ONDÓSEJTEK MÉLYHŰTÉSES TÁROLÁSA BAROMFIFÉLÉKNÉL, MINT EX SITU GÉNMEGŐRZÉSI MÓDSZER (Irodalmi áttekintés) Barna Judit, Varga Ákos Kisállattenyésztési és Takarmányozási Kutatóintézet, Gödöllő Bevezetés Sajnálatos módon ma még nem sok figyelem jut a különféle őshonos, ritka baromfifajok biztonságos megőrzésére, jóllehet a fejlődő országokban még manapság is az egyik legfontosabb táplálék-, illetve fehérjeforrást jelentik, főként a tyúkfélék. Még kevesebb információ áll rendelkezésünkre az egyéb baromfifélék megőrzésének (gyöngytyúk, parlagi pulyka, őshonos viziszárnyasok) helyzetéről (Crawford, 1990). A fejlett országokban jelentőségük a genetikai deverzitás fenntartásán túl az ökológiai, vagy egyéb organikus baromfitartásban felülmúlhatatlan. Remélhetőleg a FAO által fenntartott adatbanki nyilvántartás (EAAP/FAO Global Animal Genetic Data Bank, 1990) érdekében hozott erőfeszítések, valamint a National Research Council (1991, USA) ezirányú tevékenysége elérik azt a célt, hogy az ősi háziasított madárfajok nemcsak megmenekülnek a kihalástól, hanem biztonságosan megőrizhetők is lesznek a jövő számára. Hazánkban a hagyományos magyar baromfifélék megőrzésére irányuló program, mint a KÁTKI alaptevékenysége, a 90-es évek elejétől folyamatban van, amely magába foglalja a régi magyar tyúkfélék 6 fajtájának (sárga, fehér és kendermagos magyar, erdélyi kopasznyakú 3 színváltozata), valamint a parlagi pulykafajták közül a réz- és bronzpulykának, a fodrostollú magyar lúdnak, a fehér, illetve tarka magyar kacsafajtáknak, továbbá a gyöngytyúk 3 színváltozatának fenntartását (Szalay et al., 2000). Vitathatatlan, hogy az ilyen értékes állományok fenntartásának önmagában - a megőrzés szempontjából - nagy a kockázata, mivel folyamatosan számolnunk kell olyan tényezőkkel, amelyek kritikus szint alá csökkenthetik a létszámot (természeti csapás, elemi károk, illetve különböző megbetegedések). Mindez felveti az igényét annak, hogy egyéb, kevésbé kockázatos, bár technikailag bonyolultabb módon is próbáljuk őrizni e ritka géneket. Ismeretes, hogy a genetikai anyag megőrzése többféle módon lehetséges, egyrészt in situ élő állatok kis populációkban történő fenntartásával, másrészt ex situ, celluláris szinten a genetikai anyagot hordozó ivarsejtek, embriók, embrionális sejtek vagy embrionális szövetek fagyasztásával, illetve subcelluláris szinten az ivarsejtekben levő teljes DNS-molekulának vagy egyes
DNS-fragmentumoknak a fagyasztásával. A felsorolt eljárások közül a KÁTKIban jelenleg az in situ génmegőrzés mellett celluláris szinten az ivarsejtek és a korai embrionális sejtek fagyasztásos technikáinak kidolgozása, valamint a subcelluláris-szintű DNS-feltérképezés folyik. Jelen dolgozatban azokról a nemzetközi eredményekről számolunk be, amelyek a baromfifajok hímivarsejtjeinek hosszú távú megőrzésére irányultak, a kezdetektől napjainkig. A génmegőrzés oldaláról nézve az összes módszernek vannak előnyei és hátrányai a többi eljáráshoz képest, így a spermiumok tartósításának számos előnye mellett hátránya az, hogy általa csak a haploid génkészletet tudjuk fenntartani. 