A projekt címe A projekt nyilvántartási száma: A korai embrionális és magzati veszteségek állategészségügyi prevenciójának lehetőségei szarvasmarha állományokban NKFP4/042/2004 A szerződés száma: 4/042/2004 Munkaszakasz számát 3 A beszámolási időszak 2006. 12. 01. 2007. 12. 31. tényleges kezdési és befejezési idejét Szent István Egyetem Állatorvos-tudományi Kar Szent István Egyetem, Mezőgazdaság és Környezettudományi A támogatott szervezetek neve Kar Állattenyésztési és Takarmányozási Kutatóintézet MTA Állatorvos-tudományi Kutatóintézete V.M.D. Állatgyógyászati Kft A projektvezető neve Dr. Szenci Ottó 1
Tartalomjegyzék Oldal 1. Szakmai tudományos háttér 3 2. A projekt fő célkitűzései; az eredmények hasznosíthatósága 4 3. A projekt keretében vállalt feladatok. Projektstruktúra 5 4. A projekt keretében végzett munka részletes ismertetése 6 4.1. Elővizsgálatok 6 4.2. Diagnosztikai célú vizsgálatok 14 4.3. Az embrionális, illetve a korai magzati veszteségek csökkentése gyógyszeres kezelésekkel 4.3. Az embrionális, illetve a korai magzati veszteségek csökkentése két kísérleti takarmány adalékanyag segítségével 24 27 A projekt gyakorlatnak átadható fontosabb tapasztalatainak összegzése 48 A projekt eredményeit ismertető publikációk 49 Mellékletek 2
1. Szakmai tudományos háttér Amint pályázatunkban 1, ill. korábbi más munkáinkban részletesen ismertettük, tejhasznú tehénben az első termékenyítések nyomán tapasztalható alacsony vemhesülési arány jelentős részben az embrió korai elhalásával (EM) magyarázható. Az embrió elpusztulhat a fogamzást követő legkorábbi időszakban (rendszerint a blastocysta kialakulásának stádiumában; kb. 6-7. nap): ez esetben a jelenség a jelenleg rendelkezésre álló klinikai és endokrinológiai vizsgálómódszerek számára teljes mértékben rejtve marad. Gyakori lehet azonban EM a vemhesség anyai szervezet részéről történő felismerésének az idején (kb. 12-16. nap), vagy az ezt követő kb. 10-14 napos periódusban is. Ez esetben a ciklus sárgatest (CL) fázisa meghosszabbodik, a viszszaivarzás késlekedik, ill. ha az embrió a kb. 22-26. napon még életben van egyes, a vemhesülés megtörténtét bizonyító proteinek (pl. vemhességspecifikus protein B, PSPB) jelennek meg a vérben. Amennyiben az ellés után kb. 60. nap után termékenyített állat vérében az inszeminálás után >26-28 nappal PSPB mutatható ki, a tehén viszont ennek ellenére is a későbbiekben üresnek bizonyul, bizonyítottnak tekinthető az EM ténye. A vemhesség anyai szervezet részéről történő felismerésének idején, vagy röviddel azt követően bekövetkező EM rendszerint összefügg a luteinizáció elégtelen voltával, ami a posztovulációs időszakban naponként mért progeszteron (P4) szintemelkedés mértékével jellemezhető. Nagyszámú korábbi vizsgálat köztük saját munkáink is tanúsítják, hogy a petefészekműködés ellés utáni ciklikussá válásának késlekedése, ill. az első ovuláció megtörténte után a luteinizáció zavara tejhasznú tehénben leggyakrabban az ellés utáni negatív energetikai egyensúly (negative energy balance, NEB) metabolikus és endokrinológiai következményeivel áll öszszefüggésben. Utóbbiak sorában (az LH-alapszekréció pulzusfrekvenciájának a kívánatostól való elmaradása mellett) az adipo-insuláris tengely hormonjainak (leptin-inzulin), és a pajzsmirigy hormonjainak (T4, T3) az alacsony vérszintje, továbbá a növekedési hormon (STH) által indukált intrahepatikus inzulin-szerű növekedési faktor-i (IGF-I) produkció csökkenése nyomán az IGF-I szint alacsony volta számít meghatározó jelentőségűnek. Az ovariális funkciók regulációja szempontjából a felsorolt metabolikus hormonok közül az inzulin és az IGF-I plazmaszintjének a csökkenése tűnik elsősorban kritikusnak. Emellett az IGF-I valószínűleg közvetlenül is befolyásolja az embrió életben maradása szempontjából meghatározó jelentőségű endometriális mirigyszekréciót, és közvetlen hatása lehet az embrió fejlődési erélyére is. A NEB dekompenzációjának (hyperketonaemia) az immunszupressziv hatása széles körben bizonyított, napjainkban sem ismert ugyanakkor, hogy egyes gyakran előforduló vírusfertőzések [pl. bovin herpeszvírusok, azaz fertőző rhinotracheitis (IBR) vírus, BoHV-1 és Movár herpeszvírus, BoHV-4] kórfejlődésében, illetve direkt vagy indirekt módon az ellés utáni első inszeminálást követő EM kialakulásában érvényesül-e valamilyen interakció. Úgyszintén inkább feltételezéseken, anekdotikus közléseken, mintsem konkrét vizsgálati eredményeken alapul az EM gyakoriságának a fokozódása az egyes hiányállapotokban, a nyomelemek közül elsősorban a mangán (Mn) és talán a szelén (Se) hiánya esetében. Mind az inzulin, mind pedig az IGF-I szintje fordított arányban áll az állat energetikai egyensúly-állapotával, emellett további takarmányozási és farmakológiai módszerekkel is befolyásolható. Az utóbbiak közül bsth adásával (emellett pedig talán pótlólagos fényexpozícióval is) növelhető az IGF-I szintje, a módszer alkalmazása azonban csak Észak-Amerikában engedélyezett, az EU-ban szigorúan tiltott. A pótlólagos fénykiegészítéssel szerzett tapasztalatok biztatóak ugyan, nem mentesek azonban az ellentmondásoktól, emellett alkalmazásuk energiaigényes és jelentős kiegészítő beruházásokat is feltételez. Ezért a módszer hazai alkalmazásra ajánlása előtt még további jelentős vizsgálatok lennének indokoltak, ill. a gyakorlati alkalmazás a jelen 1 A célok szakmai megalapozottságának megítélése, illetve a jelentés tartalmi vonatkozásainak a követése csak a pályázati anyagnak is részét képező irodalmi áttekintés ismeretében lehetséges. 3
körülményeink között nem tűnik gyors sikert eredményezőnek. Az inzulin vérszintje bizonyos lassú felszívódású készítmények gyógykezelés-szerű alkalmazásával növelhető, de a nem kívánt mellékhatások megelőzése indokolja a dózis adott körülmények közötti optimalizálását, ami jelentős szakmai ismeretet és laboratóriumi hátteret feltételez, és emellett jelentős költségekkel is jár. Emellett az inzulin és indirekt módon talán az IGF-I produkciós rátája, és vérszintje is növelhető egyes glukoneogenetikus hatású takarmány-adalékanyagokkal (pl. propilénglikol, glicerin), illetve bizonyos, többszörösen telítetlen zsírsav-komponensekben (PUFA) gazdag, a bendőbeli átalakulásoktól (biohidrogenáció, lebomlás), védett zsírforrások biztosításával. Utóbbiak, az eikozainoidok kiindulási vegyületeként (pl. linolsav) közvetlenül befolyásolhatják a vemhesség anyai szervezet részéről történő felismerésében kulcsszerepet betöltő prosztaglandinok endometriális produkcióját is. Munkánk során e módszerek egyes lehetőségeivel kívántunk hazai tartási-takarmányozási körülményeken alapuló tapasztalatokat szerezni, propilénglikol- ill. PUFA-forrásként egy-egy, a konzorciumi partnerek egyike (V.M.D. Állatgyógyászati Kft) által kifejlesztett és üzemi méretekben is gyártani tervezett takarmány adalékanyagot felhasználva. 