Használati utasítás CINtec PLUS Kit A CINtec PLUS Kit egy immunhisztokémiai assay, amely a p16 INK4a és Ki-67 fehérjék egyidejű, kvalitatív detektálására szolgál a méhnyakból származó szövetmetszetekben. A rendeltetése, hogy segítségként használják a vizsgált női populáción belüli magas fokozatú méhnyaki intraepithelialis lézió azonosításában, illetve az ASC-US Pap citológiai eredményű (nem meghatározott jelentőségű atipikus laphámsejtű) vagy LSIL (alacsony fokozatú intraepithelialis laphám léziójú) betegek alcsoportjában, vagy a pozitív magas rizikójú HPV teszteredményű betegek esetében. Roche mtm laboratories AG Sandhofer Straße 116 D-68305 Mannheim Germany www.cintec.info 9531 50 2 8 C
Tartalomjegyzék I. Termék neve... 2 II. Felhasználási terület... 2 III. Összegzés és az eszköz leírása... 2 Háttér... 2 Klinikai jelentőség... 3 Az eljárás elve... 5 IV. Reagensek... 6 Biztosított anyagok... 6 Tárolás... 8 Szükséges, de nem biztosított anyagok és reagensek... 8 Szükséges felszerelések... 9 V. Figyelmeztetések és óvintézkedések... 9 Figyelmeztetés... 9 Vigyázat!... 10 VI. Eljárások... 10 A citológiai minta előkészítése... 10 A minták festés előtti, hő által indukált epitóp visszanyerési kezelése... 12 Metszetfestési eljárások... 12 1. A reagens előkészítése... 12 1.1 Epitope Retrieval Solution... 12 1.2 Wash Buffer... 13 1.3. Szubsztrát-kromogén oldatok (DAB és Fast Red)... 13 1.4. Kontrasztfestés... 14 1.5 Rögzítő közeg... 14 2. Festési eljárás... 14 2.1. A minta rehidrációja... 14 2.2. Epitóp visszanyerés... 15 2.3. Festési protokollok... 16 2.3.1. Autostainer műszerekre vonatkozó festési protokoll (Dako, LabVision)... 16 2.3.2. Javasolt festési protokoll a Shandon Coverplate System berendezés esetén... 18 2.4. Hematoxilinnel történő kontrasztfestés... 19 2.5 Rögzítés... 20 VII. Minőség-ellenőrzés... 21 Pozitív kontroll... 21 Negatív kontroll... 21 A módszer ellenőrzése... 21 VIII. Az eredmények értelmezése... 21 IX. Korlátozások... 22 X. Teljesítményjellemzők... 23 XI. Hibaelhárítás... 29 XII. Jelek... 33 XIII. Gyártó... 33 XIV. Átdolgozás állapota... 33 XV. Jogi nyilatkozat... 33 1. melléklet: Szakirodalom... 34 2. melléklet: Táblázatok... 36 REF 9531 1 / 46 2009-9531-001HU Rev 2.2
I. Termék neve CINtec PLUS Kit II. Felhasználási terület Kizárólag in vitro diagnosztikai használatra. A CINtec PLUS Kit egy immunhisztokémiai assay, amely a p16 INK4a és Ki-67 fehérjék egyidejű, kvalitatív detektálására szolgál a méhnyakból származó szövetmetszetekben. A rendeltetése, hogy segítségként használják a vizsgált női populáción belüli magas fokozatú méhnyaki intraepithelialis lézió azonosításában, illetve az ASC-US Pap citológiai eredményű (nem meghatározott jelentőségű atipikus laphámsejtű) vagy LSIL (alacsony fokozatú intraepithelialis laphám léziójú) betegek alcsoportjában, vagy a pozitív magas rizikójú HPV teszteredményű betegek esetében. A készletet orvosi citológiai laboratóriumokban történő használatra tervezték. A vizsgálati eredmények értelmezését képzett szakorvosnak kell elvégeznie a beteg kórtörténetével és a további elvégzett diagnosztikai tesztekkel összhangban. III. Összegzés és az eszköz leírása Háttér Az eukarióta sejtekben a sejtosztódási ciklus folyamatának irányítására a szabályozott expressziók és a poszttranszlációs módosítások (pl. foszforiláció) komplex mintája van hatással, mint például a sejtciklust szabályozó proteinek. A p16 INK4a fehérje fontos szerepet játszik az eukarióta sejtciklus ezen szabályozási mechanizmusában. Ez a retinoblasztóma fehérje (prb) által közvetített G1-Sfázis átmenet része, és a sejtciklus leállítását váltja ki a sejtdifferenciálódási folyamat során. Így a p16 INK4a egy antiproliferatív hatást biztosít, amikor a normál sejtciklus folyamán expresszálódik. A véglegesen differenciálódott epithelialis sejtekben a p16 INK4a expressziója annyira le van fékezve, hogy az immuncitokémiával jellemzően nem mutatható ki [lásd a 31. és 35. hivatkozást]. A Ki-67 a proliferációhoz társuló fehérje, amelyet a nucleusban kizárólag proliferáló sejtekkel lehet észlelni. A részletes sejtciklus analízis megmutatta, hogy a Ki-67 antigén észlelhető szinten van jelen az összes fázisban és a mitózisban, viszont a G 0 -fázis nyugalomban lévő vagy inaktív sejtjei nem expresszálják az antigént [lásd a 3. és 26. hivatkozást]. Ahogyan a p16 INK4a -t túlexpresszáló sejtek csak azt követően proliferálnak aktívan, miután a sejtciklust szabályozó mechanizmus károsodott, az azonos sejten belüli Ki-67 és p16 INK4a proliferációs markereknek kölcsönösen ki kell zárniuk egymást a normál fiziológiai körülmények között. Ezért a Ki-67 és a p16 INK4a együttes kifejeződése egyes sejtekben felhasználható a sejtciklus-szabályozás deregulációjának indikátoraként. REF 9531 2 / 46 2009-9531-001HU Rev 2.2
Cervicalis intraepithelialis neoplasiában kimutatták, hogy a p16 INK4a erősen túlexpresszált a prb (retinoblasztóma fehérje) inaktiválásának köszönhetően, amelyet a magas rizikójú humán papillomavírus (HR-HPV) szerotípusok E7 onkoproteinje közvetít [13;22]. Mivel HPV-asszociált prekancerózus és rákos elváltozások során a malignus fenotípus kialakulásához és fennmaradásához E7 szükséges, a p16 INK4a fokozott kifejeződése közvetlen összefüggést mutat a különböző HR-HPV szerotípusok onkogenikus aktivitásával, ezért a p16 INK4a helyettesítő markerként való alkalmazása javasolt transzformáló HPV fertőzések esetén [lásd a 6; 31; és 35. hivatkozást]. Számos tanulmány elemezte és demonstrálta a p16 INK4a immunfestés klinikai felhasználhatóságát a méhnyak szövettanának [2;6;7;11-14;17;18;20-22;32] és a citológia [4-6;8-10;13;15;17;19;20;25;29;30;33;34;37] területén. A p16 INK4a által megfestett és a CINtec Histology Kit (Roche mtm laboratories AG) felhasználásával készített metszetek konjunktív értelmezése számtalan tanulmányban kimutatta a megbízhatóság vizsgálótól független szignifikáns javulását, illetve a CIN2 és magasabb fokozatú elváltozások pontosabb diagnózisát [2;11;14]. Ráadásul a p16 INK4a pozitív CIN1 elváltozások nagyobb valószínűséggel progrediálnak magas grádusú lézióvá mint a p16 INK4a negatív CIN1 minták [7;18]. A méhnyak szövettanában a p16 INK4a immunfestés hasznos kelléknek bizonyult a nem meghatározott jelentőségű atipikus laphámsejtű (ASC-US) vagy az alacsony fokozatú intraepithelialis laphám léziójú (LSIL) Pap-kenetek osztályozásában. A mögöttes