A miokardium intracelluláris kalcium homeosztázisa: iszkémiás és kardiomiopátiás változások

Doktori értekezés A miokardium intracelluláris kalcium homeosztázisa: iszkémiás és kardiomiopátiás változások Dr. Szenczi Orsolya Témavezető: Dr. Ligeti László Klinikai Kísérleti Kutató- és Humán Élettani Intézet, Budapest, 2005 Semmelweis Egyetem Doktori Iskola Elméleti Orvostudományok Doktori Iskola Szigorlati bizottság elnöke: Dr. Pavlik Gábor, tagok: Dr. Kékesi Violetta, Dr. Hamar János Hivatalos bírálók: Dr. Kékesi Violetta, Dr. Hamar János

TARTALOMJEGYZÉK TARTALOMJEGYZÉK...2 RÖVIDÍTÉSEK...5 1 IRODALMI ÁTTEKINTÉS...8 1.1 A kalcium tranzienst létrehozó mechanizmusok...8 1.1.1 A kalcium felszabadulás mechanizmusa és szabályozása...8 1.1.1.1 A Ca 2+ -spark -ok kialakulása...8 1.1.1.2 A kalcium felszabadulás szabályozása...9 1.1.2 A kalcium szerepe a szívizom kontrakciós-relaxációs folyamatában...10 1.1.3 A kalcium szekvesztrálódás mechanizmusa és szabályozása...10 1.1.3.1 A szarkoplazmatikus retikulum Ca 2+ -pumpája...10 1.1.3.2 A Na + /Ca 2+ csereranszporter...11 1.1.3.3 A Ca 2+ -ATP-áz pumpa...11 1.1.3.4 A mitokondriális Ca 2+ -uniporter...12 1.1.3.5 Az Ca 2+ i pufferolása...12 1.2 A kalcium szerepe a szívizom kontraktilitásának homeometriás szabályozásában...13 1.2.1 A szimpatikus idegrendszer szerepe...13 1.2.1.1 A β 1 -adrenerg receptorok...13 1.2.1.2 Az α 1 -adrenerg receptorok...14 1.2.2 A nitrogén-monoxid szerepe...15 1.3 A kalcium túlterhelés kialakulása és következménye...16 1.3.1 A degeneratív enzimek aktiválódása...16 1.3.2 A mitokondriumok károsodása...17 1.3.3 Az ingerképzés és vezetés zavara...17 1.4 A kalcium hiány és következményei...18 1.5 A kalcium homeosztázis zavara speciális kórképekben...18 1.5.1 A szívizom iszkémiás/reperfúziós károsodása...18 1.5.1.1 Az iszkémia...19 1.5.1.2 A reperfúzió...20 1.5.2 Oxidatív és nitrozatív stressz által kiváltott kardiomiopátia...22 1.5.2.1 A funkciózavar kialakulásának feltételezet mechanizmusai...22 1.6 Az iszkémiás/reperfúziós és kardiomiopátiás állapotok ellen védő mechanizmusok a HS előkezelés, valamint a poli(adp-ribóz) polimeráz gátlása...24 1.6.1 Az iszkémiás/reperfúziós károsodással szembeni védelem a hősokk kezelés...24 1.6.1.1 A hősokk előkezelés védőhatása...24 1.6.1.2 A HS kezelést követő védőhatás kialakulásának feltételezett mechanizmusa...25 1.6.1.3 Terápiás lehetőségek...31 1.6.2 Oxidatív és nitrozatív stressz által kiváltott kardiomiopátia a poli(adpribóz) polimeráz (PARP) szerepe...32 1.6.2.1 A PARP szerkezete...32 2

1.6.2.2 A PARP funkciója...33 1.6.2.3 A PARP túlaktiválódása...34 1.6.2.4 A PARP gátlása...34 2 CÉLKITŰZÉSEK...36 3 MÓDSZEREK...37 3.1 Felhasznált állatok...37 3.2 Langendorff-készítmény...37 3.3 Fluoreszcens mérés...39 3.4 Statisztika...42 3.5 A hősokk előkezelést követő iszkémiás/reperfúziós károsodás vizsgálata...42 3.5.1 A hősokk előkezelés...42 3.5.2 A perfúziós protokoll...42 3.5.3 A HSP70 meghatározása...43 3.6 Oxidatív és nitrozatív stressz által kiváltott kardiomiopátia vizsgálata...43 3.6.1 Kardiomiopátia előidézése...43 3.6.2 Perfúziós protokoll...44 4 EREDMÉNYEK...45 4.1 A hősokk előkezelést követő iszkémiás/reperfúziós károsodás vizsgálata...45 4.1.1 A miokardium HSP70 tartalma...45 4.1.2 A szív mechanikai teljesítménye...45 4.1.3 A vég-diasztolés Ca 2+ i-szint...47 4.1.4 Az Ca 2+ i-tranziens...47 4.1.5 Az Ca 2+ iránti érzékenység...48 4.2 Oxidatív és nitrozatív stressz által kiváltott kardiomiopátia vizsgálata...54 4.2.1 A szív mechanikai teljesítménye...54 4.2.2 A vég-diasztolés Ca 2+ i-szint...55 4.2.3 Az Ca 2+ i-tranziens...55 4.2.4 A Ca 2+ iránti érzékenység...55 5 MEGBESZÉLÉS...62 5.1 A hősokk előkezelést követő iszkémiás/reperfúziós károsodás vizsgálata...62 5.1.1 A szív hemodinamikai tevékenysége...63 5.1.2 A vég-diasztolés Ca 2+ i-szint...63 5.1.3 Az Ca 2+ i-tranziens...64 5.1.4 A Ca 2+ iránti érzékenység...65 5.2 Oxidatív és nitrozatív stressz által kiváltott kardiomiopátia vizsgálata...66 5.2.1 A szív hemodinamikai tevékenysége...67 5.2.2 A vég-diasztolés Ca 2+ i-szint...67 5.2.3 Az Ca 2+ i-tranziens...68 5.2.4 A Ca 2+ iránti érzékenység...69 5.2.5 A kardiomiopátia progressziója...69 6 KÖVETKEZTETÉSEK...70 3

7 KÖSZÖNETNYÍLVÁNÍTÁS...72 8 IRODALOMJEGYZÉK...73 9 SAJÁT KÖZLEMÉNYEK JEGYZÉKE...90 10 ÖSSZEFOGLALÁS...92 11 SUMMARY...94 4

RÖVIDÍTÉSEK ±dca 2+ /dt max a Ca 2+ -felszabadulás és szekvesztrálódás maximális sebessége ±dp/dt max a bal kamrán belüli izovolumetriás nyomásnövekedés és csökkenés maximális sebessége O 2 - OH - ADPR ATP szuperoxid anion hidroxil anion adenozin-difoszfát-ribóz adenozin-trifoszfát Ca 2+ i Ca 2+ SR camp CB 2 CF CO COX-2 intracelluláris szabad kalcium intraszarkoplazmatikus kalcium ciklikus adenozin-monofoszfát 2-es típusú kannabinoid receptor koronária áramlás szén-monoxid ciklooxigenáz-2 DAG DNS DOX enos FKBP12.6 GRP diacil-glicerol dezoxi-ribonukleinsav doxorubicin endoteliális nitrogén-monoxid szintáz immunofilin FK506-kötő fehérje glukóz-regulált fehérje GTP H 2 O 2 HO-1 HS HSF guanozin-trifoszfát hidrogén-peroxid hem-oxigenáz-1 hősokk hősokk faktor 5