1. A baromfiondó mélyhűtésére irányuló kutatások múltja Az legelső sikeretelen madárspermium-fagyasztási próbálkozások 1939- ben az Ohio Állami Egyetemen zajlottak N.M. Nelson irányításával, majd Shaffner és mtársai (1941) voltak az elsők, akik széndioxid-alkohol keverékének segítségével -76 C-on fagyasztottak kakas-spermiumokat, fruktózt használva krioprotektánsként. Egy évvel később már termékenyítettek is a fagyasztottfelengedett spermiumokkal, amiből a néhány termékeny tojás 10-15 órás embrionális fejlődési stádiumig tudott eljutni (Shaffner, 1942). Alig 10 évvel később Polge és mtársai (1942) kiterjedt vizsgálatokba kezdtek különböző fajok spermiumaival, fruktózt használva védőanyagul a jégkristályképződés ellen, és egy véletlen eredményeként létrejött Polge (1951) korszakalkotó felfedezése a glicerol hatékony krioprotektív hatásáról kakas-spermiumoknál, amellyel megnyitotta az utat a kriobiológiai kutatások terén. Tehát a házityúk volt az első állatfaj, amelyet fagyasztott spermiumokkal tudtak reprodukálni. Hamar kiderült, hogy jóllehet a glicerol hatásos védőanyag fagyasztáskor, kontraceptív hatása van a tojók hüvelyébe történő inszemináláskor. Sloviter (1951) jött rá, hogy dialízissel eltávolítva a glicerolt kiküszöbölhető e káros hatás humán vörösvértestek esetében és ez alapján később Shaffner (1964) komplett technikát dolgozott ki a tyúkfélék spermiumainak fagyasztására. Azóta az emlős ivarsejtek, különösen a bikák spermiumainak fagyasztása problémamentesnek mondható, azonban a madár spermiumok elfogadható szintű fagyasztásos tárolásának megoldása még mindig várat magára (Graham et al., 1984). Ennek oka egyrészt az, hogy a baromfifélék mesterséges megtermékenyítését, mint szaporítási módot, csak nagyon szűk területen alkalmazzák rutinszerűen (tyúkfélék elitállományainál, illetve pulyka szülőpárok szaporításában), legtöbben a munka-, pénz- és eszközigényességére hivatkozva. Másik, ennél lényegesebb oka abban a madarakra jellemző szaporodásélettani különbségben keresendő, amely az in vivo spermium-tárolás következménye. Ismert, hogy a madár-spermiumoknak több héten át meg kell őrizni
termékenyítőképességüket az inszeminálást követően, ami egy fagyasztást követően óriási kívánalom, szemben az emlősök néhány órás, esetleg néhány napos túlélési szükségletével szemben. Mindez fokozottan nehezíti a hatékony termékenyítést a mélyhűtött madárondóval. 2. A közelmúlt és a jelen kutatásai Az 50-es évek nagy felfedezése után a baromfifélék spermiumainak fagyasztására irányuló komolyabb kutatások a 80-as évek elejétől kezdtek nagyobb lendületet venni, főként alapkutatási és génmegőrzési célokból (Buss, 1993). E kutatások, többek között, a különböző ondóvételi technikákra, a hígítók fajtáira, az inszeminálási ütemezésekre, a krioprotektánsok fajtáira és a mélyhűtési-felengedési ráta meghatározására terjedtek ki. Az ondógyűjtés technikája madarakban Burrows és Quinn (1937) masszázsmódszerével, illetve annak módosított változataival történik. Lake (1957) ajánlása szerint mélyhűtésre szánt ondónál transzparens fluid -mentes minta gyűjtése jobb minőséget eredményez. Az ondóplazma összetételéből kiindulva a glutamát-alapú hígítók váltak be baromfiféléknél (Lake et al., 1981; Duplaix and Sexton, 1983; Tajima et al., 1989), szemben az emlősök kloridalapú hígítóival. Számos, az előbbiek módosításával kidolgozott ondóhígító kipróbálásra került, többé-kevésbé hasonló eredményekkel, legalábbis ami a mélyhűtést illeti (Bakst, 1990; Surai and Wishart, 1996). 