A humán ABCG2 fehérje dimerizációjának tanulmányozása pontmutánsok segítségével Doktori értekezés Dr. Polgár Orsolya Semmelweis Egyetem Molekuláris Orvostudományok Doktori Iskola Témavezető: Dr. Váradi András tudományos főmunkatárs, Ph.D. Hivatalos bírálók: Dr. Csanády László egyetemi tanársegéd, Ph.D. Dr. Marcsek Zoltán osztályvezető, Ph.D. Szigorlati bizottság elnöke: Dr. Falus András egyetemi tanár, akadémikus Szigorlati bizottság tagjai: Dr. Sarkadi Balázs osztályvezető főorvos, akadémikus Dr. Buday László egyetemi docens, D.Sc. Budapest 2006.
Tartalomjegyzék Rövidítések jegyzéke....3 Bevezetés..5 A multidrog rezisztencia jelensége... 5 Az ABC transzporter fehérjecsalád.....5 Az ABCG2-t kódoló gén és a fehérje...7 Az ABCG2 és az őssejtek.8 Az ABCG2 szubsztrátjai és inhibitorai....9 A transzporter szerepe a klinikumban...13 Az ABCG2 fehérje szerkezete......15 Az ABCG2 polimorfizmusai...18 Célkitűzések...20 Módszerek...22 Eredmények és megbeszélésük...30 1. A GXXXG motívum szerepe az ABCG2 fehérjében...30 A GXXXG motívum...30 A GXXXG motívum az ABCG alcsaládban...31 A GXXXG mutánsok expressziója HEK 293 sejtekben...32 A mutánsok funkciójának és felszíni expressziójának vizsgálata...34 A G406L/G410L mutáns ATP-áz aktivitása...36 Kémiai keresztkötési vizsgálatok...37 Mitoxantron kezelés hatása a GXXXG mutánsokra...39 A 402-es treonin vizsgálata a dimerizáció tekintetében...40 Következtetések..41 A TM5 szerepe az ABCG fél-transzporterek és orthológjaik...43 dimerizációjában A G553L mutáns expressziója HEK 293 sejtekben...44 A G553L mutáns sejten belüli lokalizációjának vizsgálata...47 A mutáns vizsgálata keresztkötő reagensekkel...48 A G553L mutáns expressziója rovarsejtekben...49 1
A G553E mutáns...54 Következtetések..55 3. A számítógépes ABCG2 modell tesztelése pontmutánsok segítségével...56 A modell jelentősége és létrehozása...56 A modell tesztelése pontmutánsok segítségével...58 Következtetések.. 60 Összefoglalás...61 Summary...62 Irodalomjegyzék...63 Saját publikációk jegyzéke...76 Köszönetnyilvánítás...78 2
Rövidítések jegyzéke ABC ATP-kötő domén (ATP Binding Cassette) ABCG2 ABCG2 multidrog transzporter, az ABCG alcsalád második tagja ABCP placenta-specifikus ABC fehérje (placenta-specific ABC protein) ALL akut limfoblasztos leukémia AML akut mielogén leukémia BCRP emlőrák drogrezisztencia fehérje (breast cancer resistance protein) BSA marha szérum albumin (bovine serum albumin) CAPS 3-(Cyclohexylamino)-1-propanesulfonic acid cdns komplementer DNS CFTR cisztikus fibrózis transzmembrán konduktancia regulátor (cystic fibrosis transmembrane conductance regulator) DPBS Dulbecco féle foszfáttal pufferolt sóoldat (Dulbecco's phospahte buffered saline) DSG disuccinimidyl glutarate DSP dithiobis(succinimidyl propionate) DSS disuccinimidyl suberate DTT ditiotreitol ER endoplazmás retikulum FBS szarvasmarha szérum (fetal bovine serum) FTC fumitremorgin C GFP zöld fluoreszcens fehérje (green flourescence protein) HEK 293 humán embrionális vesesejt (human embryonic kidney) Hst Hoechst 33342 ICD intracelluláris domén MBS m-maleimidobenzoyl-n-hydroxysuccinimide ester MDR1 multidrog rezisztencia fehérje vagy P-glikoprotein (multidrug resistance protein, P-glycoprotein) 3
MRP1 MX MXR PCR P-gp PMSF PVDF SDS SNP SP TAP TBS TM TMD vt multidrog rezisztenciához társuló fehérje 1 (multidrug resistanceassociated protein 1) mitoxantron mitoxantron rezisztencia fehérje (mitoxantrone resistance protein) polimeráz láncreakció (polimerase chain reaction) P-glikoprotein fenilmetilszulfonil-fluorid polivinilidén-difluorid sodium dodecyl sulfate egyszerű nukleotid polimorfizmus (single nucleotide polymorphism) side population antigén processzáló transzporter (transporter associated with antigen processing) Tris-szel pufferolt sóoldat (Tris-buffered saline) transzmembrán szegmens transzmembrán domén vad-típus 4
Bevezetés A multidrog rezisztencia jelensége A fejlett országokban, köztük hazánkban is, a kardiovaszkuláris megbetegedések után a rákos betegségek állnak a mortalitási statisztikák élén. Az egyre újabb kemoterápiás szerek bevezetése és a kiterjedt kutatások ellenére mind a mai napig a rákkal diagnosztizált betegek közel felénél a megbetegedés öt éven belül halálhoz vezet. Ezen előnytelen statisztikák hátterében az elégtelen prevenció és a kései diagnózis mellett a kemoterápiás szerek iránt kialakuló rezisztencia tekinthető az egyik legfontosabb tényezőnek. A rákos sejtek számos módon képesek ellenállni a kemoterapeutikumok toxikus hatásainak, melyek közül az ABC transzporter fehérjék által közvetített úgynevezett multidrog rezisztencia jelensége az egyik legintenzívebben tanulmányozott. Az ABC transzporter fehérjecsalád Az ABC (ATP-binding cassette) transzporterek alkotják az egyik legnagyobb ma ismert fehérjecsaládot, melynek tagjai gyakorlatilag minden fajban megtalálhatók. A humán genomban 48 ABC transzportert kódoló gént azonosítottak (Dean, 2001), melyeket felépítésük és szekvenciájuk hasonlósága alapján hét alcsoportba lehet besorolni (ABCA-ABCG). Közös jellemzőjük a megközelítőleg 200 aminosavból álló nukleotid-kötő domén (NBD), amely tartalmazza a más ATP-kötő fehérjékben is megtalálható Walker A és Walker B konszenzus szekvenciákat, valamint a csak ABC transzporterekre jellemező úgynevezett C signature motívumot. Ezen fehérjék másik fontos strukturális eleme a szubsztrátkötő helyeket is tartalmazó transzmembrán domén (TMD), amely egy tipikus ABC transzporter esetében 12, egyenként 20-25 aminosavból álló transzmembrán szegmensből (TM) épül fel. A TMD és az NBD összekapcsolását, és nagy valószínűséggel a kettő közötti kommunikációt a TMD részét képező úgynevezett intracelluláris domén (ICD) biztosítja (Reyes, 2005). Működésük jellege alapján a fehérjecsalád tagjai között találhatók transzport fehérjék, ioncsatornák és receptorok, sejten belüli lokalizációjuk alapján pedig plazmamembránban, endoplazmás retikulumban, peroxiszómában vagy mitokondriumban elhelyezkedőket különböztethetünk meg. 5