CIN2 és magasabb fokozatú elváltozások kimutatásának szenzitivitása közel azonos a HPV-tesztek értékével, ugyanakkor a specificitásuk értéke magasabb [5;9;10;15;19;25;29;30;33;34;37]. Mindamellett a p16 INK4a citológia kiegészítő markerként való alkalmazása javasolt a méhnyakrákszűrés során pozitív HR-HPV eredményt mutató nők esetében [4]. Gyakorlatilag az összes magas fokozatú cervicalis intraepithelialis elváltozásban (azaz CIN2, CIN3 vagy magasabb grádusú léziók) kimutatták a p16 INK4a fokozott expresszióját [2;6;11;13;17;20;32]. Mivel CIN elváltozásokban az epithelialis sejtek nagy arányban mutatnak proliferációs aktivitást, a p16 INK4a és Ki-67 proteineket egyidőben expresszáló cervicalis epithelialis sejtek kimutatása felhasználható az átalakult sejtek indikátoraként. Ezért a méhnyaki szövettani minták értékelése, illetve a pozitív p16 INK4a és Ki-67 kettős festést mutató cervicalis epithelialis sejtek jelenléte alapján történő megközelítés lehetővé teszi a rákot megelőző és rákos elváltozások magas szenzitivitású és specificitású kimutatását. Klinikai jelentőség A sejtciklust szabályozó p16 INK4a protein és a Ki-67 proliferációs marker expressziójának immunfestett méhnyaki szövettani metszeten való egyidejű kimutatásának értelmezése segít a magas grádusú cervicalis intraepithelialis neoplasiában (HGCIN) szenvedő nők magas szenzitivitással és specificitással való felismerésében, amennyiben felhasználása: szűrt népességben történik a rutin Pap-tesztet kiegészítő eljárásként, ASC-US vagy LSIL eredményt mutató Pap-teszttel diagnosztizált betegek alcsoportjában történik, vagy negatív Pap-tesztet, ugyanakkor pozitív eredményű HPV-tesztet mutató betegek alcsoportjában történik. REF 9531 3 / 46 2009-9531-001HU Rev 2.2
A közegészségügy egyik legnagyobb kihívása, hogy a rutin méhnyakrákszűrés során hatékonyan felismerjék a HGCIN-ben szenvedő nőket. A magas fokozatú rákmegelőző állapotok alacsony prevalenciája miatt (jellemzően a nők kevesebb mint 1%-a tünetmentes a szűrt populációban) kulcsfontosságú azon szűrési módszerek elérhetősége, amelyek magas szenzitivitással és specificitással mutatják ki a fennálló HGCIN-t női páciensekben [24]. Azon országokban, ahol bevezették a szervezett lakossági méhnyakrákszűrést, a morfológiai elváltozások kimutatását szolgáló Pap-tesztnek köszönhetően sikeresen csökkent a méhnyakrák-asszociált morbiditás és mortalitás aránya az elmúlt évtizedekben. Ugyanakkor, összességében sikeresnek mondható mivolta ellenére egy Pap-teszt szenzitivitása nem éri el a kívánt értéket (jellemzően 50-70% körül mozog [16]), ami gyakori szűrést tesz szükségessé a citológia eredményének alacsony szenzitivitásának kompenzálása céljából. Ugyanakkor a Pap-teszt specificitása viszonylag magasnak mutatkozott, bár ez változhat az adott szűrt populáció jellegzetességeitől függően, beleértve az életkort, HPVprevalenciát, a Pap-teszt kivitelezésében való különbségeket (hagyományos kenet folyadékalapú citológiával szemben), technológiai különbségeket (manuális értékelés a számítógéppel támogatott citológiával és képalkotással szemben) és a vizsgáló szakmai tapasztalatát. A méhnyakrák és az azt megelőző léziók szűrését szolgáló Pap-teszt eredményességének javítása érdekében a HPV-teszt mint lehetséges megközelítés alkalmazása javasolt [24]. Habár a HPV kimutatása magas szenzitivitással bír a HGCIN-ben szenvedő nők felismerésében, a többnyire átmeneti, magas rizikójú HPV fertőzések magas prevalenciája összességében alacsony specificitást eredményez. Mivel a HPV prevalenciája az életkorral változik, a HPV kimutatás csak a Pap-kenet lehetséges kiegészítő eljárásaként javasolt 30 éves, illetve idősebb nők körében. [1] A hatékony elsődleges szűrési technológiák és algoritmusok optimális meghatározása mellett, a méhnyakrákszűrés egyéb területei is fokozott érdeklődést mutatnak, pl. a létező technológia tökéletesítése a HGCIN felismerési pontosságának optimalizálása érdekében, vagy olyan területek, amelyek jelenleg még nem rendelkeznek a szükséges kelléktárral. A nem egyértelmű (ASC-US, nem meghatározott jelentőségű atipikus laphámsejtek) vagy enyhén abnormális (LSIL, alacsony fokozatú intraepithelialis laphám lézió) Pap-teszt eredmények osztályozása tartozik ebbe a kategóriába, valamint az olyan 30 éves vagy idősebb nők kezelése, akik intraepithelialis léziókra vagy malignitásra vonatkozóan negatív Pap-/HPV-eredményt mutattak, de a magas kockázatú HPV-tesztjük pozitív lett. Az ASC-US citológiai abnormalitásainak osztályozása céljából kidolgoztak egy olyan osztályozási stratégiát, amely a mögöttes HGCIN kimutatása érdekében magába foglalja az ASC-US populáción belüli HPV kimutatást. Ugyanakkor a specificitás nem éri el az optimális értéket, és függ az életkortól [27;36]. Ráadásul, mivel az LSIL esetek túlnyomó többsége magas kockázatú HPV-szerotípusokra vonatkozóan pozitívnak mutatkozott [23], a HPV-pozitív LSIL esetek Paptesztjeinek osztályozása nem lenne túl hatékony. REF 9531 4 / 46 2009-9531-001HU Rev 2.2
Mivel a kolposzkópia kivitelezése korlátozott, illetve ezen beavatkozás és az alacsony fokozatú elváltozások következményes kezelésének költségei meglehetősen magasak, az ASC-US és az LSIL osztályozását célzó, hatékonyabb mutatókkal bíró tesztek elérhetősége folyamatos érdeklődést mutat, különös tekintettel a specificitás értékére. Egy magas szenzitivitású és specificitású biomarker teszt bevezetése, amely képes a magas fokozatú méhnyaki elváltozás felismerésére, jótékony hatással lenne a nem egyértelmű és alacsony fokozatú citológiai elváltozásokkal diagnosztizált női páciensek kezelésére. Egy ilyen teszt egyrészt megkönnyítené a betegek ASC-US Pap-kenet eredményeinek besorolását, másrészt megteremtené az LSIL Pap-teszt eredmények hatékony osztályzásának a lehetőségét. Az LSIL Pap-tesztek eredményeihez hasonlóan, a Pap-tesztre negatív, ugyanakkor magas rizikójú HPV-re pozitív szűrési eredmények további osztályozására jelenleg nincs lehetőség. A Pap/HPV kettős szűrések megközelítőleg 5-7%-át reprezentálja az esetek azon növekedést mutató csoportja, amely teljes kolposzkópiakontrollt igényel, hogy kihasználjuk a HPV-teszt Pap-tesztnél magasabb detekciós rátáját. Mivel e szűrési eredmények csoportjában a fennálló magas grádusú kóros állapotok aránya viszonylag alacsony lehet, egy hatékony osztályozási módszer elérhetősége igencsak kívánatos a pozitív HPV