QUANTA Lite HA dsdna ELISA 704615 In vitro diagnosztikai alkalmazásra CLIA komplexitás: Magas

QUANTA Lite HA dsdna ELISA 704615 In vitro diagnosztikai alkalmazásra CLIA komplexitás: Magas Javasolt alkalmazás Ez az assay a humán szérumban lévő duplaszálú dezoxiribonukleinsav (dsdna) elleni specifikus, nagy aviditású IgG autoantitestek kimutatására szolgál, mely más szerológiai vizsgálatok eredményeivel és a klinikai adatokkal együtt segíti a szisztémás lupus erythematosus (SLE) diagnózisának felállítását. A kit elegendő anyagot tartalmaz maximum 40 minta mérésére duplikátumban, vagy 88 minta egyszeri mérésére, kalibrációs görbe felvételével valamint pozitív, negatív és egyszálas DNS kontrollok egyidejű meghatározásával. A teszt összegzése és magyarázata Az anti-dsdns antitestek az SLE diagnosztikai markereként való alkalmazása, illetve a betegség aktivitásának későbbi figyelemmel kísérésében hatalmas segítség a klinikusoknak 1, amióta Ceppelini és mtsai 1957 2 -ben első alkalommal felismerték, majd az American College of Rheumatology 1982-ben átdolgozott SLE klasszifikációs kritériumai közé felvették 3. Napjainkban három elterjedt tesztmódszert alkalmaznak, melyek a felismert dsdns antitesteket aviditása alapján különböztethetők meg. Az enzimmel kapcsolt immunoszorbens vizsgálat (ELISA), amelynek több változata is van, klasszikusan az antitest aviditások széles spektrumát felismeri. A Crithidia luciliae immunofluorescens assay (IFA) a hozzá kimondottan alacsonyabb aviditással kötődő antitesteket ismeri fel. A Farr radioimmun teszt (RIA) 5, az ammónium-szulfátos kicsapási lépés révén, amely eleve kizárja az alacsony aviditású antitesteket, klasszikusan kizárólag a nagy aviditású antitesteket méri. A HA dsdns assay a tesztkörülmények egy szigorúbb halmazát foglalja magába 8, melyek arra szolgálnak, hogy kizárják az alacsony aviditású gyengén kötődő antitesteket. Néhány tanulmány 6,7 bemutatja az antitestek aviditása és a betegség progressziója közötti összefüggést, ahol a teszt kiválasztása megkönnyíti az enyhe változatú SLE, illetve a bőr és vese bonyodalmakkal (főképpen lupus nephritis esetén) rendelkező betegek közötti különbségtételt. Általában a tesztek jó egyezést mutatnak a határozott szisztémás lupus erythematosus (SLE) betegek szérum mintái esetén, azonban az inaktív betegséggel bíró, illetve azon betegek esetén, melyek nem felelnek meg az SLE klasszifikációs kritériumainak, jelentős disszonancia figyelhető meg. A módszer elve A mikrotiter lemez celláii borjú csecsemőmirigy dsdns antigénnel vannak bevonva. A kalibrátorokat, a kontrollokat és a hígított betegmintákat a cellákba pipettázzuk. Az első inkubáció során a dsdns antigént felismerő autoantitestek az antigénhez kötődnek. Miután a nem kötődött fehérjéket mosással teljesen eltávolítottuk, peroxidázzal jelölt, tisztított kecske anti-humán IgG konjugátumot adagolunk a cellákba. A konjugátum az előző fázisban megkötött humán autoantitestekhez kötődik, a nem kötődött konjugátum feleslegét egy újabb mosással eltávolítjuk. A megkötődött konjugátumot 3,3, 5,5 tetrametil-benzidin (TMB) szubsztrát segítségével tesszük láthatóvá, ami kék reakcióterméket ad. A szín intenzitása arányos a mintában lévő autoantitest koncentrációjával. A reakció leállítása céljából minden egyes cellába kénsavat adunk. Ez egy sárga végső színt eredményez, mely 450 nm-en leolvasható. Reagensek 1. Polisztirol mikrotiter ELISA lemez borjú csecsemőmirigy dsdns antigénnel bevonva (12-1 x 8 cella) tartókerettel, deszikkánst tartalmazó fóliatasakba csomagolva. 