A humán ABC transzportereket kódoló gének közül jelenleg 17-ről ismert, hogy valamilyen megbetegedés pathomechanizmusában közvetlen szerepet játszik (Dean, 2005), ilyenek pl. a Tangier betegség (ABCA1), a Stargardt betegség (ABCA4), a Dubin-Johnson szindróma (ABCC1/MRP1), a pseudoxanthoma elasticum (ABCC6) vagy a sitosterolaemia (ABCG5/ABCG8). Az ABC transzporterekkel kapcsolatba hozható betegségek közül talán a legismertebb és legkiterjedtebben tanulmányozott a mukoviszcidózis, vagy más néven cisztás fibrózis, amely az egyik leggyakrabban előforduló örökletes megbetegedés (Riordan, 1989). A mukoviszcidózis kialakulásáért az ABCC7/CFTR gén mutációi tehetők felelőssé, melyek közül leggyakrabban az 508- as aminosav delécióját okozó fordul elő. A genetikai megbetegedések mellett a korábban említett kemoterápiás szerekkel szemben kialakuló multidrog rezisztencia jelenségében játszanak jelentős szerepet az ABC transzporterek (Gottesman, 2002). Ezért a jelenségért elsősorban a fehérjecsalád három tagja tehető felelőssé, mégpedig a P-glikoprotein (ABCB1/MDR1), az MRP1 (ABCC1) és az ABCG2. Mindhárom fehérje a sejtek plazmamembránjában elhelyezkedő transzporter, melyekre igen széles és részben egymást átfedő szubsztrátspecificitás jellemző. A három fehérje közül elsőként, idén éppen 30 éve a P- glikoprotein (P-gp) került leírásra (Juliano, 1976). A több évtizeden át folytatott számos klinikai tanulmány ellenére a mai napig nem teljesen tisztázott a P-gp klinikai jelentősége és az általa okozott rezisztencia kialakulásának megelőzési módszerei, annak ellenére, hogy szubsztrátjai között olyan a mindennapi gyakorlatban használt kemoterápiás gyógyszerek vannak, mint a topotekán, a vinblasztin, a vinkrisztin, a doxorubicin és a taxol. Az említett három multidrog transzporter közül a legkevesebb klinikai adat egyelőre az ABCG2-vel kapcsolatban áll rendelkezésünkre, tekintettel arra, hogy a három közül ezt a fehérjét azonosították legfrissebben, a 1990-es évek végén. Érdekességként megemlítendő, hogy három munkacsoport (köztük az is, melyben az ezen dolgozat alapjául szolgáló kísérletek készültek) közel egy időben írta le, és három különböző névvel látta el a fehérjét, úgymint BCRP (emlőrák drogrezisztencia fehérje, breast cancer resistance protein, Doyle, 1998), MXR (mitoxantron rezisztencia fehérje, mitoxantrone resistance protein, Miyake, 1999) és ABCP (placenta-specifikus ABC fehérje, placenta-specific ABC protein, Allikmets, 1998). A humán gén nevezéktan bizottság (Human Gen Nomenclature Committee) 6
hivatalos elnevezésül az ABCG2-t jelölte meg, melyből kiderül, hogy az ABCG alcsalád második tagjáról van szó. Ennek ellenére az irodalomban gyakran BCRP néven található meg a fehérje. Az ABCG2-t kódoló gén és a fehérje Az ABCG2 fehérjét kódoló gén a 4-es kromoszóma hosszú karján helyezkedik el (4q22), több mint 60 kilobázis hosszú, 16 exonból valamint 15 intronból áll, és egy 72 kda tömegű, 655 aminosavból álló fehérjét kódol (Knutsen, 2000). Az ABCG2 gén promóterében nincs TATA box, ugyanakkor számos Sp1, AP1 és AP2 kötőhelyet tartalmaz (Bailey-Dell, 2001). Kifejeződésének pontos szabályozási mechanizmusa még nem ismert, ezidáig a nemi hormonokat (Ee, 2004; Imai, 2005; Tanaka, 2005; Yasuda, 2005; Wang 2005) és a hipoxiát (Krishnamurthy, 2004) írták le, mint az expressziót befolyásoló tényezőket. Citogenetikai vizsgálatokkal a magas ABCG2 fehérjeszinttel jellemzett, különféle kemoterápiás szerekkel szelektált karcinóma sejtvonalakban a 4-es kromoszómát érintő génátrendeződések, a gén amplifikációja, a 4-es és 7-es kromoszóma közötti kiegyensúlyozott transzlokáció, valamint az úgynevezett double minute kromoszómák voltak azonosíthatók (Knutsen, 2000; Rao, 2005). Az ABCG2 fehérje eredetileg multidrog rezisztens karcinóma sejtvonalakban került leírásra, melyet követően számos tanulmány tárgya volt szöveti megoszlásának, és a normál szövetekben betöltött funkciójának jellemzése. A lokalizációra vonatkozó vizsgálatok során időnként egymásnak ellentmondó eredmények születtek. Mindenesetre több vizsgáló egyértelműen leírta a fehérje jelenlétét a placentában, a vékony- és vastagbélben, a májban, a központi idegrendszerben (a vér-agy gátban), a herében, az ováriumban és az érfalban mind Northern blottal, mind immunhisztokémiai eljárásokkal (Doyle, 2001; Maliepaard, 2001; Fetsch, 2005). Az elvégzett kísérletek alapján a polarizált sejtekben az ABCG2 az apikális membránban helyezkedik el (Maliepaard, 2001). Az ABCG2 fehérje expressziójának ezen normál szövetekben tapasztalt megoszlása nagyban valószínűsíti a transzporter szerepét az endogén és exogén káros anyagokkal szembeni védekezésben, bár ezidáig a transzporter fiziológiás szubsztrátjai nem kerültek azonosításra. A placentában látott különösen magas szint a magzat toxikus hatásokkal szembeni védelmében játszott 7
szerepre utal. Ugyanakkor érdekes megemlíteni a laktáció során kimutatott magas ABCG2 szintet az emlő mirigyállományában, ami a más szövetekben feltételezettekkel ellentétben éppen az anyatejes csecsemő fokozott expozícióját vonhatja maga után az ABCG2 által transzportált toxikus anyagok tekintetében (Jonker, 2005; van Herwaarden, 2006). Az ismertetett szöveti megoszlás felhívja a figyelmet a fehérje potenciális jelentőségére a szubsztrátjaiként ismert, orálisan adott gyógyszerek felszívódásában és az általa transzportált gyógyszerek szervezeten belüli disztribúciójában is (Cascorbi, 2006). Ebben az értelemben az ABCG2 egy kétélű fegyvernek tekinthető, hiszen jelenléte korlátozhatja a felszívódást, ugyanakkor a központi idegrendszert és a magzatot védheti a káros mellékhatásoktól. Az Abcg2 knock-out egerek életképesek, fertilisek, és az első leírások szerint teljesen egészségesek voltak. Később azonban a knock-out egerek egy csoportjánál magas klorofill tartalmú diéta mellett, fény hatására jelentkező nekrotikus léziókat figyeltek meg, elsősorban a fülön (Jonker, 2002). A jelenség hátterében minden bizonnyal a klorofillnak és bomlástermékeinek ABCG2 hiányában kialakult fokozott felszívódása áll. Ez a megfigyelés tovább valószínűsíti a fehérje káros hatásokkal szembeni védekezésben betöltött szerepét. Az ABCG2 és az őssejtek Néhány évvel ezelőtt írták le először az ABCG2 fehérje jelenlétét a haemopoetikus őssejtek felszínen, ezen belül is az őssejtek side population-nek (SP) elnevezett frakciójában. Ez a csontvelő sejtjeinek kb. 0.05%-át kitevő, őssejtekben igen gazdag populáció Hoechst 33342-vel (Hst) nem festődő szubpopulációként különül el az áramlási citométerben (Goodell, 1996; Goodell, 1997). A fenotípusért minden valószínűséggel az ABCG2 transzporter jelenléte tehető felelőssé. A Hoechst 33342 fluoreszcens festék szintén szubsztrátja a P-glikoproteinnek, de a P-gp deficiens egerekben normál SP sejtek figyelhetők meg, kizárva ezzel ennek a transzporternek a szerepét az SP frakció létrehozásában (Zhou, 2001; Uchida, 2002). Az ABCG2 őssejtekben való jelenléte ismételten a toxikus hatások elleni védekezésben játszott szerepre irányítja a figyelmet. Egyes feltételezések szerint azonban az alacsony differenciáltsági állapot fenntartása érdekében van jelen a fehérje, és pumpál ki az őssejtekből egy, a differenciálódáshoz szükséges anyagot (Zhou, 2001). Az őssejtek 8