eredményű, ugyanakkor normális Pap-tesztet produkáló nők hatékony kezelésében. Az eljárás elve A CINtec PLUS Kit a p16 INK4a és a Ki-67 antigének immuncitokémiai kimutatását szolgáló reagensek készletét tartalmazza. A kit a méhnyakból vett citológiai minta két lépésből álló immuncitokémiai festési eljárásának elvégzésére szolgál. Az antigének kimutatására egy elsődleges, monoklonális, a p16 INK4a proteinre irányuló E6H4 egérantitestklónt, illetve egy szintén elsődleges, monoklonális, a humán Ki-67 protein ellen irányuló 274-11 AC3 nyúlantitestklónt alkalmaznak. Használatra kész vizualizációs reagensek kerülnek alkalmazásra, amelyek (I) torma peroxidázhoz és kecske anti-egér Fab antitest fragmentumhoz konjugált polimer reagenst, valamint (II) alkalikus foszfatázhoz és kecske anti-nyúl Fab antitest fragmentumhoz konjugált polimer reagenst tartalmaznak. A vizualizációs reagensek szilárd fázisú abszorpcióra lettek kialakítva a humán immunglobulinnal való keresztreakciók kiküszöbölésére. A kromogén reakciók alapját a DAB (diaminobenzidin-tetrahidroklorid) kromogén torma peroxidáz által közvetített, illetve a Fast Red kromogén alkalin foszfatáz által közvetített, a megfelelő antigénkötő helyen történő, látható reakciótermékké való átalakulása képezi. Kontrasztfestést követően egy két lépésből álló rögzítési protokoll szerint kell eljárni: első lépésben a minták vízbázisú ragasztóval való rögzítése szükséges (a vízbázisú ragasztót a kit tartalmazza). Ezt követően helyezzük a tárgylemezre a fedőlemezt pl. egy tartós rögzítő közeg alkalmazásával. Az eredményeket fénymikroszkópos megfigyeléssel értékelhetjük. REF 9531 5 / 46 2009-9531-001HU Rev 2.2
IV. Reagensek Biztosított anyagok Az alább felsorolt anyagokat minden kit tartalmazza, mennyiségük 50 teszt elvégzésére elegendő. A tesztek száma tárgylemezenként 200 µl mennyiségű reagensben értendő. 1 Peroxidase Blocking Reagent Peroxidase Blocking Reagent 11,5 ml, használatra kész állapotban. 3%-os hidrogén-peroxid, 15 mmol/l nátrium-azidot tartalmaz (NaN 3 ). Kérésre anyagbiztonsági adatlapot biztosítunk. 2 Primary Antibodies Solution Primary Antibodies Solution 11,5 ml, használatra kész állapotban. Monoclonal mouse anti-human p16 INK4a antibody, Clone E6H4 és monoclonal rabbit anti-human Ki-67 antibody Clone 274-11 AC3, 50 mm Tris puffer ph 7,2 kiszerelésben, 15 mmol/l nátrium-azidot (NaN 3 ) és stabilizáló proteint tartalmaz. 3 Visualization Reagent HRP Visualization Reagent HRP 11,5 ml, használatra kész állapotban. Torma peroxidázhoz és affinitás-tisztított kecske anti-egér Fab antitest fragmentumokhoz konjugált polimer reagensek, tartósítószert és stabilizáló proteint tartalmazó stabilizáló oldatban tárolva. 5-bromo-5-nitro-1,3-dioxánt tartalmaz, amely allergiás reakciót válthat ki. Kérésre anyagbiztonsági adatlapot biztosítunk. 4 Visualization Reagent AP Visualization Reagent AP 11,5 ml, használatra kész állapotban. Alkalikus foszfatázhoz és affinitás-tisztított kecske anti-nyúl Fab antitest fragmentumokhoz konjugált polimer reagensek, tartósítószert és stabilizáló proteint tartalmazó stabilizáló oldatban tárolva. 5-bromo-5-nitro-1,3-dioxánt tartalmaz, amely allergiás reakciót válthat ki. Kérésre anyagbiztonsági adatlapot biztosítunk. REF 9531 6 / 46 2009-9531-001HU Rev 2.2
5 DAB Buffered Substrate DAB Buffered Substrate 16,0 ml, Szubsztrátpufferoldat, ph 7,5, < 0,1%-os hidrogén-peroxidot, stabilizáló anyagokat, enhancer elemeket és antimikrobiális hatóanyagokat tartalmaz. 6 DAB Chromogen DAB Chromogen 0,85 ml, 3,3 -diaminobenzidin kromogén oldat. A DAB ártalmas. Olvassa végig a veszélyekre/kockázatokra (R-mondatok) és a biztonságos használatra (S-mondatok) utaló mondatokat: R40 A rákkeltő hatás korlátozott mértékben bizonyított. R43 Bőrrel érintkezve túlérzékenységet okozhat (szenzibilizáló hatású lehet). R68 Maradandó egészségkárosodást okozhat. S35 Az anyagot és edényzetét megfelelő módon ártalmatlanítani kell. S36/37 Megfelelő védőruházatot és védőkesztyűt kell viselni. MEGJEGYZÉS: Bár a diaminobenzidin a benzidinhez hasonló szerkezettel rendelkezik, a diaminobenzidin karcinogenitása nem bizonyított. Ártalmatlanítás során a szövetségi, az állami és a helyi előírásoknak megfelelően járjon el. Kérésre anyagbiztonsági adatlapot biztosítunk. 7 Naphthol Phosphate Substrate Naphthol Phosphate Substrate 25,0 ml, Szubsztrátpufferoldat, ph 9,2, naftol AS-TR foszfát szubsztrátot, stabilizáló anyagokat, enhancer elemeket és antimikrobiális hatóanyagokat tartalmaz. 8 Fast Red Chromogen Fast Red Chromogen 1,33 ml, Fast Red kromogén oldat. 9 Epitope Retrieval Solution 10 x Epitope Retrieval Solution 10 x 500 ml, 100 mm Tris, 10 mm EDTA, ph 9,0, 15 mmol/l nátrium-azidot (NaN 3 ) tartalmaz. REF 9531 7 / 46 2009-9531-001HU Rev 2.2
10 CINtec PLUS Mount Tárolás CINtec PLUS Mount 18,0 ml, vízbázisú tartós rögzítőközeg. A tárgylemezen lévő minta tartós konzerválására peroxidáz és alkalikus foszfatázalapú vizualizációs rendszerek segítségével megfestve. 7,7 mmol/l nátrium-azidot tartalmaz (NaN 3 ). 2 8 C hőmérsékleten tárolandó. Ne használja a lejárati időn túl. A fent említett értékektől eltérő körülmények között nem határozták meg a reagensek tárolására vonatkozó adatokat. A csomagolás eltávolítását követően a kit alkotórészei 6 hónapon keresztül stabil állapotban maradnak, amennyiben tárolásuk 2 8 C hőmérsékleten történik. Amennyiben az oldat zavaros, meg kell semmisíteni. A CINtec PLUS Mount üvegcsét (10. üvegcse) a kit első felbontását követően el kell távolítani a dobozból, és a továbbiakban környezeti hőmérsékleten kell tárolni (2 30 C). A Diluted Wash Buffer és a hígított Epitope Retrieval Solution 1 hónapon keresztül stabil állapotban marad, amennyiben tárolása 2 8 C hőmérsékleten történik. Amennyiben az oldat zavaros, használata szigorúan tilos. Szükséges, de nem biztosított anyagok és reagensek A CINtec PLUS Kittel használandó Wash Buffer megrendelhető a 8550-es katalógusszám alatt a Roche mtm laboratories AG-től, de a kit nem tartalmazza. Megrendeléssel kapcsolatos információkat a www.cintec.info oldalon talál. Alkoholmentes hematoxilin kontrasztfestés céljából. Desztillált vagy ionmentesített víz. Etanol, 99% Xilénalapú rögzítő közeg az üveg fedőlemez felhelyezésére. Tárgylemezek: SuperFrost PLUS, ThinPrep Microscopy Slides; BD SurePath PreCoat tárgylemezek. Xilén; Üveg vagy film fedőlemezek; Feldolgozás ellenőrzés pl. ThinPrep tárgylemezek: a reziduális minta üvegcséjéből készült Pozitív ellenőrzés: ThinPrep (összevont) mintá(k)ból származó tárgylemez magas fokozatú intraepithelialis laphám léziót (HSIL) igazoló Pap-teszt eredményével. Negatív ellenőrzés: (összevont) mintá(k)ból származó ThinPrep tárgylemez intraepithelialis laphám lézióra vagy malignitásra negatív (NILM) Pap-teszt eredményével. REF 9531 8 / 46 2009-9531-001HU Rev 2.2
