Újabb tenyésztésen, valamint nukleinsav amplifikációs módszereken alapuló technikák alkalmazása a Mycobacterium tuberculosis primér izolálására és rifampicin rezisztenciájának meghatározására Ph.D. értekezés Dr. Bártfai Zoltán Semmelweis Egyetem, Általános Orvostudományi Kar, Pulmonológiai Klinika Témavezető: Dr. Somoskövi Ákos Budapest, 2003 1
TARTALOMJEGYZÉK TARTALOMJEGYZÉK 2 ÖSSZEFOGLALÁS 4 SUMMARY 6 RÖVIDÍTÉSEK 8 AZ ÉRTEKEZÉS ALAPJÁUL SZOLGÁLÓ KÖZLEMÉNYEK JEGYZÉKE 9 1. BEVEZETÉS 11 1.1. Általános bevezető 11 1.1.1. A tuberkulózis megbetegedés és a Mycobacterium tuberculosis komplex 11 1.1.2. A tuberkulózis és az antituberkulotikum-rezisztens tuberkulózis epidemiológiája (I) 11 1.1.3. A tuberkulózis laboratóriumi diagnosztikájának alapjai (I) 13 1.1.4. Az antituberkulotikum rezisztencia (II, III, V) 16 1.2. A Mycobacterium tuberculosis izolálása az automatizált BACTEC MGIT 960 rendszer segítségével, összehasonlítva a BACTEC 460 TB rendszerrel és a Löwenstein-Jensen táptalajon való tenyésztéssel (IV) 19 1.3. Magyarországról származó Mycobacterium tuberculosis izolátumok rifampicinrezisztenciájának molekuláris elemzése DNS szekvenálással és Line Probe Assay segítségével (II, V) 20 2. CÉLKITŰZÉSEK 22 3. MÓDSZEREK ÉS ESZKÖZÖK 23 3.1. A Mycobacterium tuberculosis izolálása az automatizált BACTEC MGIT 960 rendszer segítségével, összehasonlítva a BACTEC 460 TB rendszerrel és a Löwenstein-Jensen táptalajon való tenyésztéssel (IV) 23 3.1.1. Betegek, minták 23 3.1.2. A minták előkészítése 23 3.1.3. Leoltás 23 3.1.4. Statisztika 24 3.2. Magyarországról származó Mycobacterium tuberculosis izolátumok rifampicinrezisztenciájának molekuláris elemzése DNS szekvenálással és Line Probe Assay segítségével (II) 25 3.2.1. Betegek, klinikai minták 25 3.2.2. Kontrollok és identifikálás 25 3.2.3. Hagyományos rezisztencia meghatározás 26 3.2.4. DNS szekvenálás 26 3.2.5. Line Probe Assay 28 2
4. EREDMÉNYEK 29 4.1. A Mycobacterium tuberculosis izolálása az automatizált BACTEC MGIT 960 rendszer segítségével, összehasonlítva a BACTEC 460 TB rendszerrel és a Löwenstein-Jensen táptalajon való tenyésztéssel (IV) 29 4.2. Magyarországról származó Mycobacterium tuberculosis izolátumok rifampicinrezisztenciájának molekuláris elemzése DNS szekvenálással és Line Probe Assay segítségével (II) 33 5. MEGBESZÉLÉS 38 5.1. A Mycobacterium tuberculosis izolálása az automatizált BACTEC MGIT 960 rendszer segítségével, összehasonlítva a BACTEC 460 TB rendszerrel és a Löwenstein-Jensen táptalajon való tenyésztéssel (IV) 38 5.2. Magyarországról származó Mycobacterium tuberculosis izolátumok rifampicinrezisztenciájának molekuláris elemzése DNS szekvenálással és Line Probe Assay segítségével (II, V) 42 6. ZÁRÓ KÖVETKEZTETÉSEK 46 7. KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS 48 8. IRODALOMJEGYZÉK 49 9. SAJÁT KÖZLEMÉNYEK JEGYZÉKE 59 9.1. Az értekezés témájával összefüggő közlemények 59 9. 2. Egyéb közlemények 61 3
Összefoglalás A tuberkulózis továbbra is jelentős népegészségügyi kihívást jelent a Föld minden pontján. Ismételt fellángolásában elsősorban gazdasági és szociális tényezők, a humán immundeficiencia vírus és a tuberkulózis közötti szinergizmus, valamint a XX. század végén újabb komoly fenyegetésként megjelent rezisztens és multidrog rezisztens tuberkulózis terjedése játszik kiemelkedő szerepet. Mindezek miatt fontos szem előtt tartani a Center for Disease Control and Prevention jelenlegi ajánlását, miszerint a Mycobacterium tuberculosis complex izolálása, identifikálása valamint az ezt követő rezisztencia vizsgálatok lehetőleg a mintavétel időpontjától számított 2-3 (izolálás, identifikálás) illetve 2-5 (rezisztencia meghatározás) héten belül történjenek meg. Ahhoz, hogy ez az ajánlás a gyakorlatban is megvalósítható legyen, nélkülözhetetlen egyrészt az újabb folyékony táptalaj alapú rendszerek rutinszerű alkalmazása, másrészt az antituberkulotikum- és ezek közül is az egyik legfontosabb, a rifampicin-rezisztencia minél gyorsabb és pontosabb kimutatása. A vizsgálat első lépéseként, a különböző tenyésztési eljárások elemzése céljából két különböző folyékony és egy hagyományos szilárd táptalaj használatával összehasonlító vizsgálatot végeztünk a mycobacterium törzsek kimutathatóságának szempontjából. 377 klinikai mintából 57 mycobacterium törzs (Mycobacterium tuberculosis, n = 55; nem tuberculosist okozó mycobacterium, n = 2) volt izolálható. BACTEC MGIT 960 folyékony táptalaj esetén 96,4%, BACTEC 12B folyékony táptalajjal 92,7%, míg Löwenstein-Jensen szilárd táptalaj alkalmazásakor 81,8% volt a Mycobacterium tuberculosis izolálási rátája. A mikroszkóposan pozitív Mycobacterium tuberculosis átlagos tenyésztési ideje 12,6 nap volt BACTEC MGIT 960 rendszerrel, 13,8 nap BACTEC 12B médiummal, és 20,1 nap Löwenstein-Jensen táptalajon. Mikroszkóposan negatív törzsek izolálásakor az átlagos tenyésztési idő BACTEC MGIT 960 alkalmazásával 15,8 nap, BACTEC 12B használatával 17,7 nap, Löwenstein-Jensen táptalajon pedig 42,2 nap volt. A kontaminációs ráta 3,7 % volt BACTEC MGIT 960, 2,9 % BACTEC 12B és 1,2% Löwenstein-Jensen táptalaj esetén. Eredményeink összefoglalása alapján elmondható, hogy a nem radiometriás, teljesen automatizált 7 ml-es BACTEC MGIT 960 rendszer megbízható alternatívája lehet a félig automatizált, radiometriás BACTEC 460 TB rendszernek. 4
A kutatások következő lépéseként Magyarország három megyéjéből származó 29 rifampicin-rezisztens Mycobacterium tuberculosis törzsnél két olyan rpob génszakaszt vizsgáltunk, amelyek összefüggést mutattak a rifampicin-rezisztenciával. A 29 rezisztens törzsből 27-nél találtunk mutációt a 81 bázispár régióban (26 törzs), illetve az N-terminális régióban (1 törzs), míg két törzs esetében egyik szakaszon sem lehetett mutációt kimutatni. A mutációk lokalizációja és gyakorisága eltért a korábban közöltektől. A D516V mutáció, amely a leggyakoribb volt a jelen vizsgálatban, 38%- ban volt kimutatható a magyar törzsekben, ami 2-10-szer gyakoribb, mint más országokban. A 29 izolátumot az Inno-LiPA Rif. TB teszttel (LiPA) is megvizsgáltuk, ami a rifampicin-rezisztencia gyors kimutatását szolgáló reverz hibridizációs teszt. A LiPA teszt 26 rezisztens törzsben mutatta ki az rpob mutációt, de 4 izolátumban nem tudta meghatározni a mutáció típusát, mivel a LiPA teszt nem tartalmazta ezeket a mutációkat. Emellett az egyik rifampicin-érzékeny kontroll törzsben lévő néma mutációt a LiPA teszt rifampicin-rezizstens mutációnak minősítette. Eredményeink azt jelzik, hogy elengedhetetlen a gyors molekuláris tesztek validálása az egyes földrajzi területeknek megfelelően, a DNS szekvencia analízis segítségével, mielőtt egy adott tesztet a rutin diagnosztikába bevezetnek. 5