iránt az utóbbi időben tanúsított nagy érdeklődés reflektorfénybe helyezte az ABCG2 fehérjét, számos csoport vizsgálja a transzporter őssejtekben betöltött szerepét, és a témával kapcsolatban szinte naponta jelenik meg újabb közlemény. Érdemes azonban megemlíteni, hogy, ellentétben a szakirodalomban látható tendenciával, az ABCG2 expresszió dokumentálása egy rákos sejtvonalban nem feltétlenül egyenlő az őssejtek jelenlétével, sok esetben pl. korábbi drog expozíció eredményének tudható be. Az őssejtek ABCG2 által mediált Hoechst transzporton alapuló azonosítása áramlási citométerben valóban fontos és viszonylagosan egyszerű technika, arra azonban lényeges felhívni a figyelmet, hogy az ABCG2 jelenléte se nem szükséges, se nem elégséges az őssejtek kialakulásához. Ez utóbbi megfigyelést támasztja alá, hogy a knock-out egerekben jelentős fejlődési rendellenesség nem észlelhető, és az állatok normál haemopoetikus őssejt állománnyal rendelkeznek. Az ABCG2 szubsztrátjai és inhibitorai Hasonlóan a multidrog rezisztenciában szerepet játszó többi ABC transzporterhez, az ABCG2 fehérje is széles szubsztrátspecificitással rendelkezik, és számos inhibitora ismert. Mind a szubsztrátok, mind az inhibitorok tekintetében jelentős átfedés található a P-glikoproteinnel és az MRP1-el. Az ABCG2 által transzportált molekulákról általánosságban elmondható, hogy nagyméretűek, hidrofóbok, lehetnek pozitív és negatív töltésűek. Vannak közöttük kemoterápiás szerek, fluoreszcens festékek, antivirális szerek, antibiotikumok, HMG-CoA reduktáz inhibitorok, egyes élelmiszerekben is megtalálható ismert karcinogének és egyéb a természetben előforduló anyagok, de olyan a mindennapi klinikai gyakorlatban régóta használt gyógyszerek is, mint a cimetidin, a folsav, vagy a szulfaszalazin (Robey, 2006). Az endogén szteroidok között is nagy valószínűséggel vannak az ABCG2 által transzportált vegyületek, de az erre vonatkozó közlemények egyelőre ellentmondásosak (Janvilisri, 2003; Imai, 2003; Pavek, 2005; Suzuki, 2003). Mivel az ABCG2-t multidrog rezisztens karcinóma sejtvonalakban azonosították, először a kemoterapeutikumok között előforduló szubsztrátjai váltak ismertté, ezek közül is elsőként a mitoxantron (Miyake, 1999). Ezt követően az ABCG2-t expresszáló sejtekben keresztrezisztenciát írtak le antraciklinekkel, etopoziddal, topotekánnal, irinotekánnal és az utóbbi SN-38 nevű metabolitjával szemben (Nakagawa, 1992; 9
Kellner, 1997; Yang, 1995; Chen, 1999; Rabindran, 1998; Allen, 1999). A fehérje képes transzportálni továbbá a flavopiridolt (Robey, 2001), egyes topoizomeráz gátlókat (Komatani, 2001) és a metotrexátot (Volk, 2002), valamint az ígéretes, új rákellenes gyógyszercsoportba tartozó, specifikus tirozin kináz inhibitorok közül az imatinibet és a gefitinibet. Ez utóbbi két vegyület egyúttal a protein kompetitív inhibitora is (Elkind, 2005; Burger, 2004; Yanase, 2004). Az említett szerek közül néhánnyal, így pl. az antraciklinekkel kapcsolatban, hasonlóan a fluoreszcens festék rhodamin 123-hoz, a későbbiekben ellentmondásos eredmények születtek, ugyanis a vad-típussal transzfektált emlős sejtek nem voltak képesek ezeket a molekulákat kipumpálni. Ma már ismert, hogy ennek az ellentmondásnak a hátterében a 482-es aminosav különböző variánsai állnak (Honjo, 2001). A vad-típusú ABCG2 esetében ebben a pozícióban arginin található, szemben az egyes drog-szelektált sejtvonalakban előforduló glicinnel vagy treoninnal. Mint kiderült, az imént említett ellentmondásos vegyületeket csak a mutáns verziók transzportálják. Későbbi tanulmányokból világossá vált, hogy ezek a mutációk csak gyógyszeres szelekció hatására jönnek létre, ezen a helyen egyszerű nukleotid polimorfizmus (single nucleotide polymorphism, SNP) nem fordul elő. Ami érdekes, hiszen a mutáns változatokra a vad-típusénál is szélesebb szubsztrátspecificitás jellemző, ami szelekciós előnyt jelenthetne. A jelenség hátterében feltételezhető, hogy az arginin jelenléte elengedhetetlen egy ezidáig azonosítatlan, ám a szervezet szempontjából fontos szubsztrát transzportjához, hasonlóan a metotrexátéhoz, melyet csak a vad-típus képes a sejtekből kipumpálni. Szintén ennek az aminosavnak a jelentőségére hívja fel a figyelmet, hogy egerekből származó drog-szelektált karcinóma sejtvonalakban is előfordulnak hasonló mutációk a 482-es argininnek megfelelő pozícióban (Allen, 2002). Több kutatócsoport tanulmányozta mélyrehatóan ennek az aminosavnak a szerepét, és azt figyelték meg, hogy helyettesítése gyakorlatilag bármely nem pozitív töltésű aminosavval, a glicint és treonint hordozó sejtvonalakéhoz hasonló szélesebb szubsztrátspecificitást eredményez (Özvegy-Laczka, 2005/A; Miwa, 2003). A számítógépes predikciós programok szerint ez az arginin a harmadik transzmembrán szegmens citoplazmikus felszínéhez közel helyezkedik el, és az említettek alapján az érintett szubsztrátok megkötésében vagy transzlokációjában lehet szerepe. 10
A szubsztrátok közül érdemes kiemelni még a feoforbid a-t (Jonker, 2002), tekintettel arra, hogy ezt a fluoreszcens porfirin vegyületet nem transzportálja sem a P- glikoprotein, sem az MRP1, ezáltal az ABCG2-t tőlük könnyen elkülöníthetővé teszi áramlási citometriás vizsgálatokban (Robey, 2004). Az 1. táblázatban a ma ismert szubsztrátok és inhibitorok átfogó listája található. Az inhibitorok közül először a fumitremorgin C-t (FTC) azonosították, mint ABCG2-re specifikus gátlószert. Az első jelentések erről a szerről még akkor születtek, 1. táblázat A humán ABCG2 szubsztrátjai és inhibitorai. A *-al jelölt vegyületek transzportját érintik a 482-es mutációk (Robey, 2006). Szubsztrátok kemoterápiás szerek: mitoxantron BBR3390 58 antraciklinek* Daunorubicin* Doxorubicin* Epirubicin* bizantrén* flavopiridol etopozid* tenipozid kamptotekinek 9-aminokamptotekin topotekán irinotekán SN-38 SN-38 glükoronid diflomotekán* (gyenge) homokamptotekin* (gyenge) DX-8951f (gyenge) BNP1350 (gyenge) indolokarbazolok: J-107088 NB-506 UCN-01 folsav antagonisták: metotrexát*,metotrexát di*- és triglutamát* GW1843* tomudex* tirozin kináz gátlók: imatinib gefitinib CI1033 egyéb vegyületek: antivirális szerek: zidovudin (AZT) Inhibitorok diketopiperazinok: fumitremorgin C Ko143 triprosztatin A indolil diketopiperazinok szteroidok és szteroidszerű vegyületek: kortikoszteron digoxin beklometazon 6-alfa-metilprednizolon dexametazon triamkinolon mometazon ciklezonid antivirális szerek: ritonavir saquinavir nelfinavir immunszupresszánsok: tacrolimus sirolimus Ciklosporin A piridines and dihidropiridinek: niguldipin nicardipin nitrendipin dipiridamol nimodipin DHP-014 tirozin kináz gátlók: gefitinib imatinib EKI-785 CI1033 P-glikoprotein inhibitorok: elacridar (GF120918) 11