Szükséges felszerelések Fénymikroszkóp (10 40x nagyítású objektív); Hőálló festőedények (műanyag); Mérőhengerek; Fecskendős üveg (mosó pufferrel kell feltölteni); Stopperóra (30 másodperces 60 perces intervallumokat lehet beállítani); Fedeles vízfürdő (képes az Epitope Retrieval Solutiont 95 99 C-on tartani); Hőmérő. V. Figyelmeztetések és óvintézkedések Figyelmeztetés 1. Vigyázat! A kit egyes reagensei veszélyes vegyi anyagokat tartalmaznak. A kit tartalmának használata során tartsa be a veszélyes laboratóriumi reagensekre vonatkozó biztonsági óvintézkedéseket. 2. A termék 1., 2., 9. és 10. komponense nátrium-azidot tartalmaz (NaN 3 ), ami vegytiszta formában erősen mérgező. Bár nem minősítették veszélyesnek, de normális koncentrációs értékeken a nátrium-azid az ólom- és rézcsövekkel reakcióba léphet, és potenciálisan robbanékony fém-azidokat hozhat létre. Megsemmisítéskor, megelőzendő az azidok vízvezetékekben történő lerakódását, nagy mennyiségű vízzel kell leöblíteni. 3. A 2., 3. és 4. jelölésű komponensek állati eredetű anyagot tartalmaznak. Tartsa be a biológiai eredetű termékek használatára vonatkozó megfelelő előírásokat. 4. Kérésre a kitre vonatkozó anyagbiztonsági adatlapot biztosítunk. 5. Citológiai minták használata és ártalmatlanítása során, beleértve minden mintát a fixációt megelőzően, illetve követően, valamint a mintáknak kitett anyagokat, tartsa be a potenciálisan fertőzésveszélyes anyagokra vonatkozó biztonsági óvintézkedéseket, illetve a hulladékkezeléssel kapcsolatos előírásokat. 6. Soha ne pipettázzon szájjal! Kerülje a bőr és a nyálkahártyák reagenssel, illetve mintával való érintkezését! Ha a reagens vagy minták bőrfelületre vagy nyálkahártyára kerülnek, bő vízzel mossa le. 7. A vizualizációs reagenseket, a DAB Chromogent és a Fast Red Chromogent káros hatások érhetik, amennyiben túlságosan erős fénynek vannak kitéve. Ne tárolja erős fényben a kit komponenseit, valamint ne végezzen festést erős fényben, pl. közvetlen napfényben. 8. Viseljen megfelelő védőfelszerelést, hogy a CINtec PLUS Kit részét képező vagy azzal együtt alkalmazandó komponensek használata közben elkerülje azok szemmel vagy bőrrel való érintkezését. További információkat lásd a termék biztonsági adatlapján. REF 9531 9 / 46 2009-9531-001HU Rev 2.2
Vigyázat! 1. Kizárólag in vitro diagnosztikai használatra. 2. Kizárólag szakszerű használatra. 3. Kerülje a reagensek mikrobiális szennyezését, hogy megelőzze a nem specifikus festést. 4. A meghatározott inkubációs időktől, hőmérsékletektől és eljárásoktól való eltérés téves eredményekhez vezethet. 5. A komponensek csomagolásának sérülése esetén ne használja a kit tartalmát! A csomagolás vagy a csomag tartalmának sérülése esetén haladéktalanul vegye fel a kapcsolatot a gyártóval. 6. A hulladékanyagok ártalmatlanításának a helyi irányelvek és előírások szerint kell történnie. 7. Minden reagens kifejezetten erre a tesztre való használatra lett kifejlesztve. Mivel a teszt specifikus, a reagensek helyettesítése, cseréje nem megengedett. 8. Nem várt, laboratóriumi hibával nem magyarázható festés megjelenése esetén, illetve a CINtec PLUS Kit kapcsán felmerülő probléma gyanúja során, további információkért és műszaki segítségért haladéktalanul látogasson el a www.cintec.info oldalra. 9. A termék kezelési problémákból vagy instabilitásból adódó hibás működése nem mutatkozik meg egyértelmű jelek formájában. Ezért mint minőségellenőrzési intézkedés, pozitív és negatív kontroll egyidejű futtatása szükséges páciensekből vett mintákon. VI. Eljárások A citológiai minta előkészítése A citológiai minták immuncitokémiai eljárásokra való megőrzéséhez a mintákat adekvát módon kell kezelni. Minden mintát a sejtfeldolgozás standard módszerei szerint kell felhasználni. ThinPrep (Hologic Inc.) tárgylemezek ThinPrep 2000 Processor (Hologic Inc.) segítségével készültek a gyártó protokollja alapján, BD SurePath (BD Diagnostics Tripath) a gyártó protokollja alapján készült tárgylemezek, illetve a manuálisan készült tárgylemezek (hagyományos kenetek) egyaránt alkalmasak a felhasználásra. Megjegyzések: 1. ThinPrep a minta előkészítése: Kérjük, vegye figyelembe, hogy a ThinPrep 3000 Processor használata nem ajánlatos, mivel a műszer által végzett spray fixációs eljárás jelentős sejtvesztéshez vezethet. REF 9531 10 / 46 2009-9531-001HU Rev 2.2
2. A BD SurePath minta előkészítése: Mivel egyes esetekben arról számoltak be, hogy a fennmaradó sejtanyag tárolása a vizes dúsítást követően káros hatással lehet az immuncitokémiai jel intenzitására, nyomatékosan ajánljuk az alábbi utasítások követését a tárgylemezek CINtec PLUS vizsgálatra való előkészítése során, hogy megelőzzük a jelvesztést: a. Tárgylemez-előkészítés közvetlenül a Pap-kenet feldolgozását követően. i. Minden esetben előkészíthetünk egy második tárgylemezt közvetlenül a megfelelő SurePath tárgylemez Pap-festését követően. ii. Helyezzen egy másik készlet címkézett tárgylemezt a tárgylemeztartóba. iii. A PrepStain -en az 1.1-es vagy az 1.2-es verziójú GYN-t futtatva, Slide Preparation, válassza a Transfer only programot. b. Tárgylemez előkészítés a dúsított sejtüledékből a Pap tárgylemez későbbi előkészítését követően. i. Távolítsa el a csőtartót a PrepStain Systemről és adagoljon megközelítőleg 2 ml SurePath Preservative Fluidot minden egyes csőbe. ii. Zárja le mindegyik csövet és tárolja 4 héten át szobahőmérsékleten vagy lehűtve (2 8 C) legfeljebb 6 hónapig. iii. Ha a tárgylemezt CINtec PLUS számára tárolt mintához kívánjuk felhasználni, engedjük, hogy a minta 1 óra leforgása alatt felvegye a szobahőmérsékletet. A GYN dúsítási folyamat második centrifugálási lépésével indítson és fejezze be a Prep folyamat hátralevő részét. c. Tárgylemez előkészítés a maradék mintaanyagból, amely az eredeti minta üvegcsében maradt meg (megközelítőleg 2 ml). i. Adjon 8 ml SurePath Preservative Fluidot a fennmaradó mintához a SurePath üvegcsébe (kb. 2 ml). ii. A hígított mintát dolgozza fel a PrepMate segítségével a standard módszert használva és a PrepStain segítségével az 1.1-es vagy az 1.2-es verziójú GYN-t futtatva, Slide Preparation, majd válassza a Transfer only programot. Közvetlenül az előkészítés után, a ThinPrep vagy BD SurePath tárgylemezeket fixálja 99%-os etanolban 10 perctől 1 óráig terjedő ideig és szárítsa levegőn 20 perctől 16 óráig terjedő ideig (éjszaka). ThinPrep vagy BD SurePath citológiai előkészítését tilos polietilén-glikol tartalmú citológiai spray fixációs reagenssel végezni (pl. Merckofix, Merck). A hagyományos kenetek fixációját polietilén-glikol tartalmú citológiai spray fixációs reagenssel kell végezni (pl. Merckofix, Merck) közvetlenül a mintavétel után. Az immunfestési eljárás megkezdése előtt rehidrálja az összes mintát a 2.1. pontban leírt specifikus protokoll szerint. REF 9531 11 / 46 2009-9531-001HU Rev 2.2
