cobas TaqScreen MPX Test for use on the cobas s 201 system IN VITRO DIAGNOSZTIKAI CÉLRA. cobas TaqScreen MPX Test MPX 96 Tests P/N: 04584244 190 cobas TaqScreen MPX Control Kit MPX CTL 6 Sets P/N: 04626290 190 cobas TaqScreen Wash Reagent TS WR 5.1 L P/N: 04404220 190 FELHASZNÁLÁS MÓDJA A cobas TaqScreen MPX teszt a cobas s 201 rendszerrel való együttes használatra egy kvalitatív, in vitro vizsgálat az 1-es típusú, M csoportú humán immundeficiencia vírus (HIV-1) RNS, 1-es típusú, O csoportú humán immundeficiencia vírus RNS, 2-es típusú humán immundeficiencia vírus (HIV-2) RNS, hepatitis C vírus (HCV) RNS és hepatitis B vírus (HBV) DNS direkt kimutatására humán plazmából. A vizsgálat célja a donorszűrő-vizsgálatok során a HIV-1 M csoportú, HIV-1 O csoportú, HIV-2, HCV RNS és HBV DNS kimutatása egyéni véradók plazmamintáiból, beleértve a teljes vér, valamint véralkotórészek donorait és egyéb élő donorokat. A vizsgálat használható továbbá egyéni szerv- és szövetdonorok szűrésére is, amennyiben a mintákat akkor vették le, amikor a donor szíve még dobogott. A szűrés során az összes donortól származó plazmát egyéni mintaként kell kezelni. Teljes vér és véralkotórészek donorainak esetében a plazmaminták vizsgálhatóak külön-külön, illetve egyéni minták egyenlő részleteiből álló csoportokba gyűjtve, a HIV, HCV vagy HBV szerológiával egybekötve. Ez a vizsgálat nem a diagnózis elősegítésére való. A VIZSGÁLAT ÖSSZEGZÉSE ÉS MAGYARÁZATA A vér és véralkotórészek transzfúziója során lényeges problémát jelentenek a vírusfertőzések, különösen az 1-es és 2-es típusú humán immundeficiencia vírus (HIV-1, HIV-2), hepatitis C vírus (HCV) és hepatitis B vírus (HBV) esetleges átvitele. Ezen ágensek átvitele elsősorban fertőzött vér vagy vér- és plazmakészítmények, bizonyos szövetek vagy testfolyadékok által, nemi érintkezés során, illetve fertőzött anyáról magzatra lehetséges. A HIV-1 az egész világon elterjedt, előfordulási gyakorisága világszerte 1,1% (0,56% Észak- Amerikában és 0,25% Nyugat-Európában). A HIV-1 fertőzött személyek rövid, kezdetben akut, influenzaszerű megbetegedést tapasztalhatnak, amelyhez a perifériás vérben magas szintű virémia társul a fertőzéstől számított 3-6. hét múlva. 1 Jelenleg a HIV-1 két fő genetikai csoportja ismert: M csoport (main, fő) és O csoport (outlier, kívülálló). Az M csoport a legelterjedtebb, és 10 szubtípusa található meg világszerte. 2 A HIV-1 fertőzés széleskörű előfordulásával szemben a HIV-2 fertőzés elsősorban Nyugat-Afrikára korlátozódik, valamint az annak területén zajló vagy áthaladó népességmozgásokat érinti. 2 A HIV-2 nemi úton kisebb mértékben terjed, mint a HIV-1. Ennek oka a fertőzés korai és késői szakaszában fennálló alacsonyabb vírusszint lehet. A HIV-2 a betegség késői szakaszában is (a vírusszint megemelkedésének időszakában) lassabban fejlődik, mint a HIV-1. Részben ezek az okok magyarázhatják a HIV-2 korlátozott terjedését a világban, szemben a HIV-1- gyel. 3 A HCV-t tartják a poszttranszfúziós non-a, non-b hepatitis esetek 90% 95%-áért felelős fő fertőző ágensnek. 4,5 A HCV világszerte előfordul, de elterjedtsége a fertőzés általános tünetmentessége miatt kevéssé ismert. Akárhogy is, a jelentett elterjedése a nyugat-európai 0,5 2,0%-tól az egyiptomi 20%-ig változhat. A HBV az akut és krónikus hepatitis, májcirrózis és hepatocelluláris karcinóma egyik fő fertőző ágense. 6,7,8 Világszerte nagyjából 350 millió ember krónikus hordozója a vírusnak, főleg a magas prevalenciájú területeken. 9 A HBV világszintű elterjedési gyakorisága Nyugat-Európában és az Egyesült Államokban < 2%, de Ázsia és Afrika országaiban > 8% is lehet. 10 A szerológiai szűrővizsgálatok jelentősen csökkentették, de nem számolták fel a vírusfertőzések vér és vérkészítmények transzfúziójával történő átvitelének kockázatát. A donoroktól levett teljes vér és 1
plazma HBV szűrését az 1970-es évek elején kezdték meg HBsAg vizsgálattal. A HBV-szűrésen kívül rutinszerűen végzik a vér és plazma HIV-1, HIV-2 és anti-hcv szűrését enzim immunoassay (EIA) vizsgálatokkal. A transzfúziós készítmények fertőző ágensekre történő magasabb szintű szűrésére támasztott közigény előmozdította a nukleinsav-vizsgálati (nucleic acid test, NAT) technológiák fejlődését. Klinikai vizsgálatok szerint a vírusnukleinsavak (HIV-1 RNS 11-13, HCV RNS 4,12-15 és HBV DNS 16-19 ) kimutatása tovább csökkentheti az ágensek ablakperiódus alatti véradásból eredő átvitel kockázatát. Az ablakperiódust átlagosan 22 napra becsülik, de a HIV-1 esetében akár 6 hónap is lehet. 20 A HIV-1 kis csoportos minta (mini-pool) NAT vizsgálat kivitelezésével a fertőző ablakperiódus jelentősen lerövidíthető, így a HIV-1 átvitelének jelenlegi kockázatát hozzávetőleg 1-re becsülik 2 millió véradásból. 12-14 Hasonlóan, a HCV RNS NAT bevezetése az antitest negatív ablakperiódust körülbelül 60 napra csökkentette 12-15, a jelenlegi becsült kockázat hozzávetőleg 1 millió véradásból 1 2. A HBV DNS NAT szűrést még nem végzik rutinszerűen, jóllehet, a NAT szűrés tovább csökkenthetné a HBV transzfúziós átvitelének kockázatát. 14,18,19,21 A többszörös target vizsgálatok hatásfokának javítása érdekében a többféle vírus egyidejű kimutatására egy multiplex (MPX) polimeráz láncreakciót (PCR) fejlesztettek ki. A MPX PCR folyamán egy reakciócsőben egynél több targetszekvencia amplifikálása és kimutatása zajlik többféle primerpár és próba segítségével. A cobas TaqScreen MPX teszt egy minőségi multiplex vizsgálat, amely lehetővé teszi a HIV-1 M és O csoport RNS, HIV-2 RNS, HCV RNS és HBV DNS egyidejű szűrését és kimutatását fertőzött csoportos és egyéni plazmamintákból. A cobas TaqScreen MPX teszt általános nukleinsavelőkészítési eljárást alkalmaz a COBAS AmpliPrep készüléken. HIV-1 M és O csoport RNS, HIV-2 RNS, HCV RNS és HBV DNS amplifikációja és kimutatása automatizált, valós idejű PCR eljárással történik a COBAS TaqMan analizátoron. A vizsgálat a teljesítmény monitorozására minden egyes vizsgálat során egy belső kontrollt foglal magába, valamint a megelőzően amplifikált anyag (amplikon) által okozott potenciális szennyezés csökkentésére AmpErase (uracil-n-glikoziláz) enzimet alkalmaz. A cobas TaqScreen MPX teszt nem különbözteti meg, hogy melyik vírus mutatható ki a mintából. A HIV-1 M csoport, HCV és HBV megkülönböztető vizsgálatára a COBAS AmpliScreen HIV-1 teszt, v1.5, a COBAS AmpliScreen HCV teszt, v2.0 és a COBAS AmpliScreen HBV teszt áll rendelkezésre. HIV-1 O csoport és HIV-2 megkülönböztetésére alkalmas teszt nem áll rendelkezésre a Roche-tól. AZ ELJÁRÁS ALAPELVEI A cobas TaqScreen MPX teszt cobas s 201 rendszeren való használatra 4 fő eljáráson alapul: 1. Automatizált mintacsoportosítás és kontrollpipettázás HAMILTON Microlab STAR IVD pipettorkészülékkel 2. Automatizált