Dr. Kengyel ndrás Enzim-szubszrá Gyors folyamaok Recepor-ligand Gyors kineikai módszerek Lizozim - poliszacharid hp://pixshark.com/enzyme-acive-sie.hm Fehérje-gyógyszer Inzulin - recepor hp://www.riniy.edu/lespey/biol3449/lecures/lec10/lec10.hm Gyógyszerész előadás 016. Máj.. 01 *STR Experimenal Therapeuic enre Seady-sae vs ranziens kineika Gyors kineikai módszerek jelenősége [] Seady-sae biológiai mechanizmusok megérése biológiai folyamaok időskáláján (ms) mérnek fehérje-fehérje, fehérje-ligandum kölcsönhaások vizsgálaa kineikai paraméerek meghaározása 0 1 3 Idő (s) Tranziens Reakciókineika Reakciókineika REKIÓSEESSÉG: a reakció jellemzésére szolgáló paraméer Reakciósebesség függ: részvevő anyagok minősége koncenrációk hőmérsékle időbeli koncenráció válozás m m m mdd m : szöchiomeriai együhaók! a k kaalizáor / inhibior a, b: reakciórendek (Nem szöchiomeriai együhaók!) MOLEKULRITÁS k: sebességi állandó (s -1 ) Egy reakcióban hány molekula vesz rész b ELEMI REKIÓK: nem bonhaók egyszerűbb lépésekre Elemi reakciók rendűségé a reakció molekulariása haározza meg. ÖSSZETETT REKIÓK 1
Relaiv koncenráció Relaiv koncenráció Fehérje koncenráció (pillananyi) Kezdei sebesség [] [] [] 1. 1/ Nulladrendű reakció Kiindulási anyag. 1/ 3. 1/ + Termékek 0 komponensek koncenrációja lineárisan válozik az idő függvényében Reakciósebesség függelen a reakánsok koncenrációjáól (a=0, b=0) Pszeudozérus-rend: reakáns koncenrációja nagy [] = [] 0 pl. enzimkaalízis (ha az enzim koncenrációja kicsi) - NEM elemi reakció! a k k b [] [] [] Kiindulási anyag 1. 1/. 1/ 3. 1/ Elsőrendű reakció + Termékek 0 komponensek koncenrációja exponenciálisan válozik az idő függvényében. reakciósebesség egyelen anyag koncenrációjáól függ felezési idő állandó, nem függ a koncenrációól Pszeudó-elsőrendű reakció: egyik reakáns nagy feleslegben - e 0 a k k 0 k ln -k b Elsőrendű reakció Reakciósebesség koncenráció-függése Példa: Fehérje foszforiláció (pszeudo-elsőrendű: TP nagy feleslegben) Fehérje + TP Fehérje-P + DP enzim 0.,08 Kezdei koncenráció Kezdei sebesség 0,4 v max 0,06 5 0,3 5 4 4 0,04 0, 3 3 0,0 0,1 K m 1 0 1 Idő 0 Koncenráció (kezdei) [] [] [] Kiindulási anyag 1. 1/ 0 komponensek koncenrációja hiperbola függvény szerin válozik az idő függvényében.. 1/ 3. 1/ Másodrendű reakció + Termékek 0 v k v k v dc d kc Összee reakciók Gyors kineikai módszerek jelenősége Sorozaos kémiai reakciók: k k 1 k1 k k k 1 biológiai mechanizmusok megérése biológiai folyamaok időskáláján (ms) mérnek fehérje-fehérje, fehérje-ligandum kölcsönhaások vizsgálaa Idő sebességmeghaározó lépés: Párhuzamos kémiai reakciók: Egyensúlyi kémiai reakciók: k1 k Idő Egyensúlyi állandó: k c 1 K k c Meghaározhaó paraméerek: maximális reakciósebesség (v max ), K D (disszociációs állandó) meghaározása K M (Michaelis konsans, affiniás ) sebességmeghaározó lépés polimerizáció, depolimerizáció időbeli köveése