MEGJEGYZÉS: Minimális szennyezettségű etanol szükséges a ThinPrep folyadékbázisú citológiai tárgylemezek fixációjához a háttérfestődés elkerülése érdekében. Az immunfestésre használatos ThinPrep tárgylemezek előkészítése során cseréljen etanolfürdőt minden 25. ThinPrep tárgylemez fixációja után. A minták festés előtti, hő által indukált epitóp visszanyerési kezelése Hő által indukált epitóp visszanyerés (HIER) a kit részét képező Epitope Retrieval Solutiont használva szükséges az optimális assay teljesítmény biztosításához. A leírt eljárástól való eltérés befolyásolhatja az eredményeket! Hő által indukált epitóp visszanyerés esetén, a citológiai minta felmelegítését az Epitope Retrieval Solutionbe való merítése által kell elérni egy olyan kalibrált vízfürdő segítségével, amely képes az Epitope Retrieval Solutiont 95 99 C-os hőmérsékleten tartani. Magasabb elhelyezkedésű laboratóriumok esetében a legkézenfekvőbb módszert kell alkalmazni a vízfürdő kívánt hőmérsékletének eléréséhez. A gyártó nem javasolja az itt leírt eljárástól való bármilyen eltérést. Hő által indukált epitóp-visszanyerést követően, a citológiai mintát 20 percig vagy hosszabb ideig környezeti hőmérsékleten kell tartani, amíg a minta hőmérséklete nem csökkent le 50 C-ig. Csak ezt követően kezdhetjük meg a minta további feldolgozását. Ezután a citológiai minta festését haladéktalanul el kell végezni. Metszetfestési eljárások A kit 50 teszt elvégzésére elegendő reagensmennyiséget tartalmaz. A tesztek száma tárgylemezenként 200 µl mennyiségű reagensben értendő. Metszetenként 200 µl reagens ajánlott a ThinPrep vagy BD SurePath tárgylemezek citológiai előkészítésére a Dako vagy a LabVision Autostainer műszerek használatával (metszetenként két, 100 µl-es cseppentési zóna), valamint a Shandon Coverplate System (Thermo Fisher Scientific Inc.) használatával. A Shandon Coverplate System használata során metszetenként 200 µl reagens ajánlott a hagyományos kenetek feldolgozására. Ugyanakkor a hagyományos kenetek teljes lefedettségének biztosítása érdekében a Dako vagy a LabVision Autostainer műszerek alkalmazása során metszetenként 300 µl reagens (100 µl mindhárom rendelkezésre álló cseppentési zónára) használata ajánlott. 1. A reagens előkészítése A festési eljárás megkezdése előtt, a Fast Red munkaoldatot leszámítva, az alábbi reagensek előkészítése javasolt. Immunfestés előtt legyen minden reagens szobahőmérsékletű (20 25 C). 1.1 Epitope Retrieval Solution Készítse elő az Epitope Retrieval Solution festési eljáráshoz elegendő mennyiségét, ami a 9. üvegcse (Epitope Retrieval Solution 10 x) tartalmának 1:10 arányú, desztillált vagy ionmentesített vízben történő hígításával készül. Hígítás után az Epitope Retrieval Solution 2 8 C hőmérsékleten tárolandó legfeljebb egy hónapon át. Amennyiben az oldat zavaros, meg kell semmisíteni. REF 9531 12 / 46 2009-9531-001HU Rev 2.2
MEGJEGYZÉS: Magas iontartalmú víz használata az epitope retrieval solution hígítása során jelentősen csökkentheti a teszt festési teljesítményét. Kérjük, győződjön meg arról, hogy a felhasznált víz megfelelően desztillált és ionmentesített (vagyis az ionmentesített víz előállítására szolgáló ioncserélő oszlop átesett-e a rutin karbantartási vizsgálaton). Ne használjon csapvizet! 1.2 Wash Buffer Használjon 8550-es katalógusszámú Wash Buffert (10 x), amelyet a Roche mtm laboratories AG biztosít a CINtec PLUS Kit termékkel. Megrendeléssel kapcsolatos információkat a www.cintec.info oldalon talál. Készítse elő a Wash Buffer mosás lépéseihez elegendő mennyiségét, ami a Wash Buffer (10 x) tartalmának 1:10 arányú, desztillált vagy ionmentesített vízben történő hígításával készül. Hígítás után a Wash Buffer 2 8 C hőmérsékleten tárolandó legfeljebb egy hónapon át. Amennyiben az oldat zavaros, meg kell semmisíteni. 1.3. Szubsztrát-kromogén oldatok (DAB és Fast Red) Győződjön meg arról, hogy mind a kromogének, mind a szubsztrátok hőmérséklete megegyezik a szobahőmérséklettel (20 25 C). Túl nagy mennyiségű kromogén adása a szubsztráthoz a pozitív jel romlását eredményezi. A) A DAB munkaoldat előkészítése a festési folyamat előtt Előkészítést követően a DAB munkaoldat 8 órán keresztül marad stabil. A DAB munkaoldatot az alábbiak szerint készítse elő: i) Töltsön 1 ml DAB Substrate Solutiont (5. üvegcse) egy tiszta kémcsőbe. ii) Adjon egy cseppet (25 30 µl) a DAB Chromogenből (6. üvegcse) és a cső megfordításával óvatosan keverje azt össze (ne rázza fel!). iii) Az Autostainer használata során, a festési eljárást megelőzően töltsön DAB munkaoldatot az Autostainer reagens üvegcsébe, majd helyezze az Autostainer-tartó megfelelő pozíciójába. B) A Fast Red munkaoldat előkészítése közvetlenül használat előtt A Fast Red munkaoldatot közvetlenül használat előtt készítse elő, különben a festés intenzitásának csökkenése, és ezért a szenzitivitás elvesztése állhat elő. Ne rázza fel a Fast Red munkaoldatot, mivel ez csapadék képződéséhez vezethet. A Fast Red munkaoldatot az alábbiak szerint készítse elő: i) Töltsön 1 ml Naphthol Phosphate Substrate Solutiont (7. üvegcse) egy tiszta kémcsőbe. ii) Adjon egy cseppet (40 45 µl) a Fast Red Chromogenből (8. üvegcse) és a cső megfordításával óvatosan keverje azt össze (ne rázza fel!). iii) Az Autostainer használata során akkor készítse elő a Fast Red munkaoldatot, amikor ezt az Autostainer szoftver jelzi. Ezt követően töltse a munkaoldatot az Autostainer reagens üvegcsébe, majd helyezze az Autostainer-tartó megfelelő pozíciójába. Az Autostainer működtetése során kerülje a substrate batch lépés késleltetését a szárítási műtermékek képződésének minimalizálása érdekében. REF 9531 13 / 46 2009-9531-001HU Rev 2.2
