Rendelési információ AMPLICOR HCV HCV PREP 96 Tests P/N: 21111086 123 Specimen Preparation Kit, ART: 11 1108 6 version 2.

COBAS AMPLICOR Hepatitis C Virus Test, version 2.0 HCV IN VITRO DIAGNOSZTIKAI CÉLRA. Rendelési információ AMPLICOR HCV HCV PREP 96 Tests P/N: 21111086 123 Specimen Preparation Kit, ART: 11 1108 6 version 2.0 US: 83126 AMPLICOR HCV HCV CTL 8 Sets P/N: 21111175 123 Controls Kit, version 2.0 ART: 11 1117 5 US: 83131 AMPLICOR HCV HCV AMP 96 Tests P/N: 21111094 123 Amplification Kit, version 2.0 ART: 11 1109 4 US: 83127 COBAS AMPLICOR HCV DK 100 Tests P/N: 21111132 123 HCV Detection Kit, ART: 11 1113 2 version 2.0 US: 83130 COBAS AMPLICOR DK 100 Tests P/N: 20757470 122 Detection Reagents Kit ART: 07 5747 0 US: 83276 COBAS AMPLICOR CN4 200 Tests P/N: 20764213 123 Conjugate Detection Reagent ART: 07 6421 3 US: 83305 COBAS AMPLICOR WB 500 Tests P/N: 20759899 123 Wash Buffer ART: 07 5989 9 US: 83314 Az alábbi készlet az AMPLICOR HCV Amplification Kit, version 2.0. segítségével amplifikált HCV belső kontroll kimutatására használható. A HCV belső kontroll kimutatása egy javasolt felhasználási lehetőség. COBAS AMPLICOR IC 100 Tests P/N: 20757608 122 Internal Control Detection Kit ART: 07 5760 8 US: 83281 10/2005, Revision 6.0 COBAS AMPLICOR Hepatitis C Virus Test, v2.0 1/42 P/N: 04741757 190

Felhasználás célja A COBAS AMPLICOR Hepatitis C Virus (HCV) Test, version 2.0 (v2.0) egy kvalitatív in vitro vizsgálat a hepatitis C vírus RNS-ének kimutatására klinikai mintákban COBAS AMPLICOR Analizátor segítségével. A HCV RNS jelenléte igazolja a fennálló HCV-fertőzést olyan betegekben, akik májbetegség klinikai és/vagy biokémiai jeleit mutatják. A HCV RNS kimutatására a vizsgálat a következő lépéseket valósítja meg: a target RNS reverz transzkripciója, azaz komplementer DNS (cdns) szintézise, a cdns amplifikálása polimerázláncreakcióval (PCR), valamint nukleinsav-hibridizáció. A COBAS AMPLICOR HCV Test, v2.0 nem való vér vagy vérkészítmények hepatitis C vírus fertőzöttségének szűrésére. A vizsgálat összegzése és magyarázata A hepatitis C vírus a poszttranszfúziós non-a, non-b hepatitis 1,2 esetek 90-95%-áért felelőssé tehető elsőrendű kóroki ágens. A HCV egyszálú, pozitív RNS-t tartalmazó vírus, amelynek genomja mintegy 3000 aminosavat kódoló megközelítően 10 000 nukleotidot tartalmaz 1. Mint vérrel terjedő vírus, a HCV vérrel és vérkészítményekkel átvihető. A HCV-fertőzés előfordulása gyakori szervátültetettekben, vérátömlesztésben vagy kereskedelemben kapható véralvadási faktor adásában részesült betegekben, intravénás kábítószerélvezőkben, valamint vesedializáltakban. Immunszerológiai felmérések alapján a HCV-fertőzés előfordulása Kanadában 0,6%, az Egyesült Államokban 1,8% 3. A HCV-fertőzött betegekben az anti-hcv antitestek megjelenése ezekre az ellenanyagokra specifikus immunszerológiai vizsgálatok kifejlesztéséhez vezetett 4,5. Ezen vizsgálatok bevezetése máris a poszttranszfúziós hepatitisek gyakoriságának csökkenését eredményezte. Az ellenanyagszűrés során ismételten reaktívnak bizonyuló minták további értékelésére kiegészítő vizsgálatként rekombináns immunoblot assay (RIBA) került bevezetésre. Újabb felmérések kimutatták, hogy ezen kiegészítő vizsgálatnak az értékelése a beteg kockázati státuszától függ. Például egy alacsony kockázatú véradó populáció RIBA-reaktív mintáinak mindössze 50%-a igazolható HCV RNS vizsgálattal 6,7,8. Ezért egy pozitív RIBA-eredmény nem valós indikátora az aktív HCV-fertőzésnek, miután a gyógyult betegek még évekig anti-hcv pozitívak maradhatnak 5. Továbbá bizonytalan RIBA-eredményeket figyeltek meg akutan fertőzött, éppen szerokonvertáló személyekben, és krónikus HCV-fertőzöttekben egyaránt 9,10. Az immunszerológiai vizsgálatok kimutatják az éppen zajló és/vagy a korábbi HCV-fertőzést, de nem tudnak különbséget tenni a kettő között. Ráadásul az akut HCV-fertőzés egyes eseteiben a betegekben nem fejlődik ki antitestes válasz 11, ezért az éppen zajló HCV-fertőzést immunológiai technikákkal lehetetlen diagnosztizálni. Ugyanakkor a HCV RNS kimutatása nukleinsav-vizsgálatokkal igazolhatja a zajló fertőzést. Nukleinsav-vizsgálatok alkalmazásával lehetőség van az immunológiai szerokonverziót megelőző HCV viraemia kimutatására 12,13. Miután a nukleinsav-vizsgálatok képesek a HCV RNS direkt kimutatására, azaz nem függenek a beteg immunológiai státuszától, ezért egy nukleinsav vizsgálat alkalmas a HCV RNS kimutatására immunkompromittált betegekben is 8. 2/42 COBAS AMPLICOR Hepatitis C Virus Test, v2.0 10/2005, Revision 6.0

Hepatitis C Virus Az eljárás alapelvei A COBAS AMPLICOR HCV Test, v2.0 öt fő lépésből épül fel: minta előkészítése; a target RNS reverz transzkripciója, azaz komplementer DNS (cdns) szintézise 14 ; a cdns amplifikálása HCV-specifikus komplementer primerek felhasználásával PCR során 14 ; az amplifikált termékek hibridizációja a targetszekvenciára specifikus oligonukleotid próbákhoz; a kötődött amplifikált termékek kolorimetriás kimutatása. A COBAS AMPLICOR HCV Test, v2.0 lehetővé teszi a HCV target és a HCV belső kontroll target RNS-ek szimultán reverz transzkripcióját és PCR-amplifikációját. A master mix reagens egy a HCV-re és a HCV belső kontrollra egyaránt specifikus primer párt tartalmaz. Az amplifikált DNS kimutatása targetspecifikus oligonukleotid próbák segítségével történik, amelyek lehetővé teszik a HCVamplikon és a HCV belső kontroll amplikon független azonosítását. Belső kontroll Az enzimreakción alapuló amplifikálási műveletek során, amilyen a PCR is, a klinikai mintákban jelen lehetnek gátlóanyagok, amelyek csökkenthetik az amplifikálás hatékonyságát. A COBAS AMPLICOR HCV Test, v2.0-hoz HCV belső kontroll lett hozzáadva, hogy lehetővé váljon az olyan feldolgozott minták azonosítása, amelyekben a PCR-amplifikációt esetleg zavaró anyagok vannak jelen. A HCV belső kontroll egy RNS- transzkriptum a HCV targetszekvenciával identikus régiókhoz kötődő primerrel, a HCV targetszekvenciához hasonló hosszúságú és bázisösszetételű random belső szekvenciával, és egy egyedi próbához kötődő régióval, amely elkülöníti a HCV belső kontrollt a targetamplikontól. Ezeket a jellemzőket azért választották ki, hogy biztosítsák a HCV belső kontroll és a HCV target RNS ekvivalens amplifikálását. Minta előkészítése A HCV RNS szérumból vagy a plazmából való izolálása során a víruspartikulumokat először egy chaotróp ágenssel roncsolják, amit azután az RNS alkoholos kicsapása követ. Ezt követően az RNS a mintaoldószerben újra feloldásra kerül. A HCV belső kontroll RNS-t a roncsoló reagenssel együtt adják hozzá az egyes mintákhoz, így az mint extrahálási, amplifikálási és kimutatási kontroll szerepel minden egyes feldolgozott minta esetén. Reverz transzkripció és PCR-amplifikáció A targetszekvencia kiválasztása A target RNS-szekvencia kiválasztása a különböző HCV-genotípusok között a genomban maximálisan konzervált régiók azonosításán múlik 15,16,17. Ezért a primerek és próbák megfelelő kiválasztása kritikus abból a szempontból, hogy a vizsgálat valamennyi genotípust képes legyen kimutatni (ld. a Nem-klinikai értékelés, HCV-genotípus inkluzivitás vizsgálata szakaszt). Az ismert HCVgenotípusok között a HCV-genom 5'-nem átírt szakasza [untranslated region (UTR)] a legnagyobb fokban konzervált RNS-szekvencia 18,19. A COBAS AMPLICOR HCV Test, v2.0 a HCV-genom nagyfokban konzervált 5'-UTR szakaszán lévő 244 nukleotidszekvenciának megfelelő KY78 és KY80 primereket használja 13. A capture próbaszekvencia és a primer szekvenciák az 5'-UTR szakaszon belül a legnagyobb fokban konzervált doméneken helyezkednek el 18. Reverz transzkripció A reverz transzkripciót és az amplifikálási reakciókat hőstabil rekombináns enzim, a Thermus thermophilus DNS-polimeráz (rtth pol) segítségével végzik. Mangán (Mn 2+ ) jelenlétében, valamint megfelelő pufferviszonyok között az rtth pol mind reverz transzkriptáz-, mind DNS-polimerázaktivitást mutat 14. Ez lehetővé teszi a reverz transzkripció és a PCR-amplifikálás megtörténését ugyanazon reakcióelegyben. A feldolgozott mintákat amplifikációs csövekben (A-csövek) lévő amplifikáló keverékhez adják, ahol tehát mind a reverz transzkripció, mind a PCRamplifikálás megtörténik. 10/2005, Revision 6.0 COBAS AMPLICOR Hepatitis C Virus Test, v2.0 3/42

