perces -20 C-os inkubálás után lecentrifugáltuk, szárítottuk és 20 µl desztillált vízben oldottuk fel a csapadékot.