2. ELISA negatív kontroll, 1 ampulla tartósítószert és humán szérumot tartalmazó puffer, dsdns-hez kötődő antitestek nélkül, előhígítva, 1,2 ml. 3. HA dsdns ELISA A kalibrátor, 1 ampulla tartósítószert, valamint dsdns-hez kötődő humán szérum 4. HA dsdns ELISA B kalibrátor, 1 ampulla tartósítószert, valamint dsdns-hez kötődő humán szérum 5. HA dsdns ELISA C kalibrátor, 1 ampulla tartósítószert, valamint dsdns-hez kötődő humán szérum 6. HA dsdns ELISA D kalibrátor, 1 ampulla tartósítószert, valamint dsdns-hez kötődő humán szérum 7. HA dsdns ELISA E kalibrátor, 1 ampulla tartósítószert, valamint dsdns-hez kötődő humán szérum 8. HA dsdns pozitív kontroll, 1 ampulla tartósítószert, valamint dsdns-hez kötődő humán szérum 9. III típusú mintahígító, 2 üveg sárga, tartalmaz: Tween 20-at, protein stabilizátorokat és tartósító anyagokat, 50 ml. 10. HA dsdns mosókoncenrátum, 2 üveg 10-szeres koncentrátum színtelen, Tween 20-at és tartósító anyagot tartalmaz., 50 ml. A hígítási javaslatok a Módszerek fejezetben találhatók. 11. HA dsdns egyszálas kontroll, 1 ampulla tartósítószert, valamint ssdns-hez kötődő humán szérum 12. HRP HA dsdns IgG konjugátum, anti-humán IgG, 1 üveg kékes színű, puffert, protein stabilizátorokat és tartósító anyagot tartalmaz, 10 ml. 13. TMB kromogén, 1 üveg, stabilizátorokat tartalmaz, 10 ml. 14. HRP stop oldat, 0,344 M kénsav, 1 üveg színtelen, 10 ml. 1

Figyelmeztetések 1. FIGYELMEZTETÉS: Ez a termék olyan kémiai anyagot (0,02% kloramfenikol) tartalmaz a kontrollokban, mintahígító és a konjugátumban, amelyet Kalifornia államban rákkeltőként tartanak nyilván. A mosó és a mintahígító Proclin 150-et tartalmaz. A sérülések megelőzése érdekében kerülje az anyag belélegzését, elfogyasztását, illetve a bőrre, szembe jutását. 2. Az összes humán eredetű anyagot, amelyeket a kontrollok előállítása során ehhez a termékhez felhasználtak, az FDA által jóváhagyott módszerekkel ellenőrizték és negatívnak találták HIV, HBsAg, és HCV ellenes antitestekre nézve. Egy tesztmódszer sem tud tökéletes bizonyosságot szolgáltatni afelől, hogy a termék mentes HIV, HBV,HCV vagy más fertőző ágensektől. Éppen ezért a HA dsdns pozitív kontroll, a HA dsdns egyszálas kontroll, a HA dsdns A E kalibrátorok potenciálisan fertőző anyagként kezelendő. 12 3. Az oldatok stabilizálására nátrium-azidot használtak. A nátrium-azid egy méreg, ami lenyelve, vagy szemen, bőrön keresztül felszívódva toxikus lehet. A nátrium-azid ólom- vagy réztartalmú vízvezeték csövekkel reakcióba léphet, robbanásveszélyes fém-azidokat képezve. Ha a reagensek maradványait a lefolyóba önti, az azid-képződés megakadályozása céljából öblítse le nagy mennyiségű vízzel. 4. A HRP konjugátum egy híg mérgező/korrozív vegyszert tartalmaz, ami nagy mennyiségben elfogyasztva toxikus lehet. Az esetleges vegyi égési sérülés megelőzése érdekében vigyázzon, hogy az anyag bőrre, szembe ne kerülhessen. 5. A TMB kromogén olyan irritáló anyagot tartalmaz, ami belélegezve, lenyelve, vagy a bőrön keresztül felszívódva veszélyes lehet. A sérülések megelőzése érdekében kerülje az anyag belélegzését, elfogyasztását, illetve a bőrre, szembe jutását. 6. A HRP stop oldat hígított kénsav oldatot tartalmaz. Ne tegye ki bázisok, fémek vagy más olyan anyagok hatásának, amelyek savakkal reakcióba léphetnek. A kénsav mérgező és maró anyag, lenyelve toxikus lehet. Az esetleges vegyi égési sérülések megelőzése érdekében vigyázzon, hogy az anyag bőrre, szembe ne kerülhessen. 