minta-előkészítés COBAS AmpliPrep készülékkel 3. Nukleinsavak automatizált amplifikációja és PCR termékek valósidejű kimutatása a COBAS TaqMan analizátorral 4. Automatizált adatkezelés az csoportosító és adatkezelő (Pooling and Data Management, PDM) szoftverrel Automatizált mintacsoportosítás és pipettázás a HAMILTON Microlab STAR IVD pipettorral A HAMILTON Microlab STAR IVD pipettor automatizálja az egyéni donorminták pipettázását, a többszörös donorminták csoportosítását, a részletek átvitelét a mély lyukú lemezekre és a vizsgálati kontrollok pipettázását. A cobas s 201 rendszer a reaktív csoportokat visszabontja egyéni összetételű mintaeredményekké. A cobas s 201 rendszert a minták tételekben történő feldolgozására tervezték. Egy tétel meghatározása a minták és kontrollok olyan gyűjteménye, amelyek pipettázása, kivonása, amplifikációja és kimutatása egyszerre zajlik. Egy tétel pipettázását követően a HAMILTON Microlab STAR IVD pipettorral az egész mintaállvány a COBAS AmpliPrep készülékbe kerül az eljárás következő lépésének elvégzésére. Automatizált minta-előkészítés a COBAS AmpliPrep készülékkel A targetből és a hozzáadott armored RNS belső kontroll (internal control, IC) molekulákból (amely a minta-előkészítési és amplifikációs/kimutatási eljárás során kontrollként szolgál) származó nukleinsavak feldolgozása egyszerre zajlik. A cobas TaqScreen MPX teszt reagensei segítségével öt egymást követő lépés megy végbe a COBAS AmpliPrep készüléken. A proteázoldat a fehérjék emésztésével elősegíti a lízist, inaktiválja a nukleázokat és lehetővé teszi az RNS és DNS 2
felszabadítását a vírusrészecskékből. A lízisreagens hozzáadása a vírusok lízisét és a nukleázok inaktiválását eredményezi a fehérjék denaturálása által a mintában. Az RNS és DNS felszabadul és egyidejűleg védve van a nukleázok hatásától. A felszabadult nukleinsavak a hozzáadott mágneses üvegpartikulumok szilikonfelületéhez kötnek. Ez elsősorban az üvegpartikulumok felszínének nettó pozitív töltése és a nukleinsavak nettó negatív töltése miatt következik be a kaotróp sókoncentráció alatt és a lízisreakció ionerőssége miatt. A mosóreagens eltávolítja a nem kötött anyagokat és a szennyeződéseket, mint denaturált fehérjék, sejttörmelék és lehetséges PCR inhibitorok (például hemoglobin stb.), valamint csökkenti a sókoncentrációt. A mágneses üvegpartikulumokról a tisztított nukleinsavakat emelt hőmérsékleten az eluáló puffer szabadítja fel. Nukleinsavak automatizált amplifikációja a COBAS TaqMan analizátor segítségével Az automatizált minta-előkészítés során a tisztított nukleinsavak humán plazmából történő izolálását követően a HIV-1 (M és O csoport), HIV-2 és HCV RNS, HBV DNS és IC RNS amplifikálása és kimutatása a cobas TaqScreen MPX master mix (MMX) segítségével történik. A mangán-acetátos aktiválást követően a cobas TaqScreen MPX master mix lehetővé teszi az RNS targetek reverz transzkripcióját, majd ezt követően a HIV-1 (M és O csoport), HIV-2 és HCV RNS, HBV DNS és IC RNS nagyfokban konzervált régióinak PCR amplifikációját specifikus primerekkel. Az amplifikált nukleinsavak párhuzamos kimutatása a master mixben ugyancsak jelenlevő HIV-1 (M és O csoport), HIV-2, HCV, HBV és IC-specifikus próbák 5'-nukleolitikus bontása során keletkező fluoreszcens jelek segítségével megy végbe. Két fluoreszcens festék használatos: az egyik festék az IC próbát jelöli, a másik pedig az összes targetspecifikus próbát, lehetővé téve ezáltal a vírustargetek többrétű, kombinált azonosítását, valamint az IC független azonosítását. Reverz transzkripció és PCR-amplifikálás A reverz transzkripciós és amplifikációs reakciókat egy hőstabil rekombináns enzim, a Z05 DNS-polimeráz végzi. Mangán (Mn 2+ ) jelenlétében a Z05 DNS-polimeráz reverz transzkriptáz és DNS-polimeráz aktivitással rendelkezik. Ez lehetővé teszi, hogy a reverz transzkripció és a PCRamplifikálás ugyanazon reakcióelegyben menjen végbe. A PCR-amplifikálás a Z05 DNS-polimeráz segítségével megy végbe, amely a targettemplátok mentén meghosszabbítja a kapcsolódott primereket és duplaszálú DNS-t (amplikon) hoz létre. Ez a folyamat sok cikluson keresztül ismétlődik, és az amplikon DNS mennyisége minden ciklus során megduplázódik. Az targetgenomok amplifikálása csak a primerek közötti régiókban zajlik; a teljes genom nem amplifikálódik. Szelektív amplifikálás A mintában található targetnukleinsav szelektív amplifikálását a cobas TaqScreen MPX teszt az AmpErase (uracil-n-glikoziláz) enzim és dezoxiuridin-trifoszfát (dutp) használatával hajtja végre. Az AmpErase (uracil-n-glikoziláz) enzim felismeri és katalizálja az olyan DNS-szálak lebontását, amelyek dezoxiuridint tartalmaznak 22, a dezoxitimidint tartalmazó DNS-ét és a ribouridint tartalmazó RNS-ét viszont nem 23,24. A dezoxiuridin a természetes DNS-ben nincs jelen, ugyanakkor az amplikonokban mindig megtalálható, miután a master mix reagens a dntp-k egyikeként dezoxiuridintrifoszfátot használ timidin-trifoszfáttal, tehát csak az amplikonok tartalmaznak dezoxiuridint. A dezoxiuridin lehetővé teszi, hogy az AmpErase (uracil-n-glikoziláz) enzim a szennyező amplikont még a target DNS amplifikálását megelőzően lebontsa. Az AmpErase (uracil-n-glikoziláz) enzim lebont továbbá minden olyan nem specifikus terméket, amely a master mix kezdeti, mangán okozta aktiválódása után képződik. A master mix reagensben lévő AmpErase (uracil-n-glikoziláz) enzim katalizálja a dezoxiuridint tartalmazó DNS hasítását a dezoxiuridin-csoportoknál úgy, hogy a dezoxiribóz lánc felnyílását okozza a C1 helyen. Az első hevítési lépésben az amplikon DNS-lánc eltörik a dezoxiuridin helyén, tehát a DNS nem lesz amplifikálható. Az AmpErase (uracil-n-glikoziláz) enzim, ha egyszer 55 ºC feletti hőmérsékletnek lett kitéve, hosszabb ideig inaktív marad, ezért nem bontja le a PCR után előállt targetamplikont. 3