2.1. Krioprotektív anyagok, equilibráció A krioprotektánsok több fajtája kipróbálásra és alkalmazásra került a különféle baromfifajok és a nem domesztikált madarak ondójának fagyasztási kísérleteinél. A penetráló protektív anyagok közül tyúkféléknél leggyakrabban azóta is a glicerolt (Gly) használják, de az etilénglikolt (EG) és a propilénglikolt (PG) is hatásosnak találták (Hammerstedt and Graham, 1992). Kiderült, hogy az egyes fajok spermiumai eltérő védőanyagot igényelnek, pl.: pulyka esetében a dimetilszulfoxid (DMSO) (Sexton, 1981), viziszárnyasoknál és túzokféléknél a dimetilacetamid (DMA) (Schramm and Hübner, 1989; Hartley et a., 1998), Lukaszewicz (2001) szerint lúdnál a dimetilformamid (DMF) a leghatásosabb krioprotektáns. A ismert kísérletek alapján összeállított rangsor szerint a krioprotektív anyagok hatásossági sorrendben a következők voltak: Gly/DMF>DMA>EG>DMSO. Természetesen e rangsorolást nem lehet teljesen objektívnek tekinteni a különböző laboratóriumok eltérő felszerelései és protokolljai miatt. A nem penetráló krioprotektánsok közé sorolhatjuk a szukrózt (Surai and Wishart, 1996), a polyvinylpyrrolidint (Lake et al., 1981), a trehalózt (Terada et al., 1989) és a metilcellulózt (Phillips et al., 1996), az utóbbi hármat
a glicerollal kombinálva használták. Ezek közül csak a trehalózzal tudták igazolni in vitro, hogy javította a fagyasztott sperma minőségét (Terada et al., 1989). Az ondóminták fagyasztás előtti hígításával és az equilibrációs idők megválasztásával kapcsolatban is sok adat áll rendelkezésünkre. Míg Seigneurin és Blesbois (1995) szobahőmérsékleten hígítják az ondót először krioprotektáns nélkül, majd 5 C-on 40 percig equilibrálják a mintákat és csak ezt követően adják hozzá a krioprotektiv anyagot, addig Tselutin és mtársai (1995) 5 C-on hígítanak és equilibrálnak. Lake és mtársai (1981) már az első hígítást a krioprotektív anyaggal együtt végezték, 5 C-on. A krioprotektánssal végzett equilibrálás időtartama is változó az egyes kísérletekben (2, 10 illetve 60 perc) (Tselutin et al., 1995; Lake et al., 1981; Alexander et al., 1993), ennek ellenére általában egységesen 50% feletti termékenységet sikerült elérni. 2.2. A mélyhűtésre használt eszközök, hűtési és felengedési protokollok A különböző laboratóriumok eltérő eszközöket használnak az előkészített minták fagyasztására, a 2 ml-es üveg- (Lake et al., 1981), illetve műanyag ampulláktól kezdve (Wishart, 1995), a 0.25 és 0.5 ml-es műszalmákon át (Duplaix and Sexton, 1984; Seigneurin és Blesbois,1995) a 10 ml-es üvegcsövekig (Kurbatov et al., 1984). Sem az eltérő anyag, sem a műszalma mérete nem eredményezett szignifikáns különbséget a termékenyülésben (Ravie and Lake, 1984; Duplaix and Sexton, 1984), bár Bellagamba és mtársai (1993) szerint a műszalma megfelelőbb eredményeket adott a csövekben, illetve ampullákban történő fagysztáshoz képest. Buss (1993) kifejlesztett egy speciális fagyasztóberendezést (Cryocell R ), amely a fagyasztást-felengedést követően dialízissel kiszűri a glicerolt az ondómintából. Pellet formájában is fagyasztható a baromfisperma, vagy széndioxid (Terada et al., 1989), vagy nitrogéngőz (Kurbatov et al., 1984), vagy folyékony nitrogén (Tselutin et al., 1995) használatával. Napjainkra két fő irányzata alakult ki a madárspermiumok fagyasztásos tartósításának. A nyugati irányzat elsősorban glicerolt használ krioprotektánsként és nitrogéngőzben, műszalmában fagyaszt (Alexander et al., 1993; Phillips et al., 1996), vagy a lassú, programozott hűtési technikát alkalmazza műszalma, illetve ampullák használatával (Seigneurin and Blesbois, 1995; Tajima et al., 1989; Lake et al., 1981). Ezzel szemben a keleti irányzat az alternatív krioprotektánsok egész skálájával dolgozik (DMSO, DMA, EG, stb.), gyors módszerrel, a hígított mintákat közvetlenül folyékony nitrogénbe cseppentve pellet formájában. Néhány baromfifaj esetében ez utóbbi egyszerű módszer hatásában felülmúlja a kontrollált lassú hűtési protokollt (Tselutin et al., 1995).