Summary Tuberculosis continues to be a great challenge all over the world. The cause of recent epidemic is multifactorial, including economic and social factors, synergism between the human immundeficiency virus and Mycobacterium tuberculosis and spreading of multidrug resistant tuberculosis, what emerged as an important problem by the end of the XX. century. For these reasons the present recommendations of Center for Disease Contol and Prevention should be kept in mind, it states that the complex isolation, identification and further resistance examinations of Mycobacterium tuberculosis should be performed within 2-3 weeks (isolation, identification) and 2-5 weeks (resistance tests) after sample taking. Routine use of new liquid media and the more rapid and accurate detection of antituberculotic especially rifampicin resistance are essential factors for putting these recommendations into daily clinical practice. Using two different liquid media and one conventional solid medium, a total of 57 mycobacterial isolates (Mycobacterium tuberculosis, n = 55; nontuberculous mycobacteria, n = 2) were recovered from 377 clinical specimens. The rates of recovery of Mycobacterium tuberculosis were 96,4% with the BACTEC MGIT 960 liquid medium, 92,7% with BACTEC 12B liquid medium, and 81,8% with the Löwenstein- Jensen medium. The mean time to detection of Mycobacterium tuberculosis in smearpositive specimens was 12,6 days for BACTEC MGIT 960 medium, 13,8 days for BACTEC 12B medium, and 20,1 days for Löwenstein-Jensen medium, and in smearnegative specimens it was 15,8 days for BACTEC MGIT 960 medium, 17,7 days for BACTEC 12B medium, and 42,2 days for Löwenstein-Jensen media, respectively. In conclusion, the nonradimetric, fully automated 7-ml BACTEC MGIT 960 system can be considered a viable alternative to semiautomated, radiometric BACTEC 460 TB system. Two regions of rpob associated with rifampin resitance were sequenced in 29 rifampin-resistant (determinde by the proportion method) isolates of Mycobacterium tuberculosis obtained from patients from three counties of Hungary. Of the 29 resistant strains, 27 had a mutation either the 81-bp region (26 strains) or the N-terminal region (1 strain), while the other 2 strains had no mutations in either region. The locations and frequencies of the mutations differed from those previously reported. The most common 6
mutation in this study, D516V, was found in 38% of the Hungarian strains, a frequency 2 to 10 times higher than that found in studies from other countries. These same 29 isolates were also evaluated with the Inno-LiPA Rif. TB test (LiPA), a reverse hybridization assay for the rapid detection of rifampin resistance. Although LiPA detected the presence of an rpob mutation in 26 of the resistant isolates, the type of mutation could not be determined in 4 isolates because the mutations present were not among those included on the LiPA strip. In addition, a silent mutation in one of the rifampin-susceptible control strains was interpreted as rifampin resistant by LiPA. These findings demonstrate the importance of validating this rapid molecular test by comparison with DNA sequence results in each geographic location before incorporating the test into routine diagnostic work. 7
Rövidítések AIDS szerzett immunhiányos szindróma ATCC - American Type Culture Collection bp bázis pár DNS dezoxiribonukleinsav EMB ethambutol HIV humán immundeficiencia vírus INH isonicid LIPA Line Probe Assay LJ Löwenstein-Jensen MGIT Mycobacteria Growth Indicator Tube MDR multi drog rezisztens M. tuberculosis Mycobacterium tuberculosis NTM - nem tuberculosist okozó mycobacteriumok RMP rifampicin RNS- ribonukleinsav rpob RNS polimeráz -alegység PCR polimeráz láncrekció PZA pyrazinamid SM - streptomycin TBC tuberkulózis ZN - Ziehl-Neelsen Az értekezés alapjául szolgáló közlemények jegyzéke 8
Ez az értekezés az alábbi közleményeken alapszik, amelyekre a szövegben az itt jelzett római számozásukkal történik hivatkozás: I. Bártfai Z., Somoskövi Á., Hutás I. A tuberculosis járványtana, terjedése, patológiája, diagnosztikája és klinikai megjelenési formái. Családorvosi Fórum 2001; január:10-15. II. Bártfai Z., Somoskövi Á., Ködmön CS., Szabó N., Puskás E., Kosztolányi L., Faragó E., Mester J., Parsons L.M., Salfinger M. Molecular characterization of rifampin-resistant isolates of Mycobacterium tuberculosis from Hungary by DNA sequencing and the Line Probe Assay. J. Clin. Microbiol. 2001; 39:3736-3739. IF: 3,965 III. Mester J., Vadász I., Bártfai Z., Ködmön Cs., Somoskövi Á. A Mycobacterium tuberculosis antituberkulotikum-rezisztenciájának molekuláris alapjai. Medicina Thoracalis 2002; 55:30-36. 9
IV. Somoskövi Á., Ködmön Cs., Lantos Á., Bártfai Z., Tamási L., Füzy J., Magyar P. Comparison of recoveries of Mycobacterium tuberculosis using the automated BACTEC MGIT 960 system, the BACTEC 460 TB system, and Löwenstein- Jensen Medium. J. Clin. Microbiol. 2000; 38:2395-2397. IF: 3,965 V. Bártfai Z., Somoskövi Á., Hutás I. A tuberculosis elleni küzdelem, a betegség gyógykezelése, a betegek gondozása Családorvosi Fórum, 2001; január:16-19. 10