A downstream vagy antisense primer (KY78) az 5' végén biotinilált; az upstream vagy sense primer (KY80) nem biotinilált. A reakcióelegyet fel kell hevíteni, hogy lehetővé váljon a downstream primernek a HCV target RNS-hez és a HCV belső kontroll target RNS-hez való specifikus kapcsolódása. Mn 2+ és dezoxinukleozidtrifoszfátok (dntps), azaz dezoxiadenozin-, dezoxiguanozin-, dezoxicitidin- és dezoxiuridin- (timidin helyett) trifoszfátok feleslegének jelenlétében az rtth pol a kapcsolódott primerhez a target RNS komplementer DNS-szálát (cdns) szintetizálja. Targetamplifikáció A HCV target és a HCV belső kontroll RNS reverz transzkripcióját követően a reakcióelegyet az RNS:cDNS hibrid denaturálása és a primer targetszekvenciák szabaddá tétele végett fel kell hevíteni. Ahogy az elegy kihűl az upstream primer (KY80) specifikusan kötődik a cdns-szálhoz, az rtth pol pedig a primerre egy második DNS-szálat szintetizál. Ezzel a PCR első ciklusa véget ért, a HCV RNS és a HCV belső kontroll RNS targetrégiójának egy kettős szálú DNS-másolatát létrehozva. A kettős szálú DNS szeparálása és a primer targetszekvenciák szabaddá tétele végett reakcióelegyet újra fel kell melegíteni. Az elegy kihűlésével a KY78 és KY80 primerek a target DNS-hez kapcsolódnak. Az rtth pol enzim Mn 2+ és feleslegben lévő dntps jelenlétében a primerekre a targettemplátoknak megfelelően 244 bázispár hosszúságú kettős szálú DNS molekulát szintetizál, amelyet amplikonnak hívnak. A COBAS AMPLICOR Analizátor automatikusan a folyamatot adott számú cikluson keresztül ismétli, az amplikon DNS-mennyisége ciklusonként megduplázódik. A szükséges számú ciklus a COBAS AMPLICOR Analizátorba előre be van programozva. Az amplifikálás a HCV-genomnak csak a primerek közötti régiójában zajlik; a teljes genom nem amplifikálódik. Szelektív amplifikálás A COBAS AMPLICOR HCV Test, v2.0 a target-nukleinsav szelektív amplifikálását a klinikai mintából az AmpErase (uracil-n-glikoziláz) enzim és dezoxiuridin-trifoszfát (dutp) használatával éri el. Az AmpErase enzim felismeri és katalizálja az olyan DNS-szálak megsemmisítését, amelyek dezoxiuridint tartalmaznak 20, a dezoxitimidint tartalmazókét viszont nem. A dezoxiuridin a természetes DNS-ben nincs jelen, ugyanakkor az amplikonokban mindig megtalálható, miután a master mix reagens a dntp-ok egyikeként timidin-trifoszfát helyett dezoxiuridin-trifoszfátot használ; tehát csak az amplikonok tartalmaznak dezoxiuridint. A dezoxiuridinnak köszönhetően a szennyező amplikont az AmpErase enzim még a target DNS amplifikálását megelőzően lebontja. A master mix reagensben lévő AmpErase enzim katalizálja a dezoxiuridint tartalmazó DNS hasítását a dezoxiuridin csoportoknál úgy, hogy a dezoxiribóz lánc felnyílását okozza a C1 helyen. Az első hevítési lépésben a master mix reagens bázikus ph-ján az amplikon DNS-lánc eltörik a dezoxiuridin helyén, tehát a DNS nem lesz amplifikálható. Az AmpErase enzim 55 C felett, azaz a hevítési lépések során inaktív, azaz nem bontja le a targetamplikont. Az amplifikálást követően a maradék enzim a denaturáló oldat hozzáadásakor denaturálódik, megelőzve ezáltal a targetamplikonok lebontását. A COBAS AMPLICOR HCV Test, v2.0 alkalmazásakor az AmpErase enzim mérések szerint legalább 10 3 darab dezoxiuridint tartalmazó HCV-amplikont inaktivál egy PCR során. 4/42 COBAS AMPLICOR Hepatitis C Virus Test, v2.0 10/2005, Revision 6.0

Hepatitis C Virus Hibridizáció Kimutatási reakció A PCR-amplifikálást követően a COBAS AMPLICOR Analizátor automatikusan denaturáló oldatot adagol az A-csövekhez, ezáltal a HCV-amplikon és a HCV belső kontroll amplikon kémiai denaturálást szenved, és egyszálú DNS lesz. A denaturált amplikonok kis részletei azután a kimutatási csövekbe (D-csövekbe) kerülnek. A HCV (KY150), illetve HCV belső kontroll (SK535) specifikus oligonukleotid próbával fedett mágneses részecskék szuszpenziója a megfelelő D-csövekhez hozzáadásra kerül. A biotinilált HCV és HCV belső kontroll amplikonok a mágneses részecskékhez kötött targetspecifikus oligonukleotid próbákhoz hibridizálnak. Ez a targetspecifikus próbákhoz való amplikonhibridizáció növeli a vizsgálat teljes specificitását. A hibridizációt követően a COBAS AMPLICOR Analizátor mossa a mágneses részecskéket a D-csövekben, melynek során a nem kötődött anyag eltávozik, ezután avidin-tormaperoxidáz konjugátumot adagol a csövekbe. Az avidintormaperoxidáz konjugátum a mágneses részecskékhez kötött target (HCV vagy HCV belső kontroll) specifikus oligonukleotid próbákhoz hibridizált biotinilált amplikonokhoz kötődik. A COBAS AMPLICOR Analizátor a mágneses részecskék mosása révén eltávolítja a nem kötődött konjugátumot, majd minden egyes D-csőhöz hidrogén-peroxidot és 3,3',5,5'-tetrametil-benzidint (TMB) tartalmazó szubsztrátoldatot ad. Hidrogén-peroxid jelenlétében a kötődött tormaperoxidáz katalizálja a TMB színes komplexszé történő oxidációját, amelynek abszorbanciáját a COBAS AMPLICOR Analizátor 660 nm-es hullámhosszon méri. Reagensek AMPLICOR HCV HCV PREP 96 teszt P/N: 21111086 123 Specimen Preparation Kit, ART: 11 1108 6 version 2.0 US: 83126 AMPLICOR HCV minta-előkészítő készlet, 2.0-s verzió HCV LYS, v2.0 (HCV roncsoló reagens, 2.0-s verzió) 8 x 6,9 ml trisz-hcl puffer 68% guanidin-tiocianát 3% ditiotreitol < 1% glikogén + Xn 68% (w/w) guanidin-tiocianát Ártalmas HCV DIL, v2.0 (HCV mintaoldószer, 2.0-s verzió) 8 x 4,8 ml trisz-hcl puffer < 0,005% poli ra RNS (szintetikus) EDTA 0,05% nátrium-azid 10/2005, Revision 6.0 COBAS AMPLICOR Hepatitis C Virus Test, v2.0 5/42