HSP hősokk fehérje I/R I Ca INDO inos IP 3 K ATP -csatorna K d MAPK mrns iszkémia/reperfúzió az L-csatornákon beáramló Ca 2+ -áram indometacin indukálható nitrogén-monoxid szintáz inozitol-1,4,5-triszfoszfát ATP-függő kálium csatorna disszociációs konstans mitogén aktivált protein kináz messenger ribonukleinsav NA NAD(H) NADP(H) NCX NF-ĸB NO nnos nikotinsavamid nikotinsavamid-adenin-dinukleotid (redukált) nikotinsavamid-adenin-dinukleotid foszfát (redukált) Na + /Ca 2+ cseretranszporter nukleusz faktor-ĸb nitrogén-monoxid neuronális nitrogén-monoxid szintáz ONOO - PARP PIP 2 PJ34 PKC PLC P lv R min és R max ROS peroxinitrit poli(adp-ribóz) polimeráz foszfatidilinozitol-4,5-difoszfát [N-(6-oxo-5,6-dihydrophenanthridin-2-yl)-N,Ndimethylacetamide.HCl], PARP gátló vegyület protein kináz C foszfolipáz C balkamrai nyomás nulla és telített Ca 2+ -koncentráció melletti fluoreszcens jelek hányadosa reaktív oxigén gyökök 6

RyR2 SD SERCA2a SR szívizom specifikus rianodinreceptor standard deviáció SR Ca 2+ -ATP-áz pumpája szarkoplazmatikus retikulum V max SERCA2a maximális transzport sebessége 7

1 IRODALMI ÁTTEKINTÉS 1.1 A kalcium tranzienst létrehozó mechanizmusok 1.1.1 A kalcium felszabadulás mechanizmusa és szabályozása 1.1.1.1 A Ca 2+ -spark -ok kialakulása A szívizomsejtben kialakuló intracelluláris kalcium szignál döntő szerepet játszik a szívizom kontrakciójának létrejöttében. A szívizom kontrakciójához szükséges intracelluláris szabad kalcium (Ca 2+ i) döntő többsége a szarkoplazmatikus retikulumból (SR) szabadul fel (37). Ezt a folyamatot a membránban lévő, feszültség függő, L típusú kalcium (Ca 2+ ) csatornákon keresztül beáramló Ca 2+ (I Ca ) idézi elő (18,94). Ezek a csatornák a szarkolemma betüremkedéseiben, a sejt tengelyére merőleges transzverzális tubulusokban helyezkednek el, a Z-vonal és egyúttal a SR közelében (15). A csatornák nyílásával a SR közelében megemelkedik a lokális Ca 2+ -koncentráció, amely a SR rianodinérzékeny Ca 2+ -csatornáit, a rianodinreceptorokat aktiválja. A rianodinreceptoroknak három izoformja ismert: a vázizomban található RyR1 (160,180), a szívizomban levő RyR2 (114,121) és az agyban, vázizomban és simaizomban működő RyR3 (22,54). Az egyes rianodinreceptor molekulák egymástól térben elszeparáltak, aktiválódásuk és a rajtuk keresztül kiáramló Ca 2+ mennyisége a közvetlen környezetükben levő intracelluláris miliő függvénye (174). Az individuális RyR2 receptorokon keresztül felszabaduló úgynevezett Ca 2+ -spark -ok, azaz Ca 2+ - szikrák, a SR spontán kialakuló elemi jelensége (23). Ugyanakkor a sejt depolarizációja és ennek következtében az L típusú Ca 2+ -csatornák nyílása szintén kiváltja a Ca 2+ - szikrákat. Annak ellenére, hogy a Ca 2+ -szikrák eredete és pontos mechanizmusa még nem teljesen tisztázott, feltételezhető, hogy a SR-ból kis csoportokban felszabaduló Ca 2+ térbeli és időbeli szummációja alakítja ki a szisztolé során mért Ca 2+ i-tranzienst. Ezt a Ca 2+ -indukálta Ca 2+ -felszabadulást tekintik a szívizomban kialakuló excitációskontrakciós kapcsolás lokális mechanizmusának (12,153,174). 8

1.1.1.2 A kalcium felszabadulás szabályozása A SR-ból történő Ca 2+ -felszabadulás legfontosabb triggere a már említett I Ca áram, a Ca 2+ -felszabadulás helyi szabályozásában azonban feltételezhetően egyéb mechanizmusok is szerepet játszhatnak (174). A szarkolemma feszültségfüggő és magas intracelluláris Na + -koncentráció mellett reverz módban üzemelő, Na + /Ca 2+ cseretranszporterén (NCX) (90), valamint a szarkolemma T-típusú Ca 2+ -csatornáján kis mennyiségű Ca 2+ áramlik a sejtbe (147). A T-típusú Ca 2+ -csatornákon a sejtbe irányuló Ca 2+ -áram az L-típusú Ca 2+ -csatornáknál alacsonyabb hatékonysággal vált ki Ca 2+ - szikrákat. A Na + /Ca 2+ cseretranszporter reverz módú működése nem vált ki Ca 2+ - szikrákat, ennek ellenére valószínű, hogy ez a mechanizmus állítja be a lokális Ca 2+ - koncentráció emelésével a szív RyR2 receptorainak I Ca árammal szembeni érzékenységét. A RyR2 receptorokon keresztül létrejövő Ca 2+ -felszabadulást extra- és intralumenális tényezők, így a receptorokhoz kötődő kinázok: protein kináz A és Ca 2+ - kalmodulin-függő protein kináz (165) valamint regulátor fehérjék: kalszekvesztrin (53), sorcin (107) és az FK506-kötő FKBP12.6 fehérje (102) szabályozzák. A SR-ban levő Ca 2+ -koncentráció (Ca 2+ SR) csökkenésével egyidejűleg a RyR2 konduktanciája is csökken, míg a Ca 2+ SR-koncentráció emelkedésével párhuzamosan RyR2 konduktanciája is fokozódik. Valószínűnek látszik, hogy az Ca 2+ SR-változásainak érzékelésében a RyR2 receptorhoz kötődő kalszekvesztrin játssza a központi szerepet. Alacsony Ca 2+ SR-koncentráció esetén a kalszekvesztrin/triadin/junkcin komplex a RyR2 receptorhoz kötődik és gátolja a RyR2 konduktanciáját. A Ca 2+ SR-szint emelkedésekor a kalszekvesztrin Ca 2+ -t köt, amelynek során a kalszekvesztrin/triadin/junkcin komplex közötti interakció csökken és a csatorna konduktanciája egyre fokozódik. A RyR2 csatorna maximális konduktanciáját a kalszekvesztrin disszociációja után éri el (53). A kalszekvesztrin mellett a sorcin nevű Ca 2+ -kötő fehérjének is feltételezett szerepet tulajdonítanak a RyR2 receptoron keresztül létrejövő Ca 2+ -felszabadulás befolyásolásában. A sorcin a RyR2 receptorhoz kötődve gátolja a csatorna megnyílását. Ez a gátló hatás a sorcin protein kináz A által létrejövő foszforilációja során szűnik meg (107). Az FKBP12.6 nevű regulátorfehérje a RyR2 receptorhoz kötődve stabilizálja a receptor zárt állapotának konformációját, ezzel megakadályozza a diasztolé alatti Ca 2+ - szivárgást. A RyR2 aktivitása újraindul, illetve fokozódik, amikor a regulátorfehérjét protein kináz A foszforilálja, és az FKBP12.6 leválik a RyR2 receptorról. Valószínű, 9