lamivudin HMG-CoA reduktáz gátlók: rosuvasztatin pitavasytatin cerivasztatin karcinogén anyagok: aflatoxin B1 2-amino-3-metilimidazo[4,5-f]quinolin 3-amino-1,4-dimetil-5H-pirido[4,3-b]indol 2-amino-1-metil-6-fenilimidazo(4,5-b) piridin porfirinok: feoforbid a pirofeoforbid a metil-észter klorin e6 protoporpfirin IX fuoreszcens anyagok: rhodamin 123* Lysotracker zöld* BODIPY-prazosin Hoechst 33342 flavonoidok: genistein quercetin glükuronid, glutation és szulfát konjugátumok: benzo[a]pirén-3-szulfát (BP3S) benzo[a]pirén-3-glükuronid (BP3S) ösztron-3-szulfát 4-metilumbelliferon szulfát 4-metilumbelliferon glükuronád 6-hidroxi-5,7-dimetil-2-metilamino-4-(3- piridilmetil)benzotiazolglükuronid (E3040) dehidroepiandroszteron szulfát (DHEAS) 17-β-esztradiol szulfát acetaminophen szulfát benzimidazolok: albendazol szulfoxid oxfendazol pantoprazol antibiotikumok: ciprofloxacin ofloxacin norfloxacin erythromycin dirithromycin rifampicin nitrofurantoin dihidrotesztoszteron szulfaszalazin fenetil izotiocianát dipiridamol ochratoxin A GV196771 folsav cimetidin ME3229 tariquidar (XR9576) biricodar* (VX-710) flavonoidok: chrysin biochanin A benzoflavon 6-prenylchrysin tectochrysin naringenin quercetin acacetin kaempferol szilimarin heszperetin daidzein rezveratrol genistein naringenin-7-glükozid benzimidazolok: pantoprazol omeprazol oxfendazol ösztrogének, ösztrogén agonisták és antagonisták: 17-béta-esztradiol ösztron dietilstilbösztrol tamoxifen toremifene TAG-11 TAG-139 taxánok: ortataxel* tra96023* tra98006* flavopiridol UCN-01 novobiocin* 12
amikor maga a fehérje még nem volt ismert, de az FTC gátolta a P-gp-t és MRP1-et nem expresszáló sejtvonalak multidrog rezisztenciáját. A későbbiekben kiderült, hogy a jelenség hátterében az ABCG2 fehérje gátlása állt (Rabindran, 1998). Kísérletekben gyakran használt specifikus ABCG2 inhibitor még az FTC-analóg Ko143 (Allen, 2002). Hasonlóan a szubsztrátokhoz az inhibitorok esetében is sok olyan van, amelyik egyúttal a P-glikoproteint, az MRP1-et, vagy mindkettőt gátolja. Legtöbbjük éppen ezen tulajdonságuk miatt került kipróbálásra mint ABCG2 inhibitor. Ilyenek pl. az elakridar, a tarikvidar, vagy a ciklosporin (de Bruin, 1999; Robey, 2004; Lee, 1997). Az inhibitorok jelentős csoportját képezik a flavonoidok, köztük a szilimarin, a heszperetin, a rezveratrol, stb. (Cooray, 2004). A flavonoidok közül némelyik a fehérje szubsztrátjaként is viselkedik, ami kompetitív inhibitor szerepet valószínűsít (Morris, 2006). Tekintettel arra, hogy az említett flavonoidok sok élelmiszerben előfordulnak, a vékonybélben való jelenlétük révén módosíthatják a szubsztrátok között szereplő orális gyógyszerek felszívódását. Az utóbbi időben több kutatócsoport fordított hangsúlyt új ABCG2 inhibitorok azonosítására. A potens, specifikus és alacsony toxicitású inhibitoroknak jelentősége lehet az ABCG2-t eleve hordozó, illetve a szubsztrátokkal való előzetes kezelés hatására a fehérjét expresszáló drog-rezisztens tumorok terápiájában. Emellett a fehérje gátlása elősegítheti a szubsztrátként szereplő gyógyszerek enterális felszívódását. Valószínűleg a P-glikoprotein inhibitorokkal látott kudarcokra való tekintettel, mely részben a szerek toxicitására, részben pedig a rosszul tervezett tanulmányokra vezethető vissza, ezidáig az ABCG2 inhibitorok még nem kerültek klinikai kipróbálásra. Az inhibitor kipróbálás késlekedésében az is jelentős szerepet játszik, hogy a mai napig ellentmondásosak az ABCG2 klinikumban betöltött szerepét célzó vizsgálatok eredményei. A transzporter szerepe a klinikumban A szakirodalomban számos tanulmány található, amely az ABCG2 klinikai jelentőségével foglalkozik a rákos sejtek multidrog rezisztenciájának tekintetében. A legtöbb adat a transzporter leukémiában betöltött potenciális szerepére vonatkozóan található, ám ezek a vizsgálatok elég ellentmondásosak. Egyes vizsgálók pl. magas 13
expressziót találtak (Ross, 2000; Suvannasankha, 2004; Galimberti, 2004) akut mielogén leukémiában (AML), míg mások nem tudták kimutatni az ABCG2-t az AMLel diagnosztizált betegekből származó mintákban (van Der Kolk, 2002; van Der Pol, 2003; Abbott,2002). Ennek megfelelően a fehérje jelenlétének a prognózisra vonatkozó predikciós értéke is egyelőre ellentmondásos ebben a betegségben. Az AML-ben látottakhoz hasonlóan akut limfoblasztos leukémiában (ALL) is egyelőre tisztázatlan az ABCG2 által betöltött szerep (Stam, 2004; Sauerbrey, 2002). Többen vizsgálták az ABCG2 transzporter jelentőségét szolid tumorok esetében is, ahol szintén egymásnak ellentmondó eredmények születtek. Az egyik ilyen tanulmány pl. 34 parafinba ágyazott, különböző szöveti eredetű minta immunhisztokémiai vizsgálatával mindössze egy, a vékonybélből származó adenokarcinóma esetében igazolta a fehérje jelenlétét (Scheffer, 2000). Ugyanakkor egy másik vizsgáló csoport szintén parafinba ágyazott tumorokban gyakori ABCG2 expressziót írt le (Diestra, 2002). Ezeknek az ellentmondásoknak a hátterében nagy valószínűséggel a nem standardizált detekciós módszerek, illetve az alkalmazott eljárások (PCR, áramlási citometria, immunohisztokémia, stb.) közötti szenzitivitási különbségek állnak. Az említett ellentmondások ellenére valószínű, hogy az ABCG2 fehérje fontos szerepet játszik a klinikai multidrog rezisztenciában, amit elsősorban az támaszt alá, hogy humán karcinóma sejtvonalak esetén bizonyítottan képes a jelenség létrehozására. Ugyanakkor korábban láttuk, hogy az ABCG2 szubsztrátjai közé a kemoterápiás szerek mellett számos más gyógyszercsoportba tartozó vegyület is tartozik (1. táblázat), melyek farmakokinetikájában lehet klinikai jelentősége a transzporternek. Ezek közül a kompetitív inhibitorként viselkedő szubsztrátok emelendők ki, amelyeknek a gyógyszerkölcsönhatások tekintetében juthat lényeges szerep. A fejezet végén lesz szó a transzporter polimorfizmusairól, melyek a szubsztrát vegyületek farmakokinetikájában látott egyéni különbségekre szolgálhatnak magyarázatul. A genetikai polimorfizmusokon alapuló, egyénre szabott gyógyszeres terápia kifejlesztése egy új, és várhatóan igen gyorsan fejlődő területe az orvostudománynak. 14