1. Bevezetés 1.1. Általános bevezető 1.1.1. A tuberkulózis megbetegedés és a Mycobacterium tuberculosis complex Nitrogén kötő aktivitásuk és más mikroorganizmusok tápanyag szükségleteit kielégítő szervesanyag bontó képességük folytán, a Mycobacterium genus legtöbb tagja a talaj és a felszíni víztakaró hasznos és nélkülözhetetlen lakója. Néhány mycobacterium faj azonban az evolúció során kórokozóvá vált. Ezek közül is a Mycobacterium tuberculosis komplexhez tartozó Mycobacterium tuberculosis (M. tuberculosis) és M. bovis vált a legjelentősebbé. Habár a komplex tagjai (M. tuberculosis, M. bovis, M. bovis bacillus Calmette-Guerin, M. africanum, M. microti, M. canetti, M. caprae) között virulenciájukat valamint a gazdaszervezetet illetően számottevő különbségek észlelhetők, genetikailag mintegy 99,9%-os dezoxiribonukleinsav (DNS) szintű azonosságot mutatnak. Így ezeket az organizmusokat sokkal inkább alfajoknak semmint egymástól elkülönülő fajoknak tartják 1-3. A tuberkulózis a M. tuberculosis okozta fertőzés eredményeképp kialakuló kórkép. A leggyakoribb kórformaként jelentkező tüdőtuberkulózisban a kórokozó hatására a különféle szabályozó mediátorokat termelő alveoláris makrofágok és limfociták aktivációja és felszaporodása, és ennek következményeként egy T helper limfocita/makrofág alveolitis kialakulása figyelhető meg 4-7. 1.1.2. A tuberkulózis és az antituberkulotikum-rezisztens tuberkulózis epidemiológiája (I) A tuberkulózis továbbra is jelentős népegészségügyi kihívást jelent a Föld minden pontján. Világszerte évente mintegy 8 millió ember betegszik meg újonnan és 2 millió ember hal meg csak tuberkulózis következtében. A Föld lakosságának egyharmada M. tuberculosis-sal fertőzött 8-10. A tuberkulózis tehető felelőssé az elkerülhető felnőttkori halálokok 25%-ért, és ugyancsak figyelemre méltó, hogy a megbetegedettek 80%-a gyermekkorú vagy a munkavégzés szempontjából legproduktívabb 15-59 éves korosztályhoz tartozik 8-10. Az Egészségügyi Világszervezet előrejelzése alapján 2000 és 2020 között közel 1 milliárd ember válik újonnan fertőzötté 11
és ezek közül várhatóan 200 millió egyénben ez a fertőzés klinikai megbetegedéshez vezet majd. Ezen 200 millió ember közül 35 millió menthetetlenül meghal amennyiben a tuberkulózis elleni védekezés nem erősödik számottevően a jövőben 8-10. A helyezet súlyosságát jelzi, hogy jelenleg minden másodpercben egy újabb egyén fertőződik meg M. tuberculosis-sal, és annyian halnak meg tuberkulózis következtében mintha a nap minden órájában lezuhanna egy Boeing 747-es utasszállító repülőgép. A M. tuberculosis fertőzöttek élete során kb. 10%-ban a fertőzés biztosan megbetegedéshez vezet. A humán immundeficiencia vírus (HIV) fertőzöttek esetében ugyancsak a fertőzöttek 10%-ban várható tuberkulózis megbetegedés kialakulása, mégpedig az expozíciót követő egy éven belül 5, 8-10. Évi mintegy 1,5 millió új megbetegedés a szub-szaharai Afrikából származik, és ez a mutató a HIV/AIDS epidémiának köszönhetően évről évre drasztikusan emelkedik. Közel évi 3 millió új eset dél-kelet ázsiai országokban (India, Kína) jelentkezik, míg Kelet-Európában évente negyedmillió új megbetegedést regisztrálnak 8-11. A tuberkulózis ismételt fellángolásában elsősorban gazdasági és szociális tényezők, a HIV vírus és a tuberkulózis közötti szinergizmus (világszerte az AIDS betegek 15%-a hal meg tuberkulózisban), valamint a XX. század végén újabb komoly fenyegetésként megjelent rezisztens és multidrog rezisztens tuberkulózis (MDR, rezisztencia legalább isonicidre és rifampicinre) terjedése játszik kiemelkedő szerepet. Az Egészségügyi Világszervezet adatai szerint 1995-ben mintegy 50 millió ember volt fertőzött rezisztens M. tuberculosis törzzsel 11, 12. Magyarországon több évtizedes csökkenést követően 1990 és 1995 között a tuberkulózis incidenciája jelentős, 23,5%-os (34,0 per 100 000 lakosról 42,0 per 100 000 lakosra), míg a pulmonalis tuberkulózis incidenciája 28,7%-os (31,0 per 100 000 lakosról 39,9 per 100 000 lakosra) növekedést mutatott 9, 13. 1996 és 2001 között a hatásosnak tekinthető programok valamint a Nemzeti Tuberkulózis Surveillance Rendszer bevezetésének köszönhetően mindkét incidencia csökkenő tendenciája volt megfigyelhető (tuberkulózis: 42,0 per 100 000 lakosról 32,5 per 100 000 lakosra; pulmonalis tuberkulózis: 39,2 per 100 000 lakosról 30,2 per 100 000 lakosra) 10, 14-17. A megbetegedések előfordulása jelentős földrajzi különbségeket is mutat, elsősorban a szociális helyzet, a bevándorlás, illetve határokon keresztüli migráció, valamint a 10, szűrési fegyelem meglazulásának következményeként 14-17. A pulmonalis 12
tuberkulózis incidenciája tartósan a legmagasabb Szabolcs-Szatmár-Bereg megyében (50,3 per 100 000 lakos), de a szomorú statisztikában kiemelkedik, Hajdú-Bihar (34,2 per 100 000 lakos), Jász-Nagykun-Szolnok (34,1 per 100 000 lakos), Borsod-Abaúj- Zemplén (27,7 per 100 000 lakos) megye illetve Budapest (40,24 per 100 000 lakos) is 10, 16, 17. Mindezen mutatók mellett a 2000-es epidemiológiai jelentések alapján, rezisztens és MDR eset az összes megbetegedett 12,9 illetve 2,1%-ban fordult elő. A látszólag kedvező adatok kapcsán nem szabad figyelmen kívül hagyni azonban, hogy a betegek (3598 fő) csak 39,7%-ban állt rendelkezésre pozitív tenyésztés és ezeknek csak 67,4%-ból történt végül rezisztencia vizsgálat 17. 1.1.3. A tuberkulózis laboratóriumi diagnosztikájának alapjai (I) A klinikai mycobacteriológia alapvető szerepet játszik a tuberkulózis elleni hatékony védekezésben, hiszen a tuberkulózis definitív klinikai diagnózisának felállításához nélkülözhetetlen feltétel a kórokozó baktérium izolálása és identifikálása. Önmagában a klinikum, valamint a radiomorfológiai kép a mycobacteriológiai vizsgálatok hiányában nem eléggé specifikus a tuberkulózis diagnózisának felállításában, hiszen a tuberkulózishoz hasonló panaszok és radiológiai eltérések más tüdőbetegségben is előfordulhatnak 18. Továbbá a röntgenkép alapján gyakran az akutan zajló tuberkulózis és egy korábban lezajlott folyamat maradványai között sem lehet különbséget tenni. A mycobacteriológiai vizsgálatok a kezelés hatásosságának monitorozásához is elengedhetetlen információkat szolgáltatnak, részben a kórokozó kimutathatóságával, részben az izolálást követő rezisztencia vizsgálatok eredményeivel. A mikroszkópia a mycobacteriológiai vizsgálatok legolcsóbb, legegyszerűbben kivitelezhető és leggyorsabb módszere. A kenetkészítést követően a festés vagy Ziehl- Neelsen (ZN) féle karbol fukszin alapú vagy auramin alapú fluoreszcein eljárásokkal történhet 19, 20. A mikroszkópia legnagyobb hátránya, hogy nem kellően érzékeny és a negatív eredmény kiadásához minimum 100-300 látótér áttekintése szükséges, ami meglehetősen munkaigényes. A mikroszkópia érzékenysége az adott beteg populáción belül a kiterjedt tuberculosisban szenvedő betegek hányadától, a vizsgált minta típusától, a mintagyűjtés minőségétől, a mycobacteriumok mintán belüli számától, az alkalmazott dekontaminálási és centrifugálási módszertől függően 50-75% 21, 22. Míg a pozitív mikroszkópos eredmény a tuberkulózis preszumptív diagnózisa mellett szól, 13