HCV IC, v2.0 (HCV belső kontroll, 2.0-s verzió) 8 x 0,1 ml < 0,001% nem fertőző in vitro átírt (mikrobiális) RNS, amely HCV primer kötő szekvenciákat és egy egyedi próbához kötődő régiót tartalmaz. < 0,005% poli ra RNS (szintetikus) EDTA 0,05% nátrium-azid AMPLICOR HCV HCV CTL 8 szett P/N: 21111175 123 Controls Kit, version 2.0 ART: 11 1117 5 AMPLICOR HCV kontrollkészlet, 2.0-s verzió US: 83131 NHP [Negatív plazma (humán)] 8 x 0,6 ml Humán plazma, US FDA engedélyezett tesztekkel nem reaktív HCV-antitestre, HIV-1/2 antitestre, HIV p24 antigénre és HBsAg-re; HIV-1 RNS, HCV RNS és HBV DNS PCR-technikával nem kimutatható 0,1% ProClin 300 HCV ( ) C, v2.0 [HCV ( ) kontroll, 2.0-s verzió] 8 0,1 ml < 0,005% poli ra RNS (szintetikus) EDTA 0,05% nátrium-azid HCV (+) C, v2.0 [HCV (+) kontroll, 2.0-s verzió] 8 x 0,1 ml < 0,001% nem fertőző in vitro átírt (mikrobiális) RNS, amely HCV-szekvenciákat tartalmaz < 0,005% poli ra RNS (szintetikus) EDTA 0,05% nátrium-azid AMPLICOR HCV HCV AMP 96 teszt P/N: 21111094 123 Amplification Kit, version 2.0 ART: 11 1109 4 AMPLICOR HCV amplifikáló készlet, 2.0-s verzió US: 83127 HCV MMX, v2.0 (HCV master mix, 2.0-s verzió) 8 x 0,7 ml bicin puffer 16% DMSO glicerol < 0,01% rtth DNS polimeráz (rtth pol, mikrobiális) kálium-acetát < 0,001% datp, dctp, dgtp, dutp < 0,005% KY78 és KY80 primerek (egyik biotinilált) < 0,01% AmpErase (uracil-n-glikoziláz) enzim (mikrobiális) 0,05% nátrium-azid 6/42 COBAS AMPLICOR Hepatitis C Virus Test, v2.0 10/2005, Revision 6.0

Hepatitis C Virus HCV Mn 2+,v2.0 (HCV mangánoldat, 2.0-s verzió) 8 x 0,1 ml < 2% mangán ecetsav amarántvörös festék 0,05% nátrium-azid COBAS AMPLICOR HCV DK 100 teszt P/N: 21111132 123 HCV Detection Kit, ART: 11 1113 2 version 2.0 US: 83130 COBAS AMPLICOR HCV kimutatási készlet, 2.0-s verzió CX PS1, v2.0 (HCV próba szuszpenzió 1, 2.0-s verzió) 1 x 100 teszt MES puffer < 0,4% Dynabeads szuszpenzió (paramágneses részecskék) HCV-specifikus oligonukleotid capture próbával (KY150) fedve 0,09% nátrium-azid CX4, v2.0 (HCV próba szuszpenzió 2, 2.0-s verzió) 1 x 100 teszt nátrium-foszfát puffer < 0,2% oldószer 42,2% nátrium-tiocianát Xn 42,2% (w/w) nátrium-tiocianát + Ártalmas COBAS AMPLICOR DK 100 teszt P/N: 20757470 122 Detection Reagents Kit ART: 07 5747 0 COBAS AMPLICOR kimutatási reagensek készlete US: 83276 DN4 (denaturáló oldat) 1 x 100 teszt 1,6% nátrium-hidroxid EDTA timolkék + Xi 1,6% (w/w) nátrium-hidroxid Irritatív CN4 (avidin-tormaperoxidáz konjugátum) 1 100 teszt trisz-hcl puffer < 0,001% avidin-tormaperoxidáz konjugátum marha-szérumalbumin (emlős) Emulsit 25 (Dai-ichi Kogyo Seiyaku Co., Ltd.) 0,1% fenol 1% ProClin 150 10/2005, Revision 6.0 COBAS AMPLICOR Hepatitis C Virus Test, v2.0 7/42

SB3 (szubsztrát A) 5 x 75 teszt citrátoldat 0,01% hidrogén-peroxid 0,1% ProClin 150 SB (szubsztrát B) 5 x 5 ml 0,1% 3,3',5,5'-tetrametil-benzidin (TMB) 40% dimetil-formamid (DMF) T 40% (w/w) dimetil-formamid (DMF) Mérgező R: 61-20/21-36 A születendő gyermekre ártalmas lehet. Belélegezve és bőrrel érintkezve ártalmas. Szemizgató hatású. S: 53-45 Kerülni kell az expozíciót használata előtt szerezze be a külön használati utasítást. Baleset vagy rosszullét esetén azonnal orvoshoz kell fordulni. Ha lehetséges, a címkét meg kell mutatni. COBAS AMPLICOR CN4 200 teszt P/N: 20764213 123 Conjugate Detection Reagent ART: 07 6421 3 COBAS AMPLICOR konjugátum kimutatási reagens US: 83305 CN4 (avidin-tormaperoxidáz konjugátum) 2 x 100 teszt trisz-hcl puffer < 0,001% avidin-tormaperoxidáz konjugátum marha-szérumalbumin (emlős) Emulsit 25 (Dai-ichi Kogyo Seiyaku Co., Ltd.) 0,1% fenol 1% ProClin 150 COBAS AMPLICOR WB 500 teszt P/N: 20759899 123 Wash Buffer ART: 07 5989 9 COBAS AMPLICOR mosópuffer US: 83314 WB (10X-mosókoncentrátum) 2 x 250 teszt < 2% foszfátpuffer < 9% nátrium-klorid EDTA < 2% detergens 0,5% ProClin 300 8/42 COBAS AMPLICOR Hepatitis C Virus Test, v2.0 10/2005, Revision 6.0