Az ABCG2 fehérje szerkezete Az ABCG2 fehérje, hasonlóan az ABCG alcsalád többi tagjához úgynevezett fél-transzporter. Jelenlegi tudásunk szerint ahhoz, hogy egy ABC transzporter működőképes legyen legalább két transzmembrán (TMD) és két nukleotid-kötő doménre (NBD) van szükség (Berkower, 1999), melynek tipikus példája a több mint 1200 aminosavból álló P-glikoprotein. Ezzel szemben a 655 aminosavból felépülő ABCG2 fehérje mindössze egy-egy ilyen domént tartalmaz, melyeknek sorrendje fordított a P-gp-nél is látott hagyományosnak tekintetthez képest, azaz az NBD helyezkedik el N-terminálisan, és C-terminális a TMD. Ennek a fordított doménszerkezetnek a jelentősége ezidáig nem ismert. Az ABC fél-transzportereknek homo-, vagy heterodimerizálódniuk kell ahhoz, hogy transzport funkciót tudjanak ellátni. A dimerizáció szükségességét támasztják alá azok a legújabb kutatások, melyek szerint a katalitikusan aktív ATP-kötő hely létrehozásában mindkét NBD részt vesz. (Reyes, 2005). Az ABC transzporterek heterodimerizációjára egy jellegzetes példa az ABCG2-vel egy alcsaládba tartozó ABCG5 és ABCG8 fehérjék által alkotott dimer, melynek a növényi szterolok transzportjában van szerepe. Ez a két fehérje obligát módon képez heterodimert, és a dimer létrejötte szükséges a plazmamembránban történő expresszióhoz, maga a heterodimerizáció nagy valószínűséggel az endoplazmás retikulumban történik (Graf, 2003). Az ABCG alcsalád két másik szintén féltranszporter tagja, az ABCG1 és az ABCG4 fehérjék egyes kísérleti eredmények szerint mind homo-, mind heterodimerizációra képesek (Cserepes, 2004). Érdekességként megemlítendő, hogy a bakteriális ABC transzporterek között találhatók olyanok is, amelyekben a TMD és NBD külön polipeptidláncként található meg, ez azonban a humán ABC fehérjék esetében nem fordul elő (van Veen, 1997). Az ABC transzporter molekulák sematikus felépítését az 1. ábra szemlélteti. Az ABCG2 fél-transzporter minden valószínűség szerint homodimerizáció útján alkotja a funkcionális molekulát. Ezt a feltételezést támasztja alá az a megfigyelés, miszerint Sf9 rovarsejtekbe transzfektálva, ahol heterodimerizációhoz szükséges partner jelenléte valószínűtlen, a fehérje funkcióképes (Özvegy, 2001). Egy korábbi tanulmány szerint a két ABCG2 monomerből létrehozott fúziós fehérje is normál transzport aktivitással rendelkezik, ami szintén a homodimerizációt valószínűsíti (Bhatia, 2005). Ugyancsak a homodimerizáció mellett szólnak a 15
koimmunoprecipitiácós kísérletek, melyekben két különböző módon jelölt monomert használtak (Henriksen, 2005/B; Kage, 2002). 1. ábra Az ABC transzporterek sematikus felépítése a lehetséges doménsorrendek bemutatásával. A: Az NBD és a TMD külön kódolódik, a transzporter négy alegységből áll össze, élesztőgombákban és baktériumokban fordul elő. B: A két TMD és a két NBD alkot egy-egy alegységet, szintén baktériumokban található meg. C: A transzporter egy polipetidláncból áll, mely két TMD-t és két NBD-t tartalmaz. D: Az előzőtől a domének sorrendjében különbözik, szintén teljes transzporter, tipikus példája a P-gp. E: Fél-transzporter N-terminálisan elhelyezkedő TMD-vel, pl. TAP1/TAP2. F: Szintén féltranszporter, ahol a TMD C-terminálisan található, ilyen az ABCG2. G: Egy polipeptidlánc, ahol N- terminálisan további TM szegmensek találhatók (TMD 0 ), az MRP1 és rokon fehérjéi esetén látható ilyen felépítés. Általánosságban elmondható, hogy elég kevés ismeret áll jelenleg rendelkezésünkre az ABCG2 fehérje szerkezetéről, illetve a dimerizáció 16
mechanizmusáról. A legpontosabb információkat a protein kristályosítása útján lehetne nyerni, ez azonban, mint általában a membránfehérjék esetén, igen nehéz feladat. Ezidáig teljes humán ABC transzportert még nem sikerült kristályosítani, csak izolált NBD térszerkezetek állnak rendelkezésünkre, és a bakteriális homológok közül is csak néhány kristályszerkezete ismert. Az utóbbiak közül az MsbA nevű lipid transzporter említendő meg, amely az ABCG2-hez hasonlóan homodimerizálódó fél-transzporter, és ezáltal egyedülálló bepillantást enged egy dimer struktúrájába. Ezt a fehérjét három különböző baktériumból, meglehetősen jó felbontással kristályosították (Chang, 2001; Chang, 2003; Reyes, 2005). Az ABCG2 molekula transzmembrán doménjét a 361-655 aminosavak képzik, melyek, bár az egyes számítógépes programok ebben eltérést mutatnak, a konszenzus predikció szerint hat transzmembrán szegmenst alkotnak. A fehérje sematikus felépítése a dolgozatban említésre kerülő aminosavak jelölésével a 2. ábrán látható. A molekula rövid C-terminális szakasza intracellulárisan helyezkedik el, és az ötödik és a hatodik transzmembrán hélix között található egy hosszabb extracelluláris hurok. Ebben az extracelluláris szakaszban található a 603-as cisztein, amelyről kimutatták, hogy egy szimmetrikus diszulfid hidat képez a homodimert formáló két monomer között (Henriksen, 2005/A). Úgy tűnik, hogy ez a diszulfid híd nem esszenciális a fehérje működése szempontjából, miután alaninra, illetve glicinre történő cserélése esetén a vad-típusnak megfelelő fenotípusú, funkcionális fehérje volt látható. Ugyanebben az extracellulárisnak tartott hurokban két másik cisztein is található, ezek szerepe azonban már nem ilyen egyértelmű, több kutatócsoport feltételezése szerint a monomeren belüli intramolekuláris diszulfid híd képzésében vesznek részt. Két egymástól független publikációban mindhárom cisztein egyidejű mutációjakor a fehérjét működésképtelennek és intracelluláris elhelyezkedésűnek írták le, szemben egy harmadik laboratóriummal, ahol ugyanez a hármas mutáns a sejtfelszínen helyezkedett el és funkcionális volt (Wakabayashi, 2006; Henriksen, 2005/A; Bhatia, 2005). Ezekre az ellentmondásokra a magyarázat valószínűleg a tanulmányokban használt különböző expressziós rendszerekben keresendő. Az ABCG2 fehérje minden bizonnyal N-glikozilálódik, melynek helye az irodalomban található kísérleti eredmények alapján az 596-os aszparagin (Diop, 2005). Két másik konszenzus N-glikozilációra alkalmas szekvencia is található a proteinben, 17
2. ábra Az ABCG2 fehérje sematikus felépítése a dolgozatban kiemelt aminosavak jelölésével. (A könnyebb tájékozódás érdekében minden tizedik aminosav telített körrel van jelezve.) ezek azonban úgy tűnik, hogy nem modifikálódnak. A glikozilációban résztvevő 596- os aminosav a fentebb említett, a predikciók szerint extracelluláris hurokban helyezkedik el, amely további bizonyítékként szolgál arra, hogy ez a TM5 és TM6 közötti régió valóban a sejten kívüli térben található. Az ABCG2 polimorfizmusai Mint korábban már említésre került, az ABCG2 fehérje a normál szövetekben leírt lokalizációja alapján fontos szerepet játszhat egyes gyógyszerek farmakokinetikájában. Ebben a tekintetben lehet igen nagy jelentősége a gén egyszerű nukleotid polimorfizmusainak, ezek közül is azoknak, amelyeknek funkcionális következménye van. Számos tanulmány foglalkozott az ABCG2 polimorfizmusainak feltérképezésével a különböző populációkban és azoknak a fehérje expessziójára és 18