7. A reagensekkel végzett műveletek során használjon megfelelő személyi védőeszközöket. 8. A kicseppenő reagenseket azonnal fel kell takarítani. A hulladékok eltávolításakor tartsa be az összes szövetségi, állami és helyi környezetvédelmi előírást. Óvintézkedések 1. Ez a termék kizárólag vizsgálati alkalmazásra készült. Ezen termék működési jellemzőit még nem határozták meg. 2. A terméket kizárólag megfelelően képzett személy használhatja. 3. Az előírások szigorú betartása javasolt. Az előírásoktól való bármely eltérés az assay működését és a kapott eredményeket hátrányosan befolyásolhatja. Figyeljen a jelen Használati Utasítás speciális Megjegyzéseire és figyelmeztetéseire. 4. A különböző gyártási számú kalibrátorok, kontrollok, konjugátumok és lemezek nem felcserélhetőek. Ezen összetevők az adott kittől eltérő gyártási számú termékekkel történő helyettesítése ellentmondásos és pontatlan eredményekhez vezethet. Minden egyes mikrotiter csíkot, amit egy adott vizsgálati sorozatban használnak fel, ugyanabból a fóliatasakból kell elővenni. 5. A reagensek beszennyeződésének elkerülése céljából kizárólag új, vagy tiszta műanyag,- illetve üvegedényeket használjon. Soha ne töltse vissza a megmaradt reagenseket az eredeti üvegekbe. 6. Ne hagyja a reagens-tartókat lezáratlanul; az emiatt fellépő párolgási veszteség, illetve szennyeződés téves eredményekhez vezethet. 7. A TMB szubsztrátot fénytől és nedvességtől óvni kell. 8. Mikrobiológiai szempontból szennyezett, hemolizált vagy lipémiás szérum, vagy csapadékot tartalmazó minta nem használható. 9. A pontatlan mintahígítást a teszt kivitelezése közben nem lehet ellenőrizni, mivel a kit kontrolljai felhasználásra kész oldatban kerülnek forgalomba. Kalibrált pipetták és alkalmas belső minőségi kontroll minták használata javasolt. 10. Automatizált tesztrendszerek, mintahígítók és más automatizált eszközök használata a manuális módszerrel összehasonlítva eltérő eredményekhez vezethet. Minden laboratórium saját felelőssége az általa használt rendszer teljes körű validálása, és annak biztosítása, hogy az eredmények a jelen útmutatóban foglalt határokon belül legyenek, és a csatolt Minőség-ellenőrzési bizonylatnak megfeleljenek. 11. Valamennyi alkalmazott készüléket a gyártó előírásainak megfelelően kell kalibrálni és karbantartani. Tárolási körülmények 1. A kit 2-8 C közötti hőmérsékleten tárolandó, lefagyasztani tilos. A nem megfelelő tárolási hőmérséklet az eredményeket befolyásolja. 2. A hígított mosópuffer 2-8 C között tartva 1 hétig stabil. 3. A kit lejárati dátuma a külső címkén van feltüntetve. A minta vétele és kezelése 1. A vérminta levétele vénapunkcióval történjen, a természetes alvadási folyamat után a szérumot el kell választani. 2. A szérum a vizsgálat elvégzése előtt 2-8 C között 7 napig tárolható 10, vagy hosszabb tárolás céljából kisebb részletekben lefagyasztható és -20 C-on, vagy ez alatti hőmérsékleten tárolható. 3. Az ismételt felolvasztást és lefagyasztást kerülni kell. 4. A szérummintákat nem szabad hővel inaktiválni, mivel ez téves pozitív eredményt adhat. 2