A PCR-termékek valósidejű automatizált kimutatása a COBAS TaqMan analizátor segítségével A PCR-amplifikálás ciklusai során a váltakozó magas hőmérsékleten a target- és IC-amplikon denaturálódik, és egyszálú DNS-molekula keletkezik. A specifikus kimutatási oligonukleotid próbák az amplifikált DNS egyszálú molekuláihoz hibridizálnak. Az amplifikálás, hibridizáció és kimutatás egymással egyidőben zajlik. A PCR-termékek kimutatása 25,26 A cobas TaqScreen MPX MMX a HIV-1 (M és O csoport), HIV-2, HCV, HBV, illetve IC nukleinsavra specifikus kimutatási próbákat tartalmaz. Mindegyik kimutatási próba jelölve van 1) a kettő közül egy, jelzőfestékként viselkedő, és 2) egy másik, blokkolófestékként viselkedő fluoreszcens festékkel. Az egyik specifikus jelzőfesték a vírusspecifikus próbákhoz kapcsolódik és egy meghatározott hullámhosszon lehet kimutatni. Egy másik jelzőfesték pedig az IC-specifikus próbához kapcsolódik és kimutatása egy eltérő hullámhosszon történik. Minden próba esetében egyféle blokkolófesték használatos. A rendszer lehetővé teszi, hogy az összes amplifikált vírustarget egy hullámhosszon, az amplifikált IC nukleinsav pedig egy másik hullámhosszon legyen kimutatható. A PCR-amplifikálás kezdete előtt a próbák még érintetlenek, és a blokkoló festék a jelzőfesték fluoreszcenciáját Förster-típusú energiatranszfer-effektus révén gátolja. A PCR-amplifikálás során a próbák a specifikus, egyszálú DNS-szekvenciákhoz hibridizálnak, amit az amplifikálással egyidőben a Z05 DNS-polimeráz 5' - 3' nukleáz aktivitása révén hasít. Amint a hasítás következtében a jelző- és a gátlófesték elválik, a jelzőfesték fluoreszcens aktivitásának gátlása megszűnik. Minden egyes PCR-ciklus során megnő a hasított próbák mennyisége, és ennek velejárójaként növekszik a jelzőfestékből származó jel összesített nagysága is. A PCR-termékek valós idejű kimutatása a felszabadult, vírustargeteket és IC-t egymástól függetlenül reprezentáló jelzőfestékek fluoreszcencenciájának mérésével megy végbe. Automatizált adatkezelés a PDM segítségével A Roche PDM adatkezelő lehetővé teszi, hogy a felhasználó áttekintse az eredményeket és jelentést készítsen. A Roche PDM adatkezelő minden vizsgálati eredményt nem reaktív, reaktív vagy érvénytelen jelöléssel lát el. A PCR-eredmények lekérésén és vizsgálatán felül a Roche PDM adatkezelő szoftver lehetővé teszi, hogy az üzemeltető a jelentéseket visszakeresés és tanulmányozás céljából kinyomtassa, az eredmények között keressen, a donoreredményeket elfogadja, illetve egy LIS kiszolgálóra továbbítsa. 4
A ROCHE ÁLTAL BIZTOSÍTOTT ANYAGOK A HIV-1 (M és O csoport), HIV-2, valamint HCV RNS és HBV DNS kimutatására három készlet szükséges és áll rendelkezésre: 1) cobas TaqScreen MPX teszt, 2) cobas TaqScreen MPX kontrollkészlet és 3) cobas TaqScreen mosóreagens. Az anyagok biztonsági adatlapjai (MSDS) igény esetén hozzáférhetőek a helyi Roche irodában. cobas TaqScreen MPX Test (P/N: 04584244 190) MPX CS1 (MPX mágneses üvegpartikulum-reagens kazetta) MPX CS2 (MPX lízisreagens kazetta) MPX CS3 (MPX multireagens kazetta) MPX CS4 (MPX tesztspecifikus reagens kazetta) cobas TaqScreen MPX Control Kit cobas TaqScreen MPX kontrollkészlet (P/N: 04626290 190) HIV-1 M (+) C (HIV-1 M pozitív kontroll) HIV-1 O (+) C (HIV-1 O pozitív kontroll) HIV-2 (+) C (HIV-2 pozitív kontroll) HCV (+) C (HCV pozitív kontroll) HBV (+) C (HBV pozitív kontroll) MPX MPX CTL 96 teszt 6 szett TS ( ) C [cobas TaqScreen negatív kontroll (humán plazma)] cobas TaqScreen Wash Reagent cobas TaqScreen mosóreagens (P/N: 04404220 190) TS WR (cobas TaqScreen mosóreagens) TS WR 5,1 l EGYÉB SZÜKSÉGES, DE KÜLÖN ÁRUSÍTOTT ANYAGOK (A ROCHE-TÓL KÜLÖN VÁSÁROLHATÓ) A vizsgálatot a cobas s 201 rendszeren kell végezni. A cobas s 201 rendszert egy komplett rendszer-konfigurációként kell telepíteni és használni. A cobas s 201 rendszer egyes komponensei nem használhatóak különálló készülékekként, és más komponensek sem helyettesíthetőek. A cobas s 201 rendszer az alábbi komponenseket használja fel. 5
Műszerezettség és szoftver a cobas s 201 rendszerhez HAMILTON Microlab STAR IVD pipettor, mintacsoport-kezelő munkaállomás és szoftver COBAS AmpliPrep készülék COBAS TaqMan analizátor AMPLILINK adatállomás és szoftver Roche PDM adatkezelő szerver, adatkezelő munkaállomás és szoftver Állványok és egyszer használatos anyagok COBAS AmpliPrep mintaállványok (SK24) (P/N: 28122172001) COBAS AmpliPrep SPU-állványok (P/N: 28122806001) COBAS AmpliPrep reagensállványok (P/N: 28122199001) Mintafeldolgozó egységek (SPU): (P/N: 03755525001) Mintabeviteli csövek (S-csövek) vonalkódklipszekkel (P/N: 03137040001) K-hegy-állványok (P/N: 03287343001) K-cső-doboz 12 x 96 (P/N: 03137082001) COBAS TaqMan K-hordozó (P/N: 28150397001) Nagytérfogatú CO-RE hegyek (1000 µl), filter (P/N: 04639642001) Mély lyukú lemezek vonalkódcímkékkel (P/N: 04639634001) Mély lyukú lemezek zárótetejei (P/N: 04789288001) Mintahordozó 24 vizsgálati cső számára (P/N: 04639502001) Mintahordozó 32 vizsgálati cső számára (P/N: 04639529001) Hegyhordozó (P/N: 04639545001) Mély lyukú lemez-hordozó (P/N: 04639553001) SK24 állvány-hordozó (P/N: 04639600001) Microcide SQ vagy HAMILTON fertőtlenítő spray (P/N: 04864425001) Egyszer használatos kesztyűk, púdermentes REAGENSEK cobas TaqScreen MPX Test (P/N: 04584252 190) MPX CS1 MGP (mágneses üvegpartikulumok) mágneses üvegpartikulumok 93% izopropanol Xi 93% (w/w) izopropanol MPX 96 teszt 2 x 48 teszt 2 x 7,0 ml Irritatív F 93% (w/w) izopropanol Igen tűzveszélyes 6
MPX CS2 LYS (lízisreagens) nátrium-citrát-dihidrát 42,5% guanidin-tiocianát < 14% polidokanol 0,9% ditiotreitol Xi 42,5% (w/w) guanidin-tiocianát 2 x 48 teszt 2 x 78 ml Ártalmas MPX CS3 Pase (proteináz oldat) trisz puffer < 0,05% EDTA kalcium-klorid kalcium-acetát 7,8% proteináz glicerin Xn 7,8% (w/w) proteináz 2 x 48 teszt 2 x 3,8 ml Ártalmas EB (eluáló puffer) trisz puffer 0,2% metilparabén tartósítószer MPX CS4 MPX MMX-R1 (MPX master mix reagens 1) trisz puffer kálium-acetát glicerin mangán-acetát betain 0,08% nátrium-azid MPX MMX-R2 (MPX master mix reagens 2) tricin puffer kálium-klorid kálium-hidroxid < 21% dimetil-szulfoxid glicerin EDTA Tween 20 Igepal CA630 < 0,09% datp, dgtp, dctp, dutp, dttp < 0,01% upstream és downstream HIV-1 M csoport, HIV-1 O csoport, HIV-2, HCV, HBV primerek < 0,01% fluoreszcens-jelölt HIV-1, HIV-2, HCV, HBV próbák < 0,01% fluoreszcens-jelölt belső kontroll próba < 0,01% oligonukleotid aptamer < 0,07% Z05 DNS-polimeráz (mikrobiális) < 0,4% AmpErase [uracil-n-glikoziláz] enzim (mikrobiális) 0,08% nátrium-azid 2 x 7,0 ml 2 x 48 teszt 2 x 3,0 ml 2 x 2,5 ml 7
MPX IC (MPX belső kontroll) trisz puffer 0,002% poli ra RNS (szintetikus) EDTA 0,05% nátrium-azid < 0,001% nem fertőző, szintetikus belső kontroll RNS, MS2 bakteriofág burokfehérjébe csomagolva 2 x 15 ml cobas TaqScreen MPX Control Kit cobas TaqScreen MPX kontrollkészlet (P/N: 04626290 190) MPX CTL 6 szett HIV-1 M (+) C (HIV-1 M pozitív kontroll) < 0,001% nem fertőző, szintetikus HIV-1 M csoportú RNS, MS2 bakteriofág burokfehérjébe csomagolva Negatív humán plazma, engedélyezett tesztek alapján nem reaktív HCV antitestre, HIV-1/2 antitestre és HBsAg-re; HIV-1 RNS, HIV-2 RNS, HCV RNS és HBV DNS PCR-technikákkal nem mutatható ki 0,1% ProClin 300 tartósítószer Xi (3:1) 5-klór-2-metil-2H-izotiazol-3-on és 2-metil-2H-izotiazol-3-on keveréke 6 x 1,6 ml Irritatív R43: Bőrrel érintkezve túlérzékenységet okozhat. HIV-1 O (+) C (HIV-1 O pozitív kontroll) < 0,001% nem fertőző, szintetikus HIV-1 O csoportú RNS, MS2 bakteriofág burokfehérjébe csomagolva. Negatív humán plazma, engedélyezett tesztek alapján nem reaktív HCV antitestre, HIV-1/2 antitestre és HBsAg-re; HIV-1 RNS, HIV-2 RNS, HCV RNS és HBV DNS PCR-technikákkal nem mutatható ki 0,1% ProClin 300 tartósítószer Xi (3:1) 5-klór-2-metil-2H-izotiazol-3-on és 2-metil-2H-izotiazol-3-on keveréke 6 x 1,6 ml Irritatív R43: Bőrrel érintkezve túlérzékenységet okozhat. HIV-2 (+) C (HIV-2 pozitív kontroll) < 0,001% nem fertőző, szintetikus HIV-2 RNS, MS2 bakteriofág burokfehérjébe csomagolva Negatív humán plazma, engedélyezett tesztek alapján nem reaktív HCV antitestre, HIV-1/2 antitestre és HBsAg-re; HIV-1 RNS, HIV-2 RNS, HCV RNS és HBV DNS PCR-technikákkal nem mutatható ki 0,1% ProClin 300 tartósítószer Xi (3:1) 5-klór-2-metil-2H-izotiazol-3-on és 2-metil-2H-izotiazol-3-on keveréke 6 x 1,6 ml Irritatív R43: Bőrrel érintkezve túlérzékenységet okozhat. 8