1.4. Kontrasztfestés A DAB és Fast Red festési reakciók vízben nem oldódó, színes végtermékeket képeznek (DAB: barna; Fast Red: piros). MEGJEGYZÉS: Kontrasztfestéshez alkoholmentes hematoxilint használjon, mert az alkohol használata negatívan befolyásolhatja vagy teljesen eltüntetheti a Fast Red által generált jelet. Amennyiben mégis ilyen hematoxilint használ, kontrasztfestés során tartsa be a hematoxilin forgalmazójának utasításait. 1.5 Rögzítő közeg A minták festést követő rögzítése során egy két lépésből álló rögzítési eljárás szerint járjon el az alábbiak szerint. Először CINtec PLUS Mount (10. üvegcse), egy vízbázisú tartós rögzítő közeget alkalmazunk manuálisan vékony bevonattal, ami lehetővé teszi a száradást ( a fedőlemez nedves felhelyezése ). Második lépésben egy üveg fedőlemezt helyezünk fel a vízbázisú rögzítő közeg megszáradt felszínére xilénbázisú rögzítő közeg felhasználásával. Használat előtt várja meg, amíg a CINtec PLUS Mount felveszi a szobahőmérsékletet, és további felhasználás esetén azt szobahőmérsékleten tárolja. 2. Festési eljárás A CINtec PLUS Kitet hitelesített Autostainer műszerekkel (pl., a LabVision Autostainer 480 vagy a Dako Autostainer PLUS) való használatra tervezték az alább látható minta szerint (lásd 2.3.1. pont), valamint a Shandon Coverplate Systemmel való használatra is hitelesítették (lásd 2.3.2. pont). Festés előtt a mintákat és a reagenseket az 1.1.-1.3., illetve 2.1. pontokban leírt módon kell előkészíteni. Az immunfestési eljárás előtt minden reagens vegye fel a környezet hőmérsékletét (20 25 C). Hasonlóképpen, minden lépést környezeti hőmérsékleten végezzen el. Festési eljárás során kerülje a minták száradását. A szárított minta a nem specifikus festődés fokozódását eredményezheti. Hosszabb inkubáció esetén a mintákat helyezze nedves környezetbe. 2.1. A minta rehidrációja Minden citológiai minta esetén egy rehidrációs lépés szükséges a festési eljárás megkezdése előtt. Ezt a lépést környezeti hőmérsékleten (20 25 C) végezze el. A) ThinPrep folyadékalapú citológiai metszetek és hagyományos kenetek A metszeteket helyezze desztillált vagy ionmentesített vízbe, majd inkubálja 10 (±3) percen keresztül. A festési eljárást a 2.2. pont első lépése szerint kezdje meg: Epitóp visszanyerés. B) BD SurePath citológiai tárgylemezek Alkohollal fixált BD SurePath citológiai metszeteknek egy speciális rehidrációs módszeren kell átesniük, hogy a speciális bevonatú üvegmetszetek kompatibilisek legyenek a fedőlemez folyékony közegével. REF 9531 14 / 46 2009-9531-001HU Rev 2.2
Győződjön meg arról, hogy a metszetek teljesen légszárazak. Helyezze a metszeteket friss 100%-os xilén fürdőbe (xilénnek ellenálló edényeket használjon); mártsa be néhányszor, majd inkubálja a metszeteket 2 percig. Helyezze a metszeteket friss 99%-os etanol fürdőbe, majd inkubálja azokat 2 percig. Helyezze a metszeteket friss 70%-os etanol fürdőbe, majd inkubálja azokat 2 percig. A metszeteket helyezze desztillált vagy ionmentesített vízbe, majd inkubálja azokat 2 percig. Megjegyzés: 50 metszet feldolgozását követően, vagy kisebb számú metszetfelhasználás esetén hetente egyszer cserélje a dehidrációra szolgáló fürdő tartalmát. 2.2. Epitóp visszanyerés A) ThinPrep folyadékalapú citológiai metszetek és hagyományos kenetek: A hőálló festőedényeket (műanyag) töltse meg hígított Epitope Retrieval Solutionnel (lásd Eljárás, 1.1. pont). Helyezze vízfürdőbe az Epitope Retrieval Solutiont tartalmazó festőedényeket, majd hevítse fel a vízfürdőt és az Epitope Retrieval Solutiont 95 99 C hőmérsékletre. A hőmérsékletet a festőedények belsejében kell mérni. Lényeges, hogy a vízfürdőben beállítsuk a víz szintjét biztosítva azt, hogy az edények 80%-a víz alá kerül. A hőmérséklet stabilizálása és a párolgás elkerülése érdekében zárja le fedéllel az edényeket. 95 99 C-os hőmérséklet elérését követően a rehidrált citológiai metszeteket merítse a festőedényekben előmelegített Epitope Retrieval Solutionbe; ez a lépés általában 90 C alá csökkenti az edények hőmérsékletét. A hőmérsékletérzékelőt hagyja az edényekben, majd a lehető leggondosabban zárja le az edények fedelét. A vízfürdőt és az edényekben lévő Epitope Retrieval Solutiont melegítse fel újra 95 99 C-os hőmérsékletre; ellenőrizze az edényekben lévő Epitope Retrieval Solution hőmérsékletét. Inkubáljon 10 (±1) percig 95 99 C hőmérsékleten; a visszaszámlálást csak az után kezdje meg, hogy az edényekben lévő Epitope Retrieval Solution hőmérséklete igazoltan elérte a 95 99 C értéket. Távolítsa el a vízfürdőből az egész edényt a metszetekkel együtt. Távolítsa el a festőedények fedelét, és hűtse a metszeteket az Epitope Retrieval Solutionben 20 (±1) percen át környezeti hőmérsékleten, amíg a hőmérsékletük nem éri el az 50 C értéket. A metszeteket helyezze egy Wash Bufferrel töltött festőedénybe (lásd Eljárás, 1.2. pont) és inkubáljon 5 (±1) percen át a metszetek Autostainer műszerre való elhelyezését megelőzően. A Shandon Coverplate System használata során, gyűjtse össze a metszeteket és a fedőlapokat a REF 2010-953-009EN protokoll szerint (elérhető: Roche mtm laboratories AG). REF 9531 15 / 46 2009-9531-001HU Rev 2.2
B) BD SurePath citológiai tárgylemezek A hőálló festőedényeket (műanyag) töltse meg hígított Epitope Retrieval Solutionnel (lásd: Eljárás, 1.1. pont). Kérjük, vegye figyelembe, hogy nem hőálló műanyagból, hanem fémből vagy hőálló üvegből készült edények használata során az epitóp-visszanyerési idő egyénileg módosul. A metszeteket merítse a hideg Epitope Retrieval Solutionbe; zárja le a festőedény fedelét. Helyezze a festőedényt hideg vízfürdőbe és várjon, amíg a vízfürdő és az Epitope Retrieval Solution hőmérséklete el nem éri a 95 99 C-ot, majd a hőmérséklet elérését követően inkubáljon 15 percig; kérjük, vegye figyelembe, hogy a 95 99 C hőmérséklet elérése nem tarthat tovább 40 percnél. Távolítsa el a vízfürdőből az egész edényt a metszetekkel együtt. Távolítsa el a festőedények fedelét, és hűtse a metszeteket az Epitope Retrieval Solutionben 20 (±1) percen át környezeti hőmérsékleten, amíg a hőmérsékletük el nem éri az 50 C értéket. A metszeteket helyezze egy Wash Bufferrel töltött festőedénybe (lásd: Eljárás, 1.2. pont) és inkubáljon 5 (±1) percen át a metszetek Autostainer