A teszt kivitelezése Rendelkezésre álló anyagok Használati utasítás: Az assay részletes leírását tartalmazza. Minőség-ellenőrzési bizonylat: Adott gyártási sorozathoz tartozó kitek elvárható működési jellemzőit mutatja be. HA dsdns-sel bevont cellák: Borjú csecsemőmirigy dsdns antigénnel bevont 12 db, egyenként 8 mérőhelyet tartalmazó, bontható mikrotiter-lemez csík Minden lemez 2 deszikkáns betéttel ellátott, visszazárható fóliatasakba van csomagolva. III típusú mintahígító: 2 db 50 ml-es a mintahígító puffert tartalmazó üveg, Sárga színű, azonnal felhasználható. HA dsdns mosókoncentrátum (10-szeres töménységű): 2 db 50 ml-es üveg, ami 10-szeres töménységű puffert tartalmaz a cellák mosására. HA dsdns kalibrátorok: 5 üveg, az egyes üvegek 1,2 ml hígított humán szérumot tartalmaznak, melyek antidsdns antitest koncentrációja a következő: 1000, 333, 111, 37, 12,3 NE/ml. Azonnal felhasználható. HA dsdns pozitív kontroll: 1 üveg 1,2 ml hígított humán szérum. A várható érték a Minőség-ellenőrzési bizonylatban található. Azonnal felhasználható. ELISA negatív kontroll: 1 üveg 1,2 ml hígított humán szérum. A várható érték a Minőség-ellenőrzési bizonylatban található. Azonnal felhasználható. HA dsdns egyszálas kontroll: 1 üveg, 1,2 ml hígított humán szérum. A várható érték a Minőség-ellenőrzési bizonylatban található. Azonnal felhasználható. HRP HA dsdns IgG konjugátum: 1 üveg 10 ml tisztított, peroxidázzal jelölt humán IgG antitest, Kék színű. Azonnal felhasználható. TMB kromogén: 1 üveg 10 ml TMB kromogént tartalmaz. Azonnal felhasználható. HRP stop oldat: 1 üveg 10 ml 0,344 M kénsav oldatot tartalmaz. Azonnal felhasználható. További szükséges anyagok, melyeket a kit nem tartalmaz Automata mikrotiter-lemez mosó: Használata ajánlott, de a lemezek mosása manuálisan is elvégezhető. Mikrotiter-lemez leolvasó: Legyen képes 450nm-en az optikai denzitás meghatározására, levegőre nullázva. Desztillált vagy ioncserélt víz: Az elérhető legjobb minőségben. Kalibrált mikropipetták: 1000, 100, illetve 10 μl adagolásához. Többcsatornás pipetta: A 100 µl konjugátum, szubsztrát és a leállító oldat beméréséhez ajánlott. Üveg/műanyag csövek: Mintahígításhoz. Módszer Mielőtt hozzákezd: 1. A kit szobahőmérsékletűre melegítése A kitet szobahőmérsékleten való felhasználásra tervezték (20-24 C). Vegye elő a kitet a tárolási helyéről és hagyja szobahőmérsékleten állni kb. 60 percig. A cellákat nem szabad a fóliatasakból kivenni addig, amíg azok el nem érték a szobahőmérsékletet. Megjegyzés: A kiteket egy hétig lehet szobahőmérsékleten tárolni. 2. A kit alkotórészei Felhasználás előtt a kit egyes összetevőit óvatosan keverje meg. 3. A mosópuffer (10-szeres koncentrációjú) hígítása Adjon 100 ml mosópuffer koncentrátumot 900 ml desztillált vízhez (1:10-es hígítás) egy tiszta edénybe, és keverje össze. Igény szerint hígíthat kisebb mennyiségeket is. Megjegyzés: A hígított mosópuffer 2 8 C között tárolva 1 hétig stabil, ezért célszerű csak a szükséges mennyiséget hígítani. 4. A minták hígítása Hígítson minden egyes mintából 10 µl-t 1000 µl mintahígítóval (1:100) és alaposan keverje össze. Megjegyzés: A hígított mintákat az elkészítésüket követő 8 órán belül fel kell használni. 