Tempfli Károly 1 Kovács Bálint 2 Simon Zoltán 3 Bali Papp Ágnes 4 Az adiponectin, a zsírsavkötő fehérje és a leptin gének expressziója sertés izom- és zsírszövetben Expression of adiponectin, adipocyte fatty acid-binding protein, and leptin genes in porcine muscle and fat tissues tempflik@gmail.com 1NymE-MÉK, tanársegéd 2NymE-MÉK, hallgató, MSc 3Olmos és Tóth Kft, tenyésztésvezető 4NymE-MÉK, egyetemi tanár, intézetigazgató Összefoglalás. A húsminőséget és a testösszetételt befolyásoló gének működésének megismerése kiemelt jelentőségű kutatási terület, hiszen a minőségi termékek felé forduló fogyasztói hozzáállás miatt a húsminőség is szelekciós szempontként jelenik meg a sertéstenyésztésben. A húsminőséget befolyásoló fontos tényezők a test zsírtartalma és az intramuszkuláris zsír mennyisége. Jelen vizsgálatban a zsíranyagcserében jelentős szerepet játszó adiponektin (ADIPOQ), zsírsejt zsírsavkötő fehérje (A-FABP) és leptin (LEP) gének expressziója került felmérésre mangalica duroc kocahízók hátszalonnájában és izomszövetében. A génműködés felméréséhez a reverz transzripciós, valós idejű polimeráz láncreakció (RT-qPCR) módszert használtuk β-actin referencia gén alkalmazásával. A vizsgált gének mindegyike detektálható a keresztezett egyedek zsír- és izomszövetében is. Az ADIPOQ kifejeződése szignifikáns (P<0,05) mértékben nagyobb a hátszalonnában, mint az izomszövetben. Az A-FABP és LEP gének esetében szintén intenzívebb működés figyelhető meg a zsírszövetben az izomhoz viszonyítva, bár a különbség nem szignifikáns mértékű. Az A-FABP és a LEP gének izomszövetben való jelentős kifejeződésük révén hozzájárulnak az intramuszkuláris zsírszövet kialakulásához. Bevezetés A sertés zsírtermelését és húsminőségét befolyásoló gének működésének feltárása tenyésztési, takarmányozási, gazdasági, vagy akár humánbiológiai szempontból is számos előnyt jelenthet. Ismert sertésfajtáink rendkívüli sokszínűséget vonultatnak fel mind a zsírtermelés, mind a húsminőség tekintetében, így a szélsőségesen különböző megjelenésű és tulajdonságú fajták együttes vizsgálatával, összehasonlításával kiváló lehetőség nyílik a fenotípusos különbségekért felelős gének azonosítására. A sertés és az ember szervezete közötti nagymértékű hasonlóságnak köszönhetően a sertés különböző emberi betegségek (pl. cukorbetegség, elhízás) potenciális modellállatának is tekinthető. A zsírszövet elsődleges funkciója a többlet energia tárolása zsír formájában; emellett azonban a zsírszövet endokrin és parakrin szervként is működik, amely többek között leptin és adiponektin termelésével és véráramba juttatásával szabályozza az energia-háztartást, az inzulin működését és további fiziológiai folyamatokat (Havel, 2002; Ding és mtsai, 2004); ezért a zsírszövet hormontermelésének fontos szerepe van a takarmányfelvétel, továbbá a hízékonysági tulajdonságok alakításában is. A zsírsejtek által termelt fehérje hormonnak, az adiponektinnek szerepe van a glükoneogenezis gátlásában, valamint a zsírsavak oxidációjának serkentésében. Embernél az adiponektin különböző alléljait összefüggésbe 439