Hepatitis C Virus Figyelmeztetések és óvintézkedések In vitro diagnosztikai célra. Csak EDTA vagy ACD véralvadásgátlókkal gyűjtött szérum- vagy plazmamintákhoz. A heparinról kimutatták, hogy gátolja a PCR-t, ezért tilos a használata. Ne pipettázzon szájjal. Ne egyen, igyon vagy dohányozzon a laboratórium területén. Viseljen egyszer használatos védőkesztyűt, védőruhát és szemvédőt a minták és a készlet reagensei kezelése közben. A minták és a tesztreagensek kezelését követően gondosan mosson kezet. A reagensflakonokból való anyagkivétel során kerülje el a reagensek mikrobiális és ribonukleáz-szennyezését. Steril egyszer használatos pipetták és RNáz-mentes pipettahegyek használata javasolt. Ne öntsön össze különböző tételekből, vagy azonos tételből, de különböző flakonokból származó reagenseket. A fel nem használt reagensek és a hulladék kezelésének összhangban kell lennie a megfelelő országos, szövetségi, állami és helyi szabályozásokkal. Ne használja a készletet a lejárati idő után. Az anyagok biztonsági adatlapjai (MSDS) igény esetén hozzáférhetők a helyi Roche-irodában. A laboratóriumi munkafolyamatnak egyirányú módon kell zajlania, kezdve a preamplifikálási területtől a posztamplifikálási (amplifikálási/kimutatási) területig haladva. A preamplifikálási műveleteket a reagens-előkészítéssel kell kezdeni, és a minta-előkészítéssel folytatni. Valamennyi preamplifikálási művelethez tartozó felszerelést és eszközt jelölni kell, és tilos használni más művelethez vagy más munkaterületre átvinni. Valamennyi munkaterületen kesztyűt kell viselni, és a terület elhagyása előtt le kell venni. A reagens-előkészítéshez használt felszerelést és eszközöket tilos használni minta-előkészítési műveletekhez, amplifikált DNS vagy más target DNS-forrás pipettázásához vagy feldolgozásához. A posztamplifikálási műveletekhez tartozó felszerelést és eszközöket mindenkor a posztamplifikálási munkaterületen kell tartani. A mintákat fertőzőként kell kezelni a Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories 21 és az CLSI Dokumentum M29-A 22 előírásoknak megfelelő biztonságos laboratóriumi eljárásokat alkalmazva. Gondosan tisztítson meg, és ioncserélt vagy desztillált vízzel frissen készített 0,5% nátrium-hipoklorit oldattal fertőtlenítsen minden munkaterületet. Megjegyzés A kereskedelemben kapható háztartási fehérítő rendszerint 5,25%-ban tartalmaz nátrium-hipokloritot. 1:10 arányban hígított háztartási fehérítő megfelel 0,5% nátrium-hipoklorit oldatnak. 10/2005, Revision 6.0 COBAS AMPLICOR Hepatitis C Virus Test, v2.0 9/42

FIGYELEM: A készlet tartalmaz olyan összetevőt (NHP), amely humán vérből származik. A forrásanyag US FDA által engedélyezett tesztekkel vizsgálva nem bizonyult reaktívnak HCV-antitestre, HIV-1/2 antitestre, HIV p24 antigénre és Hepatitis B surface antigénre (HBsAg). A negatív humán plazma PCR-technikával történő vizsgálata során HIV-1 RNS, HCV RNS vagy HBV DNS nem volt kimutatható. Egyetlen vizsgálati módszer sem nyújthat teljes garanciát arra, hogy a humán vérkészítményekben nincs jelen fertőző anyag. Emiatt minden humán eredetű anyagot potenciálisan fertőzőnek kell tekinteni. Az NHP fertőzőként kezelendő a Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories 21 és az CLSI Dokumentum M29-A 22 előírásoknak megfelelő biztonságos laboratóriumi eljárásokat alkalmazva. Gondosan tisztítson meg, és ioncserélt vagy desztillált vízzel frissen készített 0,5% nátrium-hipoklorit oldattal fertőtlenítsen minden munkaterületet. A HCV IC, v2.0; HCV DIL, v2.0; HCV MMX, v2.0; HCV Mn 2+, v2.0; HCV ( ) C, v2.0; HCV (+) C, v2.0 és CX PS1, v2.0 nátrium-azidot tartalmaz. A nátrium-azid ólom- és rézcsövekkel erősen robbanékony fém-azidokat képezve reakcióba léphet. Amikor nátrium-azid tartalmú oldatokat önt ki a laboratóriumi mosogatóba, az azidlerakódás megakadályozására nagy mennyiségű vízzel öblítse ki a lefolyót. Viseljen szemvédőt, laboratóriumi védőruhát és egyszer használatos védőkesztyűt a következő anyagok kezelése során: HCV LYS, v2.0; HCV MMX, v2.0; CX4, v2.0, DN4, CN4, SB3, SB és szubsztrát munkareagens (kevert SB3 és SB reagens). Ezen anyagok bőrrel, szemmel és nyálkahártyákkal való érintkezése kerülendő. Ha mégis előfordul érintkezés, azonnal mossa le nagy mennyiségű vízzel. Ellenkező esetben égő érzés előfordulhat. Ezen reagensek kiömlése esetén szárazra törlés előtt vízzel hígítsa. Az SB vagy a szubsztrát munkareagens bőrrel vagy nyálkahártyával való érintkezése kerülendő. Ha előfordul bőrrel való érintkezés, azonnal mossa le nagy mennyiségű vízzel. Az SB és a szubsztrát munkareagens dimetil-formamidot tartalmaz, amelyről ismert, hogy nagy orális adagban mérgező, továbbá a születendő gyermekre nézve ártalmas hatású lehet. A bőrrel való érintkezést, a gőzök belégzését és az anyag lenyelését el kell kerülni. Ha mégis előfordul a bőrrel érintkezés, gondosan mossa le szappanos vízzel, és azonnal forduljon orvoshoz. Ügyeljen rá, hogy a HCV LYS, v2.0, amely guanidin-tiocianátot tartalmaz, vagy a CX4, v2.0, amely nátrium-tiocianátot tartalmaz ne kerüljön kapcsolatba nátriumhipoklorit (fehérítő) oldattal. Az ilyen keverékből erősen mérgező gáz fejlődhet. A minták kiloccsanását és keresztszennyeződését megelőzendő a minta- és a kontrollelőkészítéshez csavarókupakos csöveket kell használni. Ne használjon pattintókupakos csöveket. 10/42 COBAS AMPLICOR Hepatitis C Virus Test, v2.0 10/2005, Revision 6.0

Hepatitis C Virus Tárolási és kezelési követelmények A reagenseket tilos lefagyasztani. A HCV LYS, v2.0, HCV DIL, v2.0 és HCV IC, v2.0 2 8 C-on tárolandók. Felbontás nélkül ezek a reagensek a jelölt lejárati dátumig stabilak. Felbontást követően a fel nem használt részt ki kell dobni. 2 8 C-on való tárolás során a HCV LYS, v2.0 reagensben csapadék képződik. Felhasználást megelőzően melegítse 25 37 C-ra, és a csapadék feloldása céljából erőteljesen keverje az oldatot. Maximum 30 percig melegítse a HCV LYS, v2.0 reagenst, azután keverje erőteljesen, amíg a kristályok feloldódnak. Használatot megelőzően fehér háttér előtt vizsgáljon meg minden egyes HCV LYS, v2.0 üveget, hogy nem ereszt-e, vagy nincs-e sárgásan elszíneződve. Sárgás elszíneződés vagy szivárgás esetén az üveget ne használja fel. Csere céljából lépjen kapcsolatba a helyi Rocheirodával. Felbontást követően a fel nem használt részt ki kell dobni. A roncsoló munkareagenst (HCV IC, v2.0 reagenst adva a HCV LYS, v2.0 reagenshez) szobahőmérsékleten kell tárolni, és az elkészítést követően 8 órán belül fel kell használni. A HCV MMX, v2.0 és HCV Mn 2+, v2.0 2 8 C-on tárolandók. Ezek a reagensek a jelölt lejárati dátumig stabilak. Felbontást követően a fel nem használt részt ki kell dobni. A master mix munkareagenst (HCV Mn 2+, v2.0 reagenst adva a HCV MMX, v2.0 reagenshez) 2 8 C-on kell tárolni, és az elkészítést követően 4 órán belül fel kell használni. A NHP, HCV ( ) C, v2.0 és HCV (+) C, v2.0 2 8 C-on tárolandók. Ezek a reagensek a jelölt lejárati dátumig stabilak. Felbontást követően a fel nem használt részt ki kell dobni. A CX PS1, v2.0 és CX4, v2.0 2 8 C-on tárolandók. Ezek a reagensek a jelölt lejárati dátumig stabilak. A CX PS1, v2.0 és a CX4, v2.0 összekeverése után a munkareagens 30 napig stabil 2 8 C-on. A munkareagenst legfeljebb hat gépi cikluson keresztül lehet használni (12 óra ciklusonként), és a gépi ciklusok között 2 8 C-on kell tárolni. A DN4 2 25 C között tárolandó. A DN4 a jelölt lejárati dátumig stabil. Felbontást követően a DN4 2 8 C-on 30 napig vagy a lejárati dátumig stabil, amelyik előbb következik. A DN4-et legfeljebb hat gépi cikluson keresztül lehet használni (12 óra ciklusonként), és a gépi ciklusok között 2 8 C-on kell tárolni. A CN4 2 8 C-on tárolandó. A CN4 a jelölt lejárati dátumig stabil. Felbontást követően a CN4 2 8 C-on 30 napig vagy a lejárati dátumig stabil, amelyik előbb következik. A CN4-et legfeljebb hat gépi cikluson keresztül lehet használni (12 óra ciklusonként), és a gépi ciklusok között 2 8 C-on kell tárolni. Az SB3 és SB 2 8 C-on tárolandó. Felbontás nélkül ezek a reagensek a jelölt lejárati dátumokig stabilak. A szubsztrát munkareagenst minden nap el kell készíteni az SB3 és az SB összekeverésével. A szubsztrát munkareagens a COBAS AMPLICOR készülékben 16 óráig stabil. Az SB3-t, SB-t vagy a szubsztrát munkareagenst ne tegye ki fémeknek, oxidáló anyagoknak vagy direkt fénynek. A WB 2 30 C között tárolandó. A WB a jelölt lejárati dátumig stabil. A WB oldatot hígítás előtt vizsgálja meg, és szükség esetén a csapadék visszaoldására melegítse 30 37 C-ra. A WB desztillált vagy ioncserélt vízzel való 1:10 hígításával készített mosó munkapuffer (1X) 2 25 C-on, a COBAS AMPLICOR mosópuffertartályában tárolandó, és az elkészítéstől számított 2 hétig stabil. 10/2005, Revision 6.0 COBAS AMPLICOR Hepatitis C Virus Test, v2.0 11/42