működésére kifejtett hatásával. Az ismert SNP-ek között legalább négy olyan található, amely megváltoztatja a protein aminosav szekvenciáját, ezek a V12M, a Q141K, az I206L és az N590Y (2. ábra). Közülük a Q141K emelendő ki, tekintettel arra, hogy hatására csökkent sejtfelszíni expressziót és ATP-áz aktivitást, valamint egyes kemoterápiás szerekre vonatkozóan a fehérje alacsonyabb transzport kapacitását írták le (Morisaki, 2005; Imai, 2002; Mizuarai, 2004). Ez a polimorfizmus egy glutamin lizinre történő cseréjével jár, és különösen a japán lakosságban fordul elő nagy frekvenciával. Topotekánnal és diflomotekánnal történő kezelés esetén a Q141K polimorfizmust hordozó betegeknél magasabb plazmakoncentrációt dokumentáltak mint a vad-típust hordozó egyéneknél (Sparreboom, 2004; Sparreboom, 2005). Kutatások folynak annak a megállapítására is, hogy egyes eddig megmagyarázatlan fototoxicitási reakciók hátterében állhatnak-e az ABCG2 csökkent transzport aktivitással rendelkező polimorfizmusai, hasonlóan pl. a más fajokban megfigyelt fényérzékenységi reakciókhoz. 19
Célkitűzések A humán ABCG2 fehérje minden valószínűséggel szerepet játszik a ráksejtek kemoterápiás szerek iránti multidrog rezisztenciájában. Emellett a fehérjét kódoló gén polimorfizmusai magyarázatot adhatnak egyes, a fehérje szubsztrátjaiként szereplő gyógyszerek felszívódásában és eloszlásánál látott egyéni különbségekre. Az elmúlt néhány évben az őssejtkutatás területén is kiterjedt vizsgálatok foglalkoznak az ABCG2-vel, tekintettel arra, hogy korai őssejt markernek bizonyult. Mindhárom kutatási irány továbbvitele érdekében lényeges megismerni a fehérje pontos felépítését, mely célzott terápiás beavatkozások alapját képezheti. Az ABCG2 fehérje úgynevezett fél-transzporter, melynek működéséhez dimerizációra van szükség. Az ABCG2 esetében ez nagy valószínűséggel homodimerizációt, esetleg homooligomerizációt jelent. A már ismert szerkezetű féltranszporterhez hasonlóan a dimerizácós folyamatban a transzmembrán régiónak feltehetőleg lényeges szerepe van. Egyes membránfehérjék esetében az alfa hélixekben elhelyezkedő, úgynevezett GXXXG motívumnak tulajdonítanak jelentőséget a dimer stabilizálásában. A legkiterjedtebben tanulmányozott ilyen protein a vörösvérsejtek membránjában található glikoforin. Az ABCG2 fehérje első transzmembrán szegmensében is megtalálható a GXXXG motívum, ennek a dimerizációban betöltött esetleges szerepét próbáltuk feltárni pontmutánsok vizsgálata segítségével. A homodimerizációban játszott szerepe tekintetében az ötödik transzmembrán hélixben elhelyezkedő 553-as glicint is vizsgáltuk. Az irodalmi adatok szerint az ennek megfelelő glicin és azt körülvevő aminosavak feltételezhetően szerepet játszanak az ABCG2-vel rokon, szintén ABC fél-transzporter Drosophila white fehérje heterodimerizációjában. Ennek az aminosavnak az ABCG2-ben betöltött szerepét szintén pontmutánsok létrehozásával tanulmányoztuk. A jelen munkával párhuzamosan, az általunk megfigyeltek figyelembe vételével készült egy számítógépes ABCG2 modell egy velünk kollaboráló krisztallográfiás laboratóriumban. A modell transzmembrán domén része, a kísérletes eredmények mellett elsősorban a már ismert kristályszerkezetű MsbA bakteriális fél-transzporterhez való homológián alapult. A modell helytállóságának pontmutánsok segítségével történő igazolására irányuló néhány kísérlet is leírásra kerül az Eredmények és megbeszélésük 20
fejezet harmadik részében. A modellt részletesen ismertető közlemény publikációja folyamatban van. 21
Módszerek Sejttenyésztés A humán embrionális vesesejteket (HEK 293, ATCC) 37 0 C-on, 10%-os FBS-el (Invitrogen), 100 U/ml penicilin/sztreptomicinnel (Invitrogen) és 2 mm/l glutaminnal (Invitrogen) kiegészített Eagle-féle minimális esszenciális médiumban (ATCC) tenyésztettük, 5% CO 2 jelenlétében. A transzfektált sejtvonalakat a fentiek mellett 2 mg/ml G418-ban (Invitrogen) tartottuk fent. A kontrollként használt SF295/MX500 sejtvonal lépcsőzetes szelekcióval készült (Rao, 2005), és 500 µm mitoxantronban (Sigma) tartottuk fent. Az MCF-7/FLV1000 kontroll sejtek pedig 1000 nm-os flavopiridolban (National Cancer Institute Drug Screen) és RPMI (ATCC) médiumban nőttek (Robey, 2001). A 80-90%-ban konfluens transzfektált sejteket a membránpreparálás előtti éjszakán 2-10 µm mitoxantronnal kezeltük a jelzett kísérletekhez. Az Sf9 (Spodoptera frugiperda) sejteket (Invitrogen) 27 0 C-on, 10% FBS-sel, 100 U/ml penicillinnel és 100 mg/ml sztreptomicinnel kiegészített TNM-FH (Sigma) médiumban tenyésztettük. Mutagenezis A HEK 293 sejtek transzfekciójához az ABCG2 pontmutánsokat hordozó plazmidokat megrendelés alapján a Lofstrand Lab Limited nevű cég készítette a pcdna3.1/myc-hisa(-) (Invitrogen) vektorban, a NotI és BamHI klónozási helyek felhasználásával irányított PCR mutagenezis technikával, a Stratagene-féle protokoll alkalmazásával. A felhasznált vektorok közvetlenül az ATG start kodon előtt egy konszenzus Kozak szekvenciát is tartalmaznak. A GXXXG mutánsok a rhodamin 123- al történő egyszerűbb vizsgálat érdekében az R482G mutációt is hordozzák. A transzfekció elvégzése előtt a plazmid DNS szekvenciáját ellenőriztük, és minden mutáns esetében egy reprezentatív transzfektált klónból preparált DNS bázissorrendjét is meghatároztuk festék terminációs szekvenáló eljárás segítségével. Az utóbbi esetben a szekvenálási reakciót megelőző, az ABCG2 gén amplifikációját célzó első PCR reakció a pcdna3.1 vektorra specifikus primerekkel történt, a HEK 293 sejtek saját ABCG2 génjének amplifikálódása elkerülése érdekében. 22