HCV (+) C (HCV pozitív kontroll) < 0,001% nem fertőző, szintetikus HCV RNS, MS2 bakteriofág burokfehérjébe csomagolva Negatív humán plazma, engedélyezett tesztek alapján nem reaktív HCV antitestre, HIV-1/2 antitestre és HBsAg-re; HIV-1 RNS, HIV-2 RNS, HCV RNS és HBV DNS PCR-technikákkal nem mutatható ki 0,1% ProClin 300 tartósítószer Xi (3:1) 5-klór-2-metil-2H-izotiazol-3-on és 2-metil-2H-izotiazol-3-on keveréke 6 x 1,6 ml Irritatív R43: Bőrrel érintkezve túlérzékenységet okozhat. HBV (+) C (HBV pozitív kontroll) 0,001% nem fertőző, szintetikus HBV DNS, lambda bakteriofág burokfehérjébe csomagolva Negatív humán plazma, engedélyezett tesztek alapján nem reaktív HCV antitestre, HIV-1/2 antitestre és HBsAg-re; HIV-1 RNS, HIV-2 RNS, HCV RNS és HBV DNS PCR-technikákkal nem mutatható ki 0,1% ProClin 300 tartósítószer Xi (3:1) 5-klór-2-metil-2H-izotiazol-3-on és 2-metil-2H-izotiazol-3-on keveréke 6 x 1,6 ml Irritatív R43: Bőrrel érintkezve túlérzékenységet okozhat. TS ( ) C [cobas TaqScreen negatív kontroll (humán plazma)] Negatív humán plazma, engedélyezett tesztek alapján nem reaktív HCV antitestre, HIV-1/2 antitestre és HBsAg-re; HIV-1 RNS, HIV-2 RNS, HCV RNS és HBV DNS PCR-technikákkal nem mutatható ki 0,1% ProClin 300 tartósítószer Xi (3:1) 5-klór-2-metil-2H-izotiazol-3-on és 2-metil-2H-izotiazol-3-on keveréke 6 x 1,6 ml Irritatív R43: Bőrrel érintkezve túlérzékenységet okozhat. cobas TaqScreen Wash Reagent cobas TaqScreen mosóreagens (P/N: 04404220 190) TS WR (cobas TaqScreen mosóreagens nátrium-citrát-dihidrát 0,1% metilparabén tartósítószer TS WR 5,1 l 9
TÁROLÁSI ÉS KEZELÉSI KÖVETELMÉNYEK A. A szobahőmérséklet meghatározása 15 30 C. B. A reagenseket és kontrollokat ne fagyassza le. C. A MPX CS1, MPX CS2, MPX CS3 és MPX CS4 reagenseket 2 és 8 C között tárolja. Használaton kívül ezek a reagensek a feltüntetett lejárati időn belül stabilak. D. Felbontást követően a reagensek 2 8 C-on 30 napig, illetve a lejárati dátumig stabil, amelyik előbb következik. E. A reagenseket a COBAS AmpliPrep készüléken legfeljebb 6 vizsgálati futtatás alakalmával, legfeljebb 40 összesített órán át lehet felhasználni. A futtatások között a reagenseket 2 és 8 C között tárolja. F. A COBAS AmpliPrep készülékben a reagensek egyhuzamban összesen 24 órán keresztül maradnak stabilak. G. A HIV-1 M (+) C, HIV-1 O (+) C, HIV-2 (+) C, HCV (+) C, HBV (+) C és TS ( ) C reagenseket 2 és 8 C között tárolja. A kontrollok a feltüntetett lejárati időn belül stabilak. Felbontást követően a fel nem használt részt ki kell dobni. H. A TS WR reagenst 15 és 30 C között tárolja. Felbontás nélkül a TS WR reagens a feltüntetett lejárati időn belül stabil. Felbontást követően ez a reagens 15 és 30 C között 30 napig illetve a lejárati dátumig stabil, amelyik előbb következik. ÓVINTÉZKEDÉSEK IN VITRO DIAGNOSZTIKAI CÉLRA. A. A minták fertőzőek lehetnek. A vizsgálat kivitelezése során alkalmazza az általános érvényű óvintézkedéseket. 27,28 Csak a cobas TaqScreen MPX rendszer használatában jártas és a fertőző anyagok kezelésében képzett személy végezheti ezt az eljárást. Gondosan tisztítson meg, és desztillált vagy ioncserélt vízből frissen készített 0,5% nátrium-hipoklorit oldattal fertőtlenítsen minden laboratóriumi munkafelületet. Ezután törölje át 70%-os etanollal a felületet. B. FIGYELMEZTETÉS: A HIV-1 M (+) C, HIV-1 O (+) C, HIV-2 (+) C, HCV (+) C, HBV (+) C és TS ( ) C reagensek emberi vérből származó humán plazmát tartalmaznak. A forrásanyag tesztekkel vizsgálva nem bizonyult reaktívnak HIV-1/2 antitestre, HCV antitestre és HBsAg-re. A forrásanyagot a cobas TaqScreen MPX teszttel is vizsgálták. A negatív humán plazma PCR-technikákkal történő vizsgálata során HIV-1 (M és O csoprt) RNS, HIV- 2 RNS, HCV RNS vagy HBV DNS nem volt kimutatható. Egyetlen ismert vizsgálati módszer sem nyújthat teljes garanciát arra, hogy a humán vérkészítményekben nincs jelen fertőző anyag. Minden humán vér eredetű anyagot potenciálisan fertőzőnek kell tekinteni, és az általános érvényű óvintézkedések betartásával kezelni. Kiömlés esetén azt azonnal fertőtlenítse frissen készített 0,5%-os nátrium-hipoklorit oldattal (hígított fehérítőszer), illetve kövesse a megfelelő helyszíni eljárásokat. C. Alkalmazza a szokásos laboratóriumi óvintézkedéseket. Ne pipettázzon szájjal. Ne egyen, igyon vagy dohányozzon a kijelölt munka területen. Viseljen egyszer használatos kesztyűt, köpenyt és szemvédőt a minták és a készlet reagenseinek kezelése közben. A minták és tesztreagensek kezelését követően gondosan mosson kezet. D. Az MPX MMX-R1, MPX MMX-R2 és MPX IC reagensek tartósítószerként nátrium-azidot tartalmaznak. Ne használjon fém vezetékezést a reagenstranszferhez. Amennyiben azidot tartalmazó oldatot önt a vízvezeték-hálózatba, hígítsa azt fel, és öblítse le nagy mennyiségű folyóvízzel. Ezek az óvintézkedések arra szolgálnak, hogy elkerülje az üledék lerakódását a fém csővezetékben, ahol azáltal robbanásra alkalmas körülmények alakulhatnak ki. E. A heparinról kimutatták, hogy gátolja a PCR-t. Az eljáráshoz ne használjon heparinos plazmát. F. Steril, egyszer használatos pipetták és nukleázmentes pipettahegyek használata javasolt. Álpozitív eredmények fordulhatnak elő, ha nem ügyel a minták keresztszennyeződésének elkerülésére a mintakezelés és -feldolgozás során. 10