A készlet tartalma A részben felhasznált kimutatási reagensek 2 8 C-on tárolandók két gépi ciklus között. Ellenőrizze a felbontott reagensek, illetve a munkareagens lejárati idejét a COBAS AMPLICOR készülékbe betöltés előtt. AMPLICOR HCV HCV PREP P/N: 21111086 123 Specimen Preparation Kit, ART: 11 1108 6 version 2.0 US: 83126 AMPLICOR HCV minta-előkészítő készlet, 2.0-s verzió HCV LYS, v2.0 (HCV roncsoló reagens, 2.0-s verzió) HCV DIL, v2.0 (HCV mintaoldószer, 2.0-s verzió) HCV IC, v2.0 (HCV belső kontroll, 2.0-s verzió) AMPLICOR HCV HCV CTL P/N: 21111175 123 Controls Kit, version 2.0 ART: 11 1117 5 AMPLICOR HCV kontrollkészlet, 2.0-s verzió US: 83131 NHP [Negatív plazma (humán)] HCV ( ) C, v2.0 [HCV ( ) kontroll, 2.0-s verzió] HCV (+) C, v2.0 [HCV (+) kontroll, 2.0-s verzió] AMPLICOR HCV HCV AMP P/N: 21111094 123 Amplification Kit, version 2.0 ART: 11 1109 4 AMPLICOR HCV amplifikáló készlet, 2.0-s verzió US: 83127 HCV MMX, v2.0 (HCV master mix, 2.0-s verzió) HCV Mn 2+,v2.0 (HCV mangánoldat, 2.0-s verzió) COBAS AMPLICOR HCV DK P/N: 21111132 123 HCV Detection Kit, version 2.0 ART: 11 1113 2 COBAS AMPLICOR HCV Kimutatási készlet, 2.0-s verzió US: 83130 CX PS1, v2.0 (HCV próba szuszpenzió 1, 2.0-s verzió) CX4, v2.0 (HCV próba szuszpenzió 2, 2.0-s verzió) 12/42 COBAS AMPLICOR Hepatitis C Virus Test, v2.0 10/2005, Revision 6.0

Hepatitis C Virus COBAS AMPLICOR DK P/N: 20757470 122 Detection Reagents Kit ART: 07 5747 0 COBAS AMPLICOR kimutatási reagensek készlete US: 83276 DN4 (denaturáló oldat) CN4 (avidin-tormaperoxidáz konjugátum) SB3 (szubsztrát A) SB (szubsztrát B) COBAS AMPLICOR CN4 P/N: 20764213 123 Conjugate Detection Reagent ART: 07 6421 3 COBAS AMPLICOR konjugátum kimutatási reagens US: 83305 CN4 (avidin-tormaperoxidáz konjugátum) COBAS AMPLICOR WB P/N: 20759899 123 Wash Buffer ART: 07 5989 9 COBAS AMPLICOR mosópuffer US: 83314 WB (10X-mosókoncentrátum) Szükséges, de nem biztosított anyagok Preamplifikálás Reagens-előkészítő terület COBAS AMPLICOR A-gyűrű 12 A-csövekkel ellátva (ART: 10 4563 6; P/N: 21045636001) COBAS AMPLICOR A-gyűrűtartó Műanyag újrazárható tasak Eppendorf Multipette pipetta 1,25 ml Combitip tartóval (steril, egyenként csomagolt) Pipettahegyek (kapacitás 50 µl és 100 µl)* aeroszolbarrierrel vagy pozitív kiszorításos RNáz-mentes hegyek Egyszer használatos kesztyűk, púdermentes Preamplifikálás Minta- és kontroll-előkészítő terület 1,5 ml polipropilén csavarókupakos csövek, steril, nem szilikonozott, kúpos (Sarstedt 72.692.005 vagy ekvivalens)** Csőállvány (Sarstedt 93.1428 vagy ekvivalens) 95% etanol, reagens minőség molekuláris biológiai vagy szövettani használatra (desztillált vagy ioncserélt vízzel frissen hígítva 70%-ra) Izopropil-alkohol, reagens minőség Steril, finomhegyű átvivőpipetták, RNáz-mentes Steril, egyszer használatos, polisztirol szerológiai pipetták (5 ml, 10 ml és 25 ml) 10/2005, Revision 6.0 COBAS AMPLICOR Hepatitis C Virus Test, v2.0 13/42

Pipettahegyek (kapacitás 20 µl, 50 µl, 100 µl, 200 µl, 400 µl, 600 µl és 1000 µl)* aeroszolbarrierrel vagy pozitív kiszorításos RNáz-mentes hegyek Mikrocentrifuga (max. RCF 16000 g, min. RCF 12500 g); Eppendorf 5415C, HERMLE Z230M vagy ekvivalens Vortex keverő 60 C ± 2 C szárazfűtőblokk Egyszer használatos kesztyűk, púdermentes Posztamplifikálás Amplifikálási/Kimutatási terület COBAS AMPLICOR Analizátor és nyomtató Felhasználói kézikönyv a COBAS AMPLICOR Analizátorhoz COBAS AMPLICOR Hepatitis C Virus Test, v2.0 módszertani kézikönyv D-cső állványok (ART: 10 4564 4: P/N: 21045644001) Desztillált vagy ioncserélt víz 5 ml szerológiai pipetták Egyszer használatos kesztyűk, púdermentes * Pipetták pontossága a névleges térfogat 3%-án belül legyen. Aeroszolbarrieres vagy pozitív kiszorításos RNáz-mentes pipettahegyeket kell használni ott, ahol alapvető megelőzni a minta és az amplikon keresztszennyeződését. ** A minták és kontrollok kiloccsanását és keresztszennyeződését megelőzendő a minta és a kontroll előkészítéshez csavarókupakos csöveket kell használni. Ne használjon pattintókupakos csöveket. A minta levétele, transzportja és tárolása Megjegyzés A minta levétele Valamennyi mintát fertőzések átvitelére alkalmasként kell kezelni. A COBAS AMPLICOR Hepatitis C Virus Test, v2.0 kizárólag szérum- vagy plazmamintákhoz való használatra alkalmas. A vért SST szérumvételező csövekbe vagy EDTA (levendulakék kupak), illetve ACD (sárga kupak) véralvadásgátlót tartalmazó steril csövekbe kell levenni. A heparinnal alvadásgátolt minták nem megfelelőek erre a vizsgálatra. A vért ne hagyja 2 25 C-on 6 óránál tovább. A szérumot vagy a plazmát a levételtől számított 6 órán belül szeparálja el a teljes vérből centrifugálással (1500 g, 20 perc, szobahőmérséklet). Vigye át a szérumot vagy a plazmát egy steril polipropilén csőben. A minta transzportja A minta tárolása A teljes vér, szérum vagy plazma transzportja meg kell feleljen a kóroki ágensek transzportjára vonatkozó országos, szövetségi, állami és helyi szabályozásoknak 23. A teljes vér 2 25 C-on transzportálandó, és a levételtől számított 6 órán belül fel kell dolgozni. A szérum vagy a plazma 2 8 C-on vagy -70 C alá fagyasztva transzportálandó, és az alább részletezett időkorlátokon belül fel kell dolgozni. A szérum és az EDTA-s plazma 2 8 C-on 72 óráig, vagy fagyasztva -70 C alatt tárolható. A minták tárolása 1,5 ml polipropilén csavarókupakos csövekben (pl. Sarstedt 72.692.105) 250 300 µl részletekben javasolt. A szérum- és plazmaminták két alkalommal fagyaszthatóak le és olvaszthatóak fel. 14/42 COBAS AMPLICOR Hepatitis C Virus Test, v2.0 10/2005, Revision 6.0