2. A projekt fő célkitűzései; az eredmények hasznosíthatósága A projekt keretében a modern molekuláris biológia, virológia, endokrinológia, szaporodásbiológia, klinikai biokémia és takarmányozástan eszköztárának felhasználásával célunk volt annak meghatározása, hogy üzemi körülmények között tejhasznú szarvasmarhában (1) mely vizsgálómódszerek alkalmazhatóak az inszeminálás után kb. >25-30 nappal bekövetkező (késői embrionális, illetve a korai magzati) veszteségek biztonságos felismeréséhez; (2) üszőkorban, illetve az ellés utáni (post partum) időszakban vizsgálva mekkora lehet e veszteségek előfordulási aránya; (3) az embrionális, illetve a korai magzati veszteségek előfordulása összefüggésbe hozható-e (a) az energia-, és a mikroelem /vitamin-ellátottság gyakran előforduló zavaraival, (b) az elléstől az első tüszőrepedésig eltelt idő tartamával, illetve (c) egyes gyakran előforduló vírusfertőzésekkel [pl. bovin herpeszvírusok, azaz fertőző rhinotracheitis (IBR) vírus, BoHV-1 és Movár herpeszvírus, BoHV-4]; (4) továbbá e veszteségek mértéke csökkenthető-e egyes, (a) a szaporodásbiológiai gondozás üzemi rendjébe könnyen beilleszthető gyógyszeres kezelésekkel, azaz (i) kb. 20-24 órás hatású, u.n. lente inzulin készítménynek az alkalmazásával, és/vagy (ii) az ellés utáni első inszeminálás időzítésére hazánkban is széles körben alkalmazott, a 63-77. napon megkezdett GnRH - PGF2 - GnRH (Ovsynch) szinkronizálási protokoll során a második GnRH kezelés humán chorion gonadotropinra (hcg) történő cseréjével, illetve (b) a kísérleti fejlesztés tárgyát képező két, a takarmány-fejadag energia koncentrációját növelő takarmány adalékanyaggal, azaz (i) egy, a májbeli glikoneogenezist is fokozni képes, szilárd halmazállapotú propilénglikol készítménnyel, valamint (ii) egy lenmag alapú, többszörösen telítetlen zsírsavakat (PUFA; elsősorban linol- és linolénsavat) nagy mennyiségben tartalmazó, ezért potenciálisan az endometriális prosztanoid szintézist is specifikusan befolyásolni képes adalék anyaggal 2. 2 A lenmag alapú takarmányadaléknak e projekt keretében történő kifejlesztése és tesztelése mellett azután döntöttünk, miután a kísérleti munka során korán bebizonyosodott a lente inzulin kezeléseknek a feltételezettektől jelentősen elmaradó hatékonysága. 4
Munkánk során adatokkal kívántunk szolgálni annak megítéléséhez, hogy lehetséges-e, és igen válasz esetén milyen specifikus módszerekkel, kezelésekkel és célirányos termékekkel ezen embrionális, illetve a korai magzati veszteségek kártételének a csökkentése. A pályázat részét képező fejlesztések során ismert általános előfordulásuk és feltételezett jelentőségük alapján az energia-háztartás és a mikroelem/vitamin-ellátottság zavarainak, valamint az oxidatív stresszállapotnak a korrekciójára alkalmas módszereket helyeztük előtérbe. A projekt eredményei új ismereteket jelentenek a tejtermelő tehenészetek takarmányozási technológiájának, valamint állategészségügyi és szaporodásbiológiai gondozásának a hagyományosan alkalmazottnál hatékonyabb megszervezéséhez. Alkalmazásuk révén javítható a hazai tejtermelő tehenészetek versenyképessége, amely hozzájárulhat a mezőgazdasági vállalkozások megerősödéséhez, az elmaradott térségekben is elősegítve azok munkahely-teremtő, illetve -megtartó képességét. 3. A projekt keretében vállalt feladatok. Projektstruktúra A konzorcium tagjai minden részletében összehangolt munka keretében a projekt teljes futamideje alatt az alábbi (jelentős laboratóriumi módszerfejlesztéseket, illetve két kísérleti takarmány adalékanyag kialakítását és formulázását is magában foglaló) kutatási és fejlesztési feladatokat végezték el: (1) Elővizsgálatok (a Támogatási Szerződésben alkalmazott jelölés: ELŐ): a posztovulációs progeszteron (P4) szintemelkedés (luteinizáció) intenzitásának, illetve a termékenyítés eredményességének, az embrionális - korai magzati veszteségek előfordulásának az összevetése, előzetesen szinkronizált ciklusú tenyészüszőkben (1. kísérlet), valamint a (63-77. napon megkezdett Ovsynch kezelés előtt már ciklikussá vált, vagy még acikliás petefészekműködésű) post partum tehenekben (2. kísérlet). (2) Diagnosztikai célú kísérletek (a Támogatási Szerződésben alkalmazott jelölés: DG-1 és DG-2): A késői embrionális - korai magzati veszteségek gyakoriságának, feltételezett metabolikus, a mikroelem/vitamin-ellátottsággal összefüggő, valamint virológiai hátterének a vizsgálata; az energiaháztartás zavarának hatása a bovin típusú herpeszvírusok (BoHV-1, BoHV-4) aktiválódására, és az EM előfordulására post partum tehenekben (továbbiakban ld. 3., 4. és 5. kísérlet). (3) Az embrionális, illetve a korai magzati veszteségek csökkentése gyógyszeres módszerekkel (a Támogatási Szerződésben alkalmazott jelölés: TR1): Az ellés utáni negatív energiaegyensúllyal (negative energy balance, NEB) összefüggő ovarialis funkciózavaroknak (azaz az ellés utáni első tüszőrepedés késlekedésének, továbbá az első termékenyítést megelőző tüszőérés, illetve az azt követő luteinizáció zavarainak) a megelőzése, kezelése (hoszszú, kb. 20-24 órás hatású, ú.n. lente) inzulin készítmény segítségével (továbbiakban ld. 6. kísérlet); továbbá az ellés utáni első inszeminálást (AI) követő luteinizáció üteme befolyásolható-e az AI időzítésére alkalmazott, a 63-77. napon megkezdett GnRH - PGF2 - GnRH (Ovsynch) szinkronizálási protokollban a második GnRH kezelés hcg-re történő cseréjével (a feladat megoldására a 2. kísérlet keretében került sor). (4) A program további részeinek (a támogatási szerződésben alkalmazott jelölés: TR2 TR3 és KF1 kísérlet; a továbbiakban ld. 7. 8. és 9. kísérlet) a sikeres kivitelezéséhez szükséges kísérleti takarmány adalékanyagok, azaz egy-egy, a gyakorlatban könnyebben alkalmazható, a takarmány-fejadag energiakoncentrációját növelő, szükség esetén mikroelem és/vagy vitamin-kiegészítést is biztosító, (a) emellett glukoneogenetikus hatású szilárd halmazállapotú propilénglikol készítmény, valamint 5
(b) PUFA-ban (elsősorban linol- és linolénsavban) gazdag, ezért potenciálisan az endometriális prosztanoid szintézist is specifikusan befolyásolni képes) lenmag alapú takarmányadalék kialakítása és formulázása, az állatkísérletek lefolytatásához szükséges mennyiségű kísérleti takarmányadalék-mennyiség gyári előállítása (olyan formában, hogy azok alkalmasak legyenek az esetleges, telepspecifikus módon összeállított mikroelem és vitamin-kiegészítésre is). (5) Az előbbiekben részletezetteknek megfelelően kialakított kísérleti takarmány adalékanyagokkal végzett vizsgálatok, azaz annak a meghatározása, hogy alkalmazásuk nyomán miként alakul az állatok tejtermelése, ellés utáni metabolikus státusza és reprodukciós képessége, különös tekintettel a petefészek-működés ellés utáni ciklikussá válására, illetve a késői embrionális - korai magzati veszteségek előfordulásának az alakulására (a támogatási szerződésben alkalmazott jelölés: TR2 TR3 és KF1 kísérlet; a továbbiakban ld. 7. 8. és 9. kísérlet). 4. A projekt keretében végzett munka részletes ismertetése 4.1. Elővizsgálatok 3 Az elővizsgálatok keretében két kísérletet végeztünk, első alkalommal termékenyítésre kerülő tenyészüszőkben (1. kísérlet), illetve a laktáció korai időszakában levő, első inszeminálású tehenekben (2. kísérlet). 1. kísérlet A kísérletben azt vizsgáltuk, hogy tejhasznosítású üszőkben az első inszeminálást követően (i) kb. 35 napon belül milyen gyakorisággal fordulnak elő embrionális / korai magzati veszteségek, továbbá e veszteségek összefüggnek-e (ii) a progeszteron koncentrációjának a posztovulációs időszakban megfigyelhető emelkedésével, valamint (iii) az állat energetikai egyensúlyával és/vagy tápláltsági állapotával, illetve az ezekről tájékoztató egyes metabolikus és endokrinológiai mutatóknak a termékenyítés időpontjában mért szintjével. Anyag és módszer A vizsgálatokat a nyári időszakban, a b-i tehenészet növendéküsző-telepén, Holstein fríz fajtájú, 14-15 hónapos korú és 365-470 kg testtömegű, közepes, vagy annál jobb tápláltsági állapotú (kondíció-pontszám, BCS: 3,0), korábban már legalább egyszer ivarzott tenyészüszőkön (n=60) végeztük. Az állatok tartása, takarmányozása és szaporodásbiológiai gondozása, valamint az ivarzók kiválogatásának a rendje az átlagos hazai üzemi viszonyokat tükrözte. Az üszők ivarszerveit a kísérletbe vonáskor klinikai módszerekkel (rektális tapintás, vaginoszkópia) megvizsgáltuk. Ivarszervi elváltozások esetén az állat nem került bevonásra. A kísérletbe állításkor mértük az állatok testtömegét, és Skidmore és mtsai (1997) módszerével egy öt fokozatú skálán 0,25 pont pontossággal pontoztuk a tápláltsági állapotukat (body condition score, BCS). A ciklust előzetesen szinkronizáltuk 4, majd az állatokat a gesztagén implantátum eltávolítása után 56 órával inszemináltuk (fix idejű inszeminálás, fix AI) 5. A vemhességet, illetve az EM előfordulását a (i) 36. napon végzett ultrahang-echográfiás (UH) vizsgálat, (ii) az egyidejű- 3 A Támogatási Szerződésben alkalmazott jelölés: ELŐ 4 Szintetikus gesztagén (norgesztomet) hatóanyag-tartalmú Crestar (Intervet) készítménnyel végzett 9 napos kezelés, az implantátum eltávolítása előtt két nappal luteolitikus dózisban alkalmazott PGF2 (Prosolvin, Intervet) injekcióval, a gesztagén forrás eltávolításával egyidejűleg pedig 400 NE ecg-vel kiegészítve (a gyári előírások szerinti, standard kezelés). 5 Valamennyi esetben standard (egyetlen, ismerten jó tenyészértékű és fertilitású bika azonos ejakulátumából származó) mélyhűtött spermával. 6