addig a negatív eredmény, az alacsony érzékenységi mutató miatt, nem zárja ki a tuberkulózis lehetőségét. Legalább 10 000 mycobacterium milliliterenkénti jelenléte szükséges ahhoz, hogy egy kenet teljes átvizsgálását követően legalább néhány saválló pálca megfigyelhető legyen 20. A mikroszkóposan pozitív betegek megkülönböztetett figyelmet igényelnek, hiszen az általuk ürített baktérium mennyiség miatt ezek a páciensek a legfertőzőbbek. Éppen ezért, hogy az ilyen esetben szükséges izolációs lépések időben foganatosíthatók legyenek, a mikroszkópos vizsgálat eredményét a laboratórium 24 órán belül vissza kell hogy jelezze a vizsgálatkérő számára. Nem szabad elfeledkezni azonban arról sem, hogy a mikroszkópia nem képes különbséget tenni élő és élettelen mycobacterium között. Így egy megfelelően kezelt és ellenőrzött beteg esetében a mikroszkópos negatívvá válást követő esetleges pozitivitás nem feltétlenül a klinikai romlás jele. Ugyancsak fontos szem előtt tartani azt a tényt is, hogy a mikroszkópia nem tud különbséget tenni a M. tuberculosis complex és a nem tuberculosist okozó mycobacteriumok (NTM) között. Azaz a kenet pozitivitás atípusos mycobacterium jelenlétének eredménye is lehet, amely nem biztos hogy aktuálisan klinikai fontossággal bír. Mint minden laboratóriumi vizsgálati leletet, így a mikroszkópia eredményét is az egyéb klinikai adatok tükrében kell kezelni. A mycobacteriológiai vizsgálatok következő lépése a tenyésztés. A mycobacteriumok izolálására használt talán legismertebb táptalaj a tojás alapú, szilárd Löwenstein-Jensen (LJ) táptalaj. Az agar alapú táptalajok, mint amilyen a Middlebrook 7H10 vagy 7H11 agar, a LJ táptalajhoz képest némileg gyorsabb tenyésztési idő, és a transzparenciájuk folytán egyszerűbb kolónia morfológia vizsgálat lehetősége miatt kedveltek 20, 23-25. Mindazonáltal, ezeken a hagyományos szilárd táptalajokon a M. tuberculosis complex telepei ritkán jelennek meg korábban mint 6-8 hét. Az izolálást követő identifikálás, majd rezisztencia meghatározás további 3-6 héttel növelheti ezt az amúgy is tetemes tenyésztési időt 20, 23-25. Mindemellett vizsgálatok azt is igazolták, hogy csak szilárd táptalajon tenyésztve a klinikailag egyértelműen tuberkulózisként diagnosztizált esetek mintegy 20-30%-ban nem sikerült a M. tuberculosis izolálása 26-30. Ez az adat világosan jelzi, hogy a szilárd táptalajon való tenyésztés érzékenysége, bár lényegesen jobb mint a mikroszkópiáé, mégsem haladja meg a 70-80%-ot. Folyékony táptalajon tenyésztve, a tenyésztési idő a minta mycobacterium tartalmától függően 1-3 hétre rövidíthető. Emellett a folyékony táptalajok szenzitivitása 14
90% feletti. Hátrányuk, hogy jóval hajlamosabbak a befertőződésre 26-30. A jelenleg arany standardnak tekintett folyékony táptalaj alapú rendszer a BACTEC 460 TB rendszer (Becton-Dickinson Diagnostic Instrument Systems, Sparks, Md., U.S.A.). Önmagában sem a szilárd, sem a folyékony táptalaj érzékenysége nem éri el a 100%-ot, azaz mindkét táptalajtípus esetében előfordulhatnak olyan törzsek, amelyek vagy csak az egyik vagy csak a másik táptalajtípuson képesek növekedni. Ez az oka, hogy jelenleg a nemzetközi ajánlásoknak megfelelően a mycobacteriumok izolálása legalább két szilárd és egy folyékony táptalaj kombinációján kell, hogy alapuljon a kórokozó minél gyorsabb és érzékenyebb detektálása, valamint a rezisztencia vizsgálatok minél gyorsabb elvégezhetősége érdekében 20, 31, 32. Amennyiben növekedés nem észlelhető az inokulált szilárd vagy folyékony táptalajokon úgy negatív tenyésztési eredmény 8 illetve 6 hetes inkubálást követően adható ki 26, 27. 1.1.4. Az antituberkulotikum rezisztencia (II, III, V) A Mycobacterium tuberculosis és a komplex többi tagja számos specifikus mechanizmust használva alakítja ki az antibiotikumokkal és antituberkulotikumokkal szembeni rezisztenciáját. A mycobacterium elsődleges védelmi rendszere a speciális hidrofób sejtfal, amely nagymértékben csökkenti a legtöbb vegyület permeabilitását (1. ábra) 33-35. Kutatások igazolták, hogy a M. tuberculosis-ban több különböző, a gyógyszerek eltávolítását segítő aktív pumpa rendszer, a gyógyszerek inaktiválását és aktiválását végző enzim, valamint ezeket a funkciókat irányító gének találhatók 36, 37. Az eddigi genetikai vizsgálatok szerint a M. tuberculosis antituberkulotikumokkal szembeni rezisztenciájának kialakulásában vagy a gyógyszer támadáspontját kódoló génekben, vagy a gyógyszer aktiválásáért felelős enzimeket kódoló génekben kialakuló spontán pontmutációk a felelősek. A rezisztenciával kapcsolatos pontmutációk, deléciók és inzerciók az összes elsővonalbeli szernél (isonicid (INH), rifampicin (RMP), pyrazinamid (PZA), ethambutol (EMB) és streptomycin (SM)) és már néhány másodvonalbeli újabb szernél (ethionamid, fluorokinolonok, makrolidek, nitroimidazopirin) is felismerésre kerültek 38-43. Mindezek alapján nagy valószínűséggel kizárható egy olyan egyedüli gén jelenléte, amelynek mutációi önmagukban vezetnének MDR fenotípus kialakulásához. Ezzel szemben úgy tűnik, hogy az MDR több, egymással párhuzamosan, illetve lépcsőzetesen kialakuló mutációk sorozatának az 15
eredménye a különböző génszakaszokon. Rezisztencia leggyakrabban a nem megfelelő gyógyszeres kombináció és dózis, a beteg együttműködésének hiányos volta következtében az egyébként kis kópiaszámban jelenlévő mutáns törzsek szelektálódásával alakul ki. Mivel az MDR törzsek kialakulása halmozódó mutációk következménye, a M. tuberculosis szaporodását megfelelő kombinált kezeléssel (legalább három, de inkább négy antituberkulotikummal) lehet eredményesen befolyásolni 44, 45. 16
1. ábra. Az isonicid, pyrazinamid, rifampicin, és ethambutol feltételezett hatásmechanizmusa a Mycobacterium tuberculosis sejten. INH Szabad sejtfal glikolipidek és peptidek Mycolsav Arabinogalaktán Porin Lipoarabinomannán (LAM) EMB Sejtfal és cytoplazma membrán PZA Rövid szénláncú zsirsavprekurzor Kromoszómális DNS RNS polimeráz (ß-alegység) Cytoplazma RMP RNS transzkripció 17