A fagyasztást követő felolvasztás történhet alkohol- (Lake et al., 1981) vagy különböző hőmérsékletű (5, illetve 37 C-on) vízfürdőben (Phillips et al., 1996; Terada et al., 1989). Jó eredményeket értek el fokozatos felolvasztással is (Buss, (1993). A fent vázolt vizsgálatok és eredmények jól illusztrálják a tényt, miszerint az egyes baromfifajok ondómélyhűtésére nem lehet egységes protokollt kidolgozni, további kutatások szükségesek az egyes őshonos, ritka, illetve kihalással fenyegető madárfajok spermiumainak biztonságos megőrzése céljából. Az ondómélyhűtéshez kapcsolódó kutatómunka másik fontos iránya a mélyhűtés hatékonyságának becslése, amely a különféle spermium-funkciók in vitro tesztelésének kidolgozását jelenti, összehasonlítva az in vivo termékenységi vizsgálatokkal (Barna et al., 2000). Hazánkban az erre irányuló kutatások végső célja az őshonos baromfi-spermabank kialakítása. Irodalom Bakst, M.R. (1990): Preservation of avian cells. In: poultry Breeding and Genetics. 98-108. Crawford, E.D. (ed.) Elsevier Science Publishers, Amsterdam and New York. Barna, J.-Do thi Dong Xuan, K.-Szalay, I. (2000): Preliminary study on the in vivo sperm transport in goose. Proc. 14th Int. Conference on Animal Reproduction. Stockholm, Sweden. Vol.1. p.114. Bellagamba, F.-Cerolini, S.-Cavalchini, L.G. (1993): Cryopreservation of poultry semen: a review. World s Poultry Science Journal, 49. 157-166. Burrows, P.H.- Quinn, J.P. (1937): The collection of spermatozoa from the domestic fowl and turkey. Poultry Science. 16. 19-24. Buss, E.G. (1993): Cryopreservation of rooster sperm. Poultry Science. 72. 944-954. Crawford, R.D. ed. (1990): Poultry Breeding and Genetics. Elsevier Science Publishers, Amsterdam and New York. Duplaix, M.- Sexton, T.J. (1983): Effects of prefreeze treatment on the fertilizing capacity of unfrozen and frozen chicken semen: extender characteristics and dilution method. Poultry Science. 62. 2255-2260. Duplaix, M.-Sexton, T.J. (1984): Effects of type of freeze straw and thaw temperature on the fertilizing capacity of frozen chicken semen. Poultry Science. 63. 775-780. FAO (1990) Animal genetic resources. A global programme for sustainable development. FAO Animal Production and Health Paper 80. Food and Agriculture Organization of the United Nations, Rome, Italy. Graham, E.F.-Schmel, M.L.-Deyo, R.C.M. (1984): Cryopreservation and fertility of fish, poultry and mammalian spermatozoa. Proc. 10th Technical Conference on AI and Reproduction. Columbia, MO. 4-27. Hammerstedt, R.H.-Graham, J.K. (1992): Cryopreservation of poultry sperm: the enigma of glycerol. Cryobiology. 29.26-38. Hartley, P.S.-Lindsay, C.-McCormick, P.-Wishart, G.J. (1998): Houbara bastard produced from cryopreserved spermatozoa. Unpublished manuscript. Kurbatov, A.D. -Narubina, L.-Bubliaeva, G.-tselutin, K. (1984): Cryopreservation of cock semen. Pticevodstvo. 11.28-29. Lake, P.E. (1957): Fowl semen as collected by the massage method. Journal of Agricultural Science. 49. 120-126. Lake, P.E.-Ravie, O.-McAdam, J. (1981): Preservation of fowl semen in liquid nitrogen: application to breeding programmes. British Poultry Science. 22. 71-77. Lukaszewicz, E. (2001): DMF effects on frozen gander semen. British Poultry Science. 42. 308-314. National Research Council (1991): Microlivestock: Little- Known Small Animals with a Promising Ecinomic Future. National Academy Press, Washington, D.C., USA. Phillips, J.J.-Bramwell, R.K.-Graham, J.K. (1996): Cryopreservation of rooster sperm using methyl cellulose, Poultry science. 75. 915-923. Polge, C. (1951): Functional survival of fowl spermatozoa after freezing at 79 o C. Nature (London). 167, 949-950. Polge, C.-Smith, A.U.-Parkes, A.S. (1949): Revival of spermatozoa after vitrification and dehydration at low temperatures. Nature (London). 164: 666. Ravie, O.-Lake, P.E. (1984): A comparison of glass ampoules and plastic straws as receptacles for freezing fowl semen. Cryo- Letters. 5. 201-208. Schramm, G.P.-Hübner, R. (1989): Konservierung von Geflügelsperma. Archiv für Tierzucht. 32. 51-61. Seigneurin, F.-Blesbois, E. (1995): Effects of the freezing rate on viability and fertility of frozen-thawed fowl spermatozoa. Theriogenology. 43. 1351-1358. Sexton, T.J. (1981) Development of a commercial method for freezing turkey semen. Poultry Science. 60. 1567-1572. Shaffner, C.S.-Henderson, E.W.-Card, C.G. (1941): Viability of spermatozoa of the chicken under various environmental conditions. Poultry Science. 20. 259-265. Shaffner, C.S. (1942): Longevity of fowl spermatozoa in frozen condition.