G. Az optimális vizsgálati feltételek biztosítása érdekében csak a szállított vagy az előírtan szükséges egyszer használatos eszközöket alkalmazza. H. A minták és kontrollok keresztszennyeződésének elkerülésére kezeljen minden mintát és kontroll tartalmazó anyagot a helyes laboratóriumi gyakorlat (GLP) szerint. I. Felhasználás előtt szemmel ellenőrizzen minden reagenskazettát, kontrollcsövet és mosóreagenst, hogy nem tapasztal-e szivárgásra utaló jeleket. Szivárgás esetén azt az anyagot ne használja fel a vizsgálathoz. J. Minden anyagot, amely mintákkal vagy reagensekkel kapcsolatba került, az országos, szövetségi, állami és helyi szabályozások szerint semmisítsen meg. K. A cobas TaqScreen MPX tesztkészletet, cobas TaqScreen MPX kontrollkészletet, illetve a cobas TaqScreen mosóreagenst a lejárati idő után ne használja fel. A különböző készletekből származó, illetve eltérő tételszámú reagensek felcserélése, összekeverése vagy kombinálása tilos. Ne töltsön kevert tételszámú reagenseket a COBAS AmpliPrep készülékbe. L. Az anyagok biztonsági adatlapjai (MSDS) igény esetén hozzáférhetőek a helyi Roche irodában. M. Kerülje a reagensek bőrrel, szemmel vagy nyálkahártyákkal való érintkezését. Ha érintkezés mégis bekövetkezik, azonnal mossa le nagy mennyiségű vízzel, ellenkező esetben égési sérülést okozhat. Ha ezek a reagensek kiömlenek, feltörlés előtt hígítsa fel azokat vízzel. Ne engedje, hogy a LYS reagens, amely guanidin-tiocianátot tartalmaz, nátrium-hipoklorit (fehérítőszer) oldattal érintkezzen. Az ilyen keverékből erősen mérgező gáz fejlődhet. N. A vizsgálat helyes kivitelezésének biztosítása végett szigorúan tartsa be a megadott eljárásokat és irányelveket. A megadott eljárásoktól és irányelvektől való bármilyen eltérés befolyásolhatja a vizsgálat teljesítményét. O. Ne használjon nagymértékben hemolizált mintákat. P. A plazmaminták vörösvértest-szennyezettsége (> 2,5%) gátolhatja a cobas TaqScreen MPX vizsgálatot. Q. A vizsgálat egyik szakaszában se használjon sérült vonalkódú összetevőket. REAGENSEK ELŐKÉSZÍTÉSE A. Használat előtt 30 percig hagyja, hogy a cobas TaqScreen MPX kontrollkészlet felvegye a szobahőmérsékletet. A cobas TaqScreen MPX teszt reagenseit hagyja 30 percen át a COBAS AmpliPrep készülékben, hogy felvegyék a szobahőmérsékletet. 11
MINTAVÉTEL, -TÁROLÁS ÉS -CSOPORTOSÍTÁS Megjegyzés: Valamennyi mintát fertőző ágensként kell kezelni. A. EDTA, CPD, CPDA1, CP2D, ACDA és 4% nátrium-citrát antikoagulánssal levett plazmaminták dolgozhatóak fel a cobas TaqScreen MPX teszttel. Kövesse a mintacső gyártójának utasításait. B. Az EDTA-s vér minták 2 30 C-on a levételtől számított legfeljebb 72 óráig, 2 8 C-on további két napig tárolhatóak. Öt napnál hosszabb tároláshoz távolítsa el a plazmát a vörösvértestekről centrifugálással (800 1600 g, 20 perc). Eltávolítást követően a plazma 2 8 C-on még további hét napig tárolható. A plazma hosszabb időn át való tárolására -18 C-on van lehetőség. Az EDTA-s plazma legfeljebb három (3) alkalommal fagyasztható le és olvasztható fel. 30 2 30 ºC EDTA véralvadásgátló Hőmérséklet ( o C) 20 10 0 Teljes vér 2 8 ºC Plazma 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 Levételt követő napok C. A CPD, CPDA1 vagy CP2D antikoagulánssal levett minták a plazma elválasztását megelőzően 2 30 C-on, legfeljebb 72 órán tárolhatóak. A CPD, CPDA1 vagy CP2D tartalmú minták centrifugálását (800 1600 x g, 20 perc) követően a plazma 2 8 C-on további hét napig tárolható. A vörösvértestektől elválasztott plazma hosszabb időn át való tárolására -18 C-on van lehetőség. A CPD, CPDA1 és CP2D tartalmú plazma legfeljebb három (3) alkalommal fagyasztható le és olvasztható fel. 30 2 30 ºC CPD, CPDA1 vagy CP2D véralvadásgátló Hőmérséklet ( o C) 20 10 0 Teljes vér 2 8 ºC Plazma 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 Levételt követő napok D. Az ACDA vagy 4% nátrium-citrát antikoagulánst tartalmazó elválasztott plazma a levételt követően 2 30 C-on, legfeljebb 72 órán át tárolható. Az elválasztott plazma hosszabb időn át való tárolására -18 C-on van lehetőség. E. A következő, plazmatérfogatokra vonatkozó előírások 13 x 100 mm-es üveg vagy műanyag donorcsövekből HAMILTON Microlab STAR IVD pipettorral történő pipettázásra alapulnak. A felsorolt térfogatok a leülepedett vörösvérsejtek tetejéről vett plazmára vonatkoznak és a cobas TaqScreen MPX teszt futtatásakor alkalmazandóak. Csoporttípus Legkisebb plazmatérfogat Elsődleges csoport * 3 ml Ismételt csoport 1,5 ml Visszabontási csoport 2 ml *Mély lyukú lemezt használva (könyvtárlemez) 12
F. A teljes vért nem szabad lefagyasztani. G. A heparinról kimutatták, hogy gátolja a PCR-t. Heparinozott plazma használata nem ajánlott. H. A lefedett mély lyukú lemezek 2 8 C-on legfeljebb hét napig tárolhatóak attól az időponttól számítva, amikor a plazmát a vörösvértestekről eltávolították. Hosszabb időn át való tárolásukra -18 C-on van lehetőség. I. Háromszori fagyasztás-olvasztás ciklusnak kitett plazmaminták esetében a vizsgálatra gyakorolt semmiféle nemkívánatos hatást nem figyeltek meg. J. Hagyja, hogy az csoportosított vagy egyéni donorminták felhasználás előtt felvegyék a szobahőmérsékletet. K. Eltérő gyűjtési és tárolási feltételeket a felhasználónak validálnia kell. Amennyiben a mintákat szállítani kell, akkor azokat a minták és kóroki ágensek transzportjára vonatkozó alkalmazandó szövetségi és nemzetközi előírásoknak megfelelően kell csomagolni és felcímkézni. 29 L. Álpozitív eredmények fordulhatnak elő a minták keresztszennyeződéséből adódóan, ha azok nem voltak megfelelően kontrollálva a mintakezelés és -feldolgozás során. MINTACSOPORTOSÍTÁS ÉS -PIPETTÁZÁS 1. A cobas s 201 rendszer a HAMILTON Microlab STAR IVD pipettort használja minden pipettázási és csoportosítási tevékenységhez. A HAMILTON Microlab STAR IVD pipettor elvégzi a vonalkód leolvasási és csoportosítási műveleteket, minek során a mintatérfogatok egyenlő részleteiből csoportokat hoz létre. 2. Ha a cobas TaqScreen MPX teszt reaktív csoportot mutat kit, a HAMILTON Microlab STAR IVD pipettor pipettázza az egyéni mintákat a mély lyukú lemezekből vagy eredeti mintacsövekből az visszabontási vizsgálathoz. ELJÁRÁSSAL KAPCSOLATOS MEGJEGYZÉSEK A. Felszerelés 1. A használathoz készítse elő a cobas s 201 rendszert a cobas s 201 rendszer felhasználói kézikönyv utasításainak megfelelően. 2. A helyes működés érdekében végezze el a javasolt karbantartást a készülékeken. B. Reagensek 1. Felhasználás előtt a cobas TaqScreen MPX teszt reagenseit hagyja 30 percen át a COBAS AmpliPrep készülékben, hogy felvegyék a szobahőmérsékletet. A cobas TaqScreen MPX kontrollkészletnek és a cobas TaqScreen mosóreagensnek a felhasználáskor szobahőmérsékletűnek kell lennie. A reagensek tárolási körülményeire vonatkozóan tanulmányozza a Tárolási és kezelési követelmények fejezetet. 2. Valmennyi cobas TaqScreen MPX tesztkészlet összesen 96 vizsgálat elvégzéséhez elegendő reagenst tartalmaz. 3. Minden kontrollt csak egyszer lehet felhasználni. 4. A rendszer megakadályozza, hogy eltérő tételből származó reagenseket, a készülékben tölthető időt túllépő reagenseket, kevert reagenseket, illetve a négykazettás szettből olyan lejárt vagy kevert kazettákat használjon, amelyek használatára a rendszerben már előzőleg sor került. Ne töltsön kevert tételszámú reagenseket a COBAS AmpliPrep készülékbe. 13