leg gyűjtött vérplazma-mintából történő vemhességspecifikus protein-b (PSPB) meghatározás (Biopryn ELISA teszt, BioTracking LLC, Moscow, ID, US), ill. (iii) a termékenyítés után 45-60 nappal végzett rektális tapintás (RP) módszerével vizsgáltuk. A metabolikus (energetikai) státusz minősítésére egy alkalommal, a fix AI idején került sor, egyes metabolikus hormonok [tiroxin (T4), trijód-tironin (T3), inzulin, inzulin-szerű növekedési faktor-1 (IGF-1) és leptin], illetve metabolitok [nem eszterifikált zsírsav (NEFA) és OHbutirát (BHB)] perifériás vérben mért szintjének a meghatározásával. A gesztagénforrás eltávolításától kezdődően hét napon át naponként kétszer (azaz 12 óránként), a 8-14. napon 24 óránként, majd ezt követően a 16., 19, 21, 23. és 36. napon egy-egy alkalommal vérmintát gyűjtöttünk. A mintákból meghatároztuk a progeszteron (P4) koncentrációját (a sárgatest kialakulásának, a luteinizáció intenzitásának a nyomon követése, posztovulációs P4 profil), továbbá csak a hét napon át naponként kétszer gyűjtött mintákból a domináns / preovulációs tüsző jelenlétét és hormontermelő képességét minősítő 17β-ösztradiol (E2) szintjét (E2 profil). Sárgatest (CL) / működő luteinszövet jelenlétére utaló jeleként értékeltük a kb. 3.2 nmol/l fölötti P4 szintet. A vemhesülés lehetőségére utalt, ha az állat vizsgált inszeminálására (fix AI) a ciklus tüszőfázisára jellemző alacsony (<3.2 nmol) P4 szint mellett került sor, ezt követően azonban 2-6 napon belül már emelkedett ( 3.2 nmol/l) P4 koncentrációt mértünk. A vemhesülés, ill. az embrionális / korai magzati elhalás diagnosztikai kritériumait az 1.1. táblázatban foglaltuk össze. 1.1. táblázat: A vemhesülés, illetve az embrionális / korai magzati elhalás (továbbiakban: EM) 1. kísérletben alkalmazott diagnosztikai kritériumai. A gesztagén-megvonást követő 16-23. nap 36. nap 45-60. nap P4 (nmol/l) P4 (nmol/l) PSPB UH ech. RP 1-14. nap: a P4 szintje a vemhesülés lehetőségére utaló Nem vemhesült Min. 1 mintában: < 3.2 --- Negatív Negatív / ivarzás Negatív / ivarzás Vemhesült Mindvégig: 3.2 3.2 + + + Embrióelhalás (EM), bizonyított 36-45. nap bizonyított 23-35. nap feltételezett 23-35. nap 3.2 --- --- + + Negatív + Negatív Negatív Negatív Negatív Negatív Eredmények és megbeszélés A P4 profil alapján biztonsággal felismerhető volt az az összesen 8 egyed (13 %), amely a ciklus-szinkronizációra adott szabálytalan ovariális válasz (n=6), emelkedett P4-szint mellett végzett (azaz túl késői) inszeminálás (n=1), ill. az ovuláció és sárgatest-képződés elmaradása (n=1) miatt a vizsgált termékenyítésből biztosan nem vemhesülhetett (ezek adatait a továbbiakban a terjedelmi korlátok miatt nem elemezzük). A további állatokban (n=52=87 %) a P4 profilnak a gesztagén-megvonást követő első 14 napon megfigyelt alakulása lehetővé tette a vemhesülést. Az E2 profil alakulása jól szinkronizált tüszőfejlődésről, illetve időben bekövetkezett ovulációról tanúskodott. Közülük később valóban vemhesnek bizonyult 28, nem vemhesült 21. A 16-23. napon mért emelkedett P4 szintek, valamint a 36. napi PSPB határozás és UH vizsgálat eredményei mindössze 3 esetben (5 %) vetették föl (EM feltételezett 23-35. nap ; n=2) vagy bizonyították (EM bizonyított 23-35. nap ; n=1) a 23-35. napon bekövetkezett embrióelhalás lehetőségét. A 36. napon végzett vemhességi tesztek (PSPB, 7
UH) eredménye teljes mértékben egyezett a 45-60. napi rektális vizsgálatokéval, azaz a 36-45/60. nap között magzatvesztés egyetlen esetben sem fordult elő. A vemhesek BCS-e és leptin szintje alacsonyabbnak bizonyult, mint a nem vemhesülteké (BCS: 3,1 0,2 ill. 3,3 0,3 P=0,014; plazma leptin: 7,31 1,37 ill. 8,03 1,03 ng/ml, P=0,043). Az egyéb hormonok és metabolitok plazmaszintjében ugyanakkor nem tapasztaltunk lényeges különbségeket. Valamennyi mutató a növendéküszőkre jellemző élettani határértéken belülinek bizonyult: közülük kiemelendő a leptinnek (5,28-10,39 ng/ml), az inzulinnak (>10,0 IU/l) és különösképpen az IGF-1-nek (154,1 436,6 ng/ml) az e korcsoportra jellemző, viszonylag magas szintje. A inszeminálás utáni kb. 60. órától (azaz a fix AI-t követő 2. nap estéjétől) kezdődően az azt követő kb. 7. napig a vemhes egyedekben szignifikánsan vagy tendenciózusan magasabb P4 szinteket mértünk, mint a nem vemhesült egyedekben (P=0,001 és 0,098 között). A termékenyítés utáni 8. naptól a luteolízisig (16-17. nap) terjedő időszakban e különbségek kiegyenlítődtek (1.1. ábra). 1.1. ábra: A posztovulációs progeszteronszintemelkedés üteme (x SEM) a vemhesült (n=28) és a nem vemhesült (n=21) üszőkben. A közepes kondíciójú üszőket alacsonyabb, de még a testzsír-depók jelentős mértékű triglicerid-telítettségére utaló leptin szint, és magasabb vemhesülési arány jellemezte, mint a közepesnél jobb tápláltsági állapotú társaikat (plazma leptin, BCS 3,0 : 7,31 1,32 ng/ml, BCS 3,5 : 8,12 0,97 ng/ml, P=0,016; vemhesülési arány, BCS 3,0 : 23/35=66 %, BCS 3,5 : 5/17=29 %, P<0,05). Adataink arra utalnak, hogy tenyészüszőkben az embrionális elhalások döntő hányada nagy valószínűséggel már a fogamzás utáni első néhány napon megtörténik, ezek azonban az alkalmazott módszereinkkel nem detektálhatóak. A kb. 23-36. nap közötti veszteségek aránya ugyanakkor elmarad a laktáció 2-3. hónapjában első alkalommal termékenyített tehenekben megfigyelhetőtől (részleteiben ld. később). A tehenekben tapasztalthoz (Mann és mtsai, 2005; Robinson és mtsai, 2005, 2008) hasonlóan a luteinizáció / posztovulációs P4-emelkedés mértéke üszőkben is összefügg a vemhesülés valószínűségével. A P4-emelkedés üteme már az ideálisnak tekintett értéknél kissé jobb tápláltsági állapotú (BCS 3,5 ) egyedekben is vontatottabbnak bizonyult, mint a közepes kondíciójúakban (BCS 3,0 ), ami egyben magasabb leptin és inzulin szintekkel is párosult. A post-ai 3. napi P 4 koncentráció negatív korrelációban állt a plazma leptin szintjével, míg nem mutatott összefüggést az egyéb metabolikus és hormonális paraméterekkel. Spicer és Francisco (1997, 1998) in vitro granulosa és theca interna sejtkultúrákon szerzett tapasztalatainak ismeretében mindezek in vivo körülmények között is megerősítik azt a feltételezést (Smith és mtsai, 2002), hogy az energetikai egyensúly fennállta esetén elsősorban a testzsír-depók lipidtelítettségének a fokát tükröző (Dalevaud és mtsai, 2001; Chilliard és mtsai, 2005), viszonylag magas (szuprafiziológiás?) leptin szinteknek, illetve a jóltáplált egyedekre jellemző magas inzulin szintnek (inzulin rezisztencia?) a főemlősökben tapasztalhatóhoz hasonlóan esetenként kérődzőkben is negatív hatása lehet az ovarialis 8