Hepatitis C Virus Használati utasítás Megjegyzés Megjegyzés Megjegyzés Megjegyzés A részletes használati utasításokat illetően lásd a COBAS AMPLICOR Analizátor Felhasználói kézikönyvét. Felhasználás előtt valamennyi reagensnek szobahőmérsékletűnek kell lennie. A vizsgálati eljárás megkezdése előtt a reagenseket vizsgálja meg, hogy elégséges térfogatuk áll-e rendelkezésre. Felhasználás előtt a szérum- és plazmamintáknak szobahőmérsékletűnek kell lennie. Használjon aeroszolbarrieres pipettákat vagy pozitív kiszorításos hegyeket, ahol indokolt. A szelektív amplifikálás érdekében rendkívüli gondossággal járjon el. Megjegyzés A minták és kontrollok kiloccsanását és keresztszennyeződését megelőzendő a minta és a kontroll előkészítéshez csavarókupakos csöveket kell használni. Ne használjon pattintókupakos csöveket. Futtatási mennyiség Valamennyi készlet elegendő reagenst tartalmaz nyolc darab 12 mintás futtatáshoz, amelyek kivitelezhetőek külön-külön vagy párhuzamosan. Valamennyi futtatásnak legalább egy AMPLICOR HCV ( ) kontrollt és egy AMPLICOR HCV (+) kontrollt kell tartalmaznia (lásd Minőség-ellenőrzés ). A minta-előkészítő és az amplifikálási reagensek 12 tesztre elegendő egyszer használatos üvegekben vannak. A HCV ( ) és HCV (+) kontrollok egyszer használatos ampullákban vannak. A reagensek leghatékonyabb felhasználása céljából a mintákat és a kontrollokat 12 többszörösének megfelelő tételekben kell feldolgozni. Munkafolyamat A COBAS AMPLICOR Hepatitis C Virus Test, v2.0 egy vagy két nap alatt végezhető el. Ha a vizsgálatot egyetlen munkanap alatt kell elvégezni, kövesse sorban az utasításokat a Reagens előkészítése, Minta és kontroll előkészítése, Reverz transzkripció, Amplifikálás és Kimutatás lépéseknek megfelelően. A vizsgálat két nap alatt végezhető el, ha az 1. nap a Minta és kontroll előkészítése lépést végzi, majd a 2. nap folytatja a Reagens előkészítése, Reverz transzkripció, Amplifikálás és Kimutatás lépésekkel, vagy az 1. nap a Minta és kontroll előkészítése, Reverz transzkripció és Amplifikálás lépéseket végzi el, majd a 2. nap a Kimutatást. Ha a minta és kontroll előkészítését az 1. napon, a reverz transzkripciót, amplifikálást és kimutatást pedig a 2. napon kívánja elvégezni, akkor csinálja meg a Minta és kontroll előkészítést (1 15. lépés), és tárolja a feldolgozott mintákat és kontrollokat a 15. lépésben leírtaknak megfelelően. A 2. napon kezdje a Reagens előkészítése lépéssel, azután olvassza fel a mintákat és kontrollokat szobahőmérsékleten, majd folytassa a Minta és kontroll előkészítéssel (16. lépés), a Reverz transzkripció, Amplifikálás és Kimutatás lépésekkel. Ha a minta és kontroll előkészítését, reverz transzkripciót és amplifikálást az 1. napon kívánja elvégezni, akkor kövesse a Reagens előkészítése és Minta és kontroll előkészítése lépéseket. Programozza a COBAS AMPLICOR készüléket Parallel (párhuzamos) módba, és végezze el az amplifikálási lépéseket (a részletes utasításokat illetően lásd a COBAS AMPLICOR készülék Felhasználói kézikönyvét). Tárolja a denaturált amplikonokat egy éjszakán át 2 8 C-on, majd folytassa a Kimutatás lépéssel a 2. napon. 10/2005, Revision 6.0 COBAS AMPLICOR Hepatitis C Virus Test, v2.0 15/42

Reagens előkészítése Munkaterület: Preamplifikálás Reagens-előkészítő terület 1. Határozza meg a beteg minta- és a kontrollvizsgálatokhoz szükséges A-gyűrű(k) számát. Helyezze az A-gyűrű(ke)t az A-gyűrűtartóba. 2. Készítse el a master mix munkareagenst 100 µl HCV Mn 2+, v2.0 egy ampulla HCV MMX, v2.0 reagenshez való hozzáadásával. A master mix térfogatát nem szükséges megmérnie. Mérjen 100 µl HCV Mn 2+, v2.0 oldatot egy teljes ampulla HCV MMX, v2.0 reagenshez. Csavarja rá a kupakot, majd a cső 10 15-szöri fordítgatásával keverje jól össze az oldatokat. A master mix munkareagenst ne vortexelje. A HCV Mn 2+, v2.0 rózsaszín színe alkalmas, hogy meggyőződjön róla, hogy a HCV Mn 2+, v2.0 oldatot a HCV MMX, v2.0 reagenshez adta. A maradék HCV Mn 2+, v2.0 oldatot dobja ki. A master mix munkareagens 2 8 C-on tárolandó, és az elkészítést követő 4 órán belül fel kell használni. 3. Mérjen valamennyi A-csőbe 50 µl master mix munkareagenst ismétlő pipettával vagy aeroszolbarrierrel vagy pozitív kiszorításos heggyel ellátott pipettával. Ezután ne zárja le az A-csöve(ke)t. 4. Helyezze a master mix munkareagenst tartalmazó A-gyűrű(ke)t egy újrazárható műanyag tasakba, és gondosan zárja le a tasakot. Az A-gyűrű(ke)t vigye át a Preamplifikálás Minta- és kontroll-előkészítő területre. A minta és kontroll előkészítése befejezéséig tárolja a master mix reagenst tartalmazó A-gyűrű(ke)t 2 8 C-on a Preamplifikálás Minta- és kontroll-előkészítő területen. A master mix munkareagens az A-csövekben lezárt műanyag tasakban 2 8 C-on 4 óra hosszat stabil. Minta és kontroll előkészítése Megjegyzés Megjegyzés Megjegyzés Munkaterület: Preamplifikálás Minta- és kontroll-előkészítő terület Korábban előkészített minták és kontrollok amplifikálásához először a Reagens előkészítése szakasz lépéseit végezze el. Olvassza fel a mintákat és a kontrollokat szobahőmérsékleten, majd folytassa a Minta és kontroll előkészítése, 16. lépéssel. Használatot megelőzően fehér háttér előtt vizsgáljon meg minden egyes HCV LYS, v2.0 üveget, hogy nem ereszt-e, vagy nincs-e sárgásan elszíneződve. Sárgás elszíneződés vagy szivárgás esetén az üveget ne használja fel. Csere céljából lépjen kapcsolatba a helyi Roche-irodával. 2 8 C-on való tárolás során a HCV LYS, v2.0 reagensben csapadék képződik. Felhasználást megelőzően melegítse 25 37 C-ra maximum 30 percig, és a csapadék feloldása céljából erőteljesen keverje az oldatot. 1. Készítsen 70%-os etanolt. 12 teszthez: keverjen össze 11,0 ml 95%-os etanolt és 4,0 ml ioncserélt vagy desztillált vizet. 2. Címkézzen meg egy-egy 1,5 ml-es csavarókupakos csövet minden egyes betegmintához és további két csövet, mint HCV ( ) C és HCV (+) C. 3. Készítsen roncsoló munkareagenst. Használat előtt vortexelje a HCV IC, v2.0 oldatot 5 10 másodpercig. Minden egyes legfeljebb 12 mintát és kontrollt tartalmazó tételre számolva, mérjen 100 µl HCV IC, v2.0 oldatot egy üveg HCV LYS, v2.0 reagenshez, és keverje össze jól. A HCV LYS, v2.0 térfogatát nem szükséges megmérnie. Megjegyzés A HCV IC, v2.0 oldatot hozzá kell adni a HCV LYS, v2.0 reagenshez akkor is, ha a HCV belső kontrollt nem fogják kimutatni. A maradék HCV IC, v2.0 oldatot dobja ki. A roncsoló munkareagens szobahőmérsékleten 8 óra hosszat stabil. 16/42 COBAS AMPLICOR Hepatitis C Virus Test, v2.0 10/2005, Revision 6.0

