Sejtmembránra ható vegyszerek hatásmódjának vizsgálata

Sejtmembránra ható vegyszerek hatásmódjának vizsgálata SZABÓ ZSÓFIA Témavezető: Dr. Blaskó Katalin Készült: Semmelweis Egyetem Biofizikai és Sugárbiológiai Intézetében SEMMELWEIS EGYETEM DOKTORI ISKOLA Elméleti Orvostudományok Program: I/3. Ionizáló és nemionizáló sugárzások biológiai hatásai 2003.

1. BEVEZETÉS 6 1.1. A sejtmembrán 6 1.1.1. A sejtmembránok szerkezete 6 1.1.1.1. Membránlipidek 7 1.1.1.2. Membránfehérjék 8 1.1.2. A sejtmembrán funkciói 9 1.1.3. Modellmembránok 11 1.2. A sejtmembránra ható vegyületek 12 1.2.1. Pórusképző vegyületek a természetben 12 1.2.2. Terápiás célra használt pórusképző vegyületek 13 1.3. Gombás fertőzések és gyógyításuk 15 1.3.1. A Gombás fertőzések jelentősége 15 1.3.1.1. A gombás fertőzések és kórokozóik 15 1.3.1.2. A szervezet védekezési mechanizmusai 16 1.3.1.3. Hajlamosító tényezők 16 1.3.2. A humán terápiában alkalmazott gomba elleni szerek 17 1.4. A ciklusos lipodepszipeptidek 19 1.4.1. A ciklusos lipodepszipeptidek szerkezete 20 1.4.2. A ciklusos lipodepszipeptidek biológiai hatásai 21 1.5. Elektronspin rezonancia spektroszkópia 23 2. CÉLKITŰZÉSEK 24 3. ANYAGOK ÉS MÓDSZEREK 26 3.1. Anyagok 26 3.1.1. Anyagok humán vörösvértesten mért iontranszporthoz 26 3.1.2. Anyagok ESR spektroszkópiai vizsgálatokhoz 26 3.1.3. Ciklikus lipodepszipeptidek 27 3.2. Módszerek 27 3.2.1. Hemolízis meghatározása 27 3.2.2. Iontranszport mérés humán vörösvértesten 27 3.2.2.1. 86 Rb + passzív transzport 27 3.2.2.2. Hemoglobin transzport 29 3.2.2.3. Permeabilitási együttható 29 2

3.2.3. Kinetikai modell a transzportfolyamatok leírására 29 3.2.4. ESR spektroszkópiai vizsgálatok 31 1.1.1.1. Spinjelölt zsírsavszármazékok alkalmazása membránok vizsgálatára 31 3.2.4.2. Permeabilitás vizsgálata ESR-spektroszkópiai módszerrel 32 3.2.4.3. Kisméretű unilamelláris liposzóma preparálása és kezelése CLP-kel 33 3.2.4.4. Multilamelláris liposzóma preparálása és kezelése CLP-kel 34 3.2.4.5. Mérés ESR spektroszkóppal 34 3.2.4.6. ESR spektrumok kiértékelése 35 3.2.4.7. ESR spektrumszimuláció 36 3.2.5. Dinamikus fényszórásmérés 37 4. EREDMÉNYEK 38 4.1. A Syringopeptin22A humán vörösvértest membránra kifejtett hatásai 38 4.1.1. Hemolizáló hatás 38 4.1.2. Az ionpermeabilitást növelő hatás 39 4.2. Syringotoxin hatása humán vörösvértest membránra 41 4.2.1. Hemolizáló hatás 41 4.2.2. A permeabilitást növelő hatás 41 4.2.2.1. 86 Rb + -transzport 41 4.2.2.2. Hemoglobin transzport 42 4.2.3. A hőmérséklet szerepe a syringotoxin permeabilitást növelő hatásában 43 4.2.4. Kinetikai modell 46 4.2.5. A syringotoxin pórusra jellemző paraméterek 47 4.3. Ciklusos lipodepszipeptidek hatása liposzóma membránra, ESR spektroszkópiai vizsgálatok 48 4.3.1. Ciklusos lipodepszipeptidek hatása telített foszfolipidből készült liposzómákon 48 4.3.2. A CLP-k koncentrációjának szerepe a fluiditásra kifejtett hatásban 50 4.3.3. CLP-k membránfluiditásra kifejtett hatása a hőmérséklet függvényében 51 4.3.4. Ciklusos lipodepszipeptidek hatása telítetlen kötést tartalmazó foszfolipidekből készült liposzómán 58 4.3.5. Syringopeptin22A hatása koleszterin tartalmú liposzómán 59 4.3.6. Syringopeptin22A hatása multilamelláris liposzómán (MLV) 60 4.3.7. Pórusképződés vizsgálata liposzómán 61 4.3.8. A syringopeptin22a hatása a membránlipidek rendezettségére és rotációs dinamikájára 62 4.3.8.1. A rendparaméter változása SP22A hatására 62 3