hozták az inzulinrezisztencia, a 2-es típusú cukorbetegség és a kóros elhízás kialakulásának kockázatával, továbbá fordított arányosságot figyeltek meg az adiponektin vérplazmában mért szintje és a testzsír aránya között (Wang és mtsai, 2006; Daniele és mtsai, 2008). A leptin gén (LEP) által kódolt hormon elsősorban a fehér zsírszövetben termelődik (Villalba és mtsai, 2009), kiemelkedő szerepe van a testtömeg szabályozásában, részt vesz a táplálékfelvétel és az energia-leadás közötti egyensúly fenntartásában, a szaporodásban és a csontfejlődésben is (Barb és mtsai, 2001). A fokozott zsírfelhalmozásra és elhízásra hajlamosabb sertésekben a génről íródott mrns szintje jóval magasabb a többi egyedhez viszonyítva (Ramsay és mtsai, 1998). Az 1994-ben, egerek LEP génjében felfedezett mutáció egyértelműen elhízáshoz vezetett (Zhang és mtsai, 1994), ami óriási lendületet adott a gén további tanulmányozásához a humán gyógyászatban és a sertéstenyésztésben egyaránt. A zsírsavkötő fehérjék elsődleges szerepe a zsírsavfelvétel szabályozásában és a zsírsavak intracelluláris szállításában van. A zsírsejt zsírsavkötő fehérjék (A-FABP) szintje és a zsírsejtek száma, továbbá az intramuszkuláris zsírtartalom között összefüggés figyelhető meg (Damon és mtsai, 2006). A húsminőség és ízletesség szempontjából az intramuszkuláris zsírtartalomnak fokozott jelentősége van, hiszen az íz- és aromaanyagok zsírban oldódva találhatók meg a húsban (Fernandez és mtsai, 1999). Vizsgálataink célkitűzése volt, hogy az adiponektin (ADIPOQ), a zsírsejt zsírsavkötő fehérje (A-FABP) és a leptin (LEP) gének működését összehasonlítsuk szőke mangalica duroc sertések hátszalonnájában és izomszövetében. Anyagok és módszerek Az expressziós vizsgálatokhoz szükséges hátszalonna- és izommintákat (m. levator scapulae) a Pick Szeged Zrt. szegedi vágóhídján gyűjtöttük. A kísérletbe vont 5 szőke mangalica duroc kocahízót az Olmos és Tóth Kft. biztosította. Az állatok élőtömege 137,3±8,5 kg volt. Az RNS-alapú vizsgálatok egyik kritikus pontja a mintavétel, hiszen a DNS-nél sokkal instabilabb és a környezetünkben általánosan elterjedt RNS-bontó enzimek (RNázok, ribonukleázok) által veszélyeztetett RNSállomány a vágást követően rövid időn belül degradálódhat; ennek elkerülése érdekében a mintavételt a vágást követő legfeljebb 45 percen belül végeztük. Az 1,5-2 g közötti mintákat műanyag fagyasztócsövekbe (VWR International) helyeztük és az adatok rögzítését (egyed fajtája, azonosító száma) követően azonnal folyékony nitrogénbe ( 196 C) mártottuk. A szállítás és a feldolgozásig történő tárolás is a mintagyűjtő nitrogéntartályban történt. Az RNS izolálását a TRIzol módszer alapján végeztük (Chomczynski és Sacchi, 1987), TRIreagent (Life Technologies), kloroform és 1-bróm-3-klórpropán (VWR International) felhasználásával. Egy extrakció során hozzávetőleg 100-150 mg hátszalonna és izommintát dolgoztunk fel. A kinyert RNS mennyisége jellemzően nagyobb volt izom esetében: 500-1500 ng/µl, a zsírszövet 70-150 ng/µl-jéhez viszonyítva. A minták koncentrációját 50 ng/µl-re állítottuk be. Az izolált RNS mennyiségét Nanodrop 2000 (Thermo Scientific) spektrofotométerrel állapítottuk meg (1. ábra). A spektrofotométer kis mennyiségű (1-2 µl) mintában méri a koncentrációt, továbbá 230, 260 és 280 nm-en elemzi a minták abszorbanciáját, az adatokból pedig arányszámokat képez. A 260/280 és a 260/230 nm-en mért abszorbancia-arányokból következtethetünk az izolátum tisztaságára is. 440