C. Mintafeldolgozás 1. A minták és kontrollok kezelése során ügyeljen a kesztyűk szennyezésének elkerülésére. 2. Legyen óvatos, hogy elkerülje a minták és a TS ( ) kontroll szennyezését a pozitív kontrollal. D. Megkülönböztető vizsgálat 1. A megkülönböztető vizsgálatot megelőzően a mintát azonosítani kell egy érvényes csoporton belül és érvényes egyéni eredményt nyerni a cobas TaqScreen MPX teszt segítségével. Ez az egyéni reaktív minta a COBAS AmpliScreen HBV teszt, a COBAS AmpliScreen HCV teszt, v2.0 és a COBAS AmpliScreen HIV-1 teszt, v1.5 megkülönböztető vizsgálatokkal futtatható. További vizsgálatokra lehet szükség a HIV-1 O csoport és HIV-2 megkülönböztetésére. A Roche nem biztosít megkülönböztető teszteket a HIV-1 O csoport és HIV-2 vizsgálatára. 2. A megkülönböztető vizsgálati eljárásokra vonatkozóan tanulmányozza a COBAS AmpliScreen HBV teszt használati utasítását, a COBAS AmpliScreen HCV teszt, v2.0 használati utasítását és a COBAS AmpliScreen HIV-1 teszt, v1.5 használati utasítását. HASZNÁLATI UTASÍTÁS A cobas s 201 rendszer négy fő eljárást foglal magában: Minta és kontroll pipettázása a HAMILTON Microlab STAR IVD pipettorral, minta-előkészítés a COBAS AmpliPrep készüléken a cobas TaqScreen MPX teszttel, amplifikálás/detektálás a COBAS TaqMan analizátoron, valamint adatkezelés. Minden cobas TaqScreen MPX tesztkészlet nyolc kazettát tartalmaz: két MPX CS1 kazetta mágneses üvegpartikulumokkal, két MPX CS2 kazetta lízisreagenssel, két MPX CS3 kazetta proteázzal és eluáló pufferrel, valamint két MPX CS4 kazetta az IC-ral, MMX 1 és MMX 2 reagensekkel. A tesztkészletet a cobas TaqScreen MPX kontrollkészlettel és a cobas TaqScreen mosóreagenssel együtt kell használni. Ne nyissa ki a kazettákat. Ne öntsön össze különböző tételekből, vagy azonos tételből, de különböző flakonokból származó reagenseket. Ne keverje a különböző készletből származó reagenseket (a kazettákat se). Ne töltsön kevert tételszámú reagenseket a COBAS AmpliPrep készülékbe. Ne válassza le a kontrollcsöveket az adapterről. Végezzen el minden szükséges karbantartást a cobas s 201 rendszer felhasználói kézikönyv utasításait követve. Részletes használati útmutatás céljából tanulmányozza a cobas s 201 rendszer felhasználói kézikönyv utasításait. A. Kontrollok és minták pipettázása a HAMILTON Microlab STAR IVD pipettorral Megjegyzés: Megjegyzés: A minták és kontrollok előkészítése során ügyeljen a kesztyűk szennyezésének elkerülésére. Ne vortexelje a kontrollokat. 1. Helyezze üzembe a HAMILTON Microlab STAR IVD pipettort, majd a képernyőn megjelenő utasításokat követve indítsa el a Roche PDM csoportosítási varázslót. 2. Ügyeljen rá, hogy ne sértse meg a minták és kontrollok azonosító vonalkódját. 3. Távolítsa el a kontrollcsövek kupakját és helyezze a mintákat, fogyóeszközöket és kontrollokat a HAMILTON Microlab STAR IVD pipettorba. A minták, fogyóeszközök és kontrollok betöltése után a készülék átviszi a kontrollokat és mintákat az S-csövekbe. 4. A pipettázási folyamatot követően tekintse át a figyelmeztetéseket és nyomtassa ki a csoportosítási jelentés(eke)t. Ellenőrizze a csoportokat és mély lyukú lemezeket lyukait. Érvénytelenítse a csoportokat és/vagy lyukakat, ha vörösvértest-szennyeződést észlel, illetve a térfogatok nem egyenletesek. 14
5. Zárja le az S-csöveket, és vigye át az SK24 állvány(oka)t a COBAS AmpliPrep készülékbe a nukleinsav-kivonás lépésének elvégzésére. Az S-csövekben a beméréstől számítva minden vírustarget és kontroll 6 órán át marad stabil 30 C-on, és további 6 órán át 40 C-on. 6. Zárja le és tárolja a mély lyukú lemezeket (amennyiben lemezek készültek a pipettázási lépés során). A mély lyukú lemezekben tárolva minden vírustarget 7 napig őrzi meg stabilitását 2 8 C-on, illetve hosszabb időszakra -18 C-on. 7. Távolítsa el a tároló- és donorcsöveket. A feltételek végett tanulmányozza a Mintavétel, -tárolás és -csoportosítás fejezetet. 8. Távolítsa el és dobja ki a kontrollcsöveket. (A kontrollcsöveket csak egyszer lehet felhasználni.) B. A cobas TaqScreen MPX tesztreagensek előkészítése és betöltése Megjegyzés: Ügyeljen rá, hogy ne sértse meg a kazetták címkéit. A COBAS AmpliPrep készülék vonalkód leolvasója automatikusan leolvassa minden kazetta vonalkódcímkéjét a reagensállvány készülékbe történő betöltése folyamán. 1. A mintafeldolgozás megkezdése előtt a reagenseket hagyja 30 percen át a COBAS AmpliPrep készülékben. Nincs szükség egyéb reagens-előkészítési lépésre. 2. Az indítást megelőzően annyi kazettát kell betölteni, hogy elegendő legyen a feldolgozásra kerülő minták teljes számának befogadására a COBAS AmpliPrep készülék a folyamatos üzeme során. Mindegyik kazetta 48 vizsgálatra elegendő reagenst tartalmaz. A reagensek folyamatos üzem során való betöltéséről a cobas s 201 rendszer felhasználói kézikönyv vonatkozó fejezetében tájékozódhat. 3. Helyezze az MPX CS1 kazettát a reagensállványba úgy, hogy a kazetta vonalkódja egy vonalban legyen az állvány jobb oldalán található vonalkóddal. Az MPX CS1 kazettákat együtt, egy másik reagensállványon kell betölteni, mint a többi kazettát. 4. Helyezze be az MPX CS1 kazettákat tartalmazó reagensállványt a COBAS AmpliPrep készülék A állványpozíciójába, és csúsztassa be a tűvel való ütközésig, majd várjon, amíg a reagensállvány LED zöldre vált, mielőtt az állványt a készülék belsejében elhelyezkedő végső pozíciójába tolja. Ne töltsön kevert tételszámú reagenseket a készülékbe. 5. Helyezzen egy-egy szett MPX CS2, MPX CS3 és MPX CS4 kazettát mindegyik MPX CS1 kazetta számára a reagensállvány(ok)ba úgy, hogy a kazetta vonalkódja egy vonalban legyen az állvány jobb oldalán található vonalkóddal. 6. Helyezze be a reagensállvány(oka)t a COBAS AmpliPrep készülék B, C, D, illetve E állványpozíciójába, és csúsztassa be a tűvel való ütközésig, majd várjon, amíg a reagensállvány LED zöldre vált, mielőtt az állványt a készülék belsejében elhelyezkedő végső pozíciójába tolja. 7. A COBAS AmpliPrep készülék állapotsorán a LED-ek zöldre váltanak, ha minden szükséges készlet és összetevő a készülékben van és a készülék felismerte azokat. C. Nukleinsavak kivonása a pipettázott mintákból és kontrollokból Megjegyzés: Az alábbi lépéseket tiszta munkapadon végezze el. 1. Távolítsa el a mintafeldolgozó egység (SPU) celofán csomagolását, de ne nyúljon a kék szalaghoz. 2. Az SPU-állvány nagy füle a felhasználó felé nézzen. Illessze az SPU-kat az SPU-állvány jobb oldali legtávolabbi pozíciójába úgy, hogy a ROCHE jel az állvány eleje felé legyen. 3. Távolítsa el a kék szalagot, és ellenőrizze, hogy minden SPU megfelelően be legyen nyomva, egy szintben legyen és teljes mértékben illeszkedjen az állványba. Egy elmozdult SPU műszerhibát okozhat. Ne nyomja meg a SPU-ban található S-hegyet. 15
