Mesterséges édesítőszerek meghatározása energiaitalokban folyadékkromatográfiás módszerrel

Budapesti Műszaki és Gazdaságtudományi Egyetem Vegyészmérnöki és Biomérnöki Kar Szervetlen és Analitikai Kémia Tanszék Mesterséges édesítőszerek meghatározása energiaitalokban folyadékkromatográfiás módszerrel TDK dolgozat Készítette: Marsi Zsófia Környezetmérnöki szak IV. évfolyam, Bsc Témavezető: Dr. Fekete Jenő, egyetemi tanár Konzulens: Bobály Balázs, doktorandusz Budapest 2014

TARTALOMJEGYZÉK MESTERS ÉGES ÉDESÍTŐSZEREK MEGHATÁROZÁSA ENERGIAITALOKBAN FOLYADÉKKROMATOGRÁFIÁS MÓDS ZERREL... 1 TARTALOMJEGYZÉK... 2 1. BEVEZETÉS... 3 1.1. MESTERSÉGES ÉDESÍTŐSZEREK... 4 1.1.1 Szacharin... 4 1.1.2 Aszpartám... 5 1.1.3 Aceszulfám-K... 6 1.2. EGÉSZSÉGÜGYI ÉS KÖRNYEZETI HATÁSOK... 7 1.2.1 Egészségügyi hatások... 7 1.2.2 Környezeti hatások... 8 1.3. MÉRÉSI MÓDSZEREK... 9 2. KÍS ÉRLETI RÉS Z...15 2.1. FELHASZNÁLT MINTA, ANYAGOK ÉS VEGYSZEREK...15 2.2. ESZKÖZÖK ÉS MŰSZEREZETTSÉG...15 2.3. MOZGÓFÁZIS, TÖRZSOLDAT, MUNKAOLDATOK KÉSZÍTÉSE...16 2.4. MINTAOLDAT ELŐKÉSZÍTÉSE...16 2.5. STANDARD ADDÍCIÓS KALIBRÁLÓ OLDATSOROZAT KÉSZÍTÉSE...16 2.6. A MÉRÉSI PARAMÉTEREK MEGHATÁROZÁSA...17 2.7. MÉRÉSI MÓDSZER...20 3. MÉRÉS I EREDMÉNYEK ÉS KIÉRTÉKELÉS...22 3.1. LINEARITÁS...22 3.2. SZÓRÁS ÉS VISSZANYERÉS...23 3.3. LOD, LOQ MEGHATÁROZÁSA...24 4. ÖSSZEFOGLALÁS...26 5. KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS...26 7. IRODALOMJEGYZÉK...29 2

1. Bevezetés A mesterséges édesítőszerek intenzív édes ízű, alacsony kalóriatartalmú, cukormentes élelmiszer adalékanyagok, melyeket az élelmiszer-, üdítőital- és gyógyszeriparban széleskörűen alkalmaznak. A szacharózénál 30-3000-szer édesebb íz érzetét keltik anélkül, hogy hasznos energiát szolgáltatnának az emberi szervezet számára. Így, segítenek az egészséges testsúly fenntartásában, az elhízás és a cukorbetegség kezelésében [1]. A leggyakoribb szintetikus édesítőszerek az aszpartám, aceszulfám-k, szacharin, ciklamát, szukralóz, alitám, neotám, és a neoheszperidin-dihidrokalkon [2]. Napjainkban az élelmiszeripar erőteljes hangsúlyt fektet a mesterséges édesítőszerek előnyös tulajdonságainak kiemelésére, és egyre nagyobb fogyasztói igény mutatkozik az alacsony kalóriatartalmú ( light, diet felirattal ellátott) termékek iránt. Intenzív édes ízüknek köszönhetően a normális íz elérése érdekében elegendő kis mennyiségek élelmiszerekhez történő adalékolása. Egyes mesterséges édesítőszereket önmagukban használnak fel, míg mások keserű ízük miatt csak keverékként alkalmazhatók. Egy jellemző példa a szacharin és ciklamát 1:10 térfogatarányú keveréke. [3] Alkalmanként citromsav adalékolásával fedik el egyes édesítőszerek keserű mellékízét, vagy fokozzák azok édes ízét. [4]. Az édesítőszerek szinergiás hatása a gyakorlatban kedvező jelentőséggel bír mind az egyes adalékanyagokra való határértékeknek könnyebb megfelelés, a költséghatékony előállítás, mind az egészségügyi- és környezeti kockázat csökkentésének szempontjából. Használatukat Európai Uniós előírások és magyar rendeletek is szabályozzák. Az Európai Unió által kiadott 89/107/EEK direktíva kimondja, hogy csak engedélyezett adalékanyagok használhatók fel élelmiszer-előállítási eljárások során. Fő elve, hogy csak akkor lehet engedélyezett egy adalékanyag, ha annak használata elkerülhetetlen, nem vezeti félre, és nem jelent egészségügyi kockázatot a fogyasztó számára [5]. Az Európai Élelmiszer-biztonsági Hatóság (European Food Safety Authority, EFSA) vizsgálati eljárása után hozza nyilvánosságra mely mesterséges adalékanyagok engedélyezhetők. További direktívák - 94/35/EK, 96/83/EK, 2003/115/EK és 2006/52/EK egyértelműen meghatározzák mely édesítőszerek milyen maximális koncentráció szinten adalékolhatók élelmiszer- és üdítőipari termékekhez [5]. Az egészségügyi kockázatcsökkentés érdekében az Egészségügyi Világszervezet (World Health Organization) Élelmiszer-adalékanyag Szakértői Bizottsága (Joint Food and Agricultural Organization Expert Committee on Food Additives) (JECFA) megállapít megengedhető napi beviteli (Acceptable Daily Intake ADI) értékeket hét (aszpartám, aceszulfám-k, szacharin, ciklamát és sói, neotám, neoheszperidin dihidrokalkon), az EU tagországaiban engedélyezett különböző édesítőszerek esetében. A világ országaiban 3

különböző mesterséges édesítőszerek engedélyezettek, és eltérő megengedhető maximális dózisokat írnak elő a határérték-rendeleteik. [1] tanulmányában részletezi e különbségeket. Magyarországon az EU irányelveit követő Magyar Élelmiszerkönyvben előírt jogszabályoknak - 152/2009. (XI. 12.) FVM rendelet és a rendelethez tartozó 3. mellékletben található határértékeknek kell megfelelni. [6]. Jelen dolgozat célja, a munkám során, napjainkban Magyarországon forgalmazott energia- és izotóniásitalok édesítését szolgáló három intenzív édesítőszer szacharin, aszpartám, aceszulfám-k mennyiségi meghatározására fejlesztett folyadékkromatográfiás mérési módszer bemutatása. A módszerrel hidrofil kölcsönhatáson alapuló (HILIC) kromatográfiás elválasztást követően optikai (UV) detektálással egyszeri injektálással, egyidejűleg határozhatók meg az édesítőszerek. A szakirodalomban főleg fordított fázisú eljáráson alapuló elválasztási módszerek találhatók. A magyar, szabványos (MSZ EN 12856) mérési eljárás is fordított fázisú elválasztási módszert ír elő [7]. Fordított fázisú elválasztás során az édesítőszerek polaritása (ld. 4. táblázat) miatt nem kapunk megfelelő visszatartást, ami az összetettebb mátrixok esetén a szelektivitás romlásához vezet. Az utóbbi években egyre elterjedtebb a HILIC módszer, melyet előnyben részesítenek poláris komponensek folyadékkromatográfiás meghatározására. Munkám célja volt, hogy irodalmi ismeretek alapján HILIC elválasztást dolgozzak ki egy előre meghatározott kolonnán. Dolgozatomban áttekintem az irodalomban talált, édesítőszerek szimultán, kvantitatív elemzésére alkalmas módszereket, összehasonlítom a HILIC módszerrel, ismertetem a módszerfejlesztés egyes lépéseit, majd az általam kidolgozott módszer alkalmasságát a valós minta mérésével és a kapott adatok kvantitatív értékelésével bizonyítom. 1.1. Mesterséges édesítőszerek 1.1.1 Szacharin A szacharin o-szulfobenzoesav, foszfor(v)-klorid és ammónia reakciójának eredménye. Kétszáz-háromszázszor édesebb a szacharóznál. 4

1. ábra A szacharin kémiai szerkezete [forrás: Chemspider adatbázis] A szacharin a legrégebben, 1879 óta használt édesítő. Hátránya, hogy néhányan érzik fémes, kesernyés mellékízét, mely erősebb hevítés, forralás hatására felerősödik. Másik édesítőszerrel kombinálva viszont az elnyomja ezt a kellemetlen utóízt. Vízben kismértékben, etanolban mérsékelten, lúgos oldatokban jól oldódik. Három formája kapható kereskedelmi forgalomban: a szacharin sav, a nátrium- és a kálcium-szacharinát, melyek élelmiszer- és üdítőital adalékanyagként körülbelül kilencven országban engedélyezettek. 25 C-on egy grammját 290ml víz oldja [8]. 1.1.2 Aszpartám Az aszpartám két aminosavból álló dipeptid. Az L-aszparaginsav és a L-fenilalanin metil-észtere. Az 1970-es évek óta alkalmazzák az élelmiszeriparban NutraSweet, Canderel, Equal asztali édesítőszer formájában. Bomlásterméke az aszparagin és fenilalanin mellett a metanol. Vízben nem túl jól oldódik, vizes oldata enyhén savas kémhatású. Savas kémhatású vizes oldatokban oldhatósága jelentősen megnövekszik, ezért előszeretettel használják diétás üdítőitalok, szörpök készítésére. Az aszpartám édes íze sokkal jobban megközelíti a cukorét, mint a korábban kifejlesztett mesterséges édesítőszerek, ugyanakkor a répacukornál mintegy száznyolcvanszor édesebb ízű, ezért energiatartalma az ételekben az alkalmazott tömeget is figyelembe véve nagyságrendekkel kisebb (4 kcal/g), mint a cukoré. Az aszpartám hőstabilitása sokkal nagyobb, mint a szachariné, de savas és lúgos közegben és melegítés során is elhidrolizálhat. 5

2. ábra Az aszpartám kémiai szerkezete [forrás: Chemspider adatbázis] 1.1.3 Aceszulfám-K Az aceszulfám-k-t az amidoszulfonsav származékaiból állítják elő szintézis útján. A keletkező fehér kristályos, szént, hidrogént, nitrogént, ként és káliumot tartalmazó anyag. 3. ábra Az aceszulfám-k kémiai szerkezete [forrás: Chemspider adatbázis] Az 1967-ben véletlenszerűen előállított vegyületet csökkentett cukortartalmú ételekben használják önállóan, vagy szénsavas üdítőkben aszpartámmal és más édesítőszerekkel kombinálva. Édesítő ereje a szacharóz kétszázszorosa. Hátránya a szacharinhoz hasonló enyhe keserű mellékíze, amely főként magas koncentráció értékeken érződik. Szemben az aszpartámmal előnye, hogy édes ízét sütés és főzés során is megtartja. Asztali édesítőszernek, cukortartalmú rágógumik ízfokozására is alkalmas. Vízben való oldhatósága 20 C-on 290g/l [8]. 6

Komponens Kémiai név Egyéb név E- szám* Bomlástermék ADI* [mg/ttkg] Olvadáspont [ C] Szacharin 2H-1λ6,2-benzothiazol-1,1,3- trion Benzoszulfimid, o-szulfobenzamid E954 o-szulfobenzoesav, foszfor(v)-klorid, ammónia 5 229 Aszpartám N-L-alfa-aszpartil-L-fenilalanin- 1-metilészter NutraSweet, Canderel, Equal E951 aszparaginsav, fenilalanin, metanol 40 246 Aceszulfám-K Kálium 6-metil-2,2-dioxo-2H- 1,2λ6,3-oxathiazin-4-olát Kálium aceszulfám E950 amidoszulfonsav 9 225 *E-szám=az Európai Unióban engedélyezett élelmiszer- adalékanyag kódja ADI= megengedhető napi beviteli érték (Acceptable Daily Intake ADI) 1.2. Egészségügyi és környezeti hatások 1.2.1 Egészségügyi hatások 1. táblázat A vizsgált édesítőszerek adatai Az 1970-es években merült fel a gyanú, hogy a szacharin növeli a rák kialakulásának kockázatát, mert egy kísérletben a nagy dózisban, Na-ciklamáttal kevert állateledel patkányokban hólyagrákot okozott. Ennek hatására használatát Kanadában ideiglenesen betiltották. Mivel az emberi szervezetre való karcinogén hatását vizsgálatok nem támasztják alá, végül az amerikai Élelmiszer- és Gyógyszerfelügyeleti Hatóság (FDA) 2001-ben biztonságosnak minősítette a szacharint emberi használatra. 2010-ben a környezetre is ártalmatlannak minősítették. A fenilketonuria nevű anyagcsere-betegségben szenvedők számára a fenilalanin súlyos mérgezést idézhet elő, ezért kötelező feltüntetni az aszpartámmal édesített élelmiszereken, hogy fenil-alanin forrást tartalmaznak. Az aszpartámot is kapcsolatba hozták már egyéb betegségek kialakulásával. Esetleges mutagén és karcinogén, agyi alváltozásokat okozó hatása máig vitatott, ám az eddigi vizsgálatok nem mutattak ki egyértelmű egészségkárosító hatást az emberi szervezetre nézve [9]. Az aceszulfám-k esetleges karcinogén hatásának vizsgálatára rágcsálókísérleteket vittek véghez, melyek egyértelmű káros hatást nem bizonyítottak. 2008-ban DNS-károsító hatásáról jelent tanulmány. A vese mind a szacharint, mind a kálium-aceszulfámot változatlanul választja ki a szervezetből. Az eddigi toxikológiai és klinikai vizsgálatok alapján az ADI értkeknek megfelelő fogyasztásukat az FDA és az EU biztonságosnak ítéli meg az emberi szervezetre nézve. 7

1.2.2 Környezeti hatások 2009-ben publikáltak először a mesterséges édesítőszerek szennyvízben és felszíni vízben való megjelenéséről [10] és azóta egyre több tanulmány foglalkozik környezetben való kiterjedésük nagyságának feltérképezésével és ezek lehetséges ökotoxikológiai hatásával. A legtöbb vizsgálat a ciklamát, szacharin, szukralóz, aszpartám és kálium aceszulfám komponensekkel foglalkozik. Az aceszulfám-k és a szukralóz bizonyul a legellenállóbbnak a szennyvíztisztítási mechanizmusokkal szemben, mert széles hőmérsékleti és ph tartományban megőrzik stabilitásukat. Az első kutatás során vizsgált két német város (Eggenste in- Leopoldshafen és Karlsruhe) 20000 és 875000 lakosegyenértékű (LE) szennyvíztisztító befolyó szennyvízének aceszulfám és szacharin koncentrációja 34 és 50µg/l volt. A mechanikai és biológiai tisztításnak köszönhetően az aceszulfám 41%-át, a szacharin több mint 90%-át távolították el. Így az elfolyó szennyvizek koncentrációja 20µg/l és 2,8 µg/l volt a két komponensre nézve. A vizsgált folyóminták aceszulfám esetén 2µg/l, míg szacharinra 50-150ng/l koncentráció értékeket állapítottak meg. Az aszpartám nem volt kimutatható egyik vizsgált vízmintából sem. [10] Az ökoszisztémák e komponensek alacsony koncentrációban való krónikus kitettségének hosszú távú hatása egyelőre ismeretlen. Ám további kutatások azt mutatják, hogy perzisztens jelenlétüknél fogva megbízható szennyezési markerekként használhatók talajvízfigyelő kutak és nyomonkövetési vizsgálatokban. Kimutatható, hogy míg a szennyvízkezelő létesítmények befolyó szennyvízébe a háztartási és ipari szennyvizekkel kerülnek az édesítőszerek, addig a felszíni vizek fő szennyezője, közvetlen kibocsátás útján, a háztartások és ipari létesítmények mellett az állattartás és mezőgazdaság. Egy adott városi környezetben a komplex szennyezőanyag források megállapítása bonyolult feladat a koncentráció értékek nagy térbeli változékonysága miatt. A különböző országok vízgyűjtőib en megjelenő édesítőszerek a népesség fogyasztási szokásainak függvénye. Például sűrűn lakott svájci tavak vízgyűjtő területén lineáris összefüggést mutatható ki (R 2 0,88) a szacharin, aceszulfám-k, ciklamát koncentráció és a népesség(q)/elfolyó szennyvízáram(q) arány között [11]. Az édesítőszer-koncentrációk pedig jól korrelálnak egyes szennyezőanyagokkal, így mennyiségi adatot nyerünk a felszíni vizek antropogén szennyvízterheléséről. Ezt támasztja alá egy svájci tanulmány, melyben a perfluoroalkil savak-népességszám összefüggést az aceszulfám-koncentráció segítségével bizonyít. Továbbá egy német monitoring program eredményeként kimutatható a Rajna és más nagy folyók vízében található karbamazepin, 1Hbenzotriazol és 4-metil-benzotriazol szennyezők lineáris összefüggése az aceszulfámtartalommal [12]. Valamint egy kanadai vizsgálat során is megállapították, hogy az 8

aceszulfám kloriddal és egyéb szennyvízszennyező anyagokkal való jó korrelációja okán megfelelő indikátora lehet a lakossági eredetű szennyezésnek fiatal (20 évnél fiatalabb) szennyvizek esetén [13]. Idősebb szennyvízmintákban a szacharin magasabb koncentráció szinten volt jelen az aceszulfámnál. Bár vízminőség ellenőrzési célból az elfolyó szennyvizek állapotának meghatározásánál szükség van szennyezési indikátorokra, markerekre, melyek hozzájárulnak az ivóvízbázisok és a természetes víztestek minőségének értékeléséhez, az előállított ivóvíz édesítőszer-tartalmának csökkentésére vizsgálták a különböző oxidációs eljárások hatékonyságát. A kémiai oxidációs eljárások közül (UV-besugárzás, klórozás, ózonozás) az ózonnal való oxidáció mutatkozik a legígéretesebb megoldásnak [14]. 1.3. Mérési módszerek Az édesítőszerek szinergiás hatását kihasználva a boltok polcaira kerülő cukormentes, mesterségesen édesített élelmiszer- és üdítőital árucikkekben édesítőszer-keverékek vannak. Mind a termék gyártójának, mind az élelmiszerbiztonsági hatóságoknak szükségük van megbízható, gyors analitikai módszerekre, melyekkel mennyiségi információkat szerezhetnek a forgalomba helyezett termék édesítőszer-koncentrációjáról. Az irodalomban leírt, édesítőszerek vizsgálatára alkalmas analitikai módszerek a kapilláris elektroforézis (CE), a micelláris elektrokinetikus kromatográfia (MEKC), a szublimáció, az elektroanalitikai módszerek (differenciál impulzus voltammetria, potenciometria), a Fourier-transzformációs infravörös spektroszkópia (FTIR), az áramló oldatos injektálásos analízis (FIA) és a kromatográfiás módszerek (gáz- (GC), vékonyréteg- (VRK), és folyadékkromatográfia (HPLC)). Nagyfokú stabilitásának és robosztusságának köszönhetően az 1980-as, 90-es évektől kezdve egyre több HPLC módszert fejlesztettek ezen komponensek egyedi kimutatására. Majd az egyidejű, egyszeri injektálású meghatározási módszerek kifejlesztésébe kezdtek, melyek a különböző komponensek eltérő fizikai-kémiai tulajdonságai miatt jelentenek kihívást. A 2. táblázatban felsorolt irodalmi adatokból látható, hogy az édesítőszerek szimultán, kvalitatív és kvantitatív meghatározását lehetővé tévő alkalmazott módszerek döntő többsége fordított fázisú elválasztáson alapul. Az alkalmazott állófázisok többsége C18 [7, 10, 11, 15-20], C8 [17], XDB-C8-[18], fenil-hexil [1] módosítású szilikagél. A mozgófázis általában vízszerves oldószer (metanol, acetonitril) elegye 1-20mM oldott puffer, ammónium-acetát [1, 10, 11, 18], trietanolamin-formiát [20], foszfát [7, 15, 19] tartalommal. Fordított fázisú elválasztás során az édesítőszerek polaritása (ld. 4. táblázat) miatt nem kapunk megfelelő visszatartást, ami az összetettebb mátrixok esetén a szelektivitás romlásához vezet. 9

Alternatív eljárást jelent a folyadékromatográfiás módszereken belül a nagyhatékonyságú anion-cserés elválasztás (nagyteljesítményű ionkromatográfia angol rövidítéséből HPIC). Az édesítőszer komponensek elválasztására kivitelezett módszerekben anioncserélő Dionex IonPac (AS4A-SC 250*4mm, I.D.) oszlopot 1mM Na2CO3 és 12,5 mm Na2CO3 mozgófázissal [4], a Dionex Ionpac AS11 (250*2mm, I.D.) kolonnát KOH mozgófázissal [21] és a Shimazdu Shim-pack IC-A3 (150*4,6mm, 5µm) oszlopot 5 mm vizes NaH2PO4 és 4 v/v% acetonitril eluens mellet [22] alkalmaztak. Az ioncserés elválasztás ionizálható csoportot tartalmazó vegyületek elválasztásánál bevett eljárási módszer. Az alkalmazott oszlop töltetek hatékonysága azonban kisebb a modern RP- és HILIC-LC állófázisok hatékonyságánál. A nem porózus ioncserélő töltettel erős kölcsönhatást alakítanak ki az ionizált komponensformák, mely csökkenti a kinetikai hatékonyságot. A fordított fázisú és hidrofil kölcsönhatási kromatográfiában az ionos kölcsönhatásnál gyengébb másodrendű hidrogénhíd-kötés dominál a poláris komponensek és a módosított szilikagél töltet között, amely gyorsabb kinetikát eredményez. A kölcsönhatási energiaerősség különbség miatt HPICmódszer kinetikai hatékonyságát a szemcseátmérő (7,5,3µm) és a kolonna hossz csökkentésével javítva sem lehet a RP és HILIC-módszer hatékonyságánál előnyösebb eljáráshoz jutni. Analát Mátrix Módszer Analitikai jellemzők Ref. aceszulfám-k, aszpartám, ciklamát, dulcin, glicirrizinsav, neotám, neoheszperidin dihidrokalkon, szacharin, szukralóz, szteviozid 27 ital (16 alkoholos és 11 alkoholmentes) és 15 konzervezett étel (zöldségek és gyümölcsök) HPLC MS/MS Visszanyerés 75-120% LOD n.a. LOQ 0,1-0,5ug/g RSD < 20% [1] aceszulfám-k, aszpartám, szacharin 25 üditőital (7 növényi kivonat, 2 gyümölcslé, 16 mesterségesen ízesített ital) RP-HPLC-DAD Visszanyerés 96,2-101% LOD n.a. LOQ 0,3-0,5mg/l RSD 0,15-0,9% [15] aceszulfám-k, aszpartám, ciklamát só, neotám, neoheszperidin dihidrokalkon, szacharin, szukralóz ivó- felszíni és szennyvíz RP-HPLC-MS/MS (HILIC-HPLC-MS/MS) Visszanyerés 23-111% LOD n.a. LOQ 1-10ng/L RSD n.a. [10] aceszulfám-k, ciklamát, szacharin, szukralóz talaj, trágya, szennyvíziszap RP-HPLC-ESI-MS/MS Visszanyerés 63-127% LOD 0,001-0,1ppm LOQ n.a. RSD n.a. [11] 10

aceszulfám-k, aszpartám, ciklamát, neoheszperidin dihidrokalkon, szacharin, szukralóz szennyvíz- és felszíni víz RP-HPLC-ESI-MS/MS (HILIC-HPLC-ESI-MS/MS) Visszanyerés 73-112% LOD 0,001-0,1ppm LOQ 0,01-0,5μg/l RSD <10% [18] aceszulfám-k, aszpartám, szacharin, citromsav, benzoát só étrendkiegészítők, asztali édesítők, alkoholmantes üdítő-, energia- és izotóniás italok HPLC-CAD-UV/DAD Visszanyerés 98,1-101% LOD 0,06-2,70ppm LOQ 0,19-8,09μg/l RSD 0,11-1,73% [16] aceszulfám-k,aszpartám, alitám, neotám, szacharin, ciklamát, szukralóz, neoheszperidin dihidrokalkon befolyó és elfolyó szennyvíz RP-HPLC-ESI-MS/MS (HILIC-HPLC-ESI-MS/MS) Visszanyerés 39-97% LOD 0,24-4,4μg/l LOQ 0,80-14,8μg/l RSD 4,2-20% [2] aceszulfám-k, aszpartám, ciklaminsav, dulcin, neotám, neoheszperidin dihidrokalkon, szacharin, szukralóz, alitám szénsavas és szénsavmentes üdítőitalok, gyümölcskonzerv és befőttek, joghurtok RP-HPLC-ELSD Visszanyerés 93-109% LOD <15μg/g LOQ <50μg/g RSD 5-8% [17] szacharin só, aszpartám, aceszulfám-k és ciklamát só, citromsav üdítőital és asztali édesítőszer HPIC-UV/CD Visszanyerés 93-107% LOD 0,019-0,22μg/ml LOQ n.a. RSD 0,84-1,72% [4] aceszulfám-k, aszpartám, ciklamát, neotám, szacharin, szukralóz, szteviozid, alitám üdítőitalok, konzervezett gyümölcsök, sütemények RP-HPLC-ESI-MS/MS Visszanyerés 95,4-104,3% LOD <10μg/ml LOQ n.a. RSD n.a. [20] aceszulfám-k, aszpartám, szacharin, benzoesav, szorbinsav, koffein, teobromin, teofillin üdítőitalok, gyümölcslevek, erjesztett tejitalok, tartósított gyümölcsök, tabletták -HPLC-UV Visszanyerés 85-104% LOD 4-30mg/l LOQ n.a. RSD 1-5% [22] aceszulfám-k, aszpartám, szacharin, benzoesav, szorbinsav, Ponceau 4R, Sunset Yellow, Tartrazin üdítőitalok HPIC-UV Visszanyerés 98,1-102,3% LOD 0,1-3mg/l LOQ n.a. RSD n.a. [19] aceszulfám-k, aszpartám, szacharin, ciklamát szénsavas kóla, gyümölcslevek, tartósított gyümölcsök HPIC-CD Visszanyerés 97,96-105,42% LOD <0,019-0,89mg/l LOQ n.a. RSD n.a. [21] 2. táblázat Irodalmi adatok az édesítőszerek folyadékkromatográfiás meghatározási módszereiről A hidrofil kölcsönhatási folyadékkromatográfia (hydrophilic interaction liquid chromatography - HILIC) nagy polaritású és ionos vegyületek vizsgálatára jött létre, így cukrok elválasztására régóta alkalmazzák. A hagyományosnak tekinthető normál-, fordított fázisú, ioncserés, ionpár és kromatográfia mellet új módszernek számít a HILIC. Jellegzetessége, hogy a poláris állófázis mellett egy kevésbé poláris, nagy szervesanyag- és kis víztartalmú oldószerelegy képezi a mozgófázist. Nagy előnye, hogy használatakor nincs szükség a 11

normálfázisú folyadékkromatográfiában alkalmazott toxikus és drága apoláris oldószerekre. A számos hozzá kapcsolható detektálási lehetőséggel tömegspektrométer (MS) és optikai detektorok, kiterjeszti az elemezhető vegyületek és mintamátrixok körét. Irodalmi adatokat összehasonlítva, az optikai detektorok UV-, ELSD és a vezetőképességi detektorok alsó kimutatási határértékeiből [3, 4], hogy az UV-detektálás érzékenyebb, így megfelelőbb az aceszulfám és szacharin sók mennyiségi meghatározására üdítőital és asztali édesítőszer mintákból. A három, UV-detektorral együtt mérhető komponens abszorciós maximumai különböző hullámhosszon vannak (λmax, aszpartám=190nm, λmax, szacharin =202nm, λmax, aceszulfám-k =226nm). Számos kolonna alkalmas HILIC módban való alkalmazásra peptidek, oligoszacharidok, aminosavak, nukleotid bázisok, biogén aminok, gyógyszerhatóanyagok, metabolitok elválasztásakor. A legismertebb állófázisok: módosítatlan szilikagél, alumíniumoxid, zirkónium-oxid, titán-dioxid, szilika alapú amino-, nitril-, amido-, ciano-, karbamát-, diol-, poliol-, zwitter-ionos szulfobetain, vagy poli(2-szulfoetil-aszpartamid) és egyéb polárisan módosított szilikagél állófázisok [23]. A HILIC módszer sajátossága a HILIC hatás, mely a komponensek visszatartási folyamatában játszik jelentős szerepet [24]. Lényege, hogy az állófázisok poláris jellegéből adódóan felületi vízréteg alakul ki, melyekbe a molekuláris formában lévő komponensek beoldódnak. Szemben a hagyományos normálfázisú folyadékkromatográfiában alkalmazott apoláris mozgófázisokkal, a HILIC eljárások mozgófázisai mindig tartalmaznak vizet (min. 2-3%), amely lehetővé teszi a szilanolcsoportok disszociációját. A kis molekulatömegű szerves, nagy polaritású vegyületek elemzésére alkalmas HILIC-nél fázisviszonyokat értelmezünk. A meghatározandó komponenseknek oldódniuk kell a mozgófázisban kémiai átalakulás nélkül. Az állófázissal való különböző mértékű kölcsönhatásuk pedig biztosítja a megfelelő elválasztást. Így, az oldódás feltétele a mozgófázis poláris jellege, míg az állófázissal való kölcsönhatás pedig úgy jöhet létre, ha az polárisabb a mozgófázisnál. Megállapíthatjuk, hogy az állófázis polárisabb a mozgófázishoz képest. Az állófázis a folyadékkromatográfiában elsősorban a vegyületek visszatartását határozza meg. A mozgófázis növekvő polaritásával, nő a poláris, vagy ionos komponensek mozgófázisban való oldhatósága, így csökken a visszatartás az állófázison. A poláris csoportot tartalmazó szilánnal kémiailag módosított szilikagélek közül a szénhidrátok, cukrok analitikai vizsgálatánál kiemelt fontosságú az aminocsoportokkal való módosítás. 12

4. ábra Aminocsoportot tartalmazó polárisan módosított szilikagél és az aminocsoport ionvisszaszorított, ionizált formája Az amino-módosítású szilikagél felületén többféle kölcsönhatás kialakítására képes csoport található. Reagálatlan szilanolok, aminocsoport, valamint a propil- és metilcsoportok. Irodalmi adatok bizonyítják, hogy retenció csökkenést okozhatnak savas csoporttal rendelkező komponensek elválasztásánál az állófázis felületén visszamaradt, reagálatlan szilanol csoportok és az anionos kompenensek között fellépő elektrosztatikus taszítóerők. Ennek a problémának az elkerülése érdekében célszerű erősen savas (ph<2) körülmények között, és amino-, vagy zwitter-ion módosítású állófázison dolgoznunk [25]. A mozgófázis ph-jától függően a szilanol és aminocsoport molekuláris formája, így kölcsönható képessége is változik. A szilanolcsoportok pka értéke 2-6, ebből következően kis ph értéken többnyire (ph<3) protonált formában vannak. A szilikagél polisav, így az alacsony ph-jú közegben nem oldódik. A primer aminocsoport pka értéke ~10,5, így savas ph-n protonálódik. A HILIC elválasztásra ajánlott aminocsoporttal módosított szilikagél állófázisok általában a 1,5-7 ph tartományban stabilak. A vizsgált komponensek állófázison való visszatartása több kölcsönhatás együttes eredménye. Az aktív hidrogén atomot tartalmazó vegyületekkel az aminocsoport hidrogénhídkötést alakít ki. A szilanolcsoport szintén hidrogén-kötés kialakítására képes. Az energetikailag heterogén felület propil- és metilcsoportjai apoláris kölcsönhatás kialakítására képesek a vizsgált komponensekkel. Az állófázis határfelületén kialakult vízréteget a protonált aminocsoportok hidratációja, az ionvisszaszorított szilanolcsoportokkal létrejövő hidrogénhíd hozza létre [24]. k = k v + k ic + k H + k dk 13

Hangsúlyozandó tehát, hogy a vegyületek visszatartását (k) és szelektivitását az állófázison a vízrétegbeli megoszlás (kv), az ioncsere (kic), a hidrogén-kötés (kh) és a diszperziós kölcsönhatás (kd) együttesen határozza meg. Az aminocsoporttal módosított szilikagél poláris, anionos és semleges vegyületek elválasztására is alkalmas. A szacharin, az aszpartám és az aceszulfám-k édesítőszerek savas és bázikus funkcióscsoportokat egyaránt tartalmaznak. Az aceszulfám-k szulfonsavanhidrid, a szacharin savamid csoportjai dominálnak, míg az aszpartám amino- és karboxil csoportjai miatt amfoter vegyület. A Pallas szakértő szoftver kinyert adatok alapján megállapíthatjuk, hogy a szacharin és az aceszulfám logd-ph függvénye lefutó jellegű, ami savas karakterre utal. Az aszpartám savas ph-n gyenge bázis, bázisos ph-n gyenge sav jellegét mutatja. 5. ábra A vizsgált édesítőszerek lgd-ph függvénye a Pallas szakértői szoftver előrejelzéséből Ezért érdemes az amino-módosítású szilikagél választása (például diol-módosítás helyett), mert az aminocsoportok felületi töltése kompenzálja az esetleges savas szilanolok negatív felületi töltését. 14

Komponens Képlet Molekulatömeg pk a* LogP* CAS-szám Szerkezet Szacharin C 7H 5NO 3S 183,18 4,98 0,23 81-07-2 Aszpartám C 14H 18N 2O 5 294,31 8,12-1,53 22839-47-0 Aceszulfám-K C 4H 5NO 4S 163,15 5,12-0,19 55589-62-3 3. táblázat Adatok a Pallas szakértői szofver előrejelzéséből 2. Kísérleti rész 2.1. Felhasznált minta, anyagok és vegyszerek A módszer fejlesztése során vizsgált valós minta WATT izotóniás ital volt. A vizsgálatok során analitikai tisztaságú aszpartám (Supelco, 99,0%), aceszulfám (Supelco, 99,9%) és szacharin (Sigma, 99,9%) standardokat alkalmaztam. A mozgófázishoz acetonitrilt (Merck, gradiens tisztaságú) és nagytisztaságú vizet (Millipore), valamint koncentrált foszforsavat (Merck, 85%) használtam. 2.2. Eszközök és műszerezettség A mintaelőkészítéshez 3db 10ml-es mérőlombikot, 3db főzőpoharat, 2db mérőhengert, 100, 250, 1000, 5000 µl-es Hamilton fecskendőket, 0,2 µm-es Phenomenex regenerált cellulóz szűrőt, illetve 2ml-es eldobható fecskendőket használtam. A mintát gázmentesítés céljából ultrahangoztam. A méréseket egy Waters Aquity UPLC rendszeren végeztem, mely ultra nagy nyomású szivattyúból, automata mintaadagolóból, 5 µl-es mintahurokból, kolonnatermosztátból és fotodióda soros detektorból (PDA) állt. A kiértékelést az Empower 2 és Excel szoftverekkel végeztem. Az édesítőszerek elválasztása Phenomenex Luna NH2 (150*4,6mm, 3 µm) analitikai oszlopon történt. 15

2.3. Mozgófázis, törzsoldat, munkaoldatok készítése Az A mozgófázishoz kimértem 500 ml vizet mérőhengerrel, majd hozzáöntöttem 1 ml tömény foszforsavat. A B mozgófázishoz kimértem 950 ml acetonitrilt mérőhengerrel, majd hozzáöntöttem 50 ml vizet. Ehhez fecskendővel hozzámértem 2 ml tömény foszforsavat. 3000, 4010, 6010 ppm (µg/ml) koncentrációjú közös törzsoldatot (TO) készítettem a következő módon. 30,0 mg szacharint, 40,1 mg aszpartámot, 60,1 mg aceszulfám-k standardot mértem be analitikai mérlegen egy 10 ml-es mérőlombikba. A lombikot félig megtöltöttem vízzel, ultrahangoztam. Majd 300, 401, 601 ppm koncentrációjú közös munkaoldatot (MO1) készítettem egy 10 ml-es mérőlombikba, oly módon, hogy 1 ml-et kivettem a 3000, 4010, 6010 ppm-s törzsoldatból, majd a mérőlombikot jelre állítottam mozgófázissal. Végül 1500, 2005, 3005 ppm koncentrációjú munkaoldatot (MO2) készítettem egy 10 ml-es mérőlombikba, oly módon, hogy 5,00 ml-et kivettem a 3000, 4010, 6010 ppm-s törzsoldatból, majd a mérőlombikot jelre állítottam mozgófázissal. 2.4. Mintaoldat előkészítése Az izotóniás italt felbontás után főzőpohárban 10 percig ultrahangoztam, majd 0,2 µmes regenerált cellulóz szűrőn átszűrtem. 2.5. Standard addíciós kalibráló oldatsorozat készítése Azonos térfogatú mintaoldathoz a benne előzetesen nagyságrendileg megbecsült édesítőszer koncentráció értékek 30, 50, 75, 100 és 125%-át adtam hozzá az elkészített standard munkaoldatokból, majd mozgófázissal egészítettem ki a végső térfogatra. A kalibráló standardoldatokat 900 µl mintához adtam hozzá. Az első négy pontnál a MO1 -ot, az ötödik pontnál a MO2-ot használtam fel, majd mozgófázissal hígítottam az 5. táblázatnak megfelelően. 16

Pontok (%) Mintaoldat (µl) A MO 1 * (1-4.) és a MO 2 * (5.) munkaoldatból bemért térfogat (µl) A bemért B mozgófázis (µl) 30 900 30 70 50 900 50 50 75 900 75 25 100 900 100 0 125 900 25 75 * MO 1=munkaoldat1, MO 2=munkaoldat2 4. táblázat Standard addíciós kalibráló oldatsorhoz szükséges bemérendő térfogatok, végkoncentráció 2.6. A mérési paraméterek meghatározása A módszerfejlesztés során közös standard oldatok spektrumát DAD detektorral felvéve a 215nm állapítottam meg a mérés ideális hullámhosszának. Alacsonyabb hullámhosszon nő az oldószer fényelnyelése, ami zavarja a mérés érzékenységét. Magasabb hullámhosszon pedig a komponensek jelerőssége csökken. HILIC módszer esetén az erősebb eluens a víz. A mintaoldat nagy víztartalma miatt vizsgálni kellett az injektálási térfogat változtatásának hatását is, hogy a kolonnára juttatott növelt mozgófázis mennyiség milyen módon hat a csúcsminőségre. Megállapítható, hogy a mért tartományban (2-5µl) nem tapasztalható csúcsminőség romlás (ld. 6. ábra). 6. ábra Az injektált térfogat változtatásának hatása a csúcsminőségre 17

Az édesítőszerek különböző hidrofobicitása miatt gradiens elúciót alkalmaztam. A gradiens elúció során nagytisztaságú mozgófázist alkalmazunk, mert a gyenge elúciós szakaszban a mozgófázis szennyezői dúsulnak a kolonna elején, majd az erős elúciós fázisban szellemcsúcsokként jelennek meg. A legnagyobb kihívást az aszpartám és aceszulfám-k komponensek egymástól és a minta-mátrixtól való elválasztása jelentette. Ennek megoldására több gradiensprogramot írtam és futtattam le. M5. Idő (min) Áramlási sebesség (ml/perc) Mozgófázis A (%) B (%) M8. Idő (min) Áramlási sebesség (ml/perc) Mozgófázis A (%) B (%) 0 1 0 100 4,5 1 0 100 12 1 20 80 12,01 1 0 100 20 1 0 100 0 1 0 100 4 1 0 100 6 1 10 90 13 1 10 90 13,01 1 0 100 16 1 0 100 A: 100 v/v% víz, 0,2 v/v% cc. H 3PO 4 B: 95 v/v% ACN, 5 v/v% víz, 0,2 v/v% cc. H 3PO 4 5. táblázat Az M5 és M8 gradiensprogram kromatogramjainak összehasonlítása Az M5 gradiensprogramhoz tartozó kromatogramon látszik, hogy az első komponens (szacharin) sok időt tölt az állófázison, a nagy visszatartás csúcsszélesítő hatású volt. A 20 18

v/v%-os A mozgófázis erősnek bizonyult. A mátrix komponensek nem váltak el egymástól, a szelektivitás nem volt kielégítő. Az M8-as programban egy gyorsabb felfutású gradienst állítottam be, majd megtartottam az M5 programhoz képest gyengébb (10v/v%) eluenserősséget állítottam be, amelyet további hét percig lineárisan tartottam. Az aceszulfá m- K továbbra is átlapolt a mátrixban található szennyező komponenssel. M11. Idő (min) Áramlási sebesség (ml/perc) Mozgófázis A (%) B (%) M14. Idő (min) Áramlási sebesség (ml/perc) Mozgófázis A (%) B (%) 0 1 0 100 3 1 0 100 8 1 25 75 8,01 1 0 100 14 1 0 100 0 1 0 100 3 1 0 100 5 1 15 85 15 1 15 85 15,01 1 0 100 19 1 0 100 A: 100 v/v% víz, 0,2 v/v% cc. H 3PO 4 B: 95 v/v% ACN, 5 v/v% víz, 0,2 v/v% cc. H 3PO 4 6. táblázat Az M11 és M14 gradiensprogram kromatogramjainak összehasonlítása Az M11 programban a poláris mátrix-komponensek szétválasztásával kísérleteztem. A mozgófázis erősségének jelentős növelése nem segítette a szelektivitást. Az M14 program 19

mérési eredményéből megállapítottam, hogy az elválasztás érdekében a gyorsabb felfutás ú gradiens után szükség van egy hosszabb lineáris szakaszra. És a kapott eredmények után a gradienserősséget 15v/v%-nál határoztam meg. Az M14-es program kromatogramján látszik, hogy tizenkét perc után már nem eluálódik komponens a kolonnáról, így a végső módszer vizsgálati idejét lecsökkentettem. A kifejlesztett módszerben (7. táblázat) három percnél indítottam a gradienst, amely keskeny szacharin csúcsot eredményezett. A megfelelő eluenserősségű hétperces izokratikus szakasznak köszönhetően a módszer megfelelő szelektivitást ért el a vizsgált szacharin, aszpartám és aceszulfám-k komponensek tekintetében. 2.7. Mérési módszer Az édesítőszerek elválasztása egy 150*4,6 mm-es, 3 µm szemcseátmérőjű Phenomenex Luna NH2 módosítású analitikai oszlopon történt. Az A mozgófázis 100 v/v% nagytisztaságú víz és 0,2 v/v% tömény foszforsavat tartalmazott, míg a B mozgófázis 95 v/v% acetonitril és 5 v/v% víz elegye volt, 0,2% tömény foszforsavval, így a ph-érték 1,90 körüli volt. A kolonnatermosztátot egységesen 27,5 C-ra állítottam. A mozgófázis áramlási sebessége 1 ml/perc és az injektálási térfogat 5 µl volt. A gradiensprogramban beállított mozgófázis arányokat a 6. táblázat mutatja. Az UV-detektálás 215 nm-en történt. A tűmosó folyadék acetonitril-víz (1:1), a mérési idő 12 perc volt. Idő (min) Áramlási sebesség (ml/perc) Mozgófázis A (%) B (%) 0 1 0 100 2 1 0 100 3 1 5 95 5 1 15 85 12 1 15 85 12,01 1 0 100 16 1 0 100 A: 100 v/v% víz, 0,2 v/v% cc. H 3PO 4 B: 95 v/v% ACN, 5 v/v% víz, 0,2 v/v% cc. H 3PO 4 7. táblázat A kifejlesztett HILIC-HPLC elválasztási módszer végső gradiensprogramja 20

21

8. táblázat Az édesítőszer komponensek kromatogramjai a 100ppm-es standard oldatban (A), a WATT mintában (B) és a szpájkolt mintában (C) 3. Mérési eredmények és kiértékelés 3.1. Linearitás A standard addíciós kalibrációt a valós mintában lévő mátrix zavaró hatásának kiküszöbölése miatt alkalmaztam. Az előkészített (gáztalanított és szűrt) mintaoldathoz növekvő koncentrációban hozzáadott standard munkaoldatokat a végső mérési módszerrel lemértem, addíciós grafikont hoztam létre. A mérési pontokra a legkisebb négyzetek elvével illesztett kalibráló egyenesek lineárisak az alkalmazott tartományban. Az R 2 értékek megfelelőek (ld. 8. táblázat). A kalibráló egyenesek y-tengelyt metsző pontjai adják meg a mintaoldat vizsgált komponenseinek elméleti koncentrációértékeit. A számított koncentrációérték a szacharin esetében: 0 = y 0 = 29434x + 258000 x = 8,77ppm Az előkészített kalibráló oldatok 900µl-re tartalmazta a vizsgált édesítőszer komponensek anyagmennyiségét, az 1,1-szorzós hígítási faktorral számolt végső értékeket az 10. táblázat tartalmazza. Komponens Adagolt mennyiség (ppm) Csúcsterület (mau*min) Csúcsmagasság (mau) Szacharin 9 522839 115114 15 696253 163411 22,5 922568 218750 30 1146403 272473 37,5 1357387 316059 Aszpartám 12,03 341039 60520 20,05 460962 80206 30,075 606928 105051 40,1 748896 123979 50,125 883772 138291 Aceszulfám-K 18,03 229779 65641 30,05 291211 88720 45,075 397386 119828 60,1 487923 145600 75,125 587422 172678 Egyenes egyenlete R 2 y=29434x+258000 0,9999 y=14262x+173676 0,9996 y=6331,2x+109561 0,9985 9. táblázat Mennyiségi meghatározás adatai 22

Csúcsterület (mau*min) 1500000 1300000 y = 29434x + 258000 R² = 0,9999 1100000 900000 y = 14262x + 173676 R² = 0,9996 Szacharin Aszpartám Aceszulfám-K 700000 500000 y = 6331,2x + 109561 R² = 0,9985 300000 100000-40 -20-100000 0 20 40 60 80 100 Hozzáadott koncentráció (ppm) 7. ábra Standard addíciós kalibráció 3.2. Szórás és visszanyerés A mérési módszer precizitását az injektálás ismételhetőségével jellemzem. A vizsgálatához a mintát előkészítettem és háromszor injektáltattam, majd megvizsgáltam a mérési eredmények szórását. A korrigált tapasztalati szórást (standard deviancia, SD) és a relatív tapasztalati szórást a képletek alapján számoltam. SD = (x i x )2 n 1 Ahol SD a szórás x a konkrét érték x az átlag n-1 az átlagtól való eltérés szabadságfoka RSD = SD x 100% Ahol RSD a relatív standard deviáció SD a szórás x a mérési eredmények átlaga A mintaelőkészítés helyességét a visszanyeréssel jellemzem. A mintaelőkészítés során, szűrés előtt és szűrés után a mintaoldathoz azonos, ismert mennyiségben adagoltam a standard 23

munkaoldatból (MO1), majd lemértem a mintákat. A két értéket egymással elosztva kaptam meg a visszanyerést százalékos formában (R). Az eredményeket (SD, RSD, R) a 10. táblázatban adtam meg. Komponens Szacharin Aszpartám Aceszulfám-K Csúcsterület (mau*min) 1 267693 182526 141596 Mintainjektálás 2 250116 182419 135820 3 252514 179666 145785 Átlag 256774 181537 141067 SD 9532 1621 5004 RSD (%) 3,71 0,89 3,55 Analátkoncentráció a mintában 9,65 ± 0.36 ppm 13,4 ± 0.12 ppm 19,0 ± 0.67 ppm Mintainjektálás Szűrés előtt addícionált 1204914 840976 589461 Szűrés után addícionált 1183423 828745 552117 R (%) 102 102 106 10. táblázat Szórás, visszanyerés, édesítőszer-koncentráció eredmények 3.3. LOD, LOQ meghatározása Kimutatási határnak azt a koncentrációt fogadjuk el, ahol a jel nagysága háromszorosa az alapvonal zaj nagyságának. A mennyiségi meghatározás alsó határának pedig azt, ahol a jelnagyság az alapvonal zaj nagyságának tízszerese. A határokat a koncentráció magasság diagramok egyenes egyenletei alapján számítottam. LoD = 3 alapvonalzaj érzékenység LoQ = 10 alapvonalzaj érzékenység A meghatározás és a mennyiségi kimutatás alsó határának megállapításához a valós mintában lévő koncentrációértékeket vettük alapul, melyeket a standard addíciós kalibráló egyenesekből kapunk meg oly módon, ha a tengelymetszeteknek a minta átlagos csúcsterületeit feleltetjük meg. A szacharin esetében az alábbi számítás alapján: y = 29434x + 256774 x = 8,72ppm 24

Ehhez az értékhez hozzáadva az addícionált koncentrációértéket kapjuk meg a csúcsmagasságokhoz tartozó eredeti koncentrációértéket. x = 8,72 + 9 = 17,7ppm Komponens Összkoncentráció (ppm) Csúcsmagasság (mau) Érzékenység LOD LOQ Szacharin 17,7 115114 23,7 163411 31,2 218750 6915,1 0,22ppm 0,70ppm 38,7 272473 46,2 316059 Aszpartám 24,1 60520 32,1 80206 42,1 105051 52,2 123979 62,2 138291 Aceszulfám-K 35,1 65641 47,2 88720 62,2 119828 77,2 145600 92,2 172678 2358,6 0,60ppm 2,00ppm 1886,6 0,75ppm 2,00ppm Alapvonalzaj 500 1500mAU 5000mAU 11. táblázat A fejlesztett módszer LOD, LOQ adatai 25

8. ábra Az LOD, LOQ meghatározása 4. Összefoglalás Munkám tervezése során feladatul tűztük ki három, napjainkban széleskörűen alkalmazott mesterséges édesítőszer szacharin, aszpartám, aceszulfám-k izotóniás italokból való szimultán meghatározását. A szakirodalomban található legtöbb eljárás és a magyar szabvány is fordított fázisú elválasztási módszert ír elő, amely az édesítőszerek polaritása (logp értékek -1,53 (aszpartám), -0,19 (aceszulfám-k) és 0,23 (szacharin)) miatt nem kapunk megfelelő visszatartást, ami az összetettebb mátrixok esetén a szelektivitás romlásához vezet. A szakirodalom az utóbbi években egyre elterjedtebb HILIC módszert részesíti előnyben poláris komponensek folyadékkromatográfiás meghatározására. Dolgozatomban az irodalmi adatok alapján egy előre kiválasztott, 150*4,6 mm-es, 3 µm szemcseátmérőjű Phenomenex Luna NH2 módosítású analitikai oszlopon történő általam kifejlesztett hidrofil kölcsönhatáson alapuló (HILIC) folyadékkromatográfiás elválasztási módszert ismertetem. A HILIC elválasztást követően optikai (UV) detektálással határozhatók meg az édesítőszerek 215 nm hullámhosszúságon. Az édesítőszerek különböző hidrofobicitása miatt gradiens elúciót alkalmazunk. A mozgófázis acetonitril- víz különböző koncentrációjú elegye. Az A mozgófázis 100 v/v% nagytisztaságú víz és 0,2 v/v% tömény foszforsavat tartalmazott, míg a B mozgófázis 95 v/v% acetonitril és 5 v/v% 26

víz elegye volt, 0,2% tömény foszforsavval. A teljes mérési idő 12perc, mely szelektív és hatékony elválasztást tesz lehetővé. A módszer alkalmasságának bizonyítására olyan a valós mintát, melyben mindhárom édesítőszer megtalálható. A WATT izotóniás ital megfelel ennek a kritériumnak, mert szacharint, aceszulfám-k-t, aszpartámot egyaránt tartalmaz. A mátrix-hatást kiküszöbölve standard addíciós kalibrációt alkalmazva határoztuk meg a minta édesítőszer-koncentrációit, mely 9,65 ppm, 13,4ppm, 19,0ppm volt rendre a szacharin, aszpartám, aceszulfám-k komponensek esetén. A kapott értékek alul maradnak a megszabott egészségügyi határértékeknek. A módszer analitikai teljesítményjellemzőit (mintaelőkészítés visszanyerését, az injektálás ismételhetőségét, linearitást, LOD és LOQ értékeket) vizsgáltam. A kapott kimutatási határértékek (LOD) 0,15ppm, 0,6ppm, 0,75ppm, a mennyiségi analízis alsó határa (LOQ) értékek 0,5ppm, 2ppm, 2,5ppm rendre a szacharin, aszpartám és aceszulfám-k komponensekre, melyek kielégítőnek bizonyultak. A kutatás folytatásaként a módszert szeretném átdolgozni, hogy alkalmas legyen tömegspektrometriás (MS) detektálásra, mely összetettebb mátrixok esetén is megfelelő szelektivitást nyújthat. A szakirodalomban egyre több publikáció születik a települési szennyvizekben Európa-szerte µg/l koncentráció szinten megjelenő édesítőszerekről, melyek a szennyvíztisztítási eljárásoknak részlegesen ellenállnak. A µg/l és ng/l koncentrációjú vízminták vizsgálatához a DAD detektornál érzékenyebb és szelektívebb MS detektálásra van szükség. A kidolgozott HILIC-HPLC-MS módszer így a környezetvédelmi analitika területén is gyakorlati jelentőségre tehetne szert. 27

5. Köszönetnyilvánítás Köszönettel tartozom témavezetőimnek Dr. Fekete Jenő Tanár Úrnak és Bobály Balázsnak, hogy a Szervetlen és Analitikai Kémiai Tanszék HPLC laborjában végezhettem a munkámat. Köszönöm nekik és Varga Bozsanának, hogy szakmai hozzáértésükkel, meglátásaikkal, türelmükkel odaadóan segítették a dolgozatom létrejöttét. 28

6. Irodalomjegyzék [1] Chui-Shiang Chang, Tai Sheng Yeh, Detection of 10 sweeteners in various foods by liquid chromatography/tandem mass spectrometry, Journal of Food and Drug Analysis, 2014, 22, 318-328. [2] Maroula G. Kokotou, Nikolaos S. Thomaidis, Analyticak Methods, Determination of eight artificial sweeteners in wastewater by hydrophilic interaction liquid chromatography-tandem mass spectrometry, 2013, 5, 3825-3833. [3] Agata Zygler, Andrzej Wasik, Jacek Namiesnik, Analytical methodologies for determination of artificial sweeteners in foodstuffs, Trends in Analytical Chemistry, 2009, 28, 9, 1082-1101. [4] Qing-chuan Chen, Shi-fen Mou, Ke-na Liu, Zu-ying Yang, Zhe-ming Ni, Separation and determination of four sweeteners and citric acid by high-performance anion-exchange chromatography, Journal of Chromatography A, 1997, 771, 135-143. [5] Európai Tanács 89/107/EGK irányelve (1988. december 21.) és az azt módosító Európai Parlament és Tanács 94/35/EK, 96/83/EK, 2003/115/EK, 2006/52/EK irányelvei) az élelmiszerekben felhasználandó édesítőszerekről. [6] 152/2009. (XI. 12.) FVM rendelet a Magyar Élelmiszerkönyv kötelező előírásairól. [7] Magyar Szabvány MSZ EN 12856 Élelmiszerek. A K-aceszulfám, az aszpartám és a szacharin meghatározása. Nagy felbontású folyadékkromatográfiás módszer. 2000 decembere. [8] Leo M. L. Nollet, Fidel Oldra, Food Analysis by HPLC, Third Edition, CRC Press, 2012 [9] Serkan Yılmaz, Aslı Ucar, Cytotechnology, A review of the genotoxic and carcinogenic effects of aspartame: does it safe or not?, Cytotechnology, 2013, DOI 10.1007/s10616-013- 9681-0 [10] Marco Scheurer, Heinz-J, Brauch, Frank T. Lange, Analysis and occurance of seven artificial sweeteners in German waste water and surface water and in soil aquifer treatment (SAT), Analytical and Bioanalytical Chemistry, 2009, 394,1585-1594. 29

[11] J. Buerge, M. Keller, H.-R. Buser, M. Kahle, M. D. Muller, T. Poiger, Saccharin and Other Artificial Sweeteners in Soils: Estimated Inputs from Agriculture and Households, Degradation, and Leaching to Groundwater, Environmental Science and Technology, 2011, 45, 615-621. [12] M. Scheurer, F. R. Storck, C. Graf, H.-J. Brauch, W. Ruck, O. Lev, F. T. Lange, Correlation of six anthropogenic markers in wastewater, surface water, bank filtrate, and soil aquifer treatment, Journal of Environmental Monitoring, 2011, 13, 966-973. [13] D. R. Van Stempvoort, J. W. Roy, S. J. Brown, G. Bickerton, Artificial sweeteners as potential tracers in groundwater in urban environments, Journal of Hydrology, 2011, 401, 126-133. [14] Maroula G. Kokotou, Alexandros G. Asimakopoulos, Nikolaos S. Thomaidis, Artificial sweeteners as emerging pollutants in the environment: analytical methodologies and environmental impact, Analytical Methods, 2012, 4, 3057-3070. [15] Maja Serdar, Zorka Knezevic, Determination of artificial sweeteners in beverages and special nutritional products using high performance liquid chromatography, Archives of Industrial Hygiene and Toxicology 2011, 62, 169-173. [16] Malgorzata Grembecka, Piotr Baran, Agata Blazewicz, Zbigniew Fijalek, Piotr Szefer,Simultaneous determination of aspartame, acesulfame-k, saccharin, citric acid and sodium benzoate in various food products using HPLC-CAD-UV/DAD, European Food Research and Technology, 2014, 238, 357-365. [17] Andrzej Wasik, Josephine McCourt, Manuela Buchgraber, Simultaneous determination of nine intense sweeteners in foodstuffs by high performance liquid chromatography and evaporative light scattering detection Development and single-laboratory validation, Journal of Chromatography A, 2007, 1157, 187-196. [18] Edgar Y. Ordonez, José Benito Quintana, Rosario Rodil, Rafael Cela, Determination of artificial sweeteners in water samples by solid-phase extraction and liquid chromatograp hytandem mass spectrometry, Journal of Chromatography A, 2012, 1256, 197-205. 30

[19] N. Dossi, R. Toniolo, S. Susmel, A. Pizzarello, G. Bontempelli, Simultaneous RP-LC Determination of Additives in Soft Drinks Chromatographia 2006, 63, 557. [20] D. Yang, B. Chen, Simultaneous Determination of Nonnutritive Sweeteners in Foods by HPLC/ESI-MS, Journal of Agricultural and Food Chemistry 2009, 57, 3022. [21] Y. Zhu, Y. Guo, M. Ye, F. S. James, Separation and simultaneous determination of four artificial sweeteners in food and beverages by ion chromatography Journal of Chromatography A, 2005, 1085, 143. [22] Q. Chen, J. Wang, Simultaneous determination of artificial sweeteners, preservatives, caffeine, theobromine and theophylline in food and pharmaceutical preparations by ion chromatography, Journal of Chromatography A, 2001, 937, 57. [23] Pavel Jandera, Stationary and mobile phases in hidrophilic interaction chromatography: a review, Analytica Chimica Acta, 2011, 692, 1. [24] Dr. Fekete Jenő, A folyadékkromatográfia újabb fejlesztési irányai, HILIC, 2008. [25] Aurélie Periat, Benjamin Debrus, Serge Ruday, Davy Gillarme, Screening of the most relevant parameters for method developement in ultra-high performance hydrophilic interaction chromatography, Journal of Chromatography A, 2013, 1282, 72. Dr. Fekete Jenő, Folyadékkromatográfia elmélete és gyakorlata, Edison House Kft., Dabas, 2007. Dr. Fekete Jenő, Kormány Róbert, Fekete Szabolcs, A folyadékkromatográfia fejlesztési irányai, Gyors folyadékkromatográfia, 2014. 31