hogy az FKBP12.6 a RyR2 Ca 2+ iránti érzékenységét is befolyásolja. Alacsony FKBP12.6 koncentráció mellett ugyanis a RyR2 sokkal érzékenyebb az Ca 2+ i iránt, mint magas koncentrációnál (76,102). 1.1.2 A kalcium szerepe a szívizom kontrakciós-relaxációs folyamatában Az excitációs-kontrakciós kapcsolás folyamata során a sejtben megemelkedett Ca 2+ i a troponin C-hez kötődve indítja be és tartja fenn a kontraktilis fehérjék összehúzódását, a kontrakció kialakulását. A szarkomerekbe rendeződött vastag (miozin) és vékony (aktin) filamentumok egymáson való elcsúszásának előfeltétele, hogy kölcsönhatásba lépjenek egymással, úgynevezett kereszthidak alakuljanak ki közöttük. Ezt a kapcsolatot a mioplazma megemelkedett Ca 2+ i-koncentrációja tartja fenn azáltal, hogy az aktinhoz kapcsolódó troponin-tropomiozin komplex Ca 2+ i-t kötve olyan konformációváltozáson megy keresztül, hogy az aktin miozinkötő helyei a miozin számára hozzáférhetővé válnak. A depolarizácó befejeztével valamint a repolarizáció kezdetével azonban az Ca 2+ i-koncentráció lecsökken. Megszűnik a sejtbe irányuló I Ca és a következményes Ca 2+ -felszabadulás a SR-ból, és túlsúlyba kerülnek az Ca 2+ i-ot a mioplazmából eltávolító folyamatok. Ezeknek a folyamatoknak az eredője a diasztolé során detektálható Ca 2+ i-tranziens. A csökkenő Ca 2+ i-szint következtében a Ca 2+ disszociál a troponin C-ről, a kontraktilis fehérjék közötti kereszthidak felbomlanak, a filamentumok szétkapcsolódnak, létrejön a relaxáció (119). 1.1.3 A kalcium szekvesztrálódás mechanizmusa és szabályozása 1.1.3.1 A szarkoplazmatikus retikulum Ca 2+ -pumpája Az Ca 2+ i döntő többsége (emberben 75%, nyúlban 70%, patkányban 92%) a SR-be jut vissza, a SR Ca 2+ -pumpáján a SERCA-n, pontosabban SERCA2a-n keresztül, amely elnevezés a miokardiumban található izoformra utal (11). Az energiaigényes aktív transzport során egy adenozin-trifoszfát (ATP) molekula hidrolízise mellett két Ca 2+ kerül mintegy 1000-szeres koncentráció grádiens ellenében a SR-ba, hiszen az SR-ben jelenlevő Ca 2+ SR-koncentráció néhány mm/l, ezzel szemben a mioplazmatikus szisztolés Ca 2+ i-koncentráció néhány µm/l (42). A folyamat azonban mégsem elektrogén, azaz a 10

látszólag nettó egyirányú ionmozgás nem vezet a SR membránjának két oldala közötti feszültségkülönbség kialakulásához. Ennek hátterében valószínűleg az áll, hogy a SR membránjában nagy permeábilitású K + és Cl - csatornák helyezkednek el, amelyek lehetővé teszik más ionok kompenzáló mozgását. Ugyanezen ok miatt nem generál membránpotenciál változást a SR-ból kilépő nagy mennyiségű Ca 2+ sem. A SR-ba visszapumpált Ca 2+ kalszekvesztrinhez (43) és kalretikulinhoz (154) kötődve raktározódik a soronkövetkező depolarizációig. A SERCA2a Ca 2+ iránti affinitását egy 27kDa molekula tömegű fehérje, a foszfolamban szabályozza. A SR membránjában elhelyezkedő fehérjét ciklikus adenozin-monofoszfát (c-amp)-függő protein kináz A képes foszforilálni. A foszfolamban defoszforilált állapotban csökkenti a SERCA2a Ca 2+ iránti affinitását. A foszforilálódás hatására a gátlás megszűnik (77,96,143). A SERCA2a aktivitását maga a Ca 2+ is fokozza, mivel Ca 2+ -kalmodulin-függő protein kinázt aktivál, amely a pumpát foszforilálja. A foszforiláció eredményeként létrejött konformáció változás miatt a SERCA2a maximális transzport sebessége (V max ) nő (115,163,176). Másrészt a Ca 2+ direkt módon képes a SERCA2a konformációját megváltoztatni, aminek következtében a pumpa aktivitása nő (119). 1.1.3.2 A Na + /Ca 2+ csereranszporter A szarkolemmában található NCX-en kifelé irányuló Ca 2+ -áram (emberben 25%, nyúlban 28%, patkányban 7%-ban) szintén hozzájárul a szívizom relaxációjához szükséges alacsony Ca 2+ i-szint visszaállításához. A Na + -gradienshez kapcsolt aktív transzport folyamat során három Na + belépése mellett egy Ca 2+ áramlik kifelé. A Ca 2+ i- túlterheléssel járó patológiás folyamatok során a megemelkedett subszarkolemmális Ca 2+ -eltávolítás rajtuk keresztül valósul meg (119). 1.1.3.3 A Ca 2+ -ATP-áz pumpa A szarkolemmában, mint más sejtekben is, van Ca 2+ -ATP-áz pumpa. A SERCA2a-val összehasonlítva azonban olyan kis mennyiségben vesz részt a normál szívciklus alatti Ca 2+ i-eliminációban, hogy működése valószínűleg elhanyagolható. Ugyanakkor expressziójának és funkciójának tekintetében humán miokardiumból nyert adatok nem állnak rendelkezésre. Magas Ca 2+ i-szinttel járó kórképekben ill. fokozott katekolamin 11

stimuláció következtében a csatorna kalmodulin ill. camp közvetített foszforiláción megy keresztül, amelynek során aktivitása fokozódik (119). 1.1.3.4 A mitokondriális Ca 2+ -uniporter A mioplazmából történő Ca 2+ -eltávolításhoz elviekben hozzájárulhat a mitokondriumokban működő Ca 2+ -uniporter. Ezen a csatornán keresztül a Ca 2+ facilitált diffúzióval jut a mitokondriumba, mivel a mitokondriális elektrokémiai protongrádiens negatív mitokondriális membránpotenciált tart fenn. Fiziológiás körülmények között azonban a Ca 2+ -eltávolítás ezen útja szintén jelentéktelen (119). A mitokondriális Ca 2+ - transzport elsődleges feladata, hogy koordinálja a miokardiális ATP igény és ellátottság közötti egyensúly kialakulását (105). 1.1.3.5 Az Ca 2+ i pufferolása Az Ca 2+ i-tranziens kialakításában az imént említett Ca 2+ -pumpák működése mellett az Ca 2+ i-pufferek is részt vesznek. A SR-ból felszabaduló Ca 2+ i 99%-a pufferekhez kötődik. Az Ca 2+ i-pufferek elhelyezkedésüket tekintve lehetnek mobilisak, sejten belül bármerre szabadon diffundálók, mint pl. a kalmodulin vagy az ATP, illetve helyhez kötöttek, mint pl. a troponin C, a SERCA2a, a miozin, a szarkoplazma és a szarkolemma fopszfolipidjei. Ca 2+ -kötő képességük alapján gyors (kalmodulin, kalszekvesztrin) és lassú (troponin) valamint nagy és alacsony affinitású puffereket különböztetünk meg (108,134,149). Az Ca 2+ i-pufferek közül a szarkolemma Ca 2+ i-kötő helyei nagy kapacitással, de alacsony affinitással, míg a szarkoplazmás retikulum Ca 2+ i-kötő helyei, a troponin C és a kalmodulin kis kapacitással, de nagy affinitással kötik a kontrakciók során felszabaduló Ca 2+ i-t (6). A felszabaduló kalcium 1%-a citoplazmában, mint szabad Ca 2+ i van jelen. A szívizomsejtben található pufferek által létrehozott pufferkapacitás a kontrakció-relaxáció során nem állandó. Ha az Ca 2+ i-szint emelkedik, a citoplazma pufferkapacitása csökken, így a pufferekről a Ca 2+ disszociál, az Ca 2+ i-szint tovább emelkedik. Ugyanakkor, ha az Ca 2+ i-szint csökken, a pufferkapacitás emelkedik, pufferekhez kötődő Ca 2+ tovább csökkenti az Ca 2+ i-szintet. Mindebből az a következtetés vonható le, hogy a citoplazma pufferkapacitása is befolyásolja az Ca 2+ i- tranziens amplitúdóját, fel- és leszálló szárának meredekségét (36). 12

1.2 A kalcium szerepe a szívizom kontraktilitásának homeometriás szabályozásában A szívizomsejt kontrakciójának és relaxációjának alapfeltétele mioplazma Ca 2+ i- koncentrációjának ciklikus emelkedése és csökkenése, azaz az Ca 2+ i-tranziens kialakulása. Ugyanakkor az Ca 2+ i-koncentráció változása a miokardium kontrakciójának és relaxációjának a mértékét is meghatározza. Az összehúzódások erejét változatlan diasztolés rosthosszúság mellett főként az adrenerg stimuláció és a nitrogén-monoxid (NO) szabályozzák (homeometriás szabályozás). A két szignál transzdukciós folyamat sejten belüli regulátora az Ca 2+ i. Az inotrop és luzitrop hatások, (azaz a kontrakció és relaxáció mértéke) az Ca 2+ i-szint növekedésével ill. csökkenésével függenek össze. Az izomrostok diasztolés hosszúságának változása (a Frank-Starling és az erő-frekvencia mechanizmusok révén) szintén képes befolyásolni a szív mechanikai teljesítményét (heterometriás szabályozás) (76). 1.2.1 A szimpatikus idegrendszer szerepe 1.2.1.1 A β 1 -adrenerg receptorok A pozitív inotrop hatás kialakulása A szimpatikus idegrendszer elsősorban β 1 -adrenerg receptorokon keresztül fokozza a kontrakciót és a relaxációt. A pozitív inotrop hatás során katekolaminok kötődnek a β 1 - adrenerg receptorokhoz, amelyek konformáció változáson mennek keresztül. Az aktivált receptor G s -fehérjét köt, amely fehérje adenilát ciklázt aktivál. Az adenilát cikláz aktiválás során ATP-ből camp keletkezik. A megnövekedett camp szint proteinkinázokat aktivál, amelyek a szarkolemma Ca 2+ -csatornáit foszforilálják (16). Ennek következtében a szarkolemma L-típusú Ca 2+ -csatornáin keresztül fokozódik a Ca 2+ - beáramlás az extracelluláris térből, az Ca 2+ i-tranziens amplitúdója megnő. A megemelkedett triggerkalcium hatására fokozódik a Ca 2+ -indukálta Ca 2+ -felszabadulás a SR-ből és megemelkedik az Ca 2+ i-koncentráció. Minthogy egy átlagos szisztolé alatti Ca 2+ i-koncentráció során a kontraktilis helyeknek csak a fele aktív, a szív rendelkezik egy bizonyos rezerv kapacitással. A megemelkedett Ca 2+ i-koncentráció következtében több troponin C képes Ca 2+ -t kötni, így nő az aktin-miozin kereszthidak száma, azaz a 13

feszülés mértéke. A β 1 -adrenerg receptor aktiváció camp képződés nélkül is fokozhatja a szarkolemma L-típusú Ca 2+ -csatornáit. Feltételezik, hogy ebben a folyamatban a szarkolemma Ca 2+ -csatornái közvetlenül aktiválódnak G-proteineken keresztül (73). A β 1 -adrenerg stimulus hatására létrejött aktív protein-kináz A a miozin könnyűláncát is foszforilálja, ezzel nő a miozin affinitása az aktin iránt, tehát a közöttük kialakuló keresztkötések száma tovább növekszik. Valószínűnek látszik, hogy a megemelkedett Ca 2+ i-koncentráció önmagában is előidézi a miozin könnyűlánc foszforilációját. Mindezek mellett a megemelkedett Ca 2+ i-koncentráció feltehetőleg a miozin ATP-áz aktivitást is fokozza, amely folyamat szintén hozzájárul a fokozott erőgeneráláshoz (119). A luzitrop hatás kialakulása A β 1 -adrenerg receptorokon keresztül szabályozott luzitrop hatás alapja szintén a megemelkedett camp szint és következményes protein kináz A aktiválódás. Ennek eredményeképpen két egymással párhuzamos folyamat zajlik. Egyrészt, foszforilálódik a SR-ban található foszfolamban és megnő a SERCA2a aktivitás (lásd előbb). Ennek az a következménye, hogy fokozódik a Ca 2+ visszavétele a SR-ba. Ugyanakkor a pozitív inotrop hatás során jelentős mértékben megemelkedett Ca 2+ i-koncentráció önmagában is fokozza a foszfolamban foszforilációját, ami szintén hozzájárul a β 1 -adrenerg receptor közvetített pozitív luzitrop hatáshoz. A másik β 1 -adrenerg receptor mediált luzitrop hatás a troponin I foszforilációja, amelynek következtében csökken a troponin C Ca 2+ iránti affinitása. A Ca 2+ disszociál a troponin C-ről, ez pedig a kontraktilis fehérjék, azaz az aktin és miozin molekulák között meglevő kereszthidak felbomlását segíti elő (119). 1.2.1.2 Az α 1 -adrenerg receptorok A szívizomban a szimpatikus idegrendszer az α 1 -adrenerg receptorokon keresztül megvalósuló Ca 2+ i-koncentrációt szabályozó hatása fiziológiás körülmények között csekély. Az α 1 -adrenerg receptor stimulálása során a receptor G q -fehérjét köt, amely fehérje a szarkolemmában levő foszfolipáz C-t aktiválja. A foszfolipáz C a membrán foszfolipidjét alkotó foszfatidil-inozitolt két komponensre hasítja: inozitol-1,4,5- triszfoszfátra (IP 3 ) és diacil-glicerolra (DAG). Az IP 3 a SR membránjában levő IP 3 14

receptorokhoz kötődve Ca 2+ -kiáramlást indukál a mioplazmába. Az ily módon létrejött Ca 2+ i-koncentráció emelkedés miatt fokozódik a szívizom kontraktilitása. Szintén pozitív inotrop hatású az angiotenzin II vagy endotelin receptorok aktiválódása. A Ca 2+ i- koncentráció emelkedése, hasonlóan az α 1 -adrenerg receptor aktiváláshoz, foszfolipáz C aktiválás következtében nő meg (119). 1.2.2 A nitrogén-monoxid szerepe Valószínű, hogy a szívizom inotropiájának beállításában a NO is szerepet játszik, mint mediátor molekula. Feltételezik, hogy nem csak az ereket borító és az endokardiális endotéliumban, hanem az izomsejten belül is képződik NO. A szívben található NOszintáz izoformák térben egymástól elhatároltak. A kaveolákban elhelyezkedő endoteliális NO-szintáz (enos) aktivitás során keletkezett NO negatív luzitrop hatású, mivel csökkenti a β 1 -adrenerg aktivitásfokozódás miatt kialakuló pozitív inotrop és kronotrop hatást. Egyrészt, mint indirekt hírvivő kolinerg molekula, csökkenti az adrenerg aktivációt követő tachycardiát, másrészt az Ca 2+ i-koncentráció szabályozásával a kontrakció mértékét is képes befolyásolni. Az inotrop hatás hátterében valószínűleg a miofilamentumok cgmp által mediált csökkent Ca 2+ iránti érzékenysége, valamint a szarkolemma L-típusú Ca 2+ -csatornáinak foszforilációja miatt kialakuló Ca 2+ -influx csökkenés áll. (19,119). Az enos aktivitással ellentétes hatást vált ki a neuronális NOszintáz (nnos) által képződött NO. A szívizomsejtben levő másik NO-szintáz izoforma, a nnos a SR-ban található. A nnos aktivitás során keletkezett NO pozitív inotrop hatásának hátterében a RyR2 receptorok stimulálása, és a SR-ból történő fokozott Ca 2+ felszabadulás áll (7). 15

1.3 A kalcium túlterhelés kialakulása és következménye A szívizomban létrejövő Ca 2+ i-koncentrációváltozás, valamint a pozitív inotrop és luzitrop hatás kialakulása között szoros kapcsolat áll fenn. Ha a szisztolé alatti Ca 2+ i- koncentrációemelkedés fokozza a szívizom kontraktilitását, akkor a diasztolé alatti jelentős Ca 2+ i-koncentráció csökkenés szükséges a tökéletesebb relaxációhoz. Ha a szisztolé vagy a diasztolé alatt fiziológiásan jelenlevő, Ca 2+ -felszabadító és szekvesztráló mechanizmusok zavart szenvednek, akkor a miociták Ca 2+ i- koncentrációja tartósan magas marad, a sejtek túltöltődnek Ca 2+ -mal. Az ily módon sérült excitációs/kontrakciós folyamat miatt a szív pumpafunkciója a normális keringés fenntartásához elégtelenné válik. A szívizomsejt Ca 2+ -mal való túltelődése a szív mechanikai teljesítményének csökkenéséhez vezet, illetve hozzájárul a kontraktúra kialakulásához. 1.3.1 A degeneratív enzimek aktiválódása A túlzott mértékű Ca 2+ i-koncentráció Ca 2+ -függő degeneratív enzimek (proteázok, foszfolipázok, endonukleázok) aktiválódásához vezet. Az aktivált foszfolipázok a sejtmembrán foszfolipidjeit feldarabolják, a keletkezett végtermékek a lipid kettősrétegben micellákat alkotnak. Ezek a micellák a fontos szerepet játszhatnak az ingerületterjedés lassulásának következtében kialakuló iszkémiás ventrikuláris aritmiák kialakulásában (119). A foszfolipázok mellett valószínűleg protein kinázok is aktiválódnak, amelyek a kontraktilis fehérjéket foszforilálják. Ennek eredményeként a kontraktilis fehérjéknek csökken a Ca 2+ iránti érzékenysége, azaz csökken a szívizom kontraktilitása. A Ca 2+ -függő protein kinázok a citoszkeletont felépítő fehérjéket is foszforilálják, ezzel a citoszkeleton struktúrális felépítése szakad meg, amely az alapvető sejtműködés végbemeneteléhez biztosít kompartmeneket (167). A kóros mértékben megemelkedett Ca 2+ i-koncentrációnak szerepet tulajdonítanak a programozott sejthalál, azaz az apoptózis kialakulásában is (49). 16

1.3.2 A mitokondriumok károsodása A megemelkedett Ca 2+ i-koncentráció helyreállításában fontos szerepet kapnak a mitokondriális Ca 2+ -szekvesztráló transzporter folyamatok. Egy darabig ezek védekező mechanizmusok a kórosan magas Ca 2+ i-koncentrációval szemben, azonban tartósan fennálló Ca 2+ i-túltelítődés további kóros következményekkel jár. Kezdetben a mitokondriumok, mint Ca 2+ -pufferek, felveszik a citoplazmából a Ca 2+ -ot, egy kritikus koncentráció fölött azonban maguk is túltelítődnek Ca 2+ -mal. A magas intramitokondriális Ca 2+ -koncentráció módosítja a mitokondrium belső membránjában elhelyezkedő ADP/ATP transzlokáz konformációját. A szerkezeti változás miatt a specifikus transzporter olyan membránpórussá módosul, amelyen minden 1500Da alatti molekula képes szabadon áramolni. A mitokondrium belső membránjának permeábilitás fokozódása miatt beáramló K +, Mg 2+ és Ca 2+ a mitokondrium struktúrális és funkcionális károsodását okozzák. A mitokondrium megduzzad és külső membránja rupturál, amelynek következtében citokrom c felszabadulás és kaszpáz aktiváláson keresztül megindulhat a programozott sejthalál folyamata. Ugyanakkor a mitokondrium membránpotenciáljának megszűnésével a légzési lánc is összeomlik és a miocita energiatermelése megtorpan (155). 1.3.3 Az ingerképzés és vezetés zavara Az Ca 2+ i-koncentráció emelkedése kamrai aritmia kialakulásának lehetőségét fokozza. Az Ca 2+ i-koncentráció emelkedését követően ugyanis fokozott foszfolipáz aktivitás figyelhető meg és az aktivált foszfolipázok a membránt alkotó foszfolipideket degradálják. A keletkező lizofoszfogliceridek akkumulálódnak a sejtmembránba és abnormális akciós potenciál terjedést indukálnak. Bizonyos sejtekben nő, másokban csökken az akciós potenciál terjedési sebessége. A szívizomsejtek között levő elektromos inhomogenitás kamrai aritmiák kialakulására hajlamosít. A magas Ca 2+ i- koncentráció gátolja az intercelluláris réskapcsolatokon (gap junction) keresztül létrejövő ingerületterjedést is, amely szintén aritmiára hajlamosító tényező (119). A Ca 2+ i-koncentrációnak emelkedése abnormális Ca 2+ -oszcillációk kialakulásához vezet, amely késleltetett utódepolarizáció kialakulását és következményes kamrai automáciát 17

eredményez, és hozzájárul a reperfúzióban megfigyelhető Ca 2+ i-túlterhelés által kiváltott kontraktúra kialakulásához (129). 1.4 A kalcium hiány és következményei Az Ca 2+ i-hiány bár csupán mesterségesen, laboratóriumi körülmények között hozható létre, jelentősége mégsem elhanyagolható, mivel az excitációs/kontrakciós folyamatok pontosabb megismerését teszi lehetővé. A kalciumkötő pufferrel (BAPTA) létrehozott abszolút Ca 2+ i-hiányt kísérleteink során a nulla Ca 2+ i-koncentráció melletti fluoreszcens jel meghatározásához használtuk, amelynek ismerete nélkülözhetetlen a Módszerek című fejezetben bemutatásra kerülő Ca 2+ i-szint meghatározásához. 1.5 A kalcium homeosztázis zavara speciális kórképekben Az értekezésemben vizsgált két speciális kórképben, a szívizom iszkémiás/reperfúziós károsodása és az oxidatív stressz által kiváltott kardiomiopátia fennállása során a Ca 2+ i- homeosztázist fenntartó folyamatok sérülése figyelhető meg. Ahhoz, hogy ezek a kórképek eredményesen kezelhetővé váljanak, pontosan meg kell ismerni, milyen mechanizmusok hozzák létre az Ca 2+ i-koncentráció tartós emelkedését, és ennek következtében elégtelenné váló kamrai kontrakciót és relaxációt. 1.5.1 A szívizom iszkémiás/reperfúziós károsodása A kardiovaszkuláris és cerebrovaszkulás kórképek döntő többségének alapja az elégtelen vérellátásból adódó iszkémiás károsodás. Ezeknek az iszkémiás sérüléseknek a nagy része még visszafordítható az idejekorán elvégzett sebészi beavatkozással vagy gyógyszeres terápia segítségével, amelyek célja az iszkémiás szövet infarktusának vagy nekrózisának megelőzése. Az iszkémiát követő reperfúzió során a szervek további súlyos károsodásnak vannak kitéve a sejteket elárasztó nagy mennyiségű oxigén miatt. Ennek megfelelően az iszkémia megszűntetése mellett a reperfúziós károsodás kivédésére is hangsúlyt kell fektetni. A hatékony terápiás beavatkozás érdekében fontos 18

tisztázni az iszkémia/reperfúzió alatti biokémiai, celluláris és mikrovaszkuláris történéseket (103). 1.5.1.1 Az iszkémia Kontraktúra kialakulása Az iszkémia állapotát az energiatermelés leállása és Ca 2+ i-túlterhelés jellemzi. Amikor a szívizmot ellátó koronária artériákban a keringés elégtelenné válik, a csökkent vérellátás miatt a szívizom oxigén igénye és ellátottsága közötti egyensúly felbomlik. A kialakult oxigénhiány miatt megszakad a mitokondriumokban a légzési lánc többlépcsős folyamata, megtorpan az ATP termelés. Annak érdekében, hogy a szívizomsejt energiaigényes folyamatai ne szenvedjenek zavart, megindul a szívizomsejtek gyors adaptációja a kialakult iszkémiás állapothoz. Megkezdődik a magas energiájú foszfátraktárak kiürítése, ezzel párhuzamosan nő az inorganikus foszfát mennyisége. Ennek a metabolitnak a felszabadulása a legfontosabb tényező a kontrakciók mérsékléséhez. Valószínű, hogy a kereszthidak kialakulását az inorganikus foszfát metabolitok gátolják. A csökkent energiatermelés miatt a zsírsav metabolizmust felváltja az anaerob glikolízis. Ennek eredményeként nagy mennyiségű laktát szaporodik fel, mely az amúgy már lecsökkent kontraktilitást tovább gyengíti. A glikolízis során ugyanis egy molekula glukóz két molekula laktáttá alakítása két H + felszabadulását eredményezi, ami miatt intracelluláris ph csökkenés jön létre. Az így keletkezett H + -ok leszorítják a Ca 2+ -okat a kontraktilis fehérjékről. Mivel a Ca 2+ -troponin kapcsolat az aktin-miozin kereszthíd létrejöttének alapja, ennek hiányában a kontrakció mechanizmusa zavart szenved. Hosszantartó, súlyos iszkémia során a kontrakció végbemeneteléhez már nem áll rendelkezésre elegendő ATP, de ATP hiányában a relaxáció is zavart szenved. Az aktin és miozin szálak elcsúszott állapotban egymáshoz kapcsoltan maradnak, amelynek eredményeként a szívizomban kontraktúra alakul ki (119). 19

Az Ca 2+ i-túlterhelés kialakulása A kontraktúra kialakulásával párhuzamosan és fokozatosan emelkedik az Ca 2+ i- koncentráció. Ennek hátterében egyrészt az ATP hiány miatt kialakult energiaigényes folyamatok zavara áll, mivel sérülnek a sejt fiziológiás Ca 2+ i-koncentrációját fenntartó felszabadító és szekvesztráló mechanizmusok. Az ATP hiánya mellett az iszkémia alatt fellépő súlyos acidózis gátolja a SERCA2a működését és a Ca 2+ -indukálta Ca 2+ - felszabadulást a RyR2 receptorokon (2,59). Továbbá a ph emelkedés mérséklésére megindult kompenzációs lépések az Ca 2+ i-koncentráció emelésével járnak. A Ca 2+ -ot a megemelkedett H + -koncentráció leszorítja az intracelluláris pufferekről, továbbá a H + - ok Na + /H + cseretranszporteren keresztüli eltávolítása miatt intracellulárisan megemelkedett Na + -ok NCX-en történő kilépésével Ca 2+ -ok lépnek a sejtbe (51,87). A sejt Ca 2+ i-mal való túltelődését fokozza, hogy a hosszantartó rövidülés és feszülés a sejt vázát alkotó citoszkeleton struktúrájának roncsolása mellett a sejtmembránt és a SR membránját is károsítja. A bennük keletkezett réseken keresztül a Ca 2+ szabadon áramolhat (129). A folyamatot súlyosbítja, hogy a magas Ca 2+ i-koncentráció következtében aktiválódott degeneratív enzimek tovább fokozzák a miocita membránjának degradációját (26,166). 1.5.1.2 A reperfúzió Az Ca 2+ i-túlterhelés által kiváltott kontraktúra A reperfúzió állapotát Ca 2+ i-túlterhelés és reaktív oxigén szabadgyökök képződése jellemzi. Abban az esetben, ha az iszkémia alatt a mitokondriumok nem szenvedtek irreverzibilis károsodást, a reperfúzió során létrejövő reoxigenizáció az energiatermelés gyors helyreállásához vezet. Elegendő mennyiségű ATP jelenlétében a rigor állapotában megrekedt szívizom újra kontrahálni kezd. Ugyanakkor a magas Ca 2+ i-koncentráció helyreállítása nem tart lépést a kontraktilis apparátus reaktiválódásával. Ennek következtében kontrollálatlan Ca 2+ -függő kontrakciók jönnek létre és kialakul az úgynevezett Ca 2+ i-túlterhelés okozta kontraktúra. A folyamat hátterében az áll, hogy nagy amplitúdójú és frekvenciájú oszcillációs Ca 2+ -szikrák jelennek meg a citoplazmában. Kialakulásukban egyrészt SR-ból felszabaduló nagy mennyiségű Ca 2+, 20

valamint az iszkémiát követő alacsony Na + -koncentráció miatt reverz módban üzemelő NCX-en keresztül a sejtbe áramló Ca 2+ -ok vesznek részt. Hosszan tartó iszkémiát követően a mitokondriumok nem képesek a sejt energiatermelését gyorsan helyreállítani, így a reperfúzió kezdetén a miocitákban tartósan alacsony marad az ATP szint. Az alacsony ATP szint az iszkémiához hasonló, Ca 2+ i-koncentrációtól függetlenül létrejövő úgynevezett rigor-típusú kontraktúra kialakulásához vezet (129) Az akut oxidatív stressz Az iszkémiát követő reperfúzió alatt a sejtet hirtelen olyan nagy mennyiségű oxigén árasztja el, ami a mitokondriális légzési lánc kapacitását meghaladja. Ennek következtében csak részben redukált, reaktív oxigén szabadgyökök képződnek: szuperoxid anion ( O - 2 ), hidroxil anion ( OH) és hidrogén-peroxid (H 2 O 2 ). A reperfúzió alatti szabadgyök képződés további forrásai az aktivált neutrofil granulociták NADPH oxidáz rendszere, az iszkémia alatt megemelkedett katekolaminok auto-oxidációja, valamint az ATP depléció miatt kialakuló xantin dehidrogenáz/xantin oxidáz enzim átalakulás (13). A fokozott szabadgyökképzés mellett az iszkémián átesett szívizom antioxidáns koncentrációja lecsökken, mivel az anaerob glikolízisre áttért miocita felhasználja a glutation regenerálásához szükséges redukált nikotinsavamid-adenindinukleotid-foszfátot (NADPH). A redukált glutation visszaoxidálódása nem következik be, ezért nem képes a szabadgyök megkötésére. Az oxigén szabadgyök molekulák rendkívül reaktívak, lipideket peroxidálnak, megváltoztatják a fehérjék szerkezetét és működését, befolyásolják a génexpressziót, károsítják a dezoxi-ribonukleinsav (DNS) struktúráját, apoptozist indukálnak. A lipid peroxidáció során károsodott membrán permeábilitása megnő korábban átjárhatatlan ionok számára. Ezzel tovább súlyosbodik az iszkémia alatt felborult intracelluláris ionhomeosztázis (103). Feltételezik, hogy az Ca 2+ i-túlterhelés és a szabadgyök képződés egymással szoros kapcsolatban van. Az Ca 2+ i-túlterhelés fokozza a szabadgyök képződést és fordítva. A megemelkedett Ca 2+ i-koncentráció Ca 2+ -függő proteázt aktivál, amely fokozza egyrészt 21