1.2. A Mycobacterium tuberculosis izolálása az automatizált BACTEC MGIT 960 rendszer segítségével, összehasonlítva a BACTEC 460 TB rendszerrel és a Löwenstein-Jensen táptalajon való tenyésztéssel (IV) A Center for Disease Control and Prevention jelenlegi ajánlása az, hogy a M. tuberculosis complex izolálása, identifikálása valamint az ezt követő rezisztencia vizsgálatok lehetőleg a mintavétel időpontjától számított 2-3 (izolálás, identifikálás) illetve 2-5 (rezisztencia meghatározás) héten belül történjenek meg 46. Ahhoz, hogy ez az ajánlás a gyakorlatban is megvalósítható legyen és ezáltal a klinikus számára a tuberkulózis definitív diagnózisa, valamint az ugyancsak elengedhetetlenül szükséges rezisztencia vizsgálatok eredménye mihamarabb rendelkezésre álljon nélkülözhetetlen az újabb, folyékony táptalaj alapú rendszerek rutinszerű alkalmazása. A radiometriás BACTEC 460 TB folyékony táptalaj alapú rendszer (Becton Dickinson Diagnostic Instrument Systems, Sparks, Md.) alkalmazása nagymértékben javította a mycobacterium tenyésztés érzékenységét, és egyúttal jelentősen megrövidítette a detektálás idejét. Ugyanakkor a tenyésztés még ezen eljárás alkalmazásával is munkaigényes és a radioizotópok használata miatt fokozott figyelmet igényel a speciális biztonsági előírások és rendszabályok betartása 47. Korábbi felmérések adatai szerint a 4-ml-es Mycobacteria Growth Indicator Tube (MGIT; BBL Becton Dickinson Microbiology Systems, Cockeysville, Md.) és az MB Redox (Biotest AG, Dreieich, Germany) folyékony táptalajok a BACTEC 460 TB rendszer megfelelő nem radiometriás alternatívái lehetnek 26, 48, 49. Ezen módszerek azonban manuális kivitelezést igénylő, nem automatizált rendszerek, amelyek leginkább azon laboratóriumok számára alkalmasak, melyeknek nem áll módjában az automatizált módszerek bevezetése, vagy az alacsony feldolgozandó mintaszámnak köszönhetően nincs szüksége műszerezett rendszerre. A nagyszámú mintákkal dolgozó laboratóriumok számára azonban a tenyésztés automatizálása igen fontos kérdés. Bár a közelmúltban kifejlesztett MB/BacT (Organon Teknika, Turnhout, Belgium) és ESP II (Difco Laboratories, Detroit, Mich.) tenyésztési rendszerek teljesen automatizáltak, sajnos mindkét módszer esetében az alkalmazott műszerek kapacitása igen csekély (MB/BacT 240 cső gépenként; ESP II 384 cső gépenként) 28, 30, 50, 51. Ezért magasabb mintaszám esetén több műszerre is szükség lehet, ami jelenleg csak nagyon kevés laboratórium számára elfogadható anyagi teher. A BACTEC MGIT 960 rendszer nagy 18
kapacitású, teljesen automatizált, a tenyésztést folyamatosan monitorozó, nem radiometriás rendszer, mely 960 darab 7 ml-es MGIT csövet képes egyszerre befogadni 52, 53. A tenyésztéshez használt MGIT csövek egy olyan fluoreszcens szenzort tartalmaznak, mely a táptalaj oxigénkoncentrációjának csökkenésére reagál. A műszer fotodetektora minden csőben 60 percenként méri a fluoreszcenciát. A fluoreszcencia szintje megfelel a táptalajra leoltott mintákban esetlegesen jelenlévő mikroorganizmusok által felhasznált oxigénszint csökkenés mértékének, ezáltal az osztódó baktériumok számának. Mikor a fluoreszcencia mértéke egy bizonyos határértéket elér, a szerkezet a csőben levő mintát pozitívnak értékeli, és ezt kijelzi. Jelen tanulmány célja az MGIT rendszer szenzitivitásának és az átlagos tenyésztési idejének a meghatározása volt a referencia BACTEC 12B és LJ szilárd táptalajjal összevetve. Az eredmények alapján a MGIT rendszer rutin diagnosztikai alkalmazhatóságát értékeltük. 1.3. Magyarországról származó Mycobacterium turberculosis izolátumok rifampicin-rezisztenciájának molekuláris elemzése DNS szekvenálással és Line Probe Assay segítségével (II, V) Az antituberkulotikum rezisztens M. tuberculosis törzsek egyre gyakoribb előfordulása miatt világszerte nagy az igény az antituberkulotikum- és ezek közül is a RMP-rezisztencia minél gyorsabb és pontosabb kimutatására, hiszen a RMP az egyik legfontosabb antituberkulotikum 33-35. A RMP az aktív metabolizmust folytató M. tuberculosis baktériumokat pusztítja igen hatékonyan, a klinikai relapszus hátterében a legtöbb esetben RMP-rezisztencia áll 44, 45, 54, 55. Mivel a hagyományos érzékenységi tesztek elvégzése hosszú időt vesz igénybe, a rezisztens törzsekkel fertőzött betegek kezelése nem mindig adekvát és így hosszabb ideig maradnak fertőzőképesek, mint azok a betegek, akiknél a fertőzést érzékeny törzsek okozzák. Számos molekuláris módszert fejlesztettek ki a M. tuberculosis RNS polimeráz ß-alegység (rpob) régió mutációinak gyors (24-48 óra) kimutatására, ami azon a kollektív megfigyelésen alapul, miszerint a RMP-rezisztens M. tuberculosis törzsek több mint 96%-ában találhatók olyan mutációk az rpob gén 81 bázispárnyi (bp) core régiójában, melyek aminosav cseréhez vezetnek 56-64. Azt is kimutatták, hogy a RMPrezisztenciával járó mutációk bár ritkábban, de az rpob gén egyéb területén is 19
előfordulhatnak 65-67. Ezeknek a molekuláris teszteknek az eredményei epidemiológiai markerként is szolgálhatnak, mivel a rezisztenciáért felelős allélok relatív gyakorisága földrajzi területenként változhat 57, 68. 20
2. Célkitűzések Vizsgálataink célkitűzései a következők voltak: A teljesen automatizált MGIT 960 folyékony táptalaj alapú rendszer magyarországi bevezetése a Semmelweis Egyetem Pulmonológiai Klinikáján. A teljesen automatizált MGIT 960 folyékony táptalaj alapú rendszer értékelése az érzékenység és az átlagos tenyésztési idő vonatkozásában a Bactec 460TB rendszerrel valamint a hagyományos LJ táptalajon végzett tenyésztéssel összevetve a M. tuberculosis primer izolálását illetően. Magyarországon izolált RMP-rezisztens M. tuberculosis izolátum rezisztencia profiljának meghatározása az első vonalbeli antituberkulotikumokra (INH, RMP, EMB és SM). Magyarországon izolált RMP-rezisztens M. tuberculosis izolátum RMP rezisztenciával összefüggésbe hozható, az rpob génen jelenlévő mutációk kimutatása és karakterizálása. 21