4. Csúsztassa a betöltött SPU-állványokat a COBAS AmpliPrep készülék I, J, illetve K SPUpozícióiba addig, amíg teljesen nem illeszkednek és a készülék fel nem ismeri azokat. A készülék egyszerre 72 SPU befogadására alkalmas. Töltsön be a futtatáshoz megkívánt számú SPU-t, illetve helyezzen be továbbiakat, ha szükséges. 5. Távolítsa el a gyártó által betöltött K-csövek és K-hegyek celofán csomagolását, és vigyázzon, hogy ne döntse meg az állványokat. Ellenőrizze, hogy megfelelően helyezkednek-e el. 6. Csúsztassa a K-cső- és K-hegyállványokat a cobas s 201 rendszer felhasználói kézikönyv szerint meghatározott állványterületekre. 7. Az munkaállomáson az AMPLILINK szoftver segítségével adja meg a mintasorrendet. 8. Töltse be a HAMILTON Microlab STAR IVD pipettorral pipettázott mintákat és kontrollokat tartalmazó SK24 állványokat a COBAS AmpliPrep készülék F, G, illetve H pozícióiba. Csúsztassa kattanásig az állványokat. Ellenőrizze a rendszer mintaállapot ablakában, hogy a készülék az összes állvány összes mintáját felismerte-e. 9. Az AMPLILINK segítségével ellenőrizze, hogy elegendő mennyiségű reagens és fogyóeszköz lett-e betöltve a kívánt minta-előkészítési eljáráshoz. 10. Nyomja meg az AMPLILINK munkaállomás Start gombját, hogy elindítsa a COBAS AmpliPrep készülék minta-előkészítési eljárást. 11. Minden fel nem használt K-hegy és K-cső a COBAS AmpliPrep készüléken belül lezárva visszamarad a következő futtatásban való felhasználás céljára. D. Amplifikáció és kimutatás 1. Vigye át a feldolgozott mintákat tartalmazó az SK24 állványokat a COBAS TaqMan analizátorra 1 órán belül attól számítva, hogy az adott állványban befejeződött a mintaelőkészítés. A COBAS TaqMan analizátor automatikusan megkezdi az amplifikálási és kimutatási eljárást. Ha 1 órán belül nem viszi át az állványokat, azokra érvénytelen eredményt fog kapni. 2. Ha befejeződött az amplifikálás és kimutatás a COBAS TaqMan analizátoron, a vizsgált minták automatikusan a hulladékgyűjtőbe kerülnek. 3. Az AMPLILINK adatállomáson fogadja el az eredményeket. 4. Az eredmények automatikusan a PDM szoftverre továbbítódnak. E. Eredmények áttekintése és kiadása 1. Indítsa el a Roche PDM adatállomást. 2. Keresse ki a még nem értékelt tételeket az adatkezelő munkaállomás Review Batches füle alatt. 3. Tekintse át a figyelmeztetéseket úgy, hogy kijelöli a tételt és a Next gombra kattint. 4. Tekintse át a kontrolleredményeket a Controls Review fül alatt. A kontrollok érvényességi kikötéseinek megismerése céljából tanulmányozza a Minőség-ellenőrzés fejezetet. 5. Tekintse át a csoporteredményeket a kiválasztott tétel Alarms Review füle alatt. A nem reaktív csoportok szükség esetén a felhasználó által manuálisan érvényteleníthetőek. Az érvénytelen csoportok minden donormintáját újra kell vizsgálni. 6. Tekintse át és adja ki a donoreredményeket a kiválasztott tétel Donor Review füle alatt. 7. Nyomtassa ki a jelentéseket és küldje tovább a laboratóriumi információs rendszerre (LIS), ha ilyen rendelkezésre áll. 16
MINŐSÉG-ELLENŐRZÉS 1. Minden egyes tétellel együtt egy negatív kontrollt [TS ( ) C] és az öt pozitív kontroll mindegyikéből egyet-egyet [HIV-1 M (+) C, HIV-1 O (+) C, HIV-2 (+) C, HCV (+) C és HBV (+) C] is fel kell dolgozni. 2. Tétel állapota: A Complete, Valid tételállapot jelenik meg, ha a tételkontrollok érvényesek. Ha a tételben bármelyik kontroll érvénytelen, az egész tétel eredménye érvénytelen lesz. a. Negatív kontroll Ahhoz, hogy a negatív kontroll [TS ( ) C] érvényes legyen, az eredmény értékelése nem reaktív, valamint a járulékos belső kontroll érvényes kell, hogy legyen. Amennyiben a belső kontroll érvénytelen, a negatív kontroll eredményének értékelése is érvénytelen lesz. Ha a negatív kontroll eredményének értékelése érvénytelen, az egész tétel érvénytelen lesz, és a vizsgálatot meg kell ismételni. b. Pozitív kontrollok Ahhoz, hogy az 5 pozitív kontroll (HIV-1 M (+) C, HIV-1 O (+) C, HIV-2 (+) C, HCV (+) C és HBV (+) C) érvényes legyen, minden egyes pozitív kontroll eredményének értékelése reaktív, valamint a járulékos belső kontroll érvényes kell, hogy legyen. Amennyiben a belső kontroll érvénytelen, a pozitív kontroll eredményének értékelése is érvénytelen lesz. Ha bármelyik pozitív kontroll eredményének értékelése érvénytelen, az egész tétel érvénytelen lesz, és a vizsgálatot meg kell ismételni. 3. Donorminták belső kontrollja a. Ahhoz, hogy a donorminta érvényes, nem reaktív ( ) vizsgálati eredményt adjon, a járulékos belső kontroll érvényes kell, hogy legyen, ellenkező esetben a nem reaktív eredmény érvénytelen lesz, és az egész vizsgálati eljárást meg kell ismételni. b. Ahhoz, hogy a donorminta érvényes, reaktív (Ct érték) vizsgálati eredményt adjon, a járulékos belső kontroll érvényes vagy érvénytelen is lehet. EREDMÉNYEK 1. A mintaeredmények csak akkor érvényesek, ha a teljes, őket tartalmazó tétel érvényes. Az elfogadhatóság feltételeit a Minőség-ellenőrzés fejezetben találja. Minden minta esetében két paraméter mérésére kerül sor, egyik a vírustargetre, másik a belső kontrollra vonatkozik. 2. A cobas TaqScreen MPX teszt PDM szoftver által jelentett végső donoreredményei a következők: Állapot Complete Non-Reactive Complete Reactive Complete Unresolved Jelentés A donor nem reaktív a vizsgált elem(ek)re. A donor reaktív a vizsgált elem(ek)re. Az életképességi időkorlát lejárt, mielőtt a donor reaktív vagy nem reaktív státuszt kapott volna. A donor további vizsgálata nem végezhető el a rendszeren. 3. További vizsgálatot igénylő donorok: az érvénytelen csoportállapotú donorcsövek értékelése Repeat Needed, továbbá a reaktív csoportban található donorcső értékelése Resolution Needed. 17
Repeat Needed Az invalid értékelésű csoport donorcsöveinek vizsgálatát meg kell ismételni egy ismétlési csoport részeként, vagy egyéni meghatározás során. Csoportvizsgálat Resolution Needed Amikor egy több mintát tartalmazó csoport kap reaktív értékelést, a cobas s 201 rendszer a csoportban található összes donort Resolution needed státusszal jelöli. Ezeket ez egyéni donormintákat a HAMILTON Microlab STAR IVD pipettor pipettázza (a mély lyukú lemezekből vagy az eredeti donorcsövekből), és további vizsgálatuk a cobas TaqScreen MPX teszttel történik a visszabontási eljárás részeként a reaktív és nem reaktív egyéni donorminták azonosítása céljából. A visszabontási vizsgálatra vonatkozó specifikus információk végett tanulmányozza a cobas s 201 rendszer felhasználói kézikönyv utasításait. Amikor egy több mintát tartalmazó csoport értékelése nem reaktív, illetve egy vagy minden, visszaoldási vizsgálatban résztvevő donorminta értékelése nem reaktív, az egyéni minta(ák) értékelése Complete, Non-reactive lesz. Minden reaktívnak talált egyéni minta további vizsgálata elvégezhető a COBAS AmpliScreen teszttel a vírus megkülönböztetése céljából. Egyéni vizsgálat Ha a donor vizsgálatára