5. A csíkok és a keret kezelése Helyezze a szükséges számú cellát a csíktartóba. Az A1-es pozíciótól kezdve töltse be az oszlopokat balról jobbra haladva a lemezen. A lemezzel végzett munka közben szorítsa le a hosszabb oldalakat, hogy a cellák ki ne essenek. Megjegyzés: A fel nem használt mérőedényeket azonnal helyezze vissza a fóliatasakba, a deszikkáns betétekkel együtt, majd szorosan zárja le a tasakokat, hogy a lehető legrövidebb ideig legyenek a nedvességnek kitéve. Vigyázzon, hogy a tasakot ne szúrja át vagy szakítsa el, lásd lent. FIGYELMEZTETÉS: Ha a cellák nedvességnek vannak kitéve, illetve porral vagy egyéb szilárd anyaggal szennyeződnek, akkor az antigén tönkremegy, és az a teszt pontosságának romlásához és téves eredményekhez vezet. Az teszt kivitelezése 1. A minták hozzáadása Pipettázzon 100 µl kalibrátort, kontrollokat és hígított (1:100) mintát a lemez megfelelő celláiba. Megjegyzés: A mintákat a lehető leggyorsabban kell bemérni, a mérési csúszás ( drift ) minimalizálása érdekében, a stoppert az utolsó minta bemérése után kell elindítani. Inkubálja a lemezt szobahőmérsékleten 30 percig. 2. Mosás A mosás kritikus része a vizsgálatnak, ezért különleges figyelmet igényel. A nem megfelelően mosott lemez hibás eredményt fog adni, gyenge reprodukálhatósággal és magas háttérrel. Az inkubáció után vegye ki a lemezt és lyukanként 200-300 µl mosópufferrel háromszor mossa. A mosás végezhető automatikus lemezmosó segítségével, vagy manuálisan, az alábbiakban javasolt módon. Az utolsó automatikus mosási ciklus után fordítsa a lemezt a nyílásokkal lefelé, helyezze egy nedvszívó papírra, és könnyedén ütögetve cseppmentesítse. Az automatikus lemezmosó programja nem tartalmazhat áztatási lépést. A lemezek manuális mosásának lépései: 3

a. A lemez tartalmát rázza ki egy kiöntőbe b. A cellákat finoman egy szűrőpapírhoz ütögetve cseppmentesítse. c. A cellákat többcsatornás pipetta segítségével töltse fel 200-300 µl mosópufferrel. d. Egy vízszintes felületre helyezve finoman rázogassa a lemezt. e. Ismételje meg az a - d lépéseket kétszer. f. Ismételje meg az a és a b lépést. Ne hagyja tovább a mosópuffert a lyukakban állni, mint amíg feltöltötte a teljes lemezt. 3. A konjugátum felvitele Pipettázzon 100 µl konjugátumot minden egyes cellába, itassa fel az lyukak peremét egy alkalmas anyaggal, hogy az esetleg kifröccsent konjugátumot eltávolítsa. Megjegyzés: A szennyeződés megelőzése érdekében soha se töltse vissza a megmaradt konjugátumot az eredeti üvegbe. Inkubálja a lemezt szobahőmérsékleten 30 percig. 4. Mosás Ismételje meg a 2. lépést. 5. A kromogén (TMB) hozzáadása Pipettázzon 100 µl TMB kromogént minden egyes cellába, itassa fel az lyukak peremét egy alkalmas anyaggal, hogy az esetleges kifröccsenéseket eltávolítsa. Megjegyzés: A szennyeződés megelőzése érdekében soha se töltse vissza a megmaradt TMB-t az eredeti reagens üvegbe. Inkubálja a lemezt szobahőmérsékleten, sötét helyen 30 percig. 6. Leállítás Pipettázzon100 µl leállító oldatot minden egyes cellába. Ekkor a reakcióelegy színe kékről sárgára változik. 7. Az optikai denzitás mérése Lemezleolvasóval olvassa le minden egyes cella optikai denzitás (OD) értékét 450 nm-en, a reakció leállítását követő 30 percen belül. Minőség-ellenőrzés 1. Minőség-ellenőrzés Annak érdekében, hogy egy meghatározás érvényes legyen, a következő kritériumok mindegyikének teljesülnie kell: Minden egyes mérési sorozatban kell kalibrátorokat, valamint pozitív, negatív és egyszálas kontrollt használni. Valamennyi kontroll mért értékének a Minőség-ellenőrzési bizonylatban megadott határokon belül kell lennie. A kalibrációs görbe alakja a Minőség-ellenőrzési bizonylatban bemutatott mintához hasonló kell legyen. Amennyiben a fenti feltételek valamelyike nem teljesül, az assay érvénytelen, a vizsgálatot meg kell ismételni. 