steroid produkcióra. Ovariális rendellenességek (policisztás ovarium szindróma) háttereként ehhez hasonló, hyper-leptinaemiával és az egész test inzulin érzékenységének a csökkenésével magyarázott elváltozásokról a korábbiakban pre-menopausalis korú nőbetegekben számoltak be. Háziemlősökben szerzett hasonló megfigyelésekről nincs tudomásunk. A posztovulációs P4- szintemelkedés kondíció-függő különbségeinek a kialakulásához emellett természetesen hozzájárulhat a progeszteronnak a jobb tápláltsági állapot / magasabb energiaszintű takarmányozás esetén sokak által feltételezett (Hruska és mtsai, 1991; Wiltbank és mtsai, 2006), gyorsabb és/vagy nagyobb mértékű metabolizációja, inaktiválódása is. Feltételezésünk szerint a jelenség kiváltásában ezen túlmenően szerepe lehetett a szokottnál melegebb nyári időszaknak, amelynek hatása a jobb tápláltsági állapotú üszőkben (ezen állatok kisebb hőleadó képessége révén) fokozottan érvényesülhetett. 2. kísérlet A kísérlet során azt vizsgáltuk, hogy nagy tejtermelésű tehenekben az ellés utáni első inszeminálást követően (i) milyen gyakorisággal figyelhetők meg a 20-35. napi embrióelhalásra / korai magzatvesztésre utaló P4 profilok, továbbá e veszteségek összefüggnek-e (ii) a P4 koncentrációjának a posztovulációs időszakban megfigyelhető emelkedésével, (iii) hurutos-gennyes / gennyes endometritis előfordulásával, valamint (iv) az állat tápláltsági állapotával, illetve az energetikai státuszáról tájékoztató egyes metabolikus és endokrinológiai mutatókkal. A termékenyítést megelőzően az állatok ciklusát az un. Ov-synch protokoll két változatának valamelyikével (azaz: GnRH inj.- 7 nap PGF 2 inj. 48 óra GnRH vagy hcg inj.; továbbiakban: GPG ill. GPH kezelés), vagy 14 napos időközzel végzett kétszeri PGF 2 kezeléssel (kontroll; továbbiakban: PP kezelés) indukáltuk / szinkronizáltuk, ami lehetőséget teremtett annak vizsgálatára is, hogy (v) a második GnRH kezelés hcg-vel történő helyettesítése befolyásolja-e a posztovulációs P4-szintemelkedés ütemét. Anyag és módszer A vizsgálatokra két nagyobb tehenészetben (továbbiakban K üzem ill. P üzem), Holstein fríz fajtájú, az 1-7. ellésük után levő, a ciklusindukció/szinkronizáció kezdetén anyagforgalmi vagy egyéb szervi megbetegedések kórjelző klinikai tüneteit nem mutató teheneken került sor (a vizsgálatokba bevont teljes állatlétszám: K üzem: n=180; P üzem: n=90; klinikai endometritis és/vagy mastitis előfordulását nem tekintettük kizáró tényezőnek). Az állatok tartásának, takarmányozásának és szaporodásbiológiai gondozásának technológiai színvonala, valamint az ivarzók kiválogatásának a rendje az átlagos hazai viszonyokat tükrözte (P üzem), vagy azt lényegesen meghaladta (K üzem). Az állományok átlagos laktációs tejtermelése a K üzemben lényegesen több volt, mint a P üzemben. Az involúció ellenőrzésére mindkét üzemben azonos módon (rektális tapintás és vaginoszkópia), állatonként legalább kétszer, az ellés utáni 6-10. és 28-35. napon sor került. Az involúció bakteriális szövődményei puerperalis metritis (<14. nap) illetve klinikai endometritis (>14. nap) (diagnosztikai kritériumok: Földi és mtsai, 2006; Pécsi és mtsai, 2006) esetén az állatok intrauterine antimikrobiális (puerperalis metritis: 2-4 g oxitetraciklin 6 ; klinikai endometritis: 0,5 g cefapirin 7 ) kezelésben részesültek, amelyet a szükség szerint a tünetmentesség eléréséig többször megismételtünk. Az üzemekben rendelkezésre álló, egy kb. 10 hetes perióduson belül megellett teheneket a komplikációktól mentes ellés után 4-6 nappal randomizálva három, azonos létszámú (üzemenként 3 x 15 állat, vagy ennek többszöröse), kb. üzemenként megegyező korösszetételű és előző laktációs tejtermelésű csoportot alakítottunk ki. A csoportokban az állatok ciklusát az ellés utáni 45-59. 6 Tetera-Bol méhpálca (CP-Pharma, Németország) 7 Metricur susp. (Intervet, Angers, Franciaország) 9
(PGP, GPH), illetve 39-53. napon kezdve a kezeléseket az alábbiak szerint indukáltuk / szinkronizáltuk: GPG kezelés: Ov-Synch protokoll (GnRH inj. 8 7 nap múlva: PGF 2 inj. 9 48 óra múlva: GnRH inj. 8 ); GPH kezelés: módosított Ov-Synch protokoll (GnRH inj. 8 7 nap múlva: PGF 2 inj. 9 48 óra múlva: 3000 NE humán chorion gonadotropin (hcg 10 ) Chorulon inj., INTERVET). PP kezelés (kontroll): 14 napos időközzel alkalmazott két PGF 2 9 kezelés. Az állatok mesterséges termékenyítésére (AI) a GPG ill. GPH csoportban az ivarzási tünetek jelentkezésétől függetlenül, a PGF 2 beadása utáni 56-72. órában (fix idejű inszeminálás, fix AI); a kontroll (PP) csoportban pedig a második PGF 2 injekció beadásától számított 5 napon belül megfigyelt ivarzás idején (továbbiakban együttesen: vizsgált AI). A kezelések időzítéséből következett, hogy a vizsgált AI-ra az ellés utáni 55-70. napon került sor. Az állatok kondícióját az 1. kísérletben is alkalmazott módon az ellés után 1-3 és 28-35 nappal becsültük és pontoztuk. Az energetikai státusz minősítésére egyes metabolikus hormonok (T 4, T 3, inzulin, IGF-1 és leptin), illetve metabolitok (NEFA, BHB és összkoleszterin [TCh]) perifériás vérben mérhető szintjének a meghatározásával, egy alkalommal, a vizsgált AI-t követő 5. napon került sor. Az ellés utáni első ovulációnak / a petefészek ciklikussá válásának, ill. petefészek-működés kezelések előtti acikliás vagy ciklikus jellegének a vizsgálata a kb. 7. naptól kezdődően hetenként háromszor gyűjtött tejminták progeszteron (P 4 ) koncentrációjának a meghatározásán alapuló egyedi post partum P 4 profil segítségével történt. A P 4 meghatározására szolgáló rendszeres tejmintagyűjtést a ciklusindukció / szinkronizáció idején hetenként háromszor, az utolsó (GnRH / hcg / PGF 2 ) kezelés időpontjában, ezt követően 12 napon át naponként, majd a fix AI utáni 36. napig ismét hetenként háromszor megismételtük (post-ai P 4 profil). Az eredmények elemzése lehetőséget teremtett a luteinizáció intenzitását tükröző posztovulációs P 4 -szintemelkedés mértékének a becslésére, ill. az esetleges embrionális / korai magzati veszteségekre utaló P4 profiloknak az azonosítására. 2.1. táblázat: A vemhesülés, illetve az embrionális / korai magzati elhalás (továbbiakban: embrióelhalás, EM) 2. kísérletben alkalmazott diagnosztikai kritériumait. A ciklusindukció/szinkronizációt követő 16-23. nap 24-36. nap 36. nap 45-60. nap P4 (nmol/l) P4 (nmol/l) PSPB UH ech. RP 1-14. nap: a (zsírtalanított tejmintából meghatározott) P4 szintje a vemhesülés lehetőségére utaló Nem vemhesült Min. 1 mintában: < 1,5 Negatív / ivarzás Negatív / ivarzás Vemhesült 1,5 + + Embrióelhalás (EM), bizonyított 36-45. nap feltételezett 23-35. nap Mindvégig 1,5 Jelölések: nem jellemző a módszer nem állt rendelkezésre + pozitív; Mindvégig 1,5 + Negatív Luteolysis min. 1 min.. tában: < 1,5 Negatív Negatív 8 Receptal inj. (Intervet, Angers, Franciaország) 9 Prosolvin TM inj. (Intervet, Angers, Franciaország) 10 Chorulon inj. (Intervet, Angers, Franciaország) 10
A vizsgált inszeminálások eredményességét (i) a post-ai P 4 profil, (ii) az AI utáni 36. napon végzett transzrektális ultrahang-echográfiás (UH) vizsgálat, valamint (iii) a termékenyítés után 45-60 nappal végzett rektális tapintás módszerével végzett vemhességvizsgálat alapján ítéltük meg. Sárgatest (CL) / működő luteinszövet jelenlétére utaló jeleként értékeltük a (zsírtalanított) tejmintákban mért kb. 1,5 nmol/l fölötti P4 szinteket. A vemhesülés lehetőségére utalt, ha az állat vizsgált inszeminálására a ciklus tüszőfázisára jellemző alacsony (<1,5 nmol) P4 szint mellett került sor, ezt követően azonban 2-6 napon belül már emelkedett ( 1,5 nmol/l) a P4 koncentrációja. A vemhesülés, ill. az embrionális / korai magzati elhalás diagnosztikai kritériumait a 2.1. táblázatban foglaltuk össze. Eredmények és megbeszélés A kísérlet céljára az ellést követő napokban kiválasztott összesen 270 állatból 236 (87 % megoszlás: GPG: n=79 GPH: n=81 PP: n=76) bizonyult értékelhetőnek. A K üzemben a tehenek tejtermelése a laktáció korai szakaszában korábban érte el a maximum értéket,, petefészekműködésük később vált ciklikussá, illetve a ciklusindukciós/szinkronizációs kezelés kezdetén közülük több volt a még acikliás egyed, mint a P üzemben, ahol a laktációs tejtermelési csúcs csak később jelentkezett. Mivel azonban a három kezelési csoport állatai üzemenként arányosan oszlottak meg, csaknem azonos volt a három állatcsoport korösszetétele, előző laktációs tejtermelése, és tápláltsági állapota (BCS), illetve annak ellés utáni változása. A laktáció első hónapjaiban kb. megegyezett az átlagos tejtermelésük is (adatok nem részletezve). Hasonló volt továbbá a 28-35. napon, vagy ezt követően megállapított hurutos-gennyes / gennyes endometritisek 11 száma és aránya (31/79=39 %, 33/81=41 % ill. 32/76=42 %) is. Ezen elváltozás előfordulása magasabb volt ugyan az általában megfigyelhetőnél, az arányos megoszlás azonban lehetővé tette a három állatcsoport reprodukciós adatainak reális összevetését. A vizsgált termékenyítésekből bekövetkező vemhesülést ez esetben is csak szabályos post- AI P4 profil (ld. 1. kísérlet) mellett figyeltünk meg. A szabályos posztovulációs P4 profilú állatok előfordulási aránya a GPH, ill. a GPG kezelések után valamennyivel magasabb volt, mint a kétszeri PGF 2 kezelést kapók között (2.2. táblázat). E különbség nagyrészt abból származott, hogy a kísérleti kezelés kezdetéig még acikliás állatok a kétszeri PGF 2 kezelés után értelemszerűen továbbra is acikliás maradtak, ezzel szemben a GPG és a GPH csoportban ezek jelentős hányada is ovulálhatott (adatok nem részletezve). Az egyéb rendellenes posztovulációs P4 profilok előfordulásában viszont nem tapasztaltunk a kezelésekkel kapcsolatba hozható lényegesebb különbségeket (az adatokat nem részletezzük). Hasonlóan az 1. kísérletben tapasztalthoz a vizsgált AI-ból vemhesült állatokat ez esetben is intenzívebb luteinizációról tanúskodó, gyorsabb ütemű posztovulációs P4-szintemelkedés jellemezte (ld. később is). A szabályos P4 profilú állatok P4 szintjének a vizsgált AI-t követő emelkedési ütemében ugyanakkor várakozásainkkal ellentétben nem figyeltünk meg az egyes kezelésekkel összefüggésbe hozható lényegesebb eltéréseket (az adatokat nem részletezzük). A vizsgált AI-ból újravemhesült állatok aránya GPH csoportban volt a legmagasabb, a kétszeri PGF 2 kezelés után pedig a legalacsonyabb, a különbség azonban nem volt szignifikáns (2.2. táblázat). A 23-35. napon bekövetkezett embrióelhalásra/ korai magzatvesztésre utaló P4 profilokat (az 1-14. napon szabályos P4 profilú) állatok 7-9 %-ában figyeltünk meg, elsősorban a korábbiakban hurutos-gennyes / gennyes endometritis tüneteit mutató egyedekben. A 36. napon UH vizsgálattal igazolt vemhesülések közül a 45-60. napig azonban mindössze egyetlent veszítettünk el (2.2. táblázat). Embrióelhalásra/ korai magzatvesztésre utaló P4 profilokat elsősorban a kezelések előtt 11 Hurutos-gennyes / gennyes (endo)metritis: az ellés utáni 28. napon a hüvelyen át ürülő váladékban a gennytartalom becsült aránya 50 % (Földi és mtsai, 2006; Pécsi és mtsai, 2006). 11
még acikliás petefészek-működésű állatokban figyeltünk meg, az esetek kis száma azonban e szempontból nem teszi lehetővé a reális értékelést (az adatokat nem részletezzük). Az ellést követő 28-35. nap között, vagy azt követően a hurutos-gennyes / gennyes endometritis klinikai tüneteit mutató tehenek vizsgált AI-ból származó (16/96 = 17 % ill. 81/150 = 54 % P 0,001), illetve 150 napon belüli (42/96 = 44 % ill. 135/150 = 90 % P 0,001) vemhesülési adatai egyaránt messze elmaradtak az e megbetegedés tüneteit nem mutató egyedekéitől (2.2. táblázat). Ez a tendencia a ciklusindukció / szinkronizáció módjától függetlenül valamennyi csoport állatait jellemezte, bizonyítva hogy a jelen kísérlet körülményei között az újravemhesülés valószínűsége jelentős mértékben az uterinális tényezőktől az állatok klinikai állapotának, illetve korábbi tapasztalatainknak (Dohmen és mtsai, 1995, Huszenicza és mtsai, 1999) az ismeretében elsősorban a méh Archanobacterium pyogenes (A. pyogenes korábbi néven: Actinomyces pyogenes) fertőzöttségétől függött. A mindhárom kezelési séma részeként alkalmazott PGF 2 befecskendezés nyilván elősegítette a méh öngyógyulását, hatása viszont nem volt elegendő a klinikai tünetek alapján feltételezhetően hosszasan fennálló intrauterinális A. pyogenes fertőzés következményeinek teljes eliminálására. 2.2. táblázat: Újravemhesülés, embrióelhalás / korai magzatvesztés lehetőségére utaló P4 profilok (a 2. kísérlet teheneinek az adatai alapján) GPG kezelés (n=82) GPH kezelés (n=81) PP kezelés (n=83) P4 profil a ciklusindukciót / szinkronizációt követő első 14 napon: Az ovuláció luteinizáció hiányára utaló (P 0,05) 14 = 17 % 9 = 11 % 23 = 28 % A vemhesülést megengedő, szabályos (P 0,10) 55 = 67 % 58 = 72 % 46 = 55 % Az utóbbiak közül: 1) A vizsgált AI-ból vemhesült 32 37 28 A teljes állatlétszám arányában 39 % 46 % 34 % A szabályos P4 profilú állatok arányában 58 % 64 % 61 % Ebből: a 28. napon: endometritis 1 előfordult 5/31 = 16 % 6/33 = 18 % 5/32 = 16 % nem fordult elő 27/51 = 53 % 31/48 = 65 % 23/51 = 45 % P 0,001 P 0,001 P 0,001 2) A vizsgált AI-t követően: embrióelhalás (EM), bizonyított 36-45. nap feltételezett 23-35. nap Ebből: a 28. napon: endometritis 1 előfordult nem fordult elő --- 4 (7 %) --- 5 (9 %) 1 (2 %) 3 (7 %) 3 1 3 2 2 2 150 napon belül: újravemhesült összesen 58 59 60 A teljes állatlétszám arányában 71 % 73 % 72 % Ebből: a 28. napon: endometritis 1 előfordult 12/31 = 39 % 16/33 = 48 % 14/32 = 44 % nem fordult elő 46/51 = 90 % 43/48 = 90 % 46/51 = 90 % P 0,001 P 0,001 P 0,001 Az elléstől az újravemhesülésig eltelt idő 91,6 88,1 a 98,4 a (nap, x SD) LSD 5% : 10,2 nap ( a P 0,05) 24,1 25,3 27,4 A 150 napon belüli újravemhesüléshez szükséges inszeminálások száma (x SD) ns 1,75 0,74 1,70 0,71 1,91 0,66 1 Hurutos-gennyes / gennyes (endo)metritis: az ellés utáni 28. napon a hüvelyen át ürülő váladékban a gennytartalom becsült aránya 50 %. 12
Az állatok kondíció-pontszámában (BCS), valamint az egyes metabolikus hormonok és metabolitok plazmaszintjében megmutatkozó tendenciák a laktáció csúcsán álló, az ellés utáni NEB mélypontján már túljutott, klinikailag tünetmentes egyedekre jellemző viszonyokat tükrözték. Az állatok mindegyikét viszonylag alacsony BCS ( 3,25), illetve leptin (<4,00 ng/ml), inzulin (<10,0 IU/l) és IGF-1 (<100,0 ng/ml) szint jellemezte (e hormonok koncentrációja szinte minden egyedben a laktáció csúcsán álló tehenekre jellemző módon az 1. kísérlet tenyészüszőiben mértnek mindössze csak kevesebb, mint kb. fele-harmada volt). A NEFA és a BHB plazmában mért aktuális szintje a mintavétel időpontjában már túljutott a laktáció korábbi időszakára jellemzőnek tartott csúcsértékein. A kezelésekre adott ovariális válaszreakciók metabolikus hátterét vizsgálva semmiféle világos összefüggés nem mutatkozott a szabálytalan P 4 profillal jellemezhető, a korai ovuláció / késedelmes AI, illetve a késlekedő vagy hiányos luteolysis jeleit mutató állatok adataiban. A vizsgált termékenyítéskor a kezelésekre szabályos P 4 profillal reagáló állatok jobb de legfeljebb csak közepes (BCS: 3,25) tápláltsági állapotúak voltak, illetve viszonylag magasabb leptin, T 3, IGF-I, inzulin és TCh, valamint alacsonyabb NEFA és BHB szintek jellemezték azokat, mint a kezelések nyomán nem ovuláló (anovulációs) egyedeket (az adatokat a terjedelmi korlátok miatt nem részletezzük). A kezelésre szabályos ovariális választ adó egyedek közül kizárólag azoknak volt esélyük a vemhesülésre, amelyek már a fix AI utáni 3. napon a CL működés markáns jeleit mutatták (P 4 : 1,50 nmol/l). Utóbbi egyedek tendenciózusan magasabb (abszolút értelemben, a tenyészüszők adataihoz viszonyítva azonban még mindig alacsony, <4,00 ng/ml) leptin, és szignifikánsan magasabb IGF-I szinteket mutattak, mint az ovuláció utáni 3. napon CL működés jeleit (P 4 : 1,50 nmol/l) még nem mutató egyedek. A post-ai 3. napi P 4 koncentráció pozitívan korrelációban állt a plazma IGF-I, T 3 és TCh szintjével, negatív összefüggést mutatott a BHB koncentrációval, és nem korrelált a plazma leptin szinttel. Ezek az összefüggések azonban csak az esetben voltak nyilvánvalóak, ha a szabályos ovariális válaszú, az anovuláció és a késlekedő luteinizáció jeleit mutató állatok adatait együttesen elemeztük (az adatokat nem részletezzük). Eredményeink összegzéseként megállapítható, hogy a 23-35. napi embrióelhalás a laktáció csúcsán álló, az ellés után első alkalommal inszeminált tehenekben feltételezhetően sokkal gyakoribb, mint növendék üszőkben. A (feltehetően tartósan fennálló, esetenként azonban tünetszegény, mindössze szubklinikai stádiumú) endometritis / méhűri A. pyogenes fertőzöttség (részleteiben: Huszenicza és mtsai, 1999; Gilbert és mtsai, 2005; Sandholm és mtsai, 2005; Földi és mtsai, 2006) mellett a posztovulációs P4-szintemelkedés üteme részét képezi azon tényezőknek, amelyek a laktáció első heteiben lényegesen befolyásolják az újravemhesülés valószínűségét, illetve az embrióelhalás / korai magzatvesztés gyakoriságát. Az ellés utáni első inszeminálást követően a P4- szintemelkedés üteme összefüggést mutat a negatív energiaegyensúly mértékét jelző bizonyos endokrinológiai jellemzőkkel (pl. a plazma IGF-1 szintjével), nincs azonban korrelációban a plazma leptin koncentrációjával. Mindezek arra utalnak, hogy más-más (kór)élettani mechanizmusok magyarázhatják e jelenség üszőkben, ill. tehenekben történő előfordulását: utóbbiakban talán nem a P4 produkció csökkenésének, hanem inkább e hormon fokozott metabolizációjának (Hruska és mtsai, 1991; Wiltbank és mtsai, 2006) lehet meghatározó jelentősége. Közvetlen gyakorlati jelentőséggel bír az a megállapításunk, hogy a ciklusindukció/szinkronizáció ismert módszereinek a megválasztásával (pl. GPG protokoll, és/vagy e kezelési sémában a második GnRH hcg-vel történő helyettesítése) a posztovulációs P4-emelkedés üteme sajnálatos módon nem befolyásolható. 4.2. Diagnosztikai célú vizsgálatok 12 12 3-5. kísérlet; a Támogatási Szerződésben alkalmazott jelölés: DG-1 és DG-2. 13
A projekt diagnosztikai részében három irányban tájékozódtunk. Két a laktáció csúcsán álló, az ellés után első alkalommal termékenyített tehenekben, nagyrészt egyező protokoll alapján végzett kísérletben arról tájékozódtunk, hogy az embrionális, illetve a korai magzati veszteségek előfordulása (i) összefüggésbe hozható-e az ellés után előforduló negatív energiaegyensúly egyes klinikai kémiai és endokrinológiai jellemzőivel, (ii) bizonyos vírusfertőzésekkel, illetve (iii) az energia- és a mikroelem-ellátottság, és az azzal feltételezetten elválaszthatatlanul összefüggő lipidperoxidációs státusz gyakran előforduló zavaraival (3. és 4. kísérlet). Egy felmérő vizsgálatban (5. kísérlet) összesen 14 állomány mikroelem-ellátottságáról, ill. az esetleges hiányállapotok okozta szaporodási zavarok előfordulásáról kívántunk tájékozódni. 3. kísérlet Anyag és módszer A feltételezett komplex vírusos és metabolikus eredet összefüggéseinek a vizsgálatára különböző bovin herpeszvírusokkal (azaz fertőző rhinotracheitis vírussal: IBR BoHV-1, valamint Movár herpeszvírussal, BoHV-4) terhelt három állományban került sor. A vizsgálatokra két közepes ill. egy nagyobb méretű tehenészetben (továbbiakban N és O üzem ill. S üzem), Holstein fríz fajtájú, a 2. kísérletnél leírtaknak megfelelő szempontok szerint kiválogatott tehenek fölhasználásával került sor. Az állatok tartásának, takarmányozásának és szaporodásbiológiai gondozásának technológiai színvonala, valamint az ivarzók kiválogatásának a rendje az átlagos hazai viszonyokat tükrözte (S üzem), vagy azt lényegesen meghaladta (N és O üzem). A kondíció becslése, az involúció lefolyásának ellenőrzése és a szövődmények kezelése a 2. kísérletben ismertetett módszerekkel történt. Az üzemekben rendelkezésre álló, a tél végi - koratavaszi időszakban megellett teheneket a komplikációktól mentes ellés után 4-6 nappal vontuk be a kísérletbe. Az O és S üzemben az ellés utáni 63-77. napon kezdve a kezelést az állatok petefészek-működését az Ov-Synch (GPG) protokoll (GnRH inj. 7 nap múlva: PGF 2 inj. 48 óra múlva: GnRH inj.; ld. 2 kísérlet) szerint indukáltuk / szinkronizáltuk. Az N üzem tehenein ezt megelőzően kétszeri PGF 2 kezelést is alkalmaztunk (Prov-synch módszer: az ellést utáni 31-38. napon kezdve 14 napos időközzel végzett kétszeri PGF2α kezelés, amelyet 14 nappal később egy, az előbbiekben részletezett Ovsynch protokoll szerint elvégzett GnRH PGF 2 GnRH kezeléssorozat követett). Elképzeléseink szerint a kezelések nyomán az állatok első termékenyítésére az ivarzási tünetek jelentkezésétől függetlenül, az Ov-Synch protokoll szerint elvégzett PGF 2 kezelés utáni 56-72. órában [azaz az ellés utáni 67-74. (N üzem), ill. 68-88. (O és S üzem) napon)] került volna sor (fix idejű inszeminálás, fix AI). Az N és S üzemben az állatokat a kísérleti tervnek megfelelően inszeminálták. Az O üzem személyzete azonban egy sajnálatos félreértés nyomán a kezelési periódus bármely időpontjában ivarzó állatokat termékenyítette, ill. ha a tehén a PGF 2 kezelés utáni 56-72. órában nem mutatott ivarzási tüneteket, azt nem inszeminálták. Mindezekre csupán a kísérlet befejeződése és a minták feldolgozása után, az eredmények feldolgozásakor derült fény. Ezen állatainak egységes szempontok szerinti értékelése nem lehetséges, adataikat e jelentés keretében ezért a továbbiakban nem részletezzük. Az energetikai és lipidperoxidációs státusz minősítésére az ellés utáni 1., 2., 3. és 5. héten, valamint a fix AI előtti PGF 2 kezelés időpontjában, továbbá a fix AI-t követő 5. napon került sor. A perifériás vérből meghatározott paraméterek: Energetikai státusz: NEFA, BHB; Lipidperoxidációs státusz: malondialdehid (MDA), redukált glutation (GSH), glutationdiszulfid (GSSG), glutation-peroxidáz (GSH-Px). A petefészek-működés ciklikussá válásának, a fix AI-t követően luteinizáció intenzitásának (posztovulációs progeszteron-szint emelkedés), és az esetleges embrionális / korai magzati veszteségekre utaló post-ai P4 profilok nyomon követése a 2. kísérletben ismertetett módszerekkel tör- 14
tént. E célból az ellés utáni kb. 7. naptól kezdődő, a ciklusindukció / szinkronizáció idejére is kiterjedő időszakban hetenként háromszor, az utolsó kezelés időpontjában, ezt követően (az ovuláció és a posztovulációs luteinizáció idején) 12 napon át naponként, majd a fix AI utáni 36. napig ismét hetenként háromszor gyűjtöttünk tejmintákat, amelyekből maghatároztuk a progeszteron (P 4 ) koncentrációját 13. A vírushordozó (BoHV-1, BoHV-4) lymphocyták számának a meghatározása az alábbiak szerint történt: Vérminták gyűjtése: az ellés utáni 1. és 5. héten, valamint a fix AI előtti PGF 2 kezelés időpontjában; Laboratóriumi feldolgozás: Az Na-EDTA-val alvadásában gátolt vérmintákból (i) a fehérvérsejtek kitisztítása (Ficoll-pacque módszer), (ii) a sejtek számolása és DNS-tartalmuk kivonása, majd (iii) annak kettős (nested) PCR módszerrel történő, a BoHV-1 és BoHV-4 jelenlétének igazolására irányuló vizsgálata. A vemhesség megállapítása ill. az esetleges embrionális / korai magzati elhalás diagnosztizálása a tehenek (i) kétszeri (a post-ai 33-42 14. és 65-70 napon végzett) transzrektális UH vizsgálatával (3.1. - 3.5. kép), valamint (ii) a vérszérum PSPB koncentrációjának a sorozatos (a post-ai 25., 32., 39., 46., 53., 60. és 66. napon 15 ) végzett meghatározásával (Biopryn ELISA teszt, BioTracking LLC, Moscow, ID, US) történt. 3.1. kép: 42 napos vehem UH képe 3.2. kép: Vemhességi sárgatest (42.nap) 13 Azaz a post partum P4 profil, a luteinizáció intenzitását tükröző posztovulációs P4-szintemelkedés, illetve az esetleges embrionális / korai magzati veszteségekre utaló post-ai P4 profil meghatározása. 14 Az első UH vizsgálat alkalmával üresnek talált teheneket a méh és petefészek állapota alapján szükség szerint kezeltük. 15 Megjegyzés: A 39. nap után PSPB határozás céljából vérmintákat már csak az első UH vizsgálat során vemhesnek talált állatokból vettünk. 15
3.3. kép: 70 napos vehem ultrahangos képe 3.4. kép: Placenta, karunkulák (70.nap) 3.5. kép: Folyadékot és szöveti maradványokat tartalmazó méh (embrionális veszteség) Az értékelés során az embrionális / korai magzati veszteségeket bekövetkezésük ideje szerint két csoportra osztottuk: (1) korábbi, a sikeres AI-tól a vemhesség 42. napjáig bekövetkező, ill. (2) későbbi, a vemhesség 70. napjáig bekövetkező veszteségek. E vizsgálatok értékelésekor a korábbi formát a két vemhességvizsgálati eljárás, a termékenyítés utáni 25. és 32. napon meghatározott PSPB koncentráció alapján felállított diagnózis és a 33-42. napon végzett ultrahangvizsgálat eredménye közötti eltérés jelentette. A termékenyítés 33-42. napján az ultrahangvizsgálattal vemhesnek talált állatok vemhességének meglétét a 65-70. nap között ismételten megvizsgáltuk, így a később bekövetkező magzati veszteségeket is nyomon tudtuk követni. Szerencsés esetben UH vizsgálattal közvetlen formában is föl lehetett ismerni a vehem degenerálódását majd pusztulását (3.5. kép). Az 1. és 2. kísérletben szerzett tapasztalatok alapján abban az esetben tekintettük a vehem elvesztését valósnak, ha a tejmintákból meghatározott P4 koncentrációk alakulása alapján a vemhesülés egyébként lehetségesnek látszott. Eredmények és megbeszélés Az N üzemben 4 ill. 16, az S üzemben pedig 26 ill. 35 első alkalommal ellett ill. idősebb tehén adatai bizonyultak értékelhetőnek. a) Vemhesülés. Az embrió- és magzatelhalás különböző formái.. Metabolikus stressz Az N üzemben 11 állat vemhesült (55 %). A vemhesség 42. napjáig bekövetkezett embrióelhalást / korai magzatvesztést összesen két esetben (egy első laktációs ill. egy idősebb tehénben, azaz a vemhességek 18 %-ában) figyeltünk meg. Az ellés utáni 1. és 5. héten mért BHB és NEFA koncentrációja között szoros pozitív korrelációt (r=0,634 ill. 0,614) tapasztaltunk, azonban nem találtunk semmiféle statisztikailag igazolható összefüggést a vemhesülés, az embrionális veszteség mértéke és a vérplazma BHB és NEFA koncentrációja között. Az S üzemben a vemhesülés mértéke 38 % (n=23) volt. A vemhesültek között az embrionális elhalás 35 % (n=8), a magzati veszteség mértéke 9 %-ot (n=2) ért el. Az első ellésű, fiatal tehenekben a vemhesülési arány mindössze 31 % (n=8) volt, az embrionális és magzati veszteség együttes mértéke pedig elérte az 50 %-ot (n=4). Az idősebb tehenekben a vemhesültek aránya magasabbnak (n=15=43 %), a veszteség mértéke, pedig alacsonyabbnak (n=6=40 %) bizonyult. Az ellés utáni 2. ill. 5. héten mért BHB és NEFA koncentrációja között ez esetben is közepes pozitív korrelációt (r=0,59 ill. 0,58) tapasztaltunk. Statisztikailag igazolható összefüggést a vemhesülés, az embrionális veszteség mértéke és a vérplazma BHB koncentrációja között nem találtunk. Az ellés utáni 1. és 5. heti NEFA koncentráció szignifikánsan különbözött a vemhes és az üresen maradt üszők esetében. Ugyanezt az összefüggést a tehenek csoportjában nem tudtuk igazolni. 16
vírus/fvs. NKFP 4 program b) A vírushordozó (BoHV-1, BoHV-4) lymphocyták számának meghatározása 16 Az N üzem 20, és az S üzem 58 állatának mintái kerültek feldolgozásra. Megállapítható volt, hogy az N üzem alacsonyabb termelési szinten ugyan, stresszhatásoktól kevéssé terhelt környezetben termel, míg az S üzem magasabb termelési szinten erős stresszhatások (főleg anyagcsere stressz) között dolgozik. A vírus aktiválódások és a szaporodásbiológiai adatok egyaránt alátámasztották a fentieket. IBR BoHV-1. A fertőző rhinotracheitis vírusának kimutatására irányuló vizsgálataink nem hoztak értékelhető eredményt, aminek több oka lehet. Az egyik ok a PCR módszer viszonylagos érzéketlensége. Az IBR vírusának DNS-e az élővilágban páratlan 71%-os guanin/citozin aránnyal rendelkezik, ami a G/C közötti 3 hidrogénkötés miatt nagyon nehézkessé teszi a DNS molekula két szálának elválasztását, ami a PCR reakció alapja. A szükséges denaturáció eléréséhez dimetil-szulfoxidot kell 10%-ban a reakcióelegyhez adni, vagy a denaturáció hőmérsékletét 95-96 C-ra emelni. Mindkettő csökkenti az enzim hatékonyságát, illetve működési idejét. A szerzők szerint (Ros és mtsai, 2001) ez az (az irodalomban a legjobb) IBR PCR rendszer is csak 60-70 virion kimutatására alkalmas. Az IBR PCR csökkent hatékonyságú működése okozta gondokat tovább növelte N üzemben a vírusaktiválódások viszonylagos hiánya és gyengesége, az S üzemben pedig a már megkezdett vakcinázás. Az is a vizsgálatok során lett nyilvánvaló, hogy a kísérleti terveink szerinti IBR vizsgálatokat már mentesítő telepeken nem érdemes elvégezni, a vakcinázás által kiváltott vírussemlegesítő ellenanyagok vírusaktiválódást gátló hatása miatt. 1000 900 800 700 600 500 400 300 200 100 0 S üzem, BHV-4 0 35 70 105 150 kisérleti napok vemhes embrió vesztés üres Movár herpeszvírus BoHV-4: Ezzel a vírussal kapcsolatban érdekes eredményeket kaptunk, és az IBR-el ellentétben semmi sem zavarta a tervezett vizsgálatokat. Ez a vírus minden hazai nagyüzemi szarvasmarhatelepen jelen van, sehol sem vakcináznak ellene, nem is lehet, vírus semlegesítő ellenanyagok nem képződnek. A kettős PCR rendszer hatékonyan, specifikusan működő módszer 1-2 viriont biztosan mutat ki (Egyed és mtsai, 1996). Eredményeinket részletesebben a két ábra és két táblázat foglalja össze. Elmondható, hogy határozott, egyértelmű, statisztikailag megalapozott (S üzem: 35 üres, 13 vemhes, 10 embrióvesztett, N üzem: 7-9 üres és vemhes állat) kapcsolatot találtunk a vírusaktiválódások száma, nagysága (a vírus által fertőzött fehérvérsejtek száma) valamint az állatokat érő stressz, és a következményes szaporodási zavarok között. A vemhesült, és vemhüket megtartó tehenekben alig tudtuk a vírust kimutatni, míg a szintén alacsony BoHV-4 szintű embrióvesztéses csoportban pont a 70 nap (inszeminálás) körül találtuk vírusaktiválódások jeleit. Az üresen maradt tehenekben 35/29 esetben aktiválódott a vírus sokszor nagyon magas fertőzött fehérvérsejt számot eredményezve. Valószínűleg egy eddig ismeretlen jelenséget tudtunk kimutatni, azaz a BoHV-4 vírus az állatokat érő stressz (és a következményes szaporodási zavarok) markereként használható, sőt a stresszhatás akár szám- 16 A jelentésnek ez a fejezete a Dr. Egyed László vezetésével az MTA Állatorvos-tudományi Kutatóintézetében dolgozó munkacsoport munkája 17
vírus/1000 fehérvérsejt NKFP 4 program szerűsíthető is (kimutatott vírusok, vagy fertőzött fehérvérsejtek száma, kimutatott vírus DNS menynyisége). A vírusaktiváció stressz-szel való szoros kapcsolatát az is jelzi, hogy a 0. napi (ellés után vett) minta minden állatban az ellés, mint általános erős stressz jeleként, aktív BoHV-4 fertőzés jeleit mutatta, függetlenül az állat későbbi szaporodásbiológiai státuszától. Bár mindkét telepen a vírusaktiválódás elléskor (a kísérlet 0. napja) a később üresen maradt vállatokban is jelentősen magasabb volt, mint a vemhesülteknél. N üzem 150 100 50 0 0 35 70 105 150 kísérleti napok vemhes üres 3.4. táblázat (S üzem): 100 ezer fehérvérsejtben kimutatott BoHV-4 virionok száma (átlag) Kísérleti napok 0. 35. 70 105. 150 Vemhes (13) 93.33 1.54 6.15 6.66 2.05 Embrióvesztés (9) 83.33 2.66 74.66 2.66 2.66 Üres (35) 229 120 874.4 276 465 3.5. táblázat (N üzem): 100 ezer fehérvérsejtben kimutatott BoHV-4 virionok száma (átlag) Kísérleti napok 0. 35. 70 105 150 Vemhes (9) 31.84 1.48 8.14 8.14 1.48 Üres (7) 118 9.52 10.47 9.52 10.47 Vizsgálataink során az S üzemben azt találtuk, hogyha egy tehénben ezer fehérvérsejtben a BoHV-4 száma a 2-3-t eléri, vagy meghaladja, az állat biztosan nem vemhesül. Így ez a PCR módszer akár diagnosztikai módszernek is minősülhet. Előre meg lehet mondani, hogy 1-2 héten belül egy adott állat biztosan nem alkalmas a vemhesítésre, de az, hogy biztosan melyik fog vemhesülni, nem mondható meg. Bár ez a BoHV-4 valószínűleg nem oka a vemhességi problémáknak, erőteljes, tartós aktiválódása során a szaporodási szervrendszer szöveteinek hámsejtjeiben és a fehérvérsejtekben való replikálódása miatt akár másodlagos kórokozónak is tekinthető, ami a meglévő szaporodási zavarokat, immunszupressziót tovább súlyosbíthatja. 18
További vizsgálatok fogják eldönteni, hogy ez a víruskimutatás milyen körülmények, feltételek között, és milyen hatékonyan alkalmazható a gyakorlatban markerként a tehénre ható metabolikus stressz jelzésére, számszerűsítésére, adott esetben pedig a szaporodásbiológiai állapot pontos előrejelzésére. c) Lipidperoxidációs státusz 17 A vizsgálatok során megállapítást nyert, hogy a szaporodásbiológiai állapot, kiemelten a korai embrióvesztés és vizsgált lipidperoxidációs és antioxidáns paraméterek között sem statisztikailag értékelhető, sem tendenciaszerű összefüggés nem áll fenn. A két vizsgált állomány között emellett jelentős tendenciaszerű összefüggések mutathatók ki, amelynek hátterében a jelen vizsgálat során nem mért az eltérő antioxidáns ellátottság állhat. A korai embrióvesztés egyik lehetséges kóroki tényezője, a BoHV-4 fertőzöttség hatását a fehérvérsejtek fent jelzett paramétereinek mérésével rögzítettük a két vizsgált állományban. Megállapítottuk, hogy a szaporodásbiológiai állapot függvényében az egyik konzorciumi tag (MTA Állatorvostudományi Kutatóintézete) által részünkre preparált fehérvérsejtek MDA tartalma a korai post partum időszakban (29-33 nap) rendkívül alacsony, míg az embrióvesztés szempontjából különösen kritikus a termékenyítést követő 30-40 nap időszakban az ebbe a csoportba sorolt állatoknál rendkívül magas volt. A fehérvérsejtek GSH tartalma és különösen GSHPx aktivitása viszont a későbbiekben feltehetően embrióvesztett állatokban a korai post partum időszakban viszont kiemelkedően magas volt. A fenti eredmények hátterében az állhat, hogy úgy a korai post partum, mind az embrióvesztés szempontjából kritikus, a termékenyítést követő 30-40 napos időszakokban a BHV fertőzöttség függvényében (különösen az 1 és 2 fertőzöttségi csoportba sorolt) magas MDA és GSH tartalmat, továbbá kiemelten az 1 fertőzöttségi csoportba sorolt állatoknál a korai post partum időszakban rendkívül magas GSHPx aktivitást mértünk. Az eredmények alapján levonható az a következtetés, hogy az embrióvesztés korai, a termékenyítést megelőző, jelzésére a rendkívül nagy egyedi variancia miatt csak nagyszámú kontrollméréseket követően alkalmas lehet feltehető BHV fertőzöttség mellett a fehérvérsejtek lipidperoxidációs és antioxidáns státuszának felmérése is. 4. kísérlet Az embrionális, illetve a korai magzati veszteségek előfordulásának az ellés után előforduló negatív energiaegyensúly egyes klinikai kémiai és endokrinológiai jellemzőivel, ovarialis következményeivel mutatott közvetlen összefüggését vizsgáltuk. Anyag és módszer A vizsgálatokat négy közepes méretű, az átlagos vagy annál kedvezőbb hazai viszonyokat tükröző üzemben, a 2. kísérletben leírtak szerint kiválogatott, többször ellett Holstein fríz tehenekben folytattuk le. A kondíció becslése, az involúció lefolyásának ellenőrzése és a szövődmények kezelése a 2. kísérletben ismertetett módszerekkel történt. A tél végi - tavaszi időszakban megellett teheneket a komplikációktól mentes ellés után 4-6 nappal vontuk be a kísérletbe. Az ellés utáni 63-77. napon kezdve a kezelést az állatok petefészek-működését az Ov-Synch (GPG) protokoll (GnRH inj. 7 nap múlva: PGF 2 inj. 48 óra múlva: GnRH inj.; ld. 3 kísérlet) szerint indukáltuk / szinkronizáltuk. Az állatok első termékenyítésére az ivarzási tünetek jelentkezésétől függetlenül, az Ov-Synch protokoll részét képező PGF 2 kezelés utáni 56-72. órában került sor (fix idejű inszeminálás, fix AI). 17 A jelentésnek ez a fejezete a Dr. Mézes Miklós vezetésével a SzIE Mezőgazdasági és Környezettudományi Karának Takarmányozástani Tanszékén dolgozó munkacsoport munkája 19
Az energetikai státusz minősítésére az ellés utáni 1., 2. és 5. héten, valamint a fix AI előtti PGF 2 kezelés időpontjában, továbbá a fix AI-t követő 5. napon vérmintákat gyűjtöttünk, amelyből az alábbi metabolikus mutatókat határoztuk meg: NEFA, BHB, karbamid-n. A petefészek-működés ciklikussá válásának, a fix AI-t követően luteinizáció intenzitásának (posztovulációs progeszteron-szint emelkedés), és az esetleges embrionális / korai magzati veszteségekre utaló post-ai P4 profiloknak a nyomon követése a 2. és 3. kísérletben 18, a vemhesség megállapítása ill. az esetleges embrionális / korai magzati elhalás diagnosztizálása pedig a 3., ill. 7., 8. és 9. kísérletben 19 ismertetett módszerekkel történt. Eredmények a) A petefészek-működés ciklikussá válása Összesen 155 állat post partum P4 profilja bizonyult értékelhetőnek. A telepek között nem volt lényeges különbség az első 35. napon ovuláló egyedek arányában (Chi 2 próba, p= 0,29), ezért az adatokat együttesen is értékeltük. Az állatok mintegy fele (80 állat, 52%) ovulált az ellés utáni 35. napig, amely megegyezik korábbi hazai üzemi vizsgálatok eredményeivel (Huszenicza és mtsai., 1988). A kísérlet során minden esetben alkalmazott ciklusindukció/szinkronizáció nem tette lehetővé az ellés utáni időszakban esetleg előforduló egyéb ovariális funkciózavarok (pl. a CL működésének zavarai, anovulációs ciszták kialakulása, stb.) előfordulásának a vizsgálatát. Mivel csak 2. ellésű vagy idősebb állatokat vizsgáltunk, nem tapasztaltunk összefüggést az ellésszám és az első ovuláció időpontja között. A petefészekműködés ciklikussá válásának az ideje nem függött össze az előző laktációs tejtermeléssel sem. A post partum időszakban az állatok korlátozott energia-ellátottsága befolyásolhatja az ellés utáni acklia hosszát. Anyagunkban ennek ellenére sem találtunk határozott metabolikus különbségeket a már a 35. nap előtt, ill. a csak ezt követően ciklikus petefészek-működésűvé váló állatok között (az adatokat a terjedelmi korlátok miatt nem részletezzük). b) A vizsgált (fix idejű) termékenyítésből történő vemhesülés A termékenyítés körüli P4 eredmények alapján a szinkronizációs protokollra nem megfelelően reagáló állatok termékenyítési eredményeit nem értékeltük. Így összesen 133 állat eredményeit vettük figyelembe. Összesen 32 tehén vemhesült (24%). Embrió mortalitást összesen 13 állatnál (10%) diagnosztizáltunk, ebből 7 esetben feltételezett, 6 esetben pedig bizonyított EM állt a háttérben. Az EM eloszlása telepenként némileg különbözött (A1 üzem: n=1; D1 üzem: n=5; M1 üzem n=4; N1 üzem: n=3; Chi 2 próba p=0.154). Az vizsgált fix idejű (első) termékenyítésre vemhesülő állatok ellés utáni BHB és NEFA szintje kissé alacsonyabb volt azoknál az állatokénál, amelyek később üresnek bizonyultak. Megjegyzendő azonban, hogy e paraméterek a legtöbb esetben az élettani határértéken belül maradtak. Az állatok 78%-a a vizsgálat egész idején normál (<1.00 mmol/l) BHB szinttel rendelkezett, 17%-a volt átmenetileg hiperketonémiás és csupán 5 % volt tartósan hiperketonémiás (a vizsgált valamennyi mintában: BHB > 1.00 momol/l). A laktáció kezdetén tartósan vagy átmenetileg hiperketonémiás állatok alacsonyabb arányban vemhesültek, mint a normál ketonémiás csoportban, azonban ez az arány nem volt szignifikáns (Fisher próba, P<0.05) (4.1. táblázat). A vérplazma karbamid-n szintje néhány esettől eltekintve a szaporodásbiológiai szempontból kri- 18 Azaz: tejminták gyűjtése a P4 koncentrációjának a meghatározására az ellés utáni kb. 7. naptól kezdődődően, a ciklusindukció / szinkronizáció idejére is kiterjedően hetenként háromszor, az utolsó kezelés időpontjában, ezt követően (az ovuláció és a posztovulációs luteinizáció idején) 12 napon át naponként, majd a fix AI utáni 36. napig ismét hetenként háromszor. 19 Azaz: a tehenek (i) kétszeri (a post-ai 33-42. és 65-70 napon végzett) transzrektális UH vizsgálatával, valamint (ii) a vérszérum PSPB koncentrációjának a sorozatos (a post-ai 25., 32., 39., 46., 53., 60. és 66. napon) végzett meghatározásával (Biopryn ELISA teszt, BioTracking LLC, Moscow, ID, US). Az értékelés részletes leírását ld. a 7., 8. és 9. kísérletnél. 20