műszerre való elhelyezését megelőzően. A Shandon Coverplate System, használata során, gyűjtse össze a metszeteket és a fedőlapokat a REF 2010-953-009EN protokoll szerint (elérhető: Roche mtm laboratories AG). MEGJEGYZÉS: Az Epitope Retrieval Solution egyszeri használatra van tervezve. Ne használja újra! 2.3. Festési protokollok 2.3.1. Autostainer műszerekre vonatkozó festési protokoll (Dako, LabVision) A CINtec PLUS Kit Autostainer műszeren való első használata előtt, egy új minta beállítása szükséges, és a CINtec PLUS Kit reagenseket hozzá kell adni az Autostainer reagens listájához ( Reagenslista ). Kérjük, tanulmányozza át az adott Autostainerhez tartozó kezelői kézikönyvet. Metszetenként 200 µl reagens ajánlott a ThinPrep vagy BD SurePath citológiai készítmények feldolgozásához. Hagyományos kenetek Dako vagy LabVision Autostainer műszereken való alkalmazása esetén metszetenként 300 µl reagens használata lehet szükséges. REF 9531 16 / 46 2009-9531-001HU Rev 2.2
Az alábbi táblázatban a programfutások vázlata látható: Program Lépés ThinPrep citológiai készítmények és hagyományos kenetek 1 öblítés* öblítés* 2 Peroxidase-Blocking Reagent 5 perc 3 öblítés* öblítés* 4 Primary Antibodies Solution 30 perc 5 öblítés* öblítés* 6 Visualization Reagent HRP 15 perc 7 öblítés* öblítés* 8 öblítés* öblítés* 9 öblítés* öblítés* 10 Visualization Reagent AP 15 perc 11 öblítés* öblítés* 12 öblítés* öblítés* 13 öblítés* öblítés* BD Surepath citológiai készítmények Peroxidase-Blocking Reagent 5 perc Primary Antibodies Solution 30 perc Visualization Reagent HRP 15 perc Visualization Reagent AP 15 perc 14 kapcsol kapcsol 15 Szubsztrát lépés: DAB 10 perc Szubsztrát lépés: DAB 10 perc 16 öblítés desztillált vagy öblítés desztillált vagy ionmentesített vízzel ionmentesített vízzel 17 öblítés* öblítés* 18 Substrate-batch lépés: Fast Red 15 perc Substrate-batch lépés: Fast Red 15 perc 19 öblítés* öblítés* 20 --- LabVision Autostainer esetében: Substrate-batch lépés: Fast Red 15 perc Dako Autostainer esetében: Substrate lépés: Fast Red 15 perc 21 ---- öblítés* 22 öblítés desztillált vagy ionmentesített vízzel 23 kapcsolás kapcsolás öblítés desztillált vagy ionmentesített vízzel *használjon Wash Buffert az adott öblítési lépésekben. REF 9531 17 / 46 2009-9531-001HU Rev 2.2
MEGJEGYZÉS: Amennyiben a festési eljárásra használt Autostainer pufferrel öblíti a metszeteket, a metszeteket desztillált vagy ionmentesített vízzel kell leöblíteni az Autostainerből való eltávolításukat követően. A programozást követően az alábbiak szerint járjon el: A kit részét képező üvegekben található reagenseket helyezze át az Autostainer reagens üvegcséibe. Használja az Autostainer által generált tájékoztató képernyőt a programidő és a reagens térfogat meghatározására. Helyezze az Autostainer reagens üvegcséket az Autostainer reagens tartóba a Reagent Layout Map (reagens elrendezési kép) szerint. Az Autostainert töltse meg metszetekkel a Slide Layout Map (metszet elrendezési kép) szerint és öblítse át a metszeteket Wash Bufferrel a minta kiszáradását megelőzendő. 2.3.2. Javasolt festési protokoll a Shandon Coverplate System berendezés esetén Egymást követően gyűjtse össze a metszeteket és a fedőlapokat a REF 2010-953- 009EN protokoll szerint (elérhető a Roche mtm laboratories AG), majd helyezze őket a metszettartóba függőleges helyzetben. A reagenstartály desztillált vagy ionmentesített vízzel (2 ml) való megtöltésével ellenőrizze, hogy a Shandon Coverplate System összeragasztása szakszerűen valósult-e meg, majd inkubáljon 5 percig biztosítva a víz teljes átfolyását a résen keresztül. A tárgylemez és a fedőlemez közötti résen való lassú vízátfolyás során az összeragasztott tárgylemez-fedőlemez rendszer teljesen szivárgásmentes. 1. Ekvilibráció (egyensúlyba hozás): A reagenstartályt töltse meg Wash Bufferrel (2 ml), majd inkubálja 5 percig biztosítva a víz teljes átfolyását a résen keresztül; ismételje meg ezt a lépést. 2. Használjon 200 µl Peroxidase Blocking Reagentet. Inkubáljon 5 percig. 3. A reagenstartályt töltse meg mosópufferrel (2 ml), majd inkubálja 5 percig biztosítva a Wash Buffer teljes átfolyását a résen keresztül. 4. Használjon 200 µl Primary Antibodies Solution (p16 INK4a /Ki-67-t). Inkubáljon 30 percig. 5. A reagenstartályt töltse meg Wash Bufferrel (2 ml), majd inkubálja 5 percig biztosítva a Wash Buffer teljes átfolyását a résen keresztül. 6. Használjon 200 µl Visualization Reagent HRP-t. Inkubáljon 15 percig. 7. A reagenstartályt töltse meg Wash Bufferrel (2 ml), majd inkubálja 5 percig biztosítva a Wash Buffer teljes átfolyását a résen keresztül. Ismételje meg ezt a lépést kétszer. 8. Használjon 200 µl Visualization Reagent AP-t. Inkubáljon 15 percig. REF 9531 18 / 46 2009-9531-001HU Rev 2.2
9. A reagenstartályt töltse meg Wash Bufferrel (2 ml), majd inkubálja 5 percig biztosítva a wash buffer teljes átfolyását a résen keresztül. Ismételje meg ezt a lépést kétszer. 10. Használjon 200 µl DAB szubsztrát-kromogén munkaoldatot, amelynek előkészítése az 1.3. pontban korábban már leírt eljárás szerint történik. Inkubáljon 10 percig. 11. Töltse meg a reagenstartályt desztillált vagy ionmentesített vízzel (2 ml), majd inkubáljon 5 percig biztosítva a víz teljes átfolyását a résen keresztül. 12. A reagenstartályt töltse meg Wash Bufferrel (2 ml), majd inkubálja 5 percig biztosítva a wash buffer teljes átfolyását a résen keresztül. 13. Használjon 200 µl Fast Red szubsztrát-kromogén munkaoldatot, amelynek előkészítése az 1.3. pontban korábban már leírt eljárás szerint történik. Inkubáljon 15 percig. Megjegyzés: BD SurePath metszet előkészítés miatt ezt a lépést meg kell ismételni. 14. Töltse meg a reagenstartályt desztillált vagy ionmentesített vízzel (2 ml), majd inkubáljon 5 percig biztosítva a víz teljes átfolyását a résen keresztül. Ismételje meg ezt a lépést. Hüvelykujjával és mutatóujjával a tárgylemez hátsó részét megfogva óvatosan húzza ki a metszettartóból az egymáshoz ragasztott tárgylemezt és fedőlemezt, majd óvatosan válassza le a tárgylemezt a fedőlemezről. Ezt ideális esetben víz alá merítve végezzük. A metszeteket helyezze desztillált vagy ionmentesített vízbe, majd folytassa az eljárást a kontrasztfestés lépéseivel. 2.4. Hematoxilinnel történő kontrasztfestés A metszeteket helyezze alkoholmentes hematoxilinfürdőbe. A használt alkoholmentes hematoxilin erejétől függően inkubáljon 2-10 percen keresztül. MEGJEGYZÉS: Alkoholmentes hematoxilin használata feltétlenül kötelező. Bluing céljából helyezze a metszeteket csapvíz fürdőbe vagy alkalikus oldatba, mint pl. gyenge ammónia oldat (NH 4 OH, 0,08% ionmentesített vízben) és inkubáljon 30 másodperctől 2 percig. Hogy minden visszamaradó hematoxilint eltávolítson, az edényben lévő csapvizet több alkalommal (3 5x) friss csapvízzel cserélje, amíg nem látja visszamaradó festék jeleit. Rövid ideig inkubálja a metszeteket desztillált vagy ionmentesített vizet tartalmazó fürdőben. REF 9531 19 / 46 2009-9531-001HU Rev 2.2
