Környezetvédelmi analitika II. (BMEVESAM108) Immunanalitika, Lab-on-a-chip Helyszín: Ch 1.emelet 106. Gyakorlatvezetők: Hajas Lívia és Török Kitti Email: ktorok@mail.bme.hu
Lab-on-a-chip (LOC) technika A kapilláris elektroforézis mikromódszerré való továbbfejlesztésével született a Labon-a-Chip (Laboratory on a Chip) technológia 1997-ben. A berendezés elsı rutinvizsgálatokra alkalmas kivitelezését 2003-ban fejlesztette ki közösen az Agilent Technologies és a Caliper Technologies. A Lab-on-a-Chip technológia célja a mérési eljárások mind kémiai, mind analitikai szempontból történő leegyszerűsítése. A szükséges mintamennyiség nagyságrendekkel csökken, csakúgy, mint a futtatási idő, mely a PAGE-el 2-12 óra (a gél méretétől függően), kapilláris elektroforézissel 2-3 perc egy mintára, Lab-on-a-Chip-pel pedig 50 másodperc egy mintára. Az injektálásától a detektálásig automatizáltan követik egymást a lépések, ez analitikai szempontból nagy előny. A LOC módszer esetében több analitikai művelet vagy egy teljes folyamat játszódik le egyetlen chipen. Általánosságban elmondható, hogy egyszerre működik biokémiai reaktorként, injektorként, elválasztó rendszerként és bizonyos esetekben még frakciószedőként is. Lehetőséget nyújt kis mennyiségek (akár nanoliternyi térfogatok) gyors analízisére. A mintát nyomással vagy elektromos árammal áramoltatjuk. A kis mintamennyiség miatt a keverés diffúzióval megoldható meg. A mikrochip alapvetően passzív eszköz, de bizonyos esetekben aktív eszközöket (mikropumpák, mikroszűrők, elektródák) is építhetnek a chipbe. A mikroichip két összekapcsolt üveglapból áll, az egyiken mikrocsatornákat alakítanak ki, a másikon pedig kerek lyukakat, amiken keresztül beinjektáljuk a gélt, a létrát és a mintaoldatokat. A mintaoldat tartalmazza a mintát, a mintapuffert, felső markereket (pl.: miozin) és egy interkaláló fluoreszcens festéket. A chip felépítése az 1. ábrán látható. 1. ábra Egy mikroelektroforézises chip felépítése
A mintabevitel keresztcsatornák kialakításával valósul meg. A kapocsfeszültséget annak megfelelően kell beállítani, hogy kereszteződésben található minta molekulái a detektor irányába mozogjanak (2. ábra). Az injektálás pontossága az elektrokinetikus szabályozásnak köszönhető, kapilláris csatornákba csatlakozó elektródok változó nagyságú és polaritású elektromos teret hoznak létre: a minta, és a pufferoldat mozgása így elektrokinetikusan szabályozott. A megfelelő elektrokinetikus hatáshoz magas feszültség szükséges, az Agilent Technologies például 50mA±1%, 100-3000V±2% -os kritériumot ír elő. 2. ábra Elválasztás folyamata: A: vázlatos felépítés B: minta betöltése C: szeparáció A detektálás UV abszorbancia vagy lézerindukált fluoresszencia (LIF) méréssel történik.
3. ábra LOC méréssel kapott fehérjeprofil elektroferogramja A LOC jól alkalmazható rutinszerű méréseknél, illetve más módszerekkel kiegészítve (pl. SE-HPLC), gabonák fehérjeprofiljának meghatározására (3. ábra).