2. Az optikai denzitások átlagainak kiszámítása (csak a párhuzamosan kivitelezett tesztek esetén). Minden egyes kalibrátor, kontroll és minta esetén számítsa ki a párhuzamos mérések OD átlagát. A párhuzamosok %-os variációs koefficienseinek (CV%) 15%-nál kisebbnek kell lennie. 3. A kalibrációs görbe elkészítése A kalibrációs görbe készülhet automatikusan vagy manuálisan, a következő eljárás szerint: ábrázolja minden egyes kalibrátorra vonatkozóan az anti-dsdns autoantitest koncentrációját a logaritmikus skálán, a lineáris skálán jelölt OD értékkel szemben: Automatikus eljárásnál - használjon megfelelően validált programot, és olyan görbeillesztési módszert, amelyik legjobban megfelel a mért adatoknak. Manuális eljárásnál - log/lin beosztású papíron egy olyan folytonos görbét rajzoljon, ami legjobban illeszkedik a pontokhoz (ne húzzon egyenes vonalat a pontok közé, és ne alkalmazzon pontról-pontra szakaszos ábrázolást). 4. A kiugró pontok kezelése Ha az egyik pont nem illeszkedik a görbére, ki lehet hagyni. Ha azonban a kérdéses pont kihagyása következtében a görbe alakja a mintául adott kalibrációs görbétől eltér, vagy egynél több pont nem illeszkedik, az egész mérést meg kell ismételni. 5. A kontrollok és a hígított minták autoantitest tartalmának kiszámítása Olvassa le a kontrollok és a hígított minták anti-dsdns autoantitest koncentrációit közvetlenül a kalibrációs görbéről. Az kontrollok értékeinek a Minőség-ellenőrzési bizonylatban feltüntetett határokon belülre kell esniük. Megjegyzés: A kalibrátor értékek úgy vannak megadva, hogy egy 100-as faktorral a minták 1:100- as hígítását számításba vették. További korrekcióra nincs szükség. 6. Az assay kalibrálása Az assay-t a WHO Wo80 6 referencia kalibrátorával, NE/ml egységben kalibrálták. A módszer korlátai 1. Ez a teszt, mivel csak a nagy aviditású anti-dsdns antitesteket képes felismerni, az SLE bizonyos változatai esetében, ahol a beteg csak kis aviditású antitstekkel rendelkezik, tévedhet. Ezért nem felel meg az olyan alkalmazásokra, ahol a teljes anti-dsdns mennyiség mérése szükséges. 2. Ez a kit csak kiegészítő információt nyújt a diagnózis felállításához. A pozitív eredmény bizonyos betegségek fennállására utalhat, de ezt klinikai adatokkal és más szerológiai tesztekkel meg kell erősíteni. 3. Az ezzel a módszerrel kapott eredmények nem tekinthetők diagnosztikai bizonyítéknak valamely betegség meglétére vagy hiányára vonatkozóan. Várható értékek A következő tartományokat egészséges véradók (n=150) és SLE betegek (n=224) FARRZYME-en végzett vizsgálatai eredményei alapján állapították meg: ÉRTELMEZÉS 30 NE/ml Negatív eredmény > 30 NE/ml Pozitív eredmény 4

Az egészséges véradóktól származó mind a 150 szérum 17,0 NE/ml alatti eredményt adott, az eredmények 97%-a (146 minta) 12,3 NE/ml-nél kisebb, azaz a kit alsó kimutatási határa alatt volt. Az SLE betegektől származó szérumok 22,8%-a pozitív FARRZYME eredményt (>30 NE/ml) adott. Az alábbiakban látható 224 SLE minta FARRZYME-en és egy olyan hagyományos anti-dsdns EIA teszten végzett összehasonlító vizsgálata, mely méri az alacsony és a magas aviditású dsdns elleni antitesteket is. A pozitív és negatív százalékos egyezések, illetve az összesített egyezés kiszámolásakor a hagyományos dsdns teszten kapott határértékre eső eredményeket negatívként kezelték. FARRZYME Hagyományos anti-ds-dns ELISA Pozitív Határértéken Negatív Pozitív 47 3 1 Negatív 33 51 89 Pozitív százalékos egyezés = 58,8% Negatív százalékos egyezés =97,2% Összesített