MEGJEGYZÉS: Az inkubáció hosszától és a használt hematoxilin potenciájától függően az utánfestés a sejtmagok halványtól sötétkékig terjedő színeződését eredményezi. A túlzott vagy nem teljes kontrasztfestés akadályozhatja az eredmények helyes értelmezését. 2.5 Rögzítés Az optimális szenzitivitás fenntartása és a Fast Red Chromogen elhalványodásának megelőzése érdekében egy két lépésből álló rögzítési eljárás szerint járjon el. Kontrasztfestést és kékre futtatást követően a metszetek egy két lépésből álló protokoll szerint kerülnek rögzítésre. Az A és B lépést egymás után kell elvégezni: A) A fedőlemez nedves felhelyezése. A metszeteket desztillált vagy deionizált vízben legalább 1 percen át inkubálja. Távolítsa el a metszeteket a desztillált vagy deionizált vízből, amelyeket nem kell tovább szárítani. Távolítsa el a felesleges folyadékot anélkül, hogy a minta megszáradna; a víz eltávolítása céljából papírtörlővel óvatosan törölje meg a metszetek alsó oldalát. LBC metszetenként 4 csepp, hagyományos kenetenként pedig 8 csepp CINtec PLUS Mountot cseppentsen (1 csepp 35 40 µl vízalapú rögzítő közegnek felel meg). Kerülje a légbuborék képződést. Az apró buborékok képződésének megelőzése érdekében az első cseppet papírtörlőre lehet cseppenteni a CINtec PLUS Mount mintán történő alkalmazása előtt. A rögzítő közeg vékony rétegének létrehozása és a minta teljes átfedése miatt óvatosan billentse meg és forgassa az üveg metszetet (még NE használja az üveg vagy film fedőlemezt!); megtekintéssel ellenőrizze a rögzítő közeg metszeten való eloszlását. Szárítás céljából a metszeteket vízszintes helyzetben helyezze el: a. Inkubálja a ThinPrep vagy BD SurePath mintákat 1 órán át 37 60 C-on, vagy éjszaka környezeti hőmérsékleten. b. Inkubálja a hagyományos keneteket 4 órán át 37 C-on, 1 órán át 60 C-on, vagy éjszaka környezeti hőmérsékleten. B) Üveg vagy film fedőlemezek felhelyezése Miután a rögzítő közeg teljesen megszáradt, inkubálja a metszeteket xilénben legalább 1 percen át, ill. legfeljebb 20 percig. Ezt követően a metszetekre helyezze fel a fedőlemezeket xilénalapú rögzítő közeg használatával. MEGJEGYZÉS: Az üveg vagy film fedőlemez felhelyezése előtt tilos dehidrálni a metszeteket fokozatosan emelt mennyiségű alkohol alkalmazásával. Várja meg, amíg a xilénalapú rögzítő közeg megszárad szobahőmérsékleten. MEGJEGYZÉS: Az elhalványodás elkerülése érdekében, a metszeteket védje a fénytől és szobahőmérsékleten tárolja (20 25 C). REF 9531 20 / 46 2009-9531-001HU Rev 2.2
VII. Minőség-ellenőrzés A méhnyaki citológiai minta fixációjával és további feldolgozásával kapcsolatos ajánlott eljárásoktól való eltérés az eredmények lényeges módosulását eredményezheti, ami rendszeres belső ellenőrzéseket tesz szükségessé. Pozitív kontroll Olyan mintákat használjon fel pozitív kontroll során, amelyek a betegek mintáival azonos módon kerültek feldolgozásra. A pozitív kontroll jelzi, hogy a minta előkészítése és a festési eljárás megfelelően lett-e elvégezve. Minden egyes festés során egy pozitív kontrollt kell elvégezni. Az ismert pozitív kontrollokat csak a feldolgozott szövetek és vizsgálati reagensek megfelelő teljesítményének követésére használhatják, és nem a páciensminták specifikus diagnózisainak meghatározásához. Ha a pozitív kontrollok nem mutatnak kellően pozitív festést, a vizsgálati minták eredményeit érvénytelennek kell tekinteni. Negatív kontroll Valamennyi festési menetben olyan negatív kontrollt kell használni, amelyről tudja, hogy a beteg mintájával/mintáival megegyező módon dolgozták fel, a festési eljárás specificitásáról való meggyőződés és a háttérfestődésre utaló jelek észlelése érdekében. Reprezentatív méhnyaki citológiai mintákban jelenlévő különböző sejttípusok, amelyekről ismert, hogy nem expresszálják a p16 INK4a és Ki-67 antigéneket (mint pl. a superficialis sejtek), kiegészítő belső negatív kontrollként szolgálhatnak a háttérfestődés megállapításában (a felhasználó hitelesítése szükséges). A módszer ellenőrzése Egy antitest vagy festési rendszer diagnosztikában való első alkalmazását megelőzően, a felhasználó feladata, hogy igazolja az antitest specificitását a laboratóriumon belüli, ismert immuncitokémiai tulajdonságokkal rendelkező minták sorozatán, amelyek ismert pozitív és negatív mintákat reprezentálnak. Tanulmányozza a korábbi fejezetben taglalt minőség-ellenőrzési eljárásokat, valamint a CAP Certification Program for Immunocytochemistry ( immuncitokémiai hitelesítési program ) és/vagy a CLSI (NCCLS) Quality Assurance for Immunocytochemistry ( immuncitokémiai minőségbiztosítás ) jóváhagyott irányelveinek minőségellenőrzési követelményeit. VIII. Az eredmények értelmezése A CINtec PLUS eljárás két, eltérő színű reakcióterméket eredményez: barna színű csapadékot a p16 INK4a antigénkötő helyen, és piros színű csapadékot a Ki-67 antigénkötő helyen. A sejtek barna festődése (citoplazma és/vagy sejtmagok) a p16 INK4a túlzott expresszióját jelzi. A sejtek piros festődése (sejtmagok) a Ki-67 expresszióját jelzi. Mindkét antigénre festett sejtek barna citoplazma festődést mutatnak jellegzetesen kihangsúlyozott piros sejtmagokkal. Az eredmények értelmezése előtt egy immunhisztokémiai eljárásokban tapasztalt és a CINtec PLUSszal festett metszetek értelmezésében jártas, képzett patológusnak/citológusnak kell értékelnie a pozitív és negatív kontrollokat. Az eredmények értékelését képzett szakembernek kell elkészítenie a beteg kórtörténetének és egyéb diagnosztikai vizsgálatainak ismeretében. A CINtec PLUS Kit által festett méhnyaki citológiai metszetek értelmezése során tekintettel kell lenni azon méhnyaki epithelialis sejtek jelenlétére, amelyek a p16 és Ki-67 egyidejű expresszióját jelző barna citoplazma és piros sejtmag festődést mutatnak. REF 9531 21 / 46 2009-9531-001HU Rev 2.2