Hepatitis C Virus Megjegyzés Fagyasztott minták használatakor olvassza fel a mintákat szobahőmérsékleten, majd vortexelje őket 3-5 másodpercig. A mintának a cső aljába gyűjtéséhez a csövet rövid időre tegye centrifugába. A mintákkal való munka során ügyeljen a kesztyűk szennyezésének elkerülésére. 4. Mérjen 400 µl roncsoló munkareagenst minden egyes megcímkézett csőbe, és csavarja a csövekre a kupakokat. 5. Készítse el a kontrollokat a következők szerint: Vortexelje az NHP, HCV ( ) C, v2.0 és HCV (+) C, v2.0 reagenseket legalább 5 10 másodpercig. Mérjen 200 µl NHP-t a két kontrollcső mindegyikébe. Csavarja a csövekre a kupakokat, és vortexelje őket legalább 3 5 másodpercig. Mérjen 20 µl HCV ( ) C, v2.0-t a roncsoló munkareagenst és NHP-t tartalmazó HCV ( ) C címkézésű csőbe. Csavarja a csőre a kupakot, és vortexelje legalább 3 5 másodpercig. Mérjen 20 µl HCV (+) C, v2.0-t a roncsoló munkareagenst és NHP-t tartalmazó HCV (+) C címkézésű csőbe. Csavarja a csőre a kupakot, és vortexelje legalább 3 5 másodpercig. 6. Mérjen minden egyes beteg mintából 200 µl-t a megfelelően címkézett roncsoló munkareagenst tartalmazó csőbe. Csavarja a csövekre a kupakokat, és vortexelje őket legalább 3 5 másodpercig. 7. Inkubálja a minta- és kontrollcsöveket egy szárazfűtőblokkban 60 C ± 2 C-on 10 percig. Azután vortexelje őket legalább 10 másodpercig. 8. Vegye le a kupakokat, és mérjen 600 µl 100% izopropil-alkoholt (szobahőmérsékleten) mindegyik csőbe. Csavarja újra a csövekre a kupakokat, és vortexelje őket legalább 3 5 másodpercig. Inkubálja a csöveket 2 percig szobahőmérsékleten. 9. Tegyen egy orientációs jelzést valamennyi csőre, majd helyezze a csöveket a mikrocentrifugába úgy, hogy az orientációs jelzés kifelé nézzen, vagyis az üledék a jelzésnek megfelelően helyezkedjen majd el. Centrifugálja le a mintákat és a kontrollokat szobahőmérsékleten maximum sebességen (12500 16000 g) 15 percig. 10. Minden egyes csőhöz új finom hegyű transzferpipettát használva óvatosan távolítsa el és dobja ki a felülúszót minden csőből, ügyeljen rá, hogy ne zavarja fel az üledéket (amely esetleg nem is látható). Távolítsa el a lehető legtöbb folyadékot anélkül, hogy felzavarná az üledéket. A felülúszót lassan szívja ki, lehetőséget adva a folyadéknak, hogy teljesen leszivárogjon a cső faláról. Ne használjon vákuum szívót. 11. Mérjen be 1,0 ml 70%-os etanolt (szobahőmérsékleten) mindegyik csőbe, csavarja vissza a kupakokat, és vortexelje őket legalább 3 5 másodpercig. 12. Helyezze a csöveket a mikrocentrifugába az orientációs jelzésekkel kifelé, és centrifugálja a csöveket szobahőmérsékleten maximum sebességen (12500 16000 g) 5 percig. 13. Minden egyes csőhöz új finom hegyű átvivőpipettát használva óvatosan távolítsa el és dobja ki a felülúszót az üledék felzavarása nélkül. Az üledék ebben a lépésben tisztán látható. Távolítsa el a lehető legtöbb felülúszót. 10/2005, Revision 6.0 COBAS AMPLICOR Hepatitis C Virus Test, v2.0 17/42

14. Csavarja vissza a csövekre a kupakokat, és centrifugálja őket maximum sebességen 3 5 másodpercig. Minden egyes csőhöz új hegyet használva egy 200 µl-es pipettával óvatosan távolítsa el a felülúszót anélkül, hogy felzavarná az üledéket. Az üledék ebben a lépésben tisztán látható. Távolítsa el a lehető legtöbb felülúszót. Az etanolmaradványok gátolhatják az amplifikálást. 15. Mérjen be 200 µl HCV DIL, v2.0-t mindegyik csőbe. Egy aeroszolbarrierrel ellátott hegyű 200 µl-es pipettával a lehető legjobban zavarja fel az üledéket. Csavarja vissza a csövekre a kupakokat. Vortexelje őket erőteljesen 10 másodpercig. Némi oldhatatlan anyag visszamaradhat. Amplifikálja a feldolgozott mintákat és kontrollokat az előkészítéstől számított 3 órán belül, vagy tárolja őket -70 C-ra vagy az alá fagyasztva maximum egy hónapig, legfeljebb kétszeri fagyasztás/olvasztás mellett. Több, mint két fagyasztás/olvasztás ciklus a HCV vagy a HCV belső kontroll jelének elvesztését eredményezheti. Megjegyzés Fagyasztva tárolt minták és kontrollok használatakor az amplifikálást megelőzően olvassza fel a mintákat szobahőmérsékleten, majd vortexelje őket 5 másodpercig mielőtt a 16. lépéssel folytatná. 16. Mérjen aeroszolbarrierrel vagy pozitív kiszorításos heggyel ellátott mikropipettával minden egyes beteg mintából és kontrollból 50 µl-t a megfelelő, master mix munkareagenst tartalmazó A-csőbe. Használjon új hegyet minden egyes mintához és kontrollhoz. Ügyeljen arra, hogy ne vigyen át semminemű csapadékos anyagot, amely nem ment vissza oldatba. Csavarja az A-csövekre a kupakokat. 17. Jegyezze fel az A-gyűrűkben levő kontrollok és minták helyzetét. Az amplifikálást a mintáknak és kontrolloknak a master mix munkareagenst tartalmazó A-csövekhez adásától számított 45 percen belül meg kell kezdeni. Vigye át az A-gyűrűkben lévő előkészített mintákat és kontrollokat az amplifikálási/kimutatási területre. A feldolgozott minták és kontrollok maradéka -70 C-ra vagy az alá fagyasztva legfeljebb egy hónapig tárolható. A feldolgozott minták legfeljebb két alkalommal fagyaszthatóak le és olvaszthatóak fel. Több, mint két fagyasztás/olvasztás ciklus HCV RNSveszteséget eredményezhet. Reverz transzkripció, Amplifikálás és Kimutatás Munkaterület: Posztamplifikálás Amplifikálási/Kimutatási terület Végezzen napi eszközkarbantartást a COBAS AMPLICOR Analizátor Felhasználói kézikönyvében leírtaknak megfelelően: Törölje le az indítóhelyet szálmentes nedves ruhával, és szárítsa meg. Törölje le a D-csőtartó hegyet szálmentes nedves ruhával, és szárítsa meg. Ellenőrizze a mosópuffertartályt, és ha szükséges, töltse fel. Készítse el a mosó munkapuffert (1X) a következők szerint: A WB oldatot vizsgálja meg, és szükség esetén a csapadék visszaoldására melegítse 30 37 C-ra. Adjon 1 térfogatrész WB oldatot 9 térfogatrész ioncserélt vagy desztillált vízhez. Keverje jól össze. Mindig tartson legalább 3 4 liter mosó munkapuffert (1X) a készülék mosópuffertartályában. Ürítse ki a hulladéktárolót. Indítsa be a készüléket. A beindítás során ellenőrizze a fecskendőket és a csövezést. A beindítás során ellenőrizze a transzferhegyet. 18/42 COBAS AMPLICOR Hepatitis C Virus Test, v2.0 10/2005, Revision 6.0