egyezés = 83,5% 100 SLE beteg mintáit FARRZYME és Farr RIA teszttel vizsgálva a nagy aviditású anti-dsdns antitestek előfordulását 36, illetve 38%-osnak találták 8. Ezzel szemben, amikor 100 különböző kötőszöveti, illetve egyéb autoimmun betegségben szenvedők mintáit vizsgálták az előfordulás a két teszt szerint 4, illetve 5% volt. A FARRZYME teszttel kapott egység-értékek nem egyeztek a más tesztekkel kapott NE/ml értékekkel, mivel a FARRZYME csak a nagy aviditású anti-dsdns antitestek részhalmazát méri. A közölt tartományok csak útmutatásnak tekintendők. Az ELISA tesztek nagyon érzékenyek, alkalmasak a mintapopulációkban lévő igen kis különbségek kimutatására is. Minden egyes laboratóriumnak tanácsos meghatározni saját referencia tartományát, ami a vizsgált populációt jellemzi az alkalmazott módszerekkel és eszközökkel. Működési jellemzők 1. Mérési tartomány: A teszt mérési tartománya 12,3 1000 NE/ml. 2. A teszt érzékenységének megerősítése Annak megerősítése, hogy a FARRZYME teszt képes különbséget tenni két olyan minta között melyek értékei a mérési tartomány aljának közelében vannak (a legalacsonyabb kalibrátor értékének 120, illetve 165 %-án), statisztikai analízist alkalmaztak. 3. Specificitási egyezés 189 SLE betegtől származó mintát, 35 Crithidia vagy ELISA alapján dsdns antitest tekintetében pozitív mintát és 28 egészséges ember mintáját tesztelték FARRZYME-mel, Crithidia luciliae immunofluoreszcens assay-vel, továbbá egy hagyományos dsdns ELISA teszttel. Crithidia IFA + - + 37 14 FARRZYME - 18 183 Pozitív százalékos egyezés 67,3% Negatív százalékos egyezés 92,9% Összesített egyezés 87,3% A FARRZYME EIA tetszetős negatív egyezést mutatott a Crithidia luciliae immunofluorescens assay-vel. A pozitív százalékos egyezés alacsonyabb volt, mivel az utóbb említett tesztek, eltérően a FARRZYME assay-től, képesek kimutatni az alacsony aviditású anti-dns antitesteket is. Hagyományos dsdns ELISA + Határértéken - + 47 3 1 FARRZYME - 33 51 117 *Pozitív százalékos egyezés 58,8% Negatív százalékos egyezés 97,7% Összesített egyezés 85,3% *A két teszt közötti egyezés kiszámításakor negatívnak tekintették azokat a mintákat, melyek a hagyományos dsdns teszten a határértékre estek. A hagyományos ELISA teszt a kis és a nagy aviditású antitesteket is felismeri, ez eredményezi a FARRZYME assay-vel szembeni csökkent pozitív egyezést. 4. Interferáló anyagok Interference Check A plus kit (Kokusai, Japan) felhasználásával vizsgáltak különböző típusú szérumokat, hogy teszteljék az interferáló anyagok esetleges hatását. Interferáló anyag Koncentráció Bilirubin F (szabad) 20,3 mg/dl Bilirubin C (konjugált) 20,2 mg/dl Hemolizált hemoglobin 486 mg/dl Nyiroknedv 1460 egység Rheumatoid faktor 45 NE/ml A fentiekben felsorolt szabad vagy konjugált bilirubin, hemoglobin, lipid, vagy rheumatoid faktor esetén sem figyeltek meg interferenciát. Egy különálló vizsgálat során 6 IgG myeloma szérumot teszteltek FARRZYME assay-n, a minták közül egy sem adott pozitív eredményt. 5