Gyors kineikai módszerek Gyors kineikai módszerek időskálája Keveréses módszerek Módszer Időskála Leírás Jel Kifagyaszo áramlás (quench flow) Megállío áramlás (sopped flow) Folyamaos áramlás (coninuous flow) SPR (felülei plazmon rezonancia) Villanófény foolízis Relaxációs módszerek T-jump (hőmérsékle ugrás) P-jump (nyomás ugrás) TSP (időkorrelál egyfoon számlálás) ms s ms s μs ms μs ms μs ms μs min μs h fs ns Reakció megállíása kifagyaszással, nincs spekroszkópiai jel Áramlás megállíása, spekroszkópiai mérés Keverés uán folyamaos áramlás, ávolság korrelál az idővel Felszín megválozása inerakció eseén, jelölésmenes Köö molekula felszabadíása fényimpulzussal, nincs keverés Gyors hőmérsékle-válozaás köveő új egyensúly beállása Gyors nyomás-válozaás köveő új egyensúly beállása Ulragyors lézeres gerjeszés köveő emisszió Nem spek Spekroszkópiai Lombik reakció Quench flow ( kifagyaszo áramlás ) Sopped flow ( megállío áramlás ) Temperaure jump Pressure jump Villanófény foolizis Felülei plazmon rezonancia Egyfoon-számlálás (TSP) Ulragyors ranziens abszorpció 10 0 10-3 10-6 10-9 10-1 s ms ms ns ps 10-15 fs Folyamaos és megállío áramlás Folyamaos áramlású echnika oninuous flow (Harridge and Roughon, 193) Megállío áramlású reakor Megállío áramlású echnika Sopped flow (hance and Gibson, 1964) Sopped flow Folyamaos áramlású echnika Sopped flow Fecskendő 140 mm belső kapilláris Mikrogyöngy 10 mm üveg üskék Kvarc mérőcella számíógép 50 mm csaorna Meghajó: 5 am reakor fényforrás Meghajó moor Áramlási sebesség: 10 m/s Reakció úhossz: 600 mm monokromáor ápegység Szűrő Holidő: 60 ms PMT vezérlő Monokromáor Lencse Lencse D-kamera (Shasry, 1998) hp://www.phoophysics.com/sx0.php 3
Sopped flow alkalmazásának feléele Fecskendők és keverés Egy alkalmas spekroszkópiai jel inrinsic: Tripofán, NDH, flavin exrinsic: fluorofór Deekor mi válozik a reakció során Termoszál cella: 0 100 ul Tipikus spekroszkópiai jelek: bszorbció Opikai kábel Fluoreszcencia inenziás Deekor Fényszórás nizorópia 4 bar nyomás Sopped Sopped flow működése flow Sopped Sopped flow működése flow Megállíó Megállíó Sopped Sopped flow működése flow Sopped Sopped flow működése flow Megállíó Megállíó 4
mpliúdó 1 mm TP Miozin kin 1 um Mann-DP mpliúdó Sopped Sopped flow működése flow Sopped Sopped flow működése flow Fluoreszcencia bszorbancia Megállíó Megállíó STOP Deekálás Sopped flow mérés spekroszkópiai jel válozzon a reakció során abszorpció fluoreszcencia inenziás anizorópia fényszórás : Xenon ívlámpa, Hg-gőz lámpa, lézer Monokromáor Szűrők Deekor: PMT, foodióda Számíógép: vezérlés és adafeldolgozás naliikai szofver párhuzamos deekálás merőleges deekálás 0.5 0.0 0.15 0.10 0.05 1 3 4 5 0.00-0.10-0.05 0.00 0.05 0.10 0.15 0.0 0.5 Idő (s) 1. Előző reakció. Folyadékcella felölése 3. Folyonos áramlás 