A rovarsejtek transzfekciójához a pacuw21 vektort (Pharmingen) annak érdekében, hogy több klónozóhelyet tartalmazzon, egy korábbi munka során egy linker beépítésével módosítottuk, és pacuw21-l-nek neveztük el (Szakács, 2001). Ezen vektor SacI helyére ligáltuk az ABCG2/R482G és ABCG2/G553L cdns-eket, amelyeket a megfelelő pcdna3.1/abcg2 vektorokból SacI emésztéssel vágtunk ki. A vad-típusú ABCG2-t és a K86M mutáns változatot irányított PCR mutagenezis (overlap extension) módszerrel hoztuk létre (Horton, 1993). A PCR során az ABCG2/R482G cdns-t használtuk templátként, és a két belső primér pár tartalmazta a mutáns aminosavnak megfelelő kodont. A mutagenezis a következő reakcióelegyben zajlott: 1x ThermoPol puffer (NEB), 250 mm dntp (Amersham), 200 ng templát DNS, 1 mm külső primér, 1 mm belső primér, U. P. vízzel 50 ml-ig kiegészítve, 1 egység Vent DNS polimeráz. A mutációt hordozó DNS szakaszt két darabban amplifikáltuk, és a keletkezett két PCR terméket 2% agarózt tartalmazó TAE (40 mm Tris, 20 mm acetát, 1 mm EDTA, ph 7,2, Crosslink Lab) gélben megfuttattuk, majd QIAquick gél extrakciós kit segítségével (Qiagen) tisztítottuk. A gélből izolált PCR termékeket használtuk fel a PCR mutagenezis második lépésében, ahol a teljes mutációt tartalmazó kazetta amplifikációja történt. A második PCR reakció összetétele 1x ThermoPol puffer, 250 mm dntp, 500 ng tisztított termék, 1 mm A külső primér, 1 mm B külső primér U. P. vízzel 50 ml-ig kiegészítve, valamint 1 egység Vent DNS polimeráz volt. A második PCR reakció termékét 1 mm ammónium-acetát jelenlétében, egyszeres térfogatú fenol:kloroform:izoamil-alkohol (35:34:1) hozzáadásával tisztítottuk, majd a vizes fázisban lévő DNS-t kétszeres térfogatú abszolút alkohol hozzáadásával kicsaptuk. Az ily módon tisztított, vad-típust kódoló DNS-t PstI és MscI, míg a K86M mutációt tartalmazó DNS-t NotI és SpeI restrikciós enzimekkel emésztettük, 2% agaróz TAE gélben megfuttattuk, és Sephaglas BrandPrep kit segítségével (Amersham) izoláltuk. A tisztított fragmenteket ezután a pacuw21- L/ABCG2/R482G vektor PstI-MscI, illetve NotI-SpeI hasítóhelyei közé eső DNSszakasz helyére ligáltuk. A mutagenezisen átesett DNS-szakaszok bázissorrendjét minden esetben ellenőriztük festék terminációs szekvenáló eljárás segítségével (ABI, SzBK Szeged). 23
Transzfekció emlős sejtekben A stabil transzfekcióra HEK 293 sejtekben került sor, a TransFast elnevezésű transzfekciós reagens (Promega) felhasználásával. A transzfekciót megelőző napon 10 cm átmérőjű kör alakú sejttenyésztő edényenként 7.5 x 10 5 sejtet telepítettünk, amely másnapra 60-70%-os konfluenciának felelt meg. A transzfekció 1:2 arányban kevert plazmid DNS-el és transzfekciós reagenssel, edényenként 10 µg DNS felhasználásával, 37 0 C-on, 5% CO 2 jelenlétében, szérummentes médiumban, egy órán át történt. A sejteket ezt követően 48 órán át növesztettük szérummal kiegészített médiumban, majd fokozatosan megkezdtük a G418 hozzáadását, 2 mg/ml végső koncentrációig. Az elhalt sejteket naponta eltávolítottuk friss médium hozzáadásával. Átlagosan két hét elteltével láthatóvá váltak a rezisztens kolóniák, melyeket tripszinezett, steril klónozó korongok (PGC Scientific) segítségével izoláltunk. További átlagosan két hét eltelte után az ABCG2 fehérje sejtfelszíni expresszióját az 5D3 antitest (ebioscience) segítségével, áramlási citométerben vizsgáltuk (részletesen lásd alább). Amennyiben ezzel a módszerrel pozitív klónok kerültek meghatározásra, azok közül mutációnként legalább hatot tovább tenyésztettünk. Amennyiben az 5D3 antitesttel nem voltak pozitív klónok azonosíthatók, akkor immunobloton ellenőriztük a mutáns fehérje jelenlétét (részletesen lásd alább). Kísérleti kontroll céljából vad-típussal és ABCG2-t nem tartalmazó pcdna3.1 vektorral transzfektált stabil sejtvonalakat is létrehoztunk. A GFP tag-gel jelölt mutánsok létrehozása Az N-terminálison GFP tag-gel jelölt vad-típusú ABCG2-t és a G553L mutánst a pacuw21-l/wtabcg2 illetve a pacuw21-l/abcg2-g553l vektorok XhoI- BamHI fragmensének, a pegfp vektor (Clontech) megfelelő helyére történő klónozásával hoztuk létre. Ezt követően a FuGene reagens (Roche) felhasználásával HEK 293 sejteket transzfektáltunk a pegfp/vtabcg2 illetve a pegfp/g553l vektorokkal, a gyártó utasításait követve. 72 órával a transzfekció után a sejtek natív GFP fluoreszcenciáját egy Olympus IX70 lézer szkennelő mikroszkóppal analizáltuk, illetve a sejteket az immunofluoreszcenciánál leírtak szerint a BXP-21 monoklonális ABCG2 ellenes antitesttel jelöltük. A stabil klónokat 0,5 mg/ml G418-ban történő szelekcióval hoztuk létre. A rekombináns bakulovírusok létrehozása 24
Az ABCG2 változatok cdns-ét hordozó, rekombináns bakulovírusokat a BaculoGold transzfekciós kit (Pharmingen) felhasználásával, a gyártó utasításait követve készítettük el. Röviden: 1,5 x 10 5 Sf9 sejthez a médium teljes eltávolítását követően 250 ng E. coli BHM törzsből (NEB) izolált transzfer vektort és 60 ng linearizált bakulovírus DNS-t, majd 250 µl A (Grace-féle médium, 10% FBS-sel) és 250 µl B (25 mm Hepes, ph 7,1; 125 mm CaCl 2 ; 140 mm NaCl) puffert adtunk. Ezután 4 órán át, 27 0 C-on inkubáltuk a kotranszfektált sejteket, majd 4 óra elteltével eltávolítottuk a transzfekciós elegyet, és médiumra cseréltük. Négy nap elteltével összegyűjtöttük a sejteken lévő médiumot, ami tartalmazta a rekombináns vírusokat (vírusfelülúszó). A vírusfelülúszóból az egyedi, rekombináns vírusokat végponthígítással állítottuk elő. Ezek közül immunoblot segítségével kiválasztottuk a legmagasabb ABCG2 fehérje expressziót nyújtó klónokat. A kiválasztott klónt több lépésben amplifikáltuk, míg magas titerű (10 8 pfu/ml) vírusfelülúszóhoz jutottunk. Membránpreparátumok készítése Az eljárást végig 4 0 C-on végeztük. A sejteket jéghideg DPBS-ben (Invitrogen) történt két egymást követő mosás után hipotóniás lízis pufferbe (5 mm EGTA, 5 mm EDTA, 10 mm Tris ph 7.4, 10 mm HEPES, 5 µg/ml aprotinin, 5 µg/ml leupeptin, 2 mm PMSF and +/- 2 mm dithiothreitol /DTT) helyeztük, és nagy nyomású nitrogén jelenlétében 20 percen át lizáltuk. A sejtmagokat és a fel nem tárt sejteket 1200/perc fordulatszámon történő 10 perces centrifugálással távolítottuk el. Ezt követően a mitokondriumokat szedimentáltuk ultracentrifugában, 7000/perc fordulatszámon, újabb 10 percen át. Végül a membránokat a felülúszó egy órán át tartó, 40000/perc fordulatszámon végzett ultracentrifugálásával nyertük ki. A membránokat tartalmazó csapadékot lízis pufferben oldottuk fel, és a lizátumokat 20 0 C-on tároltuk. A membránpreparátumok fehérje koncentrációját a Bradford módszer alkalmazásával, a Bio-Rad fehérje meghatározó reagens (Bio-Rad) segítségével, spektrofotométerben állapítottuk meg. A kalibrációs görbe BSA (Pierce) felhasználásával készített standard hígítási sorral történt. Elektoforézis és immunoblot A membránpreparátumokat mintafelvivő pufferben (50 mm Tris-PO 4 ph 6,8, 25