Science 96. 337. Shaffner, C.S. (1964): Observations on freezing chicken semen. 5 th Int. Congress on Animal Reproduction and AI. Trento 3. 426-429. Sloviter, H. (1951): Recovery of human red blood cells after freezing. Lancet. 1. 823-824. Surai, P.F.-Wishart, G.J. (1996): Poultry artificial insemination technology in the countries of the former USSR. World s poultry Science journal. 52. 227-243. Szalay, I.-Barta, I.-Barna, J.-K. Do thi Dong Xuan-Lennert, L.-Hidas, A. (2000): Poultry genetic resources the Hungarian poultry breed collection. Proc. of 5 th Global Conference on the Conservation of Domestic Animal Resources. 2000. Brasilia. Tajima, A.-Graham, E.F.-Hawkins, D.M. (1989): Estimation of the relative fertilizing ability of frozen chicken spermatozoa using a heterospermic competition method. Journal of Reproduction and Fertility. 85. 1-5. Terada, T.-Ashizawa, K.-Meada, T.-Tsutsumi, Y. (1989): Efficacy of trehalose in cryopreservation of chicken spermatozoa. Japanese Journal of Animal Reproduction. 35. 20-25. Tselutin, K.-Narubina, L.-Mavrodina, T.- Tur, B. (1995): Cryopreservation of poultry semen. British Poultry Science. 36. 805-811. Wishart, G.J. (1995): Cryopreservation of Avian Spermatozoa. In: Cryopreservation and Freeze-Drying Protocols. Methods in Molecular Biology. (Day,J. and McLellan, M. Eds.) Humana Press Inc. 38. 167-177. Summary Conservation programmes of traditional poultry breeds involve the in situ conservation work by keeping and maintaining the various species, breeds and varieties in nucleus populations, and ex situ conservation works such as cryopreservation of spermatozoa and early embryonic cells, or at a subcellular level, storage of DNA or DNA-fragments for maintaining the valuable genetic material. The paper describes the present research situation in the field of cryopreservation of poultry spermatozoa. According to some authors semen cryopreservation is the most cost-effective germplasm conservation strategy. Domestic fowl were the first species to be bred with cryopreserved spermatozoa, in experiments which first demonstrated the cryoprotective action of glycerol. During the ensuing decades, various improvements in the technology for cryopreservation of domestic fowl spermatozoa have been devised, including programmable freezing protocols, systems for the removal of glycerol which is contraceptive to avian spermatozoa inseminated into the vagina and use of alternative cryoprotectants which do not require to be removed before insemination, such as dimethylsulphoxide, ethylene glycol, dimethylacetamide and dimethylformamide. The layout of this paper has been arranged to reflect the rather uneven distribution of information on the comparatively limited range of cryopreservation technologies which have been applied to avian species. Most work has involved developing methodologies for freezing spermatozoa of the domestic fowl and applications to semen of other species are based on these systems. Various stages of the application of cryopreservation still need to be improved. One of the most critical aspects is the choice of cryoprotectant and its use during the process of freezing and thawing. Most studies using fowl semen report final freezing temperatures between -79 C and -196 C, a cooling rate of 1-10 C/min and a thawing rate of 50-70 C/min. For some species the method is not reliable or yet suitably developed, thus further research is needed.