3. Módszerek és eszközök (II, IV) 3.1. A Mycobacterium tuberculosis izolálása az automatizált BACTEC MGIT 960 rendszer segítségével, összehasonlítva a BACTEC 460 TB rendszerrel és a Löwenstein-Jensen táptalajon való tenyésztéssel (IV) 3.1.1. Betegek, minták A vizsgálatok a Semmelweis Egyetem Pulmonológiai Klinikájának Mycobacteriológiai Laboratóriumában történtek. A 243 betegből származó 377 klinikai minta (288 köpet, 51 bronchoalveolaris lavage vagy bronchialis váladék aspirátum, 32 gyomormosó folyadék, és 6 pleuralis fluidum) 1999. március 29. és 1999. május 31. között került levételre. Valamennyi beteg HIV negatív volt. 3.1.2. A minták előkészítése Minden klinikai minta a Kent és Kubica 25 által leírt N-acetyl-L-cystein-NaOH metodikának megfelelő emésztésen és dúsításon esett át. A NaOH-t 4%-os koncentrációban (induló koncentráció) használtuk. A dekontaminációt és dúsítást követően mikroszkópos vizsgálat céljából a minták koncentrált üledékből keneteket készíttettünk, melyeket ZN szerint festettünk meg. A visszamaradó üledéket 1,5 ml steril foszfát puffer sóoldatban (ph 6,8) oldottuk fel. A minták leoltása előtt a BACTEC MGIT 960 és a BACTEC 12B csöveket a gyártó előírásának megfelelő adalékkal (Polymyxin, Amphotericin, Nalidixin sav, Trimethoprim, Azlocillin) készítettük elő leoltáshoz. 3.1.3. Leoltás A feldolgozott mintából 0,5 ml-t injektáltunk a BACTEC MGIT 960 csőbe, 0,5 ml-t a BACTEC 12B palackba, és 0,2-0,2 ml-t 2 LJ táptalajra. Minden leoltott táptalajt 37 0 C-on inkubáltuk. A BACTEC MGIT 960 csöveket a gyártó cég utasításainak megfelelően helyeztük el a BACTEC MGIT 960 automatába és teszteltük mindaddig, amíg pozitívnak nem mutatkozott, vagy egyébként 6 hétig, amelynek végén negatívként adtuk ki a mintát. A BACTEC 12B csöveket az első két héten hetente két alkalommal mértük le a BACTEC 460 TB műszerrel, majd további 4 héten át hetente egy alkalommal. Amikor a BACTEC 12B cső növekedési indexe elérte a 10 mértéket, a 22
csövet naponta ellenőriztük mindaddig, amíg a növekedési index el nem érte a 100 értéket, amikor is a mintát pozitívnek tekintettük. Amennyiben 6 hét elteltével sem sikerült 14 CO 2 termelést kimutatni, a BACTEC 12B csőben levő mintát negatívnak tartottuk. A LJ táptalajt 8 héten át hetente vizsgáltuk mycobacterium telepek megjelenését keresve. Mind a folyékony, mind a szilárd táptalajon észlelt mycobacterialis növekedés esetén továbbiakban a párhuzamos táptalajokon naponta végeztünk leolvasást. A detektálás napján minden pozitív folyékony vagy szilárd táptalajt ZN festéssel vizsgáltunk meg a saválló baktérium jelenlétének megerősítése céljából. A kontamináció kizárása céljából Columbia agarra is leoltottuk (bio-merieux Microbiology Systems, Marcy l Etoile, France). A mikroszkóppal pozitívnak talált tenyészetet AccuProbe nukleinsav hibridizációs teszt (Gen-Probe, San Diego, Calif.) és hagyományos biokémiai tesztek segítségével identifikáltuk 25. 3.1.4. Statisztika A chi négyzet tesztet használtuk a különböző táptalajok közötti érzékenységbeli különbségek értékelésére. A variancia analízist (ANOVA) és a Newman-Keuls tesztet alkalmaztuk az egyes táptalajok átlagos tenyésztési ideje közötti különbségek vizsgálatára. 3.2. Magyarországról származó Mycobacterium turberculosis izolátumok rifampicin-rezisztenciájának molekuláris elemzése DNS szekvenálással és Line Probe Assay segítségével (II) 3.2.1. Betegek, klinikai minták Magyarországon 20 év csökkenés után a pulmonalis tuberkulózis incidenciája 1990 és 1999 (a vizsgálatra került törzsek izolálásának éve) között 18,1%-kal növekedett (31,0-ről 36,6 per 100 000 lakosra nőtt) 9. Ezen belül Kelet-Magyarország területén (Borsod-Abaúj-Zemplén, Hajdú-Bihar és Szabolcs-Szatmár-Bereg megyék) a 23
legnagyobb a tuberkulózis incidenciája (38,7, 51,5, illetve 56,7 per 100 000 lakos), illetve a drog-rezisztens tuberkulózis előfordulása 9. 1999-ben ebből a három megyéből összesen 888 esetet jelentettek a 3912 (22,7%) magyarországi tuberkulózis esetből. A vizsgálat során elemzett 29 RMP-rezisztens törzs a fenti megyékből származó 29 esetből került izolálásra 1999 során 9. A minták gyűjtésében részt vett a Jósa Kórház, Prodia laboratórium, Nyíregyháza, a Borsod Abaúj Zemplém Megyei Állami Népegészségügyi és Tisztiorvosi Szolgálat, Miskolc, valamint a Debreceni Tudományegyetem Általános Orvostudományi Kar, Mycobacteriológiai Laboratórium, Debrecen. A 29 betegből 25 férfi, 4 nő volt, átlag életkoruk 48,9 év. 5 beteg volt hajléktalan és ugyanakkor munkanélküli is. A rizikófaktorok közül megemlítendő, hogy az anamnézisben 5 beteg esetén szerepelt alkoholizmus, két esetben pedig diabetes mellitus. A betegek HIV negatívak voltak. A vizsgált betegek közül kettőt tuberkulózis miatt korábban még nem kezeltek, 27 beteg előzőleg már állt kezelés alatt tuberkulózis miatt. 3.2.2. Kontrollok és identifikálás Kontrollként H37Rv American Type Culture Collection 27294 M. tuberculosis referencia törzset és hat olyan klinikai M. tuberculosis izolátumot használtunk, melyek mind a négy elsővonalbeli antituberkulotikumra érzékenyek voltak. Valamennyi tenyészetet az AccuProbe teszttel (Gen-Probe Inc., San Diego, Calif), illetve hagyományos biokémiai tesztekkel identifikáltuk 10, 23, 25, 27, 69, 70. 3.2.3. Hagyományos rezisztencia meghatározás A 36 izolátum INH, RMP, EMB, valamint SM érzékenységét a proporciós módszerrel határoztuk meg LJ táptalajon, Canetti és munkatársai közlése szerint 71. Az INH-ra, RMP-re, EMB-ra, illetve SM-re vonatkozó kritikus koncentráció 0,2, 40, 1,0 illetve 10 µg/ml volt. 3.2.4. DNS szekvenálás Vizsgálataink során két molekuláris tesztet alkalmaztunk. Először két, a RMPrezisztenciával összefüggő rpob régiót amplifikáltunk polimeráz láncreakcióval (PCRel), majd szekvenálással meghatároztuk az amplifikált DNS szakasz bázissorrendjét. 24
Ezután a DNS szekvenálás eredményét összehasonlítottuk a kereskedelemben kapható gyors teszt, a PCR-alapú reverz hibridizációs line-probe teszt (Inno-LiPA Rif. TB Test (LiPA); Innogenetics N.V., Ghent, Belgium) eredményeivel 72. A molekuláris tesztek elvégzéséhez az antituberkulotikum érzékeny kontrollokból és a RMP-rezisztens izolátumokból BACTEC 12B táptalajra oltottunk le. A szubkultúrákat már korábban közölt szempontok alapján kezeltük, illetve monitoroztuk 27. A 999-es növekedési index detektálásának napján az érzékeny kontrollok és a RMP-rezisztens izolátumok BACTEC 12B tenyészeteinek 200 µl-ét 80 C-on inkubáltuk 1 órán keresztül, a mycobacteriumok elölése céljából. Rpo95 (5 - CCACCCAGGACGTGGAGGCGATCACACCG-31) és rpo397 (5 - GTCAACCCGTTCGGGTTCATCGAAACG-3 ) primérek segítségével, melyek az rpob 81 bp-nyi core régióját fogják közre, a 36 izolátum mindegyikéből egy 329 bp-nyi terméket állítottunk elő 72, 73. Az amplifikációt Perkin-Elmer 480 programozható hőblokkban végeztük, az amplifikációs protokoll a következő volt: Denaturáció: 95 C 5 perc Amplifikáció: 95 C 1 perc 55 C 1 perc 72 C 1 perc 35 ciklusban ismételve az amplifikációs ciklus Extenzió: 72 C 10 perc 4 C végtelen Ugyanezekkel a primérekkel történt az amplifikált DNS szakasz mindkét szálának szekvencia analízise is, automata Applied Biosystems 377 DNS szekvenáló segítségével (Applied Biosystems, Foster City, Calif.) 72. Egy nemrégiben közölt vizsgálatban kimutatták, hogy néhány olyan RMPrezisztens törzsben, ahol a 81 bp régióban mutáció nem észlelhető (vad-típus), egy V146F mutáció található az N-terminális régióban 66. Ennek a mutációnak a kimutatására a Tb176-f (5 -CTTCTCCGGGTCGATGTCGTTG-3 ) és Tb176-r (51- CGCGCTTGTCGACGTCAAACTC-3 ) primérekkel végeztünk amplifikációt és szekvenálást 66. 25