4. Áramlás megállíása 5. Reakció Holidő Példa: Sopped flow mérés folyadékok összekeverése és a hasznos mérés kezdee közö elel idő Tipikusan: 0,5 1 ms Függ: flow rae, ávolság, keverési sebesség Keverési haékonyság vs holidő obs e o k d ln( ) ln( ) k obs o d Miozin DP kibocsájás mérés: leszoriás ( single urnover ) M-DP DP TP M M-TP 0,5 o konrol exponenciális 0,0 obs1 illeszés 0,15 0,10 obs mérési adaok 0,05 c d Ep 0,00-0,0 0,00 0,0 0,04 0,06 0,08 0,10 0,1 reakció mérés Idő (s) kezdee kezdee c 1 o lnδ obs y b ax 0 k (s -1 ) Mann-DP fluoreszcencia (U) 6,15 6,10 6,05 6,00 5,95 5,90 5,85 Double exponenial y0 + 1e^(-x/1) + e^(-x0/) y0=5,88134±0,00457 1=0,16854±0,006 1=0,08609±0,01153 =0,10771±0,01914 =0,37319±0,09081 0,0 0, 0,4 0,6 0,8 1,0 Idõ (s) 5
Példa: Sopped flow mérés Single vs. double mixing Egyszerű keverés Többszörös keverés Fluoreszcencia Fluoreszcencia bszorbancia bszorbancia Késleleő hurok. Megállíó 1. D 1.. Speciális sopped flow alkalmazások ryo-sf: nagyon gyors (inorganikus) reakciók, -90 onduciviy SF: fém ligand köés, micella képződés, proon exchange, ion exchange, redox reakció FT-IR SF Raman, infravörös spekroszkópiai módszerek High pressure SF: 000 bar Quench flow Quench flow Nincs spekroszkópiai jel Késleleő hurok. 1. Ké lépéses keverés Minagyűjés 1. +: keverendő oldaok összekeverednek egy késleleő hurokban (cellában), reakció indul. (+) + Q: quenching olda megállíja a reakció, bizonyos idő uán Kioló olda Villanófény foolízis Flash phoolysis Reakció ermékek mérése (pl. radioakiviás) Időbeli érzékenység: - 100 ms 6
rezonancia jel Fényszórás Villanófény foolizis Villanófény foolizis Rövid élearamú reakciók nyomon köveése 1. 1. caged-tp beköés Kémiailag köö, caged molekula Nagy fényinenziás haására kiszabadul indul a folyama. 3. 4.. ko-miozin disszociáció (k 1 k + ) 3. TP DP + P i 4. kin miozin újraköés (k TPase ) Előnye: és molekula már egymás melle van (keverés nem vesz el idő) Fény deekálása a spekroszkópiás mérés nulla időponja Idő (s) TP kin köö M 1. kin disszociál Pi DP M-TP M-DP.Pi M-DP M. 4. 3. M-TP M-DP.Pi Gyenge kereszköö Erős kereszköö állapo állapo Felülei plazmon rezonancia Felülei plazmon rezonancia fémlemez (pl. arany v. ezüs) üveg parner parner Surface plasmon resonance (SPR) fényforrás deekor Felülei plazmonok: Fémek felüleén egy speciális fénysugárral hullámszerű mozgásra kényszeríe elekronok. Rezonancia feléele: gerjeszés a fény egy ado beesési szögénél örénik meg és ilyenkor a fém felüleről visszaver fény inenziásában egy minimum észlelheő (abszorpció!). Felülei plazmon rezonancia Felülei plazmon rezonancia fémlemez (pl. arany v. ezüs) üveg polarizál fény visszaver fény köés megválozaja II. a visszaverődés szögé. I. köés disszociáció regeneráció beköődés megválozaja a felüleel érinkező réeg örésmuaójá rezonancia szög elolódás érzékeny deekálás idő (s) 7