a xantin dehidrogenáz/xantin oxidáz enzim átalakulást, másrészt, károsítja a mitokondriális légzési lánc folyamatát, így elősegíti a szabadgyök képződést. A reaktív oxigén szabadgyökök ugyanakkor befolyásolják a miokardium Ca 2+ -transzport folyamatait, mivel károsítják a SR és a sejt membránját és gátolják az anaerob glikolízist (103). 1.5.2 Oxidatív és nitrozatív stressz által kiváltott kardiomiopátia Az oxidatív stressz által kiváltott kardiomiopátia egy olyan specifikus kórkép, amely leggyakrabban krónikus adriamycin (doxorubicin, DOX) kezelés után alakul ki. A DOX széles spektrumú antineoplasztikus antibiotikum, melyet számos malignus megbetegedés (leukémiák, limfómák és egyéb karcinómák) terápiája során alkalmaznak. A terápiás felhasználást azonban korlátozza a vegyület dózisfüggő kardiotoxikus hatása. Krónikus DOX kezelést követően ugyanis irreverzibilis kardiomiopátia alakul ki, melyet csökkent kamrai funkció, csökkent ejekciós frakció, kamradilatáció, megemelkedett szívfrekvencia és csökkent vérnyomás jellemez. Szövettani metszetekben a miocitákban vakuolumok figyelhetőek meg, amelyek degradált miofibrillumokkal teli kitágult szarkotubulusok (145,146). 1.5.2.1 A funkciózavar kialakulásának feltételezet mechanizmusai A DOX indukálta miokardiális funkciózavar hátterében számos mechanizmus állhat. Csökken a nukleinsav és a protein szintézis, vazoaktív aminok szabadulnak fel, módosul az adrenerg aktiváció, a mitokondriumokban funkciózavar lép fel, módosul a szarkolemmális Ca 2+ -transzport, csökken a Na + -K + -ATP-áz, a Ca 2+ -ATP-áz, az adenilát cikláz aktivitás, megindul szabad oxiradikálok fokozott képződése, felgyorsul a lipid peroxidáció (145). Valószínűnek látszik, hogy a kardiotoxikus hatás kialakulásáért főként az oxidatív és nitrozatív stressz okozta sejtkárosodás felelős (113,146,173). A szervezetbe került DOX ugyanis redukciós cikluson megy keresztül, amelynek során szabadgyökök képzőnek (145). A képződött szabadgyökök károsítják a sejt szerkezetét és megzavarják a sejt fiziológiás működését. A sejtfunkció irreverzibilis zavara egyben az adott szerv funkciójának zavarát is okozza. A szabadgyökök miokardium károsító képességének egyik bizonyítéka, hogy a szabadgyökök különféle farmakonokkal, (vas 22

kelátorok, antioxidáns vitaminok, NO-szintáz inhibitor) történő semlegesítése védelmet nyújt a DOX által kiváltott kardiotoxicitással szemben. Terápiás felhasználásukat azonban korlátozza a nem kívánt kóros mellékhatásuk (41,109,110, 124,145). A DOX által indukált kóros miokardiális kontrakció és sejthalál kialakulásához vezető pontos mechanizmus nem ismert. A miociták hipertrófiájának kialakulásában a peroxinitrit által kiváltott, fokozott mátrix metalloproteináz aktivitásnak tulajdonítanak feltételezett szerepet. A fokozott enzimaktivitás eredményeként felgyorsul az extracelluláris mátrix elemeinek lebomlása, és zavart szenved a miocitákban lezajló remodeling folyamata. Végül a sejt váza szétesik és a miocita excentrikusan hipetrófizál (4,151). Az oxidatív stressz során képződő szabadgyökök a mitokondriumok fiziológiás működését is megzavarják. A szabadgyökök hatására a mitokondriumokból fokozódik a citokrom c elválasztás. A citokrom c aktiválja a kaszpáz-3 enzimet, amely a sejtben apoptozist indukál (24,50,69). A mitokondriumok valószínűleg közvetlenül is károsodnak a DOX által indukált szabadgyökképződés hatására fellépő lipid peroxidáció folyamatában. Maga a DOX szelektíven gátolja azoknak a mitokondriális enzimeknek a transzkripcióját, amelyek a miocita fiziológiás energiatermelésében központi szerepet játszanak. Nevezetesen az ADP/ATP transzlokáz szívizom specifikus izoformját, a mitokondriális elektrontranszport vas-szulfur ún. Reiske fehérjét, valamint a 6- foszfofrukto-1-kináz izomspecifikus izoformját (63). Ez magyarázhatja a DOX szelektív kardiotoxicitását. 23

1.6 Az iszkémiás/reperfúziós és kardiomiopátiás állapotok ellen védő mechanizmusok a HS előkezelés, valamint a poli(adp-ribóz) polimeráz gátlása 1.6.1 Az iszkémiás/reperfúziós károsodással szembeni védelem a hősokk kezelés 1.6.1.1 A hősokk előkezelés védőhatása Az utóbbi két évtizedben számos olyan tanulmány készült, amelyben kimutatták, hogy hősokk (HS) előkezelés hatására megnő a szívizom iszkémiás/reperfúziós károsodással szembeni tűrőképessége (29,71,84,148,179). A szívizom kontrakciós ereje visszatér. A HS előkezelés kardioprotektív hatását Currie és kutatócsoportja mutatta ki elsőként patkány szíven. Kísérleteikben a HS előkezelés után 24 órával véghez vitt iszkémiát követő reperfúziós protokoll során a mechanikai restitúció javulását figyelték meg (29). Ezt a jótékony hatást később nyúl és kutya miokardiumban is tapasztalták (135,179). A HS előkezelés kardioprotektív hatása azonban a kor előrehaladtával egyre kevésbé érvényesül (47,93). Antiaritmiás hatás. A HS előkezelés mérsékli az iszkémiás/reperfúziós károsodás következtében kialakuló kamrai aritmiák kialakulását és időtartamát patkányokon végzett in vitro és in vivo kísérletekben (67,152). Az infarktus kiterjedése. A HS előkezelés mérsékli a koronária artériák okklúzióját követő reperfúzió során kialakuló infarktus kiterjedését egészséges és genetikailag létrehozott hipertrófizált szívizomban egyaránt (35,66). A miociták és a koronária endothel életképessége. HS előkezelés hatására alacsonyabb a sejt sérülését jelző markerek, azaz a kreatin kináz (29) és a laktát dehidrogenáz extracelluláris koncentrációja (162). A HS előkezelés megakadályozza, hogy a mitokondriumok szerkezete és működése sérüljön az iszkémiás/reperfúziós inzultus 24

során, valamint, hogy a nagyenergiájú foszfát raktárak ne ürüljenek ki teljesen (139,178). HS előkezelést követően mérséklődik a metabolikus acidózis. HS előkezeléssel kivédhető az iszkémia/reperfúzió okozta endotélsérülés miatt kialakuló koronária artéria diszfunkció. 1.6.1.2 A HS kezelést követő védőhatás kialakulásának feltételezett mechanizmusa A miocitákban a HS előkezelés hatására kifejlődő kardioprotektív hatás összetett intracelluláris kaszkádfolyamat végeredménye. A HS előkezelésre adott válasz három komponensre bontható: 1. a HS kezelés hatására képződő, a kardioprotektív választ beindító trigger molekulák és receptoraik (1. ábra, sötétszürkével jelölve), 2. a trigger molekulák kiváltotta szignál transzdukciós folyamatok (1. ábra, világosszürkével jelölve), 3. a kardioprotektív választ kiváltó mediátorok (1. ábra, fehérrel jelölve). Trigger molekulák és receptoraik A HS előkezelést követően a plazma katekolamin koncentrációja megemelkedik és fokozódik a miokardiális noradrenalin turnover is (78,79). Az α 1 -adrenerg receptorok blokkolásával a HS előkezelés kardioprotektív hatása nem alakul ki (66). A HS előkezelés következtében a NO termelés fokozódik, amelyet blokkolva szintén elmarad az HS előkezelés jótékony hatása (98). A HS előkezelés stimulálja a reaktív oxigén szabadgyökök és a citokinek termelését is. Ezeknek a molekuláknak a neutralizálása szintén a HS előkezelés kardioprotektív hatását csökkenti (40,74,138). Feltételezik, hogy a hem-oxigenáz-1 és a kalcitonin gén-kapcsolt peptid szintén szerepel a HS előkezelés védőhatásának kiváltásában (95). További triggermolekulaként tartják számon az opioidokat. Az δ 1 -opiod receptor gátlásával ugyanis elmarad a HS előkezelés kardioprotektív hatása (128). 25