5. Pontosság Az intra- és inter-assay pontosságot hat olyan minta vizsgálatával állapították meg, melyek lefedték az assay teljes kalibrációs tartományát. Az egyes minták esetében kapott CV% értékek az alábbiak voltak: Az intra-assay pontosságot 20 replikátum egyazon tesztben történő mérésével határozták meg. INTRA-ASSAY PONTOSSÁG n= 20 Koncentráció (NE/ml) CV% 1. minta 25,1 5,4 2. minta 39,0 4,8 3. minta 74,5 2,2 4. minta 205,5 3,3 5. minta 361,2 4,3 6. minta 528,6 5,1 Az inter-assay pontosságot a minták 3 napon át történő hatszori, alkalmanként 2-2 párhuzamos minta tesztelésével határozták meg. INTRA-ASSAY PONTOSSÁG n= 6 Koncentráció (NE/ml) CV% 1. minta 24,6 13,5 2. minta 42,3 3,9 3. minta 61,3 11,6 4. minta 123,2 4,9 5. minta 272,4 7,0 6. minta 474,1 6,9 A lemez beosztása 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A B C D E F G H Az eljárás összefoglalása 1. Adjon 100 µl-t az egyes kalibrátorból, kontrollból és az 1:100 arányban hígított mintából a lemez megfelelő celláiba. Inkubálja azokat 30 percig. Mosás. 2. Adjon minden egyes cellához 100 μl konjugátumot. Inkubálja azokat 30 percig. Mosás. 3. Adjon minden egyes cellához 100 μl szubsztrátot. Inkubálja azokat 30 percig. 4. Adjon minden egyes cellához 100 μl leállító oldatot. Mérje meg az abszorbanciát 450 nm-en. QUANTA Lite és INOVA Diagnostics bejegyzett védjegyei.copyright 2011 Minden jog fenntartva 6

Hivatkozások 1. Isenberg D and Smeenk R. Clinical laboratory assays for measuring anti-dsdna antibodies. Where are we now? Lupus, 2002; 11: 797-800. 2. Ceppelini R, Polli E and Celada F. A DNA-reacting factor in serum of a patient with lupus erythematosus diffuses. Proc Soc Exp Biol Med, 1957; 96: 572-574. 3. Tan et al. The 1982 revised criteria for the classification of systemic lupus erythematosus. Arthritis Rheumatism, 1982; 25:1271-7. 4. Riboldi P et al. Anti-DNA antibodies: a diagnostic and prognostic tool for systemic lupus erythematosus? Autoimmunity. 2005; 38: 39-45. 5. Werle E et al. The clinical significance of measuring different ant-dsdna antibodies by using the Farr assay, an enzyme immunoassay and a crithidia luciliae immunofluorescence test. Lupus, 1992; 1: 369-377. 6. Isenberg D. Anti-dsDNA antibodies: still a useful criterion for patients with systemic lupus erythematosus? Lupus, 2004; 13: 881-885. 7. Nossent H C and Rekvig O P. Is closer linkage between systemic lupus erythematosus and anti-doublestranded DNA antibodies a desirable and attainable goal? Artheritis Res Ther, 2005; 7(2): 85-7. 8. Jaekel HP et al. Anti-dsDNA antibody subtypes and anti-c1q antibodies: toward a more reliable diagnosis and monitoring of systemic lupus erythematosus and lupus nephritis. Lupus, 2006; 15: 1-11. 9. Renaudineau Y et al. Association of α-actinin-binding anti-dsdna antibody Protein Reference Unit Handbook of Autoimmunity (3rd Edition) 2004 Ed A with lupus nephritis. Arthritis Rheumatism, 2006 (in press) 10. Protein Reference Unit Handbook of Autoimmunity (3rd Edition) 2004 Ed A Milford Ward. J. Sheldon, GD Wild. Publ. PRU Publications, Sheffield. 14. 11. Smeenk R, van der Lelij G and Aarden L. Measurement of low avidity anti-dsdna by the Crithidia luciliae test and the PEG assay. Clin Exp Immunol, 1982; 49: 603-610. 12. Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories. Center for Disease Control/National Institute of Health, 2007, Fifth Edition. A terméket előállítja: INOVA Diagnostics, Inc. 9900 Old Grove Road San Diego, CA 92131 United States of America Technical Service (U.S. & Canada Only) : 877-829-4745 Technical Service (Outside the U.S.) : 00+ 1 858-805-7950 support@inovadx.com Forgalmazásra jogosult az EU területén: Medical Technology Promedt Consulting GmbH Altenhofstrasse 80 D-66386 St. Ingbert, Germany Tel.: +49-6894-581020 Fax.: +49-6894-581021 www.mt-procons.com 624615HUN Május 2011 Felülvizsgálat 2 7