4.3.8.2. Rotációs korrelációs idő 64 4.4. Ciklusos lipodepszipeptidek hatása liposzóma membránra; dinamikus fényszórásmérés 65 5. MEGBESZÉLÉS 67 5.1. A membránösszetétel inhomogenitása, változatossága mint védelmi mechanizmus 67 5.2. A CLP-k szerkezeti variabilitása mint hatásos támadó eszköz 76 5.3. Változatosság hatóanyagtervezés 77 6. KÖVETKEZTETÉSEK 78 7. KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS 82 8. IRODALOMJEGYZÉK 83 9. SAJÁT KÖZLEMÉNYEK JEGYZÉKE 93 10. ÖSSZEFOGLALÓ 96 11. SUMMARY 97 4

Rövidítések BLM CLP DMPC DOPC DOPE DOPS DPPC EC ESR Hgb HXD IC LUV MLV MOPS NLLS OD PBS SL-12 SL-16 SL-5 SL-7 SP SP22A SP22B SP25A SP25B SRE SR ST SUV UH vvt sík bimolekuláris lipidmembrán ciklusos lipodepszipeptid dimirisztoil-l-α-foszatidilkolin dioleoil- foszatidilkolin dioleoil-foszfatidil-etanolamin dioleoil-foszfatidil -serine dipalmitoil-l-α- foszatidilkolin extracelluláris tér elektronspin rezonancia spektroszkópia hemoglobin 4-(N,N-dimetil-N-hexadecil)ammónium-2,2,6,6 -tetrametilpiperidin-1-oxyljodid intracelluláris tér nagy unilamelláris liposzóma (large unilamellar vesicles) multilamelláris liposzóma (multilamellar vesicles) 3-(N-morpholino)-propánszulfonsav nemlineáris regressziós módszer/program (nonlinear least-squares method/program) optikai denzitás foszfáttal pufferelt izotóniás sóoldat (phosphate buffered saline) 12-doxyl-sztearinsav spinjelölő 16-doxyl-sztearinsav spinjelölő 5-doxyl-sztearinsav spinjelölő 7-doxyl-sztearinsav spinjelölő syringopeptinek syringopeptin22a syringopeptin22b syringopeptin25a syringopeptin25b syringomycin E syringomycinek syringotoxin kis unilamelláris liposzóma (small unilamellar vesicles) ultrahang vörösvértest 5

1. BEVEZETÉS 1.1. A sejtmembrán A sejtek nélkülözhetetlen építőköve a sejtmembrán, ami egyrészt biztosítja a sejtek önállóságát, a környezettől való szerkezeti elhatárolódást, másrészt szerepet játszik a sejtfunkciók jelentős részében is (pl.: energiatermelés, sejtek közötti kommunikáció). A sejtmembrán a szerkezeti elhatárolás mellett megakadályozza az ionok és molekulák szabad (korlátlan) diffúzióját, ugyanakkor speciális transzportfolyamatok révén biztosítja a szükséges anyagok felvételét, illetve eltávolítását. Ezáltal a membrán aktívan részt vesz az intracelluláris tér sajátos összetételének kialakításában, ami a sejt működéséhez szükséges, és biztosítja az anyagcserét [1-4]. 1.1.1. A sejtmembránok szerkezete A biológiai membránok szerkezeti alapját a lipid kettős réteg képezi, ebbe ágyazódnak bele, illetve ehhez kapcsolódnak a membránfehérjék. Lipid Fehérje Mielin Vörösvértest membrán Máj plazmamembrán Retinapálca külső szegmentum Mitokondrium külső membrán Mitokondrium belső membrán Agy szinaptikus vezikulum Ehrlich-ascites tumorsejt membrán Bakteriális membránok 75 25 49 40 41 45 22 41 30 30 1.1. ábra. Lipid-fehérje arány a különböző sejtmembránokban 51 60 59 55 78 59 70 70 A biológiai membránokról alkotott mai elképzelések egyetértenek abban, hogy a struktúrák lipid kettős réteget tartalmaznak (vastagsága: 4,5-5,5 nm), valamint mindkét oldalon egy-egy fehérje réteget (vastagsága: 2,5-3,5 nm). A lipid-fehérje arány általában közel azonos, de széles határok között mozoghat a speciális funkcióknak megfelelően [1-4]. Néhány adatot tüntettünk föl az 1.1. ábrán (szerkesztve az [5] adatai alapján). 6