Az amplifikációt Perkin-Elmer 9700 programozható hőblokkban végeztük, az alábbi amplifikációs protokollnak megfelelően: Denaturáció: 94 C 5 perc Amplifikáció: 94 C 45 másodperc 64 C 1 perc 72 C 2 perc 40 ciklusban ismételve az amplifikációs ciklus Extenzió: 72 C 7 perc 4 C végtelen Így egy 365 bp-nyi terméket állítottunk elő, amelyből ugyanezekkel a primérekkel végeztünk szekvenálást 72. A molekuláris biológiai teszteket a Semmelweis Egyetem Pulmonológiai Klinikájának Molekuláris Biológiai Laboratóriumában végeztük. A szekvenálási vizsgálatokat a Wadsworth Center, Albany NY, USA Központi Szekvenáló részlegétől rendeltük meg. 3.2.5. Line Probe Assay A Line Probe Assay (LIPA) vizsgálatok a Semmelweis Egyetem Pulmonológiai Klinikájának Molekuláris Biológiai Laboratóriumában történtek. A LiPA kittel, a gyártó utasításainak megfelelően egy biotinnal jelölt 256 bp-nyi rpob gén fragmentumot amplifikáltunk a hővel elölt mintákból 72, 74. A biotinnal jelölt PCR terméket denaturálást követően 10 specifikus oligonukleotid próbával hibridizáltuk (19-23 bázis hosszú). Az első próba a M. tuberculosis komplexre specifikus, további öt (S1-S5) pedig egymást részlegesen átfedve a vad-típusra (RMP érzékeny) jellemző DNS szakasz komplementere az rpob gén 509-534-es aminosavakat kódoló régiójának megfelelően. A négy másik próba az rpob génen belül előforduló leggyakoribb mutációkra specifikus: D516V, H526Y, H526D és S531L, (R2, R4a, R4b és R5 próbák) 72, 74. A hibridizált PCR produktumok detektálását követően a LiPA vizsgálat eredményeit az irodalomban már korábban közzétett módon értékeltük 75. 26
4. Eredmények 4.1. A Mycobacterium tuberculosis izolálása az automatizált BACTEC MGIT 960 rendszer segítségével, összehasonlítva a BACTEC 460 TB rendszerrel és a Löwenstein-Jensen táptalajon való tenyésztéssel (IV) A 377 leoltásra került klinika mintából 57 (15,1%) esetében észleltük mycobacterium növekedését. Az 57 mycobacterium pozitív mintából 14 (24,6%) mikroszkóposan saválló baktérium pozitív, 43 (75,4%) pedig mikroszkóposan negatív volt. A mycobacterium fajok közül M. tuberculosis (n=55), M. avium complex (n=1), és M. xenopi (n=1) volt identifikálható. A BACTEC MGIT 960, a BACTEC 12B és a LJ táptalajon izolált mycobacteriumok száma az 1. táblázatban került megadásra. A BACTEC MGIT 960 az 55 M. tuberculosis izolátumból 53 (96,4%), a BACTEC 12B 51 (92,7%), míg a LJ táptalajon történő tenyésztés 45 (81,8%) esetben észlelte a kórokozó jelenlétét. A BACTEC MGIT 960 és a LJ táptalaj között statisztikailag szignifikáns különbség volt kimutatható (p < 0,05), míg a BACTEC 12B és LJ, valamint a két folyékony táptalaj közötti különbség nem volt szignifikáns. A 14 mikroszkóposan pozitív törzs mindhárom táptalajtípuson növekedést mutatott, és a törzsek mindegyike M. tuberculosis-nak bizonyult az identifikálást követően. A mikroszkóposan negatív M. tuberculosis-t tartalmazó minták esetében a tenyésztés szenzitivitása 95,1% (39/41) volt a BACTEC MGIT 960, 90,2% (37/41) a BACTEC 12B, és 75,6% (31/41) a LJ táptalajon (1. táblázat). Ismét statisztikailag szignifikáns különbség volt kimutatható a BACTEC MGIT 960 és a LJ táptalaj között (p < 0,005). A BACTEC 12B és LJ, valamint a két folyékony táptalaj közötti különbség nem volt szignifikáns. A NTM száma a jelen vizsgálatban túl alacsony volt megbízható statisztikai számítások végzéséhez. A szenzitivitást meghatároztuk a két folyékony táptalaj és a LJ táptalaj kombinációjára vonatkoztatva is, amely a M. tuberculosis-ra vetítve 96,4% (53/55) volt a BACTEC MGIT 960 és LJ táptalaj, illetve 92,7% (51/55) volt a BACTEC 12B és LJ táptalaj kombinációja esetében. A statisztikai analízis nem mutatott szignifikáns különbséget a két kombináció között. 27
Az egyes táptalaj típusokon észlelt kontamináció mértéke (az összes leoltásra került mintaszám százalékában megadva) a BACTEC MGIT 960, a BACTEC 12B és a LJ táptalaj esetén 3,7%, 2,9% illetve 1,2% volt (1. táblázat). A M. tuberculosis t illető átlagos izolálási idő BACTEC MGIT 960 esetén 14,3 (6-24) nap, BACTEC 12B esetén 16,6 (8-23) nap, LJ táptalaj esetén pedig 35,8 (14-58) nap volt. Az ANOVA és a Newman-Keuls teszt statisztikailag szignifikáns különbséget mutatott a BACTEC MGIT 960 és a LJ táptalaj, valamint a BACTEC 12B és a LJ táptalaj tenyésztési idejei között (p < 0,001 mindkét esetben). A két folyékony táptalaj tenyésztési idejei között nem volt szignifikáns különbség. A mycobacteriumok és a M. tuberculosis növekedésének észlelhetőségéig eltelt átlagos tenyésztési idők a mikroszkópos vizsgálat eredményét is tekintetbe véve a 2. táblázatban kerültek összefoglalásra. A M. tuberculosis izolálási ideje a mikroszkóposan pozitív törzsek esetén hasonló volt a 7 ml-es BACTEC MGIT 960 és a BACTEC 12B (12,6 versus 13,8 nap) esetében. Vizsgálatunkban a mikroszkóposan negatív törzsek esetén a M. tuberculosis átlagos tenyésztési ideje a 7 ml-es BACTEC MGIT 960 esetén minimálisan volt csak rövidebb mint a BACTEC 12B-vel (15,8 versus 17,2 nap). 28
