FEHÉRJÉK A MÁGNESEKBEN Bodor Andrea ELTE, Szerkezeti Kémiai és Biológiai Laboratórium Alkímia Ma, Budapest, 2013.02.28.
I. FEHÉRJÉK: L-α aminosavakból felépülő lineáris polimerek α H 2 N CH COOH amino csoport R karboxil csoport R-oldallánc: Savas (Glu) Bázikus (Arg) Apoláris (Leu) Poláris (Ser) H 3 N + CH COO _ R ikerionos szerkezet L-alanin D-alanin ikerionos szerkezet 20 természetes aminosav
Hogyan alakulnak ki a láncok? Két aminosav maradék között amid-, vagy peptid kötés: Peptidek: görög πεπτίδια, kis emészthető rövid láncok (< 50 aminosav, de vannak kivételek) Fehérjék, proteinek: görög proteios, első polipeptid láncok
A fehérje szerkezete Elsődleges szerkezet: aminosavak sorrendje, szekvenciája pld. Ubikvitin, 76 aminosav, 8.5kDa: MQIFVKTLTGKTITLEVEPSDTIENVKAKIQDKEGIPPDQQRLIFAGKQLEDGRTLSDYN IQKESTLHLVLRLRGG Másodlagos szerkezet: peptidgerinc lokális rendezettsége (leggyakoribb az α-hélix, β-redő), hidrogénhidak stabilizálják Harmadlagos szerkezet: a polipeptidlánc teljes térbeli konformációja; hidrofób kölcsönhatások stabilizálják. A másodlagos szerkezeti elemek rendezetlen szakaszokkal váltakoznak.
A fehérje szerkezete Nincs rendezett szerkezet: IUP (intrinsically unstructured proteins) Fehérje feltekerdés (folding): az a folyamat, melynek során a fehérjék felveszik a natív szerkezetük Negyedleges szerkezet: alegységek jelenléte
Miért fontos tanulmányozni a fehérjéket? Betegségek megértése Alzheimer kór (AD): β-amiloid aggregáció Creutzfeldt-Jakob szindróma, vagy kergemarhakór: prion fehérjék hibás feltekeredése (misfold) Hozzásegít hatékonyabb gyógyszerek tervezéséhez Megválaszolandó kérdések: Mi a fehérje szerkezete? Milyen mozgások jellemzik? Milyen kölcsönhatásokban vesz részt? Mi a funkciója? Atomi szintű jellemzés oldatfázisban: NMR spektroszkópia
II. Az NMR spektroszkópia hullámhossz: 1nm 1μm 1mm 1m 1km 1GHz 1MHz frekvencia: 10 18 10 15 10 12 10 9 10 6 energia: γ- sugarak X- sugarak UV IR távoli IR mikrohullámok rádióhullámok mag átmenetek belső elektronok külső elektronok rezgések forgások e - - mágneses átmenetek mag - mágneses átmenetek Mössbauer Optikai spektroszkópia ESR NMR
Az NMR spektroszkópia és a periódusos rendszer Fehérjék: 1 H, 13 C, 15 N Ha magspin nem nulla (I 0): NMR aktív mag I=0, ha n=2x, p=2y (például 12 C, 16 O) Szinte minden elemnek van NMR aktív izotópja!
Az NMR spektroszkópia alkalmazási területei Kémia: szerkezet, konformáció Gyógyszer kutatás -omika: metabolomika Analitika: eredet, minőség Szerkezeti biológia dinamika MRI
A készülék 500 MHz, ELTE 700 MHz, ELTE
A műszer felépítése Szupravezető mágnes, mérőfej, Rádió adó, rádió vevő, analóg-digitál konverter (ADC) Számítógép
III. Fehérje a mágnesben a minta Izotóp jelölés: fehérje expresszió 13 C, 15 N, 2 D jelölés Térerő: 11,7 23,5T 500 MHz 1GHz Mérések: 2D, 3D, nd A maximális mérettartomány: kb. 255 kda
a) Szerkezet meghatározás Jelazonosítás Távolsági kényszerfeltételek Számítógépes modellezés Szerkezet finomítás 3D szerkezet
Jelazonosítás: 1 H, 13 C, 15 N kémiai eltolódás meghatározás 1 H 1 H- 1 H korreláció (2D) 10.0 9.0 8.0 7.0 6.0 N H, aromás (ppm) 5.0 4.0 3.0 2.0 1.0 alifás Hα, Hβ, Hγ Spinrendszer azonosítás Szekvenciális hozzárendelés 1 H- 15 N korreláció (2D) 1 H- 15 N- 13 C korreláció (3D) NH régió
Távolsági kényszerfeltételek (NOE) 6Å Számítógépes program: szerkezet!
b) Az NMR időskála gerinc rotáció diffúzió domén mozgás, kinetika feltekeredés ps ns μs ms s 10 3 s NOE, R 1,R 2 R 1ρ,CPMG ZZ, STD, csere
Példák H 2 O i) 15 N: R 1, R 2, hetnoe ii) -NH H 2 O csere
i) A gerinc dinamikájának feltérképezése R2/R1 20 15 10 5 0 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 1 0.8 HETNOE 0.6 0.4 0.2 0 mobilis mobilis mobilis -0.2 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90-0.4 Aminosav tagszám 15 N: R 1, R 2, hetnoe
ii) Cserefolyamatok: -NH H 2 O csere CLEANEX ratio 2 1.6 1.2 0.8 0.4 5 ms 10 ms 70 ms nincs detektálható csere 0 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 Aminosav tagszám
c) Kölcsönhatások vizsgálata: hova kötődik a partner? Homodimer, 15 N jelölt G50 T42 G27 E44 N71 E26 S47 S17 S23 L8 F30 V73 N33 L32 E91 D74 1 H- 15 N mérés, HSQC K29 Jelaszignáció előzi meg
Hova kötődik a partner? G50 T42 G27 E44 N71 E26 S47 S17 S23 L8 F30 N33 V73 L32 E91 K29 D74 Homodimer Homodimer +kötőpartner : A két monomer már nem ekvivalens A 45 aminosavból álló kötőpartner nem 15 N jelölt! Legnagyobb kémiai eltolódás változás: leginkább megváltozott környezet (lásd G50, L8, K29)
KÖVETKEZTETÉSEK Oldatbeli szerkezeti, dinamikai információ DE: ezek tisztított fehérje oldatok! Tudunk-e fiziológiás/közel fiziológiás körülmények között mérni? IGEN: In cell NMR
In cell mérések In vitro In cell In vitro In vitro Élő sejtben: szerkezet, viselkedés tanulmányozása
Köszönöm a figyelmet!