Megfelelő tisztaságúnak tekintettük a legalább 1,8 feletti 260/280 és 260/230 értékekkel jellemzett RNSizolátumokat. 1. ábra. Hátszalonna mintából izolált teljes RNS mennyiségi meghatározása Nanodrop 2000 spektrofotométer segítségével. Az RNS-minták integritását agaróz gélelektroforézis alkalmazásával ellenőriztük (2. ábra). A gél festéséhez etídium-bromidot (Promega) használtunk. A vizsgálatok során kizárólag a tisztán látható, ép 18S és 28S rrns-t mutató, nem degradálódott minták használhatók fel. A tisztított RNS-pelletet DEPC (dietilpirokarbonát)-kezelt, nukleázmentes vízben oldottuk vissza. 2. ábra. A zsír- és izomszövetből izolált teljes RNS integritásának vizsgálata 1%-os agaróz gélben. 441 441
A valós idejű kvantitatív polimeráz láncreakció (qpcr) eredményét befolyásoló potenciális DNS-szennyezés elkerülése érdekében a tisztított RNS-izolátumokat DNáz kezelésnek vetettük alá, amely során az RQ1 RNasefree DNase kitet (Promega) alkalmaztuk. A reakcióelegyet legalább 30 percig 37 C-on tartottuk, majd a DNáz enzimet 65 C-on inaktiváltuk. Reverz transzkripció során az izolált teljes RNS-ről cdns-t állítottunk elő iscript cdna synthesis (Bio-Rad Laboratories) kit segítségével. A cdns szintézishez 500 ng RNS-t használtunk fel. A cdns előállítása oligo(dt) és random hexamer primerek keverékével történt. Az előállított cdns-t 1:100 arányban hígítottuk a qpcr alkalmazását megelőzően. Az optimális hígítási mérték kiválasztásához standard hígítási sorokat készítettünk. A β-actin, ADIPOQ, LEP és A-FABP génszakaszok amplifikálása az 1. táblázatban bemutatott primerek felhasználásával történt. 1. táblázat. Az expressziós vizsgálatok során alkalmazott primerek. Gén Szekvencia (5 3 ) Hossz β-actin1 F: CCAGGTCATCACCATCGG; R: CCGTGTTGGCGTAGAGGT 158 bp ADIPOQ2 F: CGAGAAGGGTGAGAAAGGAG; R: TAGGCGCTTTCTCCAGGTTC 123 bp LEP2 102 bp F: TGACACCAAAACCCTCATCA; R: ATGAAGTCCAAACCGGTGAC A-FABP3 F: CAGGAAAGTCAAGAGCACCA; R: TCGGGACAATACATCCAACA 1 Luo és mtsai (2009) 2 Cirera és mtsai (2013) 3 Zhao és mtsai (2009) 227 bp A vizsgálatok során a Bio-Rad CFX96 Real-Time PCR Detection System-et használtuk átlátszó ( clear ) plateekkel. A reakciók összeállítása a következő volt: 10 µl SsoFast EvaGreen supermix (Bio-Rad Laboratories), 1-1 µl forward és reverse primer, 1 µl cdns és nukleázmentes víz 20 µl-ig. 442
A reakciók beállításai a következők voltak: ADIPOQ esetében: 95 C 1 percig, majd 40, kétlépcsős ciklus 95 C-on 5 s-ig és 60 C-on 5 s-ig LEP esetében: 95 C 1 percig, majd 40, kétlépcsős ciklus 95 C-on 5 s-ig és 56 C-on 5 s-ig A-FABP esetében: 95 C 1 percig, majd 40, kétlépcsős ciklus 95 C-on 5 s-ig és 58 C-on 5 s-ig a referenciagénként alkalmazott β-actin kapcsolódási hőmérséklete az aktuális vizsgált gén hőmérsékletével egyezett meg. A különböző hőmérsékleteken végzett reakciók esetében a β-actin amplifikáció hatékonysága 93±8% volt. Az optimális primer-kapcsolódási hőmérséklet és cdns-hígítási arány megállapítása érdekében tízszeres hígítási sorokat készítettünk (3. ábra). 3. ábra. A reakciók hatékonyságának ellenőrzése ismert relatív koncentrációjú standard-ok segítségével. A supermixben található EvaGreen egy fluoreszcens nukleinsav-festék, amely segítségével a SYBR Green-alapú módszerhez hasonlóan ciklusonként detektálható a keletkező PCR-termékek mennyisége. Mivel a módszer nem termék-specifikus, különösen fontos az olvadási (melting) teszt elvégzése (4. ábra) és negatív (cdns nélküli) kontroll futtatása valamennyi reakció esetében. 4. ábra. Az egyes gének PCR-termékeinek specifikus olvadási görbéi. 443 443
A génexpresszió értékelése delta delta Ct (2 - Ct ) módszer alkalmazásával, β-actin referenciához normalizálva történt. A statisztikai értékeléshez az SPSS for Windows v16.0 program Tukey-tesztjét használtuk. Eredmények és értékelés Az ADIPOQ, az A-FABP és a LEP génről íródott mrns szintje is detektálható volt a keresztezett egyedek zsírés izomszövetében egyaránt (5. ábra). Az ADIPOQ expressziója a zsírszövetben szignifikáns (P<0,05) mértékben meghaladta az izomban megállapított értéket. Az izomszövetben való kifejeződés hátterében az intramuszkuláris zsírsejtek ADIPOQ-termelése áll. Az ADIPOQ hosszú hátizomban való kifejeződéséről számoltak be Ding és mtsai (2004) a Lee Sung taiwani fajta esetében, míg keresztezett lapály yorkshire duroc egyedeknél izomban nem fejeződött ki a gén. Összefüggést figyeltek meg továbbá az ADIPOQ izombeli expressziója és az intramuszkuláris zsírtartalom között is: 2,55% körüli izomközötti zsír esetén detektálható volt mrns, míg 1,6% körül még nem. A mangalica duroc fajtával való keresztezéseiben is megjelenő fokozott zsírfelhalmozási hajlam megnyilvánul a modern fajták húsához viszonyított magasabb izomközötti zsírtartalomban, ami hozzájárul az ADIPOQ izomszövet-beli megjelenéséhez, kifejeződéséhez is. 5. ábra. Az adiponektin (ADIPOQ), a zsírsejt zsírsavszállító-fehérje (A-FABP) és a leptin (LEP) gének expressziója a keresztezett egyedek zsír- és izomszövetében a β-actin referenciagén segítségével normalizálva. 444
Normalizált expressziós ráta 4,5 4 3,5 3 2,5 2 1,5 1 0,5 0 ADIPOQ A-FABP LEP Zsírszövet Izomszövet Az A-FABP és a LEP gének expressziós mintázata hasonlóan alakult: mindkét gén aktívabb a zsírszövetben, de jelentős a kifejeződésük izomszövetben is. A nagymértékű izomban való expresszió révén összefüggésben állnak az izomközötti zsírtartalom alakulásával. Az A-FABP szintje és az intramuszkuláris zsírmennyiség közötti összefüggést erősítették meg Luo és mtsai (2009) lapály és kínai taihu eredetű keresztezett ártányokban. A kísérleti állatokban a lenmag-etetés idejével arányosan növekedő izomközötti zsírtartalmat és A-FABP expressziót figyeltek meg a hosszú hátizomban. A LEP gén hasonló expressziójáról számoltak be Ramsay és Richards (2005) yorkshire lapály keresztezett egyedek esetében, bár a hátszalonna és izomszövet közötti különbség esetükben szignifikáns (P<0,05) volt. További vizsgálatainkban a keresztezett egyedek eredményeit fajtatiszta mangalica és modern, intenzív fajták (pl. magyar nagy fehér) expressziós mintázatával vetjük össze annak érdekében, hogy azonosíthassuk a nagymértékben különböző zsírosodási hajlamot mutató fajták génműködése szintjén jelentkező különbségeket. Köszönetnyilvánítás A kutatás a TÁMOP 4.2.4.A/2-11-1-2012-0001 azonosító számú Nemzeti Kiválóság Program Hazai hallgatói, illetve kutatói személyi támogatást biztosító rendszer kidolgozása és működtetése országos program című kiemelt projekt keretében zajlott. A projekt az Európai Unió támogatásával, az Európai Szociális Alap társfinanszírozásával valósul meg. A mintavételi lehetőségért és segítségükért köszönetet mondunk az Olmos és Tóth Kft. és a Pick Szeged Zrt. munkatársainak. Irodalomjegyzék 1. Barb, C.R.; Hausman, G.J.; Houseknecht, K.L. (2001): Biology of leptin in the pig. Domestic Animal Endocrinology, 21. 297 317. 445 445