20% glicerin, 1-20 µg bromofenolkék, 2% SDS, 2% β-merkaptoetanol) történt oldás után 7,5%-os Tris-HCl gélen (Bio-Rad), 100 V-on egy órán át elektroforizáltuk, Mini- Proteán elktroforézis készülékben (Bio-Rad). A nem redukáló körülmények között végzett elektroforézis esetében a mintafelvivő puffer nem tartalmazott β- merkaptoetanolt, és a membránpreparálásnál használt lízis puffer DTT felhasználása nélkül készült. Az elektroforézist követően a fehérjéket 0,2 µm pórusméretű PVDF (Millipore) membránra blotoltuk át, Mini-Trans-Blot (Bio-Rad) készülék segítségével CAPS-et (Sigma) és 10 % metanolt tartalmazó transzfer pufferben 100 V-on, 60 percen át, a készülék állandó hűtése mellett. A transzfer sikerességét és mintafelvitel egyenletességét 0,1%-os Ponceau S oldatban (Sigma) történt 10 perces festéssel ellenőriztük, melyet többszöri desztillált vizes öblítés és 5%-os tejet tartalmazó TBS pufferben történő blokkolás követett, egy órán át. Ezután a membránt egy éjszakán át inkubáltuk 5%-os tejet és a BXP-21 monoklonális antitestet (Kamiya Biomedicals) 1:250 hígításban tartalmazó TBS oldatban, 4 0 C-on. Majd 1%-os Tween 20-t tartalmazó TBS pufferben történt mosásokat követően a membránokat egy órán át tormaperoxidázzal konjugált egér ellenes másodlagos antitestet (Amersham) és 5% tejet tartalmazó TBS-ben inkubáltuk, melyet ismételt mosások követtek TBS-tweenben. Végül ECL-ben (Amersham) történt 3 perces áztatást követően a jelerősséget autoradiográfiával határoztuk meg. Northern blot analízis A transzfektált sejtekből az RNS-t az RNA STAT-60 reagens (Tel-Test Inc.) felhasználásával, a gyártó utasításait követve nyertük ki. A cdns jelölése a Riboprobe in vitro transzkripciós reagens (Promega) segítségével történt. Az RNS mennyiségének és minőségének meghatározása érdekében 5 µg-ot elektoforézisnek vetettünk alá 1% agarózt és 6% formaldehided tartalmazó gélen. A gélt etidium bromiddal megfestettük, majd az RNS-t nitrocellulóz membránra transzferáltuk. A jelöléshez az ABCG2 gén első 662 bázispárjából készült riboprobe került felhasználásra a pcrii-topo nevű vektorban (Invitrogen). A hibridizáció 58 0 C-on, egy éjszakán át, 50%-os formamid oldatban történt, amely 0,75 M NaCl-t, 0,075 M nátrium citrátot, 0,1% SDS-t és 5X Denhardt féle oldatot tartalmazott. SDS-t, NaCl-t és nátrium citrátot tartalmazó oldatban két egymást követő mosás után a jelerősséget autoradiográfiával határoztuk 26
meg, a film -70 0 C-on történt expozíciójával. Áramlási citometria Az ABCG2 ellenes monoklonális 5D3 antitesttel történő jelöléshez a sejteket előzetes tripszinizációt követően, 2% BSA-t és a fikoeritrinnel konjugált 5D3 antitestet, vagy fikoeritrinnel konjugált IgG-t tartalmazó DPBS oldatban inkubáltuk szobahőmérsékleten 30 percen át, melyet két mosás követett DPBS-ben. A mintákat az analízis elvégzéséig sötétbe helyeztük. A drog transzport vizsgálatára irányuló kísérletek esetében a tripszinizált sejteket 10% FBS-t tartalmazó médiumban reszuszpendáltuk, és szintén 30 percig inkubáltuk 37 0 C-on, 5%-os CO 2 jelenlétében. A médiumhoz 20 µm mitoxantront, vagy 0,5 µg/ml rhodamin 123-at (Sigma), vagy 10 µm pheophorbid a-t (Frontier Scientific), vagy 250 nm BODIPY-prazosint (Molecular Probes) adtunk, az FTC (Natural Product Extraction Laboratory, NIH) nevű specifikus ABCG2 blokkoló 10 µm-os koncentrációjának jelenlétében, illetve annak hiányában. A sejteket ezután jéghideg médiumban egyszer átmostuk, és további egy órán keresztül inkubáltuk szubsztrátot nem tartalmazó médiumban, 37 0 C-on, FTC jelenlétében vagy annak hiányában. A sejteket ezután kétszer DPBS-ben mostuk, és az analízis elvégzéséig sötétben tartottuk. A mintákat 488 nm-es argon és 635 nm-es vörös dióda lézerrel felszerelt FACSort áramlási citométerben elemeztük. Mintánként legalább 10000 esemény került regisztrálásra. Az elpusztult sejteket propidium jodidos festéssel azonosítottuk. Kémia keresztkötés A kémiai keresztkötési reakciók in vivo történtek. A sejteket 3-30 percig inkubáltuk szobahőmérsékleten 2 mm-os koncentrációjú DSS-t, vagy DSP-t, illetve 1 mm-os koncentrációjú MBS-t, vagy DSG-t tartalmazó médiumban. A keresztkötő reagenseket a Pierce-től vásároltuk. A reakciót 20 mm-os végső koncentrációjú Tris- HCl (ph 8) hozzáadásával állítottuk le, melyet azonnal a fent leírtak szerinti membránpreparálás és immunoblotolás követett. PNG-áz enzimes kezelés Ehhez a kezeléshez a Glyko N-Glycanase (ProZyme) nevű kitet használtuk a 27
gyártó utasításainak megfelelően. Mintánként 100 µg membránpreparátumot inkubáltunk egy éjszakán át, 37 0 C-on, melyet a fentiekben részletezett immunoblotolás követett. Az ATP-áz aktivitás mérése A membránok ATP-áz aktivitását az ATP-hidrolízis során felszabaduló inorganikus foszfát kolorimetriás detektálásával határoztuk meg. Az ABCG2-re specifikus aktivitásnak az össz ATP hidrolízis vanadátra érzékeny frakcióját tekintettük (Sarkadi, 1992). A membránokat a Gribar et al által leírtak alapján készítettük (Gribar, 2000), és 70 C-on, TSNa pufferben (20 mm Tris-HCl, ph 7,5, 50 mm NaCl, 250 mm sucrose, 1 mm AEBSF és 1% aprotinin) tároltuk. A méréseket 20 percen át végeztük, ATP-áz pufferben (10 mm MgCl 2, 50 mm Tris-HCl ph 7,5, 50 mm KCl, 2 mm dithiothreitol, 2 mm EGTA, 5 mm Na-azide, 1,5 mg/ml ouabain), 37 C-on. A reakciót 5 mm ATP-vel indítottuk, és 2,5%-os végső koncentrációjú SDS-el állítottuk meg. A Hoechst 33342 festék transzportjának vizsgálata rovarsejtekben 4 x 10 6 Sf9 rovarsejtet koinfektáltunk a vad-típust, a K86M-et, a G553L-t illetve β -galaktozidázt hordozó változó mennyiségű bakulovírussal a 16. ábrán jelzett arányokban. A fertőzést követően 40 órával a sejteket egyszer mostuk, majd szuszpendáltuk szobahőmérsékletű HPMI oldatban (120 mm NaCl, 5 mm KCl, 400 µm MgCl 2, 40 µm CaCl 2, 10 mm Hepes, 10 mm NaHCO 3, 10 mm glükóz és 5 mm Na2HPO 4 ). A sejtekből mintát vettünk, amit ezután tripán-kékkel (Sigma) festettünk meg, és megszámoltuk az élő és az elpusztult sejteket. Ezután 5 x 10 5 rovarsejtet szuszpendáltunk 2ml HPMI oldatban, és a Hoechst 33342 festék akkumulációját állandó keverés mellett, 37 0 C-on olvastuk le, fluoreszcens spektrofotométerben (Perkin Elmer), 350 nm (excitáció)/460 nm (emisszió) mellett. A festék csak akkor válik fluoreszcenssé, amikor DNS-hez kötődik (Haugland, 1996), így a mérés során folyamatosan detektálhattuk annak sejtbe történő beáramlását. A sejteket 4 percen át előinkubáltuk 37 0 C on, majd 1µM Hst-t adtunk hozzájuk, és további 10 percen át jegyeztük a fluoreszcencia változását. Ezt követően ABCG2 inhibitort (1 µm Ko143) adtunk a sejtekhez. A sejten belüli fluoreszcenciát meghatároztuk a transzport inhibitor 28