eredetileg egyéni mintaként került sor és nem reaktív eredményt adott, a minta értékelése Complete, Non-reactive. Amennyiben az egyéni minta eredménye reaktív, a minta értékelése Complete, Reactive. Minden reaktívnak talált egyéni minta további vizsgálata elvégezhető a COBAS AmpliScreen teszttel a vírus megkülönböztetése céljából. Megjegyzés: 4. Megkülönböztető vizsgálat Egy átfogó minőség-biztosítási program részeként a felhasználó további vizsgálatokat végezhet el, hogy meghatározza a minta reaktivitásának eredeti okát. Minden egyéni reaktív minta, amelyet a cobas TaqScreen MPX teszt reaktívnak ismert fel, tovább vizsgálható annak meghatározására, hogy melyik vírus(ok) kimutatása történt: HIV-1, HBV vagy HCV. A HIV-1 M csoport, HCV és HBV megkülönböztetése céljából tanulmányozza a COBAS AmpliScreen HBV teszt, a COBAS AmpliScreen HCV teszt, v2.0 és a COBAS AmpliScreen HIV-1 teszt, v1.5 használati útmutatójának multiprep mintafeldolgozási eljárásokra vonatkozó részét. HIV-1 O csoport és HIV-2 megkülönböztetésére alkalmas teszt nem áll rendelkezésre a Roche-tól. Ha egy egyéni mintát, amelyet a cobas TaqScreen MPX teszt reaktívnak talált mind a három COBAS AmpliScreen teszt nem reaktívnak talál, a felhasználó további NAT vagy szerológiai vizsgálatokat végezhet el, illetve visszarendelheti a donort utánkövetési vizsgálatokra. A donor utánkövetésére és esetleges visszavételére a felhasználóknak a helyi specifikus irányelveket/ eljárásokat kell követniük. ELJÁRÁSSAL KAPCSOLATOS KORLÁTOZÁSOK 1. A vizsgálatot kizárólag a cobas TaqScreen MPX tesztkészlet, cobas TaqScreen MPX kontrollkészlet, a cobas TaqScreen mosóreagens és a cobas s 201 rendszer együttes használatára értékelték. 2. A heparinról kimutatták, hogy gátolja a PCR-t. Az eljáráshoz ne használjon heparinos plazmát. 3. A megbízható eredmény a megfelelő mintalevételen, valamint a helyes transzporteljárásokon múlik. 4. A plazmacsoportok automatikus előkészítésére csak a HAMILTON Microlab STAR IVD pipettort validálták a cobas TaqScreen MPX teszttel való együttes használatra. Ragaszkodjon a cobas s 201 rendszer felhasználói kézikönyv és a HAMILTON Microlab STAR IVD pipettor felhasználói kézikönyv hardver utasításaihoz és biztonsági óvintézkedéseihez. 18
5. A HIV-1 M csoport RNS, HIV-1 O csoport RNS, HIV-2 RNS, HCV RNS és HBV DNS kimutatása függ a mintában jelenlevő vírusrészecskék számától, és befolyásolhatják a mintalevételi módszerek, betegfaktorok (azaz kor, tünetek megléte) és/vagy a fertőzés stádiuma, valamint a mintacsoport mérete. 6. Ritkán bár, de előfordulhat, hogy a cobas TaqScreen MPX teszt primerei és/vagy próbái által lefedett virális genomok nagyfokban konzervált régióiban levő mutációk következtében a vírus kimutatása sikertelen lesz. 7. A technológiák különbözősége miatt javasolt, hogy az egyik technológiáról a másikra való áttéréskor a felhasználók végezzenek korrelációs laboratóriumi vizsgálatokat, hogy a technológiák közötti különbség minősíthető legyen. TELJESÍTMÉNYJELLEMZŐK Reprodukálhatóság A cobas TaqScreen MPX teszt cobas s 201 rendszerrel való használatának reprodukálhatóságát 12 tagú, randomizált, két negatív plazmamintát és két-két, HIV-1 M csoport, HIV-1 O csoport, HIV-2, HCV és HBV pozitív plazmamintát, minden vírus esetében megközelítőleg a cobas TaqScreen MPX teszt kimutatási határának (LOD) 0,54X és 3X koncentrációit tartalmazó vak panelű vizsgálattal állapították meg. A vizsgálatok kivitelezésére 3 vizsgálati helyen, helyenként 1 üzemeltető által, 3 különböző tételszámú cobas TaqScreen MPX tesztkészletet és 1 cobas s 201 rendszer alkalmazásával került sor. Mindegyik színhelyen naponta 4 panelt és 4 kontrollszettet vizsgáltak 5 napon keresztül mind a 3 tételű reagenskészlettel, a panelek minden egyes mintájával összesen 180 vizsgálatot végeztek (összesen 2160 vizsgálat). Valamennyi érvényes reprodukálhatósági adatot úgy értékeltek, hogy kiszámították valamennyi panel tag esetében a reaktív vizsgálati eredmények százalékos arányát. Az adatokat készlettétel és vizsgálati helyszín/üzemeltető szerint dolgozták fel. Ez a vizsgálat megmutatta a cobas TaqScreen MPX teszt készlettétel és vizsgálati helyszín/ üzemeltető szerinti kivitelezésének következetességét. 19
Vírus 1. táblázat cobas TaqScreen MPX teszt Reprodukálhatósági eredmények Koncentráció Negatív 0 HIV-1 M csoport 0,54 X LOD** HIV-1 O csoport 0,54 X LOD* HIV-2 HCV HBV HIV-1 M csoport HIV-1 O csoport HIV-2 HCV HBV * Kimutatási határ 0,54 X LOD* 0,54 X LOD* 0,54 X LOD* 3 X LOD* 3 X LOD* 3 X LOD* 3 X LOD* 3 X LOD* Készlettétel Reaktív eredmény reagenstétel alapján Vizsgálati hely/ Üzemeltető Reaktív eredmény vizsgálati hely/ üzemeltelő alapján A 0,0% (0/120) 1 0,0% (0/120) B 0,0% (0/120) 2 0,0% (0/120) C 0,0% (0/120) 3 0,0% (0/120) A 75,0% (45/60) 1 75,0% (45/60) B 80,0% (48/60) 2 71,7% (43/60) C 75,0% (45/60) 3 83,3% (50/60) A 96,7% (58/60) 1 100,0% (60/60) B 98,3% (59/60) 2 95,0% (57/60) C 98,3% (59/60) 3 98,3% (59/60) A 83,3% (50/60) 1 73,3% (44/60) B 81,7% (49/60) 2 80,0% (48/60) C 73,3% (44/60) 3 85,0% (51/60) A 81,4% (48/59) 1 71,7% (43/60) B 78,3% (47/60) 2 71,2% (42/59) C 61,7% (37/60) 3 78,3% (47/60) A 98,3% (58/59) 1 96,7% (58/60) B 98,3% (59/60) 2 98,3% (58/59) C 95,0% (57/60) 3 96,7% (58/60) A 100,0% (60/60) 1 98,3% (59/60) B 98,3% (59/60) 2 100,0% (60/60) C 100,0% (60/60) 3 100,0% (60/60) A 100,0% (60/60) 1 100,0% (60/60) B 100,0% (60/60) 2 100,0% (60/60) C 100,0% (60/60) 3 100,0% (60/60) A 100,0% (59/59) 1 100,0% (60/60) B 100,0% (60/60) 2 100,0% (60/60) C 100,0% (60/60) 3 100,0% (59/59) A 100,0% (60/60) 1 100,0% (60/60) B 100,0% (60/60) 2 100,0% (60/60) C 100,0% (60/60) 3 100,0% (60/60) A 100,0% (60/60) 1 100,0% (60/60) B 100,0% (60/60) 2 100,0% (60/60) C 100,0% (60/60) 3 100,0% (60/60) Analitikai érzékenység WHO nemzetközi szabvány/roche szabvány A cobas TaqScreen MPX teszt kimutatási határa a HIV-1 M csoport, HIV-1 O csoport, HIV-2, HCV és HBV ágensekre a következő szabványok alapján lett meghatározva: a WHO HBV nemzetközi standard (NIBSC kód 97/746) 30, a WHO 2. HCV RNS nemzetközi standard (NIBSC kód 96/798) 31 és a Roche HIV-1 M csoport, HIV-1 O csoport és HIV-2 standard. A Roche HIV-1 M csoport standard egy kereskedelmi forgalomban levő vírustörzs kultúra (HIV-1 LAV 8E5, PN 227, Boston Biomedica, Inc.), amely visszavezethető a WHO 1 st HIV-1 RNS nemzetközi standardra (NIBSC code 97/656), és a COBAS TaqMan HIV-1 teszt nagytisztaságú rendszerrel való felhasználásra módszerrel lett kalibrálva. HIV-1 O csoport és HIV-2 nemzetközi standard jelenleg nem áll rendelkezésre. A Roche HIV-1 O csoport és HIV-2 standardok kereskedelmi forgalomban levő vírustörzs kultúrák, PN 242O (Boston Biomedica, Inc.) és katalógusszám 10-127-000 (Advanced Biotechnologies, Inc.). A HIV-1 O 20