Immunanalitikai módszerek A gabonák az egyszikűek osztályába, a pázsitfűfélék családjába tartozó növények. Egy érett gabonaszem fehérje tartalma 8-20%. Osborne (1907) szerint a búzafehérjék négy csoportja különböztethető meg oldhatóság alapján: o a vízben oldható albuminok o a sóban oldható globulinok, o az alkoholban oldható gliadinok, o a savban, lúgban oldható glutelinek. A gliadinok és gluteninek körülbelül fele-fele arányban teszik ki az ún. glutén fehérjéket, melyek a teljes lisztfehérjék 80-85%-át adják. A sikér (glutén) fehérjék vízzel kölcsönhatásba lépve alakítják ki a sikérszerkezetet, melynek fehérje összetétele a búza sütőipari minőségét és a tészta funkcionális tulajdonságait határozza meg. A gliadinok monomer fehérjék, egyetlen polipeptid láncból állnak. A gliadin frakcióban található fehérjék további alcsoportokra oszthatók: relatív elektroforetikus mozgékonyságuk alapján (α, β, γ és ω alfrakciók) vagy N terminális aminosav szekvenciájuk alapján (α, γ és ω alfrakciókra. A gliadin frakció molekulatömege 32-58 kda tartományba esik. A gluteninek nagy molekulasúlyú polimer fehérjék (több millió Dalton). Molekulatömegük alapján két alegységre oszthatók: nagy molekulasúlyú glutenin alegységre (high molecular weight glutenin subunit, HMW-GS) és kis molekulasúlyú glutenin alegységre (low molecular weight glutenin subunit, LMW-GS). A HMW-GS a teljes fehérjetartalom 5-10%-át adja. Molekulasúlya 80-160 kda. Az LMW-GS a búza tartalék fehérjéinek fő komponense. A teljes fehérjetartalom 20-30%-át, a gluteninek 70%-át teszi ki. Molekulasúlya 30-51 kda (Ciclitira et al., 2005; Khan et al., 2010). Az előbb ismertetett búzafehérjék több, eltérő patomechanizmusú kóros folyamatot képesek elindítani a szervezetben: IgE-mediált és sejtmediált allergiás reakciót, valamint T- sejt mediált autoimmun megbetegedést. A betegségek egyetlen, elterjedten alkalmazott kezelési módja az egész életen át tartó diéta. A betegek étrendjéből száműzni kell valamennyi glutént tartalmazó gabonafélét: a búzát, a rozst és az árpát. Azonban a búza és annak komponensei (keményítő, sikér, stb.) számtalan élelmiszertermékben előfordulnak, mely a diéta betartását rendkívül megnehezíti (Briani et al., 2008). A túlérzékenységi reakciót kiváltó fehérjék meghatározására alkalmas analitikai módszerek irányulhatnak magára a fehérjére vagy annak egy meghatározott markerére pl. specifikus DNS fragmentumra, amely az adott fehérje jelenlétét jelzi az érintett élelmiszerben
(1. táblázat). A megfelelő mérési technika kiválasztásánál figyelembe kell venni a vizsgálandó élelmiszer és fehérje tulajdonságait (pl. specifikus antitestek/dns primerek elérhetőségét, a megvalósítható kimutatási határt). Fehérje meghatározásán alapuló módszerek ELISA o Szendvics ELISA o Kompetitív ELISA Immunblotting o IEF-blotting Immunanalitikai o SDS-PAGE-blotting módszerek o 2D elektroforézis-blotting o Dot-blotting RAST/EAST inhibíció Rakéta immunelektroforézis Kettős immundiffúzió Immunkromatográfia Kromatográfiás Ioncserés kromatográfia módszerek Méretkizárásos kromatográfia Reverz fázisú-hplc Spektrometriás Tömegspektrometria módszerek Mágneses magrezonancia LC/MS LC/MS/MS Kapcsolt módszerek ESI/MS MALDI-TOF/MS MALDI-TOF/MS/MS DNS meghatározásán alapuló módszerek PCR Real-time PCR PCR-ELISA Gyorsvizsgálati módszerek
LFD tesztcsíkok ELISA kitek Bioszenzorok 1. táblázat Túlérzékenységi reakciót kiváltó fehérjék maghatározására alkalmas analitikai módszerek A fehérje meghatározáson alapuló módszereket két nagy csoportra lehet osztani: az immunanalitikai eljárásokra és a fehérjék elválasztásán alapuló eljárásokra. A fehérje meghatározásán alapuló módszereket, ezen belül az immunvizsgálatokat alkalmazzák leggyakrabban glutén fehérjék minőségi és mennyiségi meghatározására. Ezen technikák alapja az antitest-antigén komplexek kialakulása. A szeparációs (kromatográfiás) módszerek szintén elérhetők, azonban kevésbé használatosak. A tömegspektrometriás eljárások a fehérjék jelenlétét peptidszintű meghatározással bizonyítják. A módszer érzékenysége és a tömegmeghatározás pontossága lehetővé teszi marker peptidek kimutatása által túlérzékenységi reakciót kiváltó fehérjék meghatározását. A DNS, mint lehetséges célmolekula nagyfokú stabilitást mutató biomakromolekula. A polimeráz láncreakción (Polymerase Chain Reaction, PCR) alapuló DNS analízist az élelmiszer-előállítási folyamat minden lépésénél alkalmazhatjuk, a nyersanyagok és végtermékek tesztelésére egyaránt alkalmas feltéve, hogy rendelkezésre áll a megfelelően amplifikálható DNS kivonat. Az túlérzékenységi reakciót kiváltó fehérjék élelmiszerekben történő meghatározásának dinamikusan fejlődő területe a gyorsvizsgálati eljárások. Az antitesten alapuló tesztcsíkok előnye, hogy nem igényelnek laboratóriumi körülményeket, bárhol elvégezhetők és az eredmény már a helyszínen megkapható (Besler, 2001; Krska et al., 2004; Poms & Anklam, 2004; Yeung, 2006). Az ELISA módszer Az enzim-kapcsolt immunszorbens vizsgálat (Enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA) a leggyakrabban használt immunológiai eljárás túlérzékenységi reakciók meghatározására. Az ELISA tesztek alapja, hogy a létrejött antigén-antitest komplexet enzim segítségével detektálják. Az antitesthez kapcsolt enzim a hozzáadott színtelen (kromogén) szubsztrátot színes termékké alakítja, ezzel jelezve a komplex jelenlétét. Az analit (antigén) mennyisége a mért színintenzitásból kalibrációs görbe segítségével meghatározható. Az ELISA teszteknek két típusa ismert: a szendvics és a kompetitív ELISA.