Hepatitis C Virus Minden egyes futtatás előtt Ellenőrizze a hulladéktárolót, és ürítse ki, ha szükséges. Ellenőrizze a mosópuffertartályt, és ha szükséges, töltsön hozzá puffert. Cserélje ki a használt D-cső állványokat. Indítsa be a készüléket. Eszköz feltöltése és a rendszer működtetése 1. Vizsgálja meg az asztali reagensek mennyiségeit a COBAS AMPLICOR készüléken. Készítsen elegendő reagenskazettát a műveletekhez való feltöltéshez. 2. Vortexelje jól össze a CX PS1, v2.0 szuszpenziót. Mérjen 2,5 ml CX PS1, v2.0 szuszpenziót egy CX4, v2.0 kazettába. Helyezze a kazettát a tesztspecifikus reagensállványra. Dobja ki a használt CX PS1, v2.0 ampullát. Jegyezze fel a reagens készítési dátumát a CX4, v2.0 kazettára. 3. HCV belső kontroll kimutatásakor vortexelje az IC PS1 szuszpenziót jól össze. Mérjen 2,5 ml IC PS1 szuszpenziót egy IC4 kazettába. Helyezze a kazettát a tesztspecifikus reagensállványra. Dobja ki a használt IC PS1 ampullát. Jegyezze fel a reagens készítési dátumát az IC4 kazettára. 4. Készítsen 5 ml SB egy SB3 kazettába való pipettázásával szubsztrát munkareagenst. Fel-le pipettázással keverje össze. Dobja ki az üres SB ampullát. Jegyezze fel a reagens készítési dátumát az SB3 kazettára. 5. Helyezze a szubsztrát munkareagenst a generikus reagensállványba. 6. Helyezze a DN4 és CN4 kazettákat a generikus reagensállványba. Jegyezze fel a felnyitás dátumát mindegyik kazettára. 7. Azonosítsa a reagensállványokat mint generikus vagy tesztspecifikus, a COBAS AMPLICOR készülék Felhasználói kézikönyvében leírtaknak megfelelően, billentyűzet vagy vonalkód-leolvasó segítségével, illetve az AMPLILINK szoftver segítségével, az AMPLILINK szoftver Felhasználói kézikönyvében leírtaknak megfelelően. 8. Konfigurálja a reagensállványokat a reagenspozícióknak és tételszámoknak a készülékbe való bevitelével a COBAS AMPLICOR készülék Felhasználói kézikönyvében leírtaknak megfelelően, billentyűzet vagy vonalkód-leolvasó segítségével, illetve az AMPLILINK szoftver segítségével, az AMPLILINK szoftver Felhasználói kézikönyvében leírtaknak megfelelően. 9. Töltse a reagensállványokat a készülékre a COBAS AMPLICOR készülék Felhasználói kézikönyvében leírtaknak megfelelően, billentyűzet vagy vonalkód-leolvasó segítségével, illetve az AMPLILINK szoftver segítségével, az AMPLILINK szoftver Felhasználói kézikönyvében leírtaknak megfelelően. Győződjön meg arról, hogy minden egyes reagenskazetta a jelölt pozíciójában van, és szorosan illeszkedik az állványba. 10. Helyezze a D-cső állványt a D-cső platformra. Egy D-cső szükséges minden egyes kimutatási reakcióhoz, és kettő D-cső szükséges minden egyes szubsztrát munkaoldat kazettához, tekintettel a COBAS AMPLICOR készülék általi kiürítésre. 10/2005, Revision 6.0 COBAS AMPLICOR Hepatitis C Virus Test, v2.0 19/42

11. Helyezze az A-gyűrű(ke)t a COBAS AMPLICOR készülék PCRkészülékszegmense(i)be. 12. Töltse be az A-gyűrű(ke)t a készülékbe a COBAS AMPLICOR készülék Felhasználói kézikönyvében leírtaknak megfelelően, billentyűzet vagy vonalkód-leolvasó segítségével, illetve az AMPLILINK szoftver segítségével, az AMPLILINK szoftver Felhasználói kézikönyvében leírtaknak megfelelően. 13. Készítsen egy A-gyűrű munkalistát a COBAS AMPLICOR Analizátor Felhasználói kézikönyvében leírtaknak megfelelően. 14. Szorosan zárja le a PCR-készülékszegmens(ek) tetejét. 15. Indítsa el a COBAS AMPLICOR készüléket a COBAS AMPLICOR Analizátor Felhasználói kézikönyvben leírtaknak megfelelően. 16. Várja meg, míg a készülék kijelzi, hogy a töltés ellenőrzése megtörtént. Megjegyzés A COBAS AMPLICOR készülék minden egyes A-cső tartalmának hatszori önálló detektálását teszi lehetővé. A kimutatási reagens szükséges mennyiségét minden esetben a készülék kiszámolja, és minden egyes futtatás kezdetén egy töltésellenőrzés határozza meg, hogy az adott teszthez elegendő reagens áll-e rendelkezésre. 17. A COBAS AMPLICOR készülék a reverz transzkripciót, amplifikálást és kimutatást automatikusan végzi. Az eredmények 660 nm-en mért abszorbancia értékben, valamint Pozitív, Negatív, illetve Bizonytalan megjelöléssel vannak megadva. 20/42 COBAS AMPLICOR Hepatitis C Virus Test, v2.0 10/2005, Revision 6.0

Hepatitis C Virus Eredmények Az eredmények értékelése Belső kontroll kimutatással Megjegyzés Az eredmények kinyomtatását, valamint a jelzők és megjegyzések értelmezését illetően lásd a COBAS AMPLICOR készülék Felhasználói kézikönyvét. 1. Ellenőrizze a kinyomtatott eredménylapon a jelzőket (FLG) és megjegyzéseket, hogy meggyőződjön arról, hogy a futtatás érvényes. Ha a futtatás érvénytelen (invalid), ismételje meg a teljes eljárást (mintaelőkészítés, amplifikálás és kimutatás). 2. Ha a futtatás érvényes, a minta eredmények az alábbiak szerint értékelendők: HCV A 660 eredmény HCV IC A 660 eredmény A 660 COBAS jelző A 660 COBAS jelző Értékelés < 0,15 NEGATIVE 0,15 POSITIVE Nincs kimutatott HCV RNS. A negatív eredmény nem zárja ki a HCV-fertőzés jelenlétét, mivel az eredmény a megfelelő mintavételen, a gátlóanyagok hiányán és az elegendő mennyiségű kimutatható RNS jelenlétén is múlik. < 0,15 NEGATIVE < 0,15 NEGATIVE Gátlóanyagot tartalmazó minták. HCV RNS, ha jelen is van, nem kimutatható. Az eredeti minta egy másik részletével ismételje meg a vizsgálatot. A gátlóanyagok gyakran labilisak, és az eredetileg ilyen tartalmú minták az ismétléskor már nem mutatnak gátlást. Ha az eredeti minta nem érhető el, új mintát kell venni. 1,0 POSITIVE BÁRMI BÁRMI Kimutatott HCV RNS. A minta HCV jelenlétére nézve pozitív. 0,15, < 1,0 GZ 0.15 0.99 BÁRMI BÁRMI Bizonytalan. Az eredmények HCV RNS jelenlétére nézve nem meggyőzőek. Ismételje meg két párhuzamos mintával a teljes vizsgálati eljárást betegminta új részletével. Ha a megismételt vizsgálatok egyik vagy mindkét esetben 0,15 A 660 eredményt adnak, a mintát HCV RNS jelenlétére nézve pozitívnak kell tekinteni. Az ismételten vizsgált minták HCV RNS jelenlétére nézve negatívnak tekintendők, ha az eredmények < 0,15 A 660 feltéve, ha az IC-eredmények mindkét ismétlés esetén 0,15 A 660. 10/2005, Revision 6.0 COBAS AMPLICOR Hepatitis C Virus Test, v2.0 21/42