1. táblázat. A BACTEC MGIT 960, a BACTEC 12B és a LJ táptalaj érzékenysége a mycobacteriumok és a M. tuberculosis izolálását illetően, valamint a kontaminált tenyészetek aránya az egyes táptalajokra vonatkoztatva. Táptalaj Minden mycobacterium (MTB+NTM) Az izolált törzsek száma (%) a M. NTM tuberculosis Kontaminált (%) b BACTEC 55 (96,5) 53 (96,4) 2 (100) 14 (3,7) MGIT 960 BACTEC 12B 53 (93,0) 51 (92,7) 2 (100) 11 (2,9) LJ 46 (80,7) 45 (81,8) 1 (50) 4 (1,2) a Az izolált mycobacteriumok teljes száma 57 volt, ebből 55 M. tuberculosis, 2 NTM volt. Emellett 17 tenyészet kontaminált volt. A chi négyzet teszt az egyes táptalaj típusok érzékenysége közötti különbségekre vonatkoztatva a mycobacteriumok izolálását illetően: BACTEC MGIT 960 versus LJ táptalaj: p < 0,05 (szignifikáns). A chi négyzet teszt az egyes táptalaj típusok érzékenysége közötti különbségekre vonatkoztatva a M. tuberculosis izolálását illetően: BACTEC MGIT 960 versus LJ táptalaj: p < 0,05 (szignifikáns). b Az összes leoltásra került mintaszám százalékában megadva. MTB: Mycobacterium tuberculosis, NTM: nem tuberculosist okozó mycobacteriumok. 29
2. táblázat. Az átlagos tenyésztési idők az összes mycobacteriumokra és M. tuberculosisra vonatkoztatva. A kimutatás napjainak átlaga napokban (tartomány) a M. tuberculosis Táptalaj Mycobacterium Mikroszkóposan pozitív Mikroszkóposan negatív BACTEC MGIT 13,2 (6-24) 12,6 (8-18) 15,8 (6-24) 960 BACTEC 12B 16,8 (8-23) 13,8 (8-23) 17,7 (9-23) LJ 36,2 (14-58) 20,1 (14-27) 42,2 (18-58) a ANOVA, p < 0,001. Newman-Keuls teszt a mycobacteriumok és a M. tuberculosis átlagos tenyésztési idejét illetően az egyes táptalaj típusokon: BACTEC MGIT 960 versus LJ táptalaj, p < 0,001 (szignifikáns), BACTEC 12B versus LJ táptalaj, p < 0,001 (szignifikáns). 30
4.2. Magyarországról származó Mycobacterium turberculosis izolátumok rifampicin-rezisztenciájának molekuláris elemzése DNS szekvenálással és Line Probe Assay segítségével (II) A 29 RMP-rezisztens izolátumból csupán két (6,95%) olyan törzs volt, amely csak RMP-re mutatott rezisztenciát. Huszonhat (89,7%) törzs a RMP-rezisztencia mellett INH-ra is (így multidrog rezisztensnek minősült), 18 (62,1%) EMB-ra is, és 9 (31,0%) SM-re is rezisztens volt (3. táblázat). A vizsgált 29 törzsből összesen 20 olyan izolátum fordult elő (70,0%), amely legalább három elsővonalbeli szerre rezisztens volt. A korábbi közleményekkel ellentétben (4. táblázat) 63, 68, 76-82 a mutációk előfordulási gyakorisága eltérő volt az általunk vizsgált kelet-magyarországi izolátumokban, mivel 11 (37,95%) izolátumban a kevésbé gyakori D516V mutáció volt kimutatható 72. Kilenc izolátumban (31,05%) az S531L mutációt észleltük, míg kettőben (6,95%) a H526D mutációt. Ezeket a mutációkat a LiPA teszttel is azonosítani tudtuk. Emellett a DNS szekvenálás során egy eddig az irodalomban még nem szereplő kettős mutációt (S509T és D516V), valamint egy deléciót (522-525 deléció) is sikerült kimutatnunk 42, 72. Ebben a két esetben a LiPA a mutáció pontos típusát nem volt képes azonosítani, de genetikai eltérés jelenlétét jelezte (3. táblázat). Emellett azonban a LiPA teszt két további törzs esetében sem volt képes azonosítani két további ritkán előforduló mutáció típusát (Q513K és Q513P) (3. táblázat). Ráadásul a teszt álrezisztenciát jelzett az egyik teljesen érzékeny kontroll törzs néma mutációja esetében (R529R) (3. táblázat) 72. A LiPA teszttel kapcsolatos beszámolók alapján a módszer egy egyszerű, könnyen használható eszköz a RMP-rezisztencia gyors kimutatására 72, 74. A teszt kit formában szerezhető be, így különösen olyan klinikai laboratóriumok rutin munkájához nyújthat segítséget, ahol nincs mód DNS szekvenálás elvégzésére 75, 83. Vizsgálatunkban a LiPA a 29 RMP-rezisztens törzs közül 26 (89,7%) esetben jelezte genetikai eltérés jelenlétét, de csak 22 esetben volt képes a mutáció típusát is meghatározni (75,9%) (3. táblázat) 72. A LiPA ugyanis a mutáció típusát csak a négy leggyakoribb rpob gén mutációjának esetében képes azonosítani (S531L, H526Y, H526D és D516V), míg az egyéb mutációk esetében csak a genetikai eltérés jelenlétét mutatja 74. 31
3. táblázat. Magyarországi rifampicin rezisztens Mycobacterium tuberculosis törzsek rezisztencia típusai a proporciós módszerrel, a Line Probe Assay-vel, és az rpob gén 81 bázispárnyi centrális régiójának DNS szekvencia analízisével. No. Proporciós módszer LiPA Mutációk SM INH RMP EMB TB-P S1 S2 S3 S4 S5 R2 R4a R4b R5 LiPA Szekv. 1. S R R R + + -- + + + + -- -- -- D516V D516V 2. S R R S + + + + + -- -- -- -- + S531L S531L 3. S R R R + + -- + + + + -- -- -- D516V D516V 4. S R R S + + + + + -- -- -- -- + S531L S531L 5. R S R S + + + + + -- -- -- -- + S531L S531L 6. S S R S + + + -- -- +/-- -- -- -- -- AR Deléció 522-525 7. S R R R + + -- + + + + -- -- -- D516V D516V 8. S R R R + + -- + + + + -- -- -- D516V D516V 9. R R R S + + + + -- + -- -- + -- H526D H526D 10. S R R R + + -- + + + + -- -- -- D516V D516V 11. R R R R + + -- + + + + -- -- -- D516V D516V 12. R R R R + + -- + + + + -- -- -- D516V D516V 13. S R R R + + + + + -- -- -- -- + S531L S531L 14. R R R R + + + + + -- -- -- -- + S531L S531L 15. S R R R + + -- + + + + -- -- -- D516V D516V 16. S R R R + + -- + + + + -- -- -- D516V S509T / D516V 17. S R R S + -- + + + + -- -- -- -- AR Q513K 18. S R R R + + + + + + -- -- -- -- A VT 19. S R R R + + + + + -- -- -- -- + S531L S531L 20. R R R S + +/-- + + + + -- -- -- -- AR Q513P 21. S R R S + + + + + -- -- -- -- + S531L S531L 22. S R R S + + + + -- + -- -- + -- H526D H526D 32
No. Proporciós módszer LiPA Mutációk SM INH RMP EMB TB-P S1 S2 S3 S4 S5 R2 R4a R4b R5 LiPA Szekv. 23. S R R R + + -- + + + + -- -- -- D516V D516V 24. S R R R + + -- + + + + -- -- -- D516V D516V 25. S R R S + + -- + + + + -- -- -- D516V D516V 26. S S R S + + + + + -- -- -- -- + S531L S531L 27. R R R R + + + + + -- -- -- -- + S531L S531L 28. R R R R + + + + + + -- -- -- -- VT VT a 29. R R R R + + + + + + -- -- -- -- VT VT Ko.1. S S S S + + + + -- -- -- -- -- -- AR R529R Ko.2. S S S S + + + + + + -- -- -- -- VT VT Ko.3. S S S S + + + + + + -- -- -- -- VT VT Ko.4. S S S S + + + + + + -- -- -- -- VT VT Ko.5. S S S S + + + + + + -- -- -- -- VT VT Ko.6. S S S S + + + + + + -- -- -- -- VT VT H37Rv S S S S + + + + + + -- -- -- -- VT VT Ko. = kontrol; Szekv. = a hipervariábilis régió DNS szekvencia analízise; EMB = Ethambutol; INH = Izoniacid; H37Rv = Mycobacterium tuberculosis H37Rv ATCC 27294; RMP = Rifampicin; SM = Streptomycin; A = azonosítatlan; AR = azonosítatlan rezisztens; VT = Vad típus; a = egy V146F mutáció volt detektálható ebben az izolátumban. Az R2, R4a, R4b és R5 oligonukleotid próbák a D516V, H526Y, H526D, és S531L mutációkra specifikusak. 33