Szendvics ELISA elve (4. ábra) A megfelelően tisztított, specifikus (elfogó) antitesteket felesleges mennyiségben egy műanyag lemezre abszorbeálják vagy kovalensen kötik (1). Hozzáadják a vizsgálandó mintát. Az immobilizált elfogó antitestekhez a megfelelő antigének - a mintában lévő glutén fehérjék hozzákötődnek (2). Mosási lépést követően, enzimmel konjugált (detektáló) antitesteket adnak a reakcióelegyhez, melyek az antigén egy másik szabad epitópjához kötődnek (3). Mosási lépés következik, majd hozzáadják a kromogén szubsztrátot tartalmazó oldatot (4). A kötött enzim a szubsztrátot detektálható színes termékké alakítja (5). A színintenzitás a megfelelő hullámhosszon spektrofotometriás módszerrel mérhető. A mért abszorbancia egyenesen arányos a mintában lévő antigén koncentrációval. 4. ábra A szendvics ELISA elve [http://www.biomol.de/details/ep/sandwich_450.jpg] Kompetitív ELISA elve (5. ábra) A kérdéses antigént műanyag lemezhez kötik (1). Hozzáadják a vizsgálandó mintát és a korlátozott mennyiségű antitestet tartalmazó oldatot. A mintában található antigén és a lemezhez kötött antigén az antitest kötőhelyeiért verseng. A mosási lépésben az immobilizált antigénhez nem kötött ellenanyagot kimossák (2). Az antigén-antitest komplexek detektálása végett az antitesthez konjugált enzim kromogén szubsztrátját tartalmazó oldatot adnak a reakcióelegyhez (3). Az enzim a szubsztrátot színes termékké alakítja, melynek színintenzitása fotométerrel mérhető. A mért abszorbancia fordítottan arányos a mintában lévő antigén koncentrációval.
1. 2. 3. 5. ábra A kompetitív ELISA elve [http://en.wikipedia.org/wiki/elisa] Glutén fehérjék kvantitatív méréséhez számos kereskedelmi forgalomban kapható ELISA kit alkalmazható. Az egyes gyártók és laboratóriumok részben eltérő extrakciós eljárást, ellenanyagot valamint kalibráló anyagot használnak fel az általuk kidolgozott ELISA módszerekhez (Yeung, 2006). LFD (Lateral Flow Device) tesztcsíkok A legelterjedtebb gyorsvizsgálati technika az LFD (Lateral Flow Device) tesztcsík. Az antitest-antigén kölcsönhatáson alapuló tesztcsíkok kvalitatív vagy szemikvantitatív meghatározásra alkalmazhatók. Az LFD tesztcsík öt alapvető alkotóelemből áll (6. ábra). 1. Mintaszűrő A mintaszűrő két fő funkcióval rendelkezik: a mintában található szilárd anyagok (pl. élelmiszer- vagy szérumrészecskék) szűrése és a minta pufferelése.