HŐSOKK KEZELÉS opioidok ROS citokinek NO katekolaminok endokannabinoidok SZARKOLEMMA δ 1 -opioid receptor α 1 -adrenoreceptor PLC PIP 2 CB 2 receptor hem HO-1 CO NOS ROS NO DAG IP 3 K ATP csatorna CITOSZOL MAPK PKC MITOKONDRIUM SEJTMAG transzkripciós faktorok NF-κB HSF gén transzkripció NO Fokozott antoixidáns aktivitás Fehérje szintézis: HSP, COX-2, inos I/R SZEMBENI TŰRŐKÉPESSÉG 1. ábra. A HS előkezelés kardioprotektív hatásának feltételezett mechanizmusa.co: szén monoxid, COC-2: ciklooxigenéz-2, DAG: diacil-glicerol, HO-1: hemoxigenéz-1, HSF: hősokk faktor, HSP: hősokk fehérje, K ATP csatorna: ATP-függő kálium csatorna, MAPK: mitogén aktivált protein kináz, NO nitrogén-monoxid, inos: indukálható nitrogénmonoxid szintáz, NF-κB: nukleusz faktor κb, PIP2: foszfatidil-inozotol-difoszfát,plc: foszfolipáz C, PKC: protein kináz C, ROS: reaktív oxigén gyökök (Joyeux-Faure M et al. Cardovasc Res,2003,469-77). A jelátviteli mechanizmusok A HS előkezelést követő védőhatás kialakulásának feltételezett mechanizmusában az alábbi szignáltranszdukciós folyamatok szerepelnek. Foszfolipáz C (PLC) és protein kináz C (PKC). HS előkezelés hatására a szarkolemmában levő foszfatidilinozitol-4,5-difoszfátot (PIP 2 ) a PLC bontja DAG-ra és IP 3 -ra. A keletkezett DAG a protein kináz C-t aktiváláson keresztül kardioprotektív gének transzkripcióját idézi elő. A PKC aktivációját a HS előkezelés hatására képződött NO is képes előidézni (17). 26

Protein tirozin kinázok. Bár a protein tirozin kinázok gyógyszeres gátlásával nem marad el a HS kezelést követően kialakuló kardioprotektív hatás, a protein tirozin kinázok szerepe mégsem zárható ki, mivel fibroblasztokban HS előkezelés hatására létrejövő, fokozott c-src tirozin kináz aktivitást figyeltek meg (65). Mitogén aktivált protein-kinázok (MAPK). HS előkezelés hatására a p38 MAPK aktiválódását figyelték meg. Ugyanakkor, a HS előkezelést megelőzően adott p38 MAPK gátlószerrel a szívizom iszkémiával szembeni fokozott ellenállóképessége nem alakult ki. Bár a PKC által közvetített MAPK aktivitás kialakulásának pontos mechanizmusa egyenlőre nem ismert, feltételezik, hogy a MAPK a sejtmagban olyan gének átírását indukálja, amelyek kapcsolatban lehetnek a kardioprotektív hatás kialakulásával (132). A kardioprotektív választ kiváltó mediátorok A hősokk fehérjék Bár a folyamatos kutatások ellenére még ma sem tisztázott milyen folyamatok felelősek a hősokk fehérje (HSP) által közvetített szívizomvédelemért, valószínű, hogy a HSP család több tagja is kiemelt szerepet játszik a miociták iszkémiás inzultussal szembeni védelmében. Közvetlen kapcsolatot mutattak ki a hősokk előkezelést követően kialakuló HSP upreguláció és a szívizom iszkémia utáni mechanikai teljesítményének helyreállása között. A hősokk fehérjék szintézise A HSP-nek a stresszhatás által kiváltott károsodást mérsékelik, illetve, hogy jelenlétükkel a soron következő stressz okozta káros hatásokat kivédik. Bár a HSP-k nevüket onnan kapták, hogy első megismert képviselőjük HS előkezelést követően termelődött a sejtben, kiderült, hogy a HS előkezelésen kívül számos egyéb, a sejtet érő noxa is HSP termelődéshez vezet. A sejtet ért hipoxia, iszkémia, gyulladás, akut magas vérnyomás valamint nehézfémek, endotoxinok, reaktív szabadgyökök, farmakonok, anesztetikumok, alkohol stb. szintén HSP termelődést indukálnak. Az extracelluláris vagy intracelluláris stressz a sejtben inaktivált állapotban jelen levő hősokk-faktort 27

(HSF) aktiválja. Az aktivált hősokk-faktort a sejtmagba vándorol és a DNS HSPgénjéhez kötődve messenger ribonukleinsav (mrns) szintézist indukál. A HSP képződés lépései, a transzkripció és a transzláció folyamata meghatározott időt vesz igénybe. Ennek eredményeként késleltetett, illetve időben megnyújtott kardioprotektív hatás alakul ki. A HS előkezelés közvetítette jótékony hatás a kezelés utáni 24. órában éri el maximumát és mintegy 48-72 óráig tart (56). A folyamatos kutatások ellenére azonban még ma sem tisztázott milyen folyamatok felelősek a közvetlenül a HS előkezelés és/vagy a HSP által közvetített szívizomvédelemért (84,148). A hősokk fehérje családok A miokardiumban szintetizálódó HSP-ket molekulatömegük szerint csoportosítjuk. Ezen belül megkülönböztetünk konstitutív és indukálható formákat. Az indukálható formák a sejtet érő intracelluláris stresszt követően exszpresszálódnak és citoprotektív tulajdonságuk révén a sejt túlélését segítik elő. Ezzel szemben a HSP-k konstitutív formája stresszhatástól függetlenül is jelen vannak a sejtben. Ezeknek a molekuláris csaperonoknak (dajkafehérjéknek) a feladatuk, hogy a protein szintézis során biztosítsák a fehérjék háromdimenziós konformációját, amely hiányában denaturálóládnak, aggregálódnának(104). HSP70 Elsőként a HSP70 (a jelölés a molekulatömegre utal) fehérje családot hozták közvetlen összefüggésbe kardioprotektív hatásokkal. Humán HSP70 overexpresszált egerekben figyeltek meg iszkémiás/reperfúziós károsodást követően kialakuló jobb mechanikai restitúciót (75). A HSP 70 egyik fő feladata, hogy megakadályozza az iszkémia során sérült és ez által instabil formába került fehérjék denaturációját (56). A fehérjének ezt a funkcióját a 2-es számú sematikus ábra szemlélteti. A Hsp70 végzi a már denaturálódott és aggregálódott fehérjék degradálásához szükséges lizoszómális transzportot is. Ezen kívül a HSP70 szerepe a súlyos iszkémiás károsodás következtében létrejövő apoptózis kialakulásának gátlásában is felmerült (84). Humán HSP70 génnel rendelkező és HSP70 fehérjét expresszáló transzgenetikus egérmodellben közvetlen kapcsolatot mutattak ki a HSP70 termelődés és a miokardiális ATP és nagyenergiájú foszfátraktárak iszkémia 28

alatti konzerválódása, valamint a súlyos iszkémiás acidózis mérséklése között (131). Mindezek ellenére az iszkémiás/reperfúziós inzultusban nyújtott védő hatás pontos mechanizmusa egyelőre nem ismert (48). Transzláció HSP70 Hidrofób aggregáció ATP ADP ATP ADP ATP ADP ATP ADP kész fehérje HŐSOKK Denaturált fehérje HSP70 2. ábra. A HSP70 szerepe a fehérjék szerkezetének kialakításában és fenntartásában (Gray CC et al. IJBCB 1999;31:559-73). HSP90 A citoplazmában legnagyobb mennyiségben előforduló stresszfehérje a HSP90, amelynek endoplazmatikus retikulumbeli homológja a GRP94 (glukóz-regulált fehérje) (30). A Hsp90 molekuláris csaperon funkciója mellett részt vesz egyéb HSP-k transzkripciójának fokozásában, az aktinhoz és a tubulinhoz kötődve részt vesz az aktinmiozin interakció szabályozásában és hozzájárul a citoszkeleton dinamikájának befolyásolásában, ha a sejtet stresszhatás éri (48). A HSP90 legutóbb megismerésre került funkciója az endoteliális nitrogén-monoxid szintáz aktivitásának stimulálása. A HSP90 tehát a NO termelés közvetett fokozásával a véredények endotél-függő relaxációját képes előidézni (48). A GRP94 az endoplazmás retikulum alacsony 29