2. Chomczynski, P.; Sacchi, N. (1987): Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanatephenol-chloroform extraction. Analytical Biochemistry, 162. 156 159. 3. Cirera, S.; Jensen, M.S.; Elbrond, V.S.; Moesgaard, S.G.; Christoffersen, B.O.; Kadarmideen, H.N.; Skovgaard, K.; Bruun, C.V.; Karlskov-Mortensen, P.; Jorgensen, C.B.; Fredholm, M. (2013): Expression studies of six human obesity-related genes in seven tissues from divergent pig breeds. Animal Genetics, 45. 59 66 4. Damon, M.; Louveau, I.; Lefaucheur, L.; Lebret, B.; Vincent, A.; Leroy, P.; Sanchez, M.P.; Herpin, P.; Gondret, F. (2006): Number of intramuscular adipocytes and fatty acid binding protein-4 content are significant indicators of intramuscular fat level in crossbred Large White Duroc pigs. J. Anim. Science, 84. 1083 1092. 5. Daniele, A.; Cammarata, R.; Masullo, M.; Nerone, G.; Finamore, F.; D Andrea, M.; Pilla, F.; Oriani, G. (2008): Analysis of adiponectin gene and comparison of its expression in two different pig breeds. Obesity, 16. 1869 1874. 6. Ding, S.T.; Liu, B.H.; Ko, Y.H. (2004): Cloning and expression of porcine adiponectin and adiponectin receptor 1 and 2 genes in pigs. Journal of Animal Science, 82. 3162 3174. 7. Fernandez, X.; Monin, G.; Talmant, A.; Mourot, J.; Lebret, B. (1999): Influence of intramuscular fat content on the quality of pig meat 1. Composition of the lipid fraction and sensory characteristics of m. longissimus lumborum. Meat Science, 53. 59 65. 8. Havel, P.J. (2002): Control of energy homeostasis and insulin action by adipocyte hormones: Leptin, acylation stimulating protein, and adiponectin. Current Opinion in Lipidology, 13. 51 59. 9. Luo, H.F.; Wei, H.K.; Huang, F.R.; Zhou, Z.; Jiang, S.W.; Peng, J. (2009): The effect of linseed on intramuscular fat content and adipogenesis related genes in skeletal muscle of pigs. Lipids, 44. 999 1010. 10. Ramsay, T.G.; Richards, M.P. (2005): Leptin and leptin receptor expression in skeletal muscle and adipose tissue in response to in vivo porcine somatotropin treatment. Journal of Animal Science, 83. 2501 2508. 11. Ramsay, T.G.; Yan, X.; Morrison, C. (1998): The obesity gene in swine: sequence and expression of porcine leptin. Journal of Animal Science, 76. 484 490. 12. Villalba, D.; Tor, M.; Vidal, O.; Bosch, L.; Reixach, J.; Amills, M.; Sanchez, A.; Estany, J. (2009): An agedependent association between a leptin C3469T single nucleotide polymorphism and intramuscular fat content in pigs. Livestock Science, 121. 335 338. 13. Wang, Y.; Lam, K.S.L.; Xu, A. (2006): Adiponectin as a therapeutic target for obesity-related metabolic and cardiovascular disorders. Drug Development Research, 67. 677 686. 14. Zhang, Y.; Proenca, R.; Maffei, M.; Barone, M.; Leopold, L.; Friedman, J.M. (1994): Positional cloning of the mouse obese gene and its human homologue. Nature, 372. 425 432. 15. Zhao, S.M.; Ren, L.J.; Chen, L.; Zhang, X.; Cheng, M.L.; Li, W.Z.; Zhang, Y.Y.; Gao, S.Z. (2009): Differential expression of lipid metabolism related genes in porcine muscle tissue leading to different intramuscular fat deposition. Lipids, 44. 1029 1037. 446