2. Konjugátum régió A konjugátum régió egy üveggyapotszerű régió. Arany-, latex- vagy szénkonjugált oldattal vonják be permetezés vagy merítés útján. 3. Membrán A membrán nylonból vagy nitrocellulózból áll. Rendszerint polipropilén, polietilén vagy polisztirén hátlapra ragasztják fel. A membrán halászháló jellegű szerkezettel és változatos pórusmérettel rendelkezik. A pórusméret befolyásolja a teszt gyorsaságát és az érzékenységét is. 4. Abszorpciós régió Az abszorpciós réteg egyetlen funkciója a folyadék abszorpciója a tesztcsík végén. 5. Tesztvonal és kontroll vonal A teszt és kontroll vonal a nitrocellulóz/nylon membránra felpermetezett, immobilizált ellenanyagot tartalmazó sávok. 6. ábra Az LFD tesztcsík felépítése [http://www.rapid-diagnostics.org/images/lateralflow_platform_labels.gif] A tesztcsíkot belehelyezve a vizsgálandó oldatba, a minta végigfut a mintaszűrőn és a konjugátum régión. A konjugátum régió nagy tisztaságú, jelölt (arany/latex/szén), az analitra specifikus antitestet tartalmaz. Ha jelen van az analit, komplexet alakít ki a konjugált antitesttel, majd a membrán mentén a tesztzóna felé halad tovább. A tesztzóna immobilizált, az analitra specifikus antitestet tartalmaz. A tesztvonalon az ott lévő ellenanyagok megkötik az analit-konjugált antitest komplexet. A membrán végénél egy ellenőrző vonal (kontrollzóna) is található, mely immobilizált, konjugált antitestre specifikus antitestet tartalmaz. Ha az ellenőrző vonal nem jelenik meg a teszt során, akkor a teszt nem megfelelően zajlott le. A mérés során a következő eredmények kaphatók: pozitív (két elszíneződött vonal), negatív (csak a kontroll vonal látható) vagy érvénytelen eredmény (ha egyik vonal sem jelenik meg vagy csak a tesztvonal látható) (Van Herwijnen et al., 2006).
Gyakorlati rész Gyakorlat célja: Két rizsliszt glutén szennyezettségének vizsgálata. Felhasznált anyagok és eszközök: Riszlisztek (genotípus: M488) 96%-os etanol desztillált víz spatula analitikai mérleg centrifugacsövek (15 ml-es) pipetták és pipettahegyek vortex RIDA QUICK Gliadin (Art. Nr. R7003) Kimutatási határ: 2.5 mg/kg gliadin (5 mg/kg glutén) Ellenanyag: R5 monoklonális antitest (búza, rozs és árpa prolaminjaira specifikus). Szója, zab, kukorica, rizs, köles, hajdina, quinoa és amaránt fehérjékkel nem keresztreagál. Mérés kivitelezése 1. A két vizsgálandó lisztmintából mérjünk ki 1-1 g-ot. 2. Adjunk hozzá 10 ml 60%-os etanolt. 3. Vortexeljük 30 másodpercig. 4. Centrifugáljuk 2500 g-n 10 percen át szobahőmérsékleten. 5. Két műanyag cellába mérjünk ki 500-500 µl-t a tesztcsíkhoz tartozó minta hígítóból. 6. Adjunk hozzá 50 µl-t a lecentrifugált minták felülúszójából és óvatosan rázzuk össze. 7. Helyezzük bele a tesztcsíkot (nyíllal lefelé) a cellába. 8. 5 perc elteltével emeljük ki a tesztcsíkot a folyadékból és olvassuk le az eredményt. Értékelés
A kontroll vonal kék, a teszt vonal piros színnel jelenig meg. Ha mindkettő látható, a teszt pozitív. Csak a kontroll vonal jelenléte negatív eredményt jelent. Ha egyik sem látható, vagy csak a teszt vonal, a mérés érvénytelen. 7. ábra Mérés kivitelezése és értékelése [www.r-biopharm.com] Felhasznált szakirodalom Besler, M.: Determination of allergens in foods. Trends in Analytical Chemistry. 2001; 20 (11): 666-672. Briani, C., Samaroo, D., Alaedini, A.: Celiac disease: From gluten to autoimmunity. Autoimmunity Reviews. 2008 (7): 644-650. Ciclitira, P. J., Ellis H. J., Lundin, K. E. A.: Gluten-free diet what is toxic? Best Practice & Research Clinical Gastroenterology. 2005 (19): 359-371. Khan, M. R., Anjum, F. M., Din, A., Hussain, S., Shabbir, M. A., Nadeem, M.: Immunochemical characteristics of wheat proteins. Food and Agricultural Immunology. 2010; (21): 279-294. Krska, R., Welzig, E., Baumgartner, S.: Immunoanalytical detection of allergenic proteins in food. Analytical&Bioanalytical Chemistry. 2004; 378: 63-65.
Poms, R. E, Anklam, E.: Polymerase Chain Reaction Techniques for Food Allergen Detection. Journal of AOAC International. 2004; 87 (6): 1391-1397. Van Herwijnen, R., Baumgartner, S.: The use of lateral flow devices to detect food allergens. In: In: Koppelman, S. J., Hefle, S. L. (eds.): Detecting allergens in food. Woodhead Publishing in Food Science and Technology. 2006; 175-181. Yeung, J.: Enzyme-linked immunosorbent assays (ELISAs) for detecting allerens in foods. In: Koppelman, S. J., Hefle, S. L. (eds.): Detecting allergens in food. Woodhead Publishing in Food Science and Technology. 2006; 109-124.