1.1.1.1. Membránlipidek A lipid kettős réteget amfifil szerkezetű lipid molekulák alakítják ki, amelyek két részből állnak, egy poláros fejcsoportból és egy apoláros farokrészből. A lipidek úgy helyezkednek el, hogy a poláros fejcsoportjaik néznek kifelé, az extacelluláris-, illetve az intracelluláris tér felé, az apoláros farok részek pedig a membrán belseje felé fordulnak. A membrán kettős rétegének kialakításában résztvevő három nagy lipidcsoport a glicerofoszfolipidek, a szfingofoszfolipidek és a glikoszfingolipidek [6, 7]. A biológiai membránok jelentős mennyiségben tartalmaznak koleszterint is (1.2. ábra). A biológiai membránok kettős funkciójának, a stabilitásnak és a funkcionális dinamizmusnak az ellátását az egymással másodlagos kötéssel kapcsolódó, nagy számú lipid- és fehérje molekula biztosítja. Így a biológiai membránoknál, az adott biológiai rendszer szokásos működési hőmérsékletén, a lipid-kettős rétegben az egyes lipidek nagyfokú mozgékonysággal rendelkeznek, mivel közöttük nem-kovalens kölcsönhatások működnek. A foszfolipid molekulák saját tengelyük körül foroghatnak, a molekulák pedig a membrán egyik rétegében elmozdulhatnak, ez utóbbit nevezzük laterális diffúziónak. Előfordul a foszfolipidek flip-flop mozgása is; ez a kettős rétegen keresztül történő (transz-membrán) mozgás, mely ritkább és lassabb folyamat az előzőeknél, hiszen ekkor a poláros molekularészeknek a membrán apoláros részén át kell hatolniuk, és ez nagyobb energiát igényel. Ezek a mozgások eredményezik a membrán fluiditását, ami működésüknek elengedhetetlen feltétele [7, 8]. A membránokban a lipidek mozgékonysága függ a hőmérséklettől és a membrán összetételétől. Testhőmérsékleten a sejtmembránok általában fluid állapotban vannak. Ha a hőmérséklet a fázisátalakulási hőmérséklet alá csökken, a membrán merev, un. gél állapotba kerül, ilyenkor a lipidek mozgása csökken. A fluiditás-növekedés a permeabilitás növekedését vonja maga után. A zsírsavlánc régió egy adott hőmérséklet felett jelentős strukturális átalakulást mutat, a rendezettség csökken. A zsírsavláncok orientációja csökken, nő a mozgási szabadság és a zsírsavláncok közötti távolság is 0,048 nm-ről 0,053-0,060 nm-re nő, növekszik a kettős réteg felszíne, térfogata és a foszfolipidek laterális diffúziós sebessége is [9]. Hasonló változásokat a membrán kémiai összetételében való eltérések is előidézhetnek. A foszfolipidekben a telítetlen zsírsavak jelenléte fokozza a fluiditást. Míg a transz kettős kötés nem okoz jelentős 7

változást, a telített kötésekhez képest, addig a cisz kettős kötések kifejezett eltérést okoznak a zsírsavlánc elhajlása miatt. E kötések csökkentik a tényleges lánchosszúságot, növelik a molekula szélességét, megakadályozzák az oldalláncok közötti túl szoros kapcsolat létrejöttét. Ezzel szemben a nagy mennyiségű telített zsírsav a membránokban a fluiditást, következésképpen a permeabilitást is csökkenti. A koleszterin jelentősen megváltoztatja a foszfolipid kettős réteg dinamikai sajátosságait, "kompaktabbá" teszi a sejtmembránt, csökkenti a foszfolipidek laterális diffúzióját, és általában a membránfluiditást. A koleszterin csökkenti a foszfolipid alkotók átlagos molekuláris területét, tehát kondenzáló hatással rendelkezik. Ez a jelenség a koleszterin és a foszfolipid molekula közötti van der Waals erőknek köszönhető, amik közelebb hozzák a kölcsönhatásban résztvevő membránalkotókat. A koleszterin ezen felül csökkenti a modellmembránoknak a hidrofil molekulákra vonatkozó permeabilitását. A lipidek elhelyezkedése a membránban aszimmetrikus 1.2. ábra. Pl. a vörösvértestben a lipid kettős réteg külső oldalán található a foszfatidilkolin és a szfingomielin nagy része, valamint a glikolipidek döntő többsége, ezzel szemben a foszfatidiletanolamin nagy többsége a membrán belső részében helyezkedik el hasonlóan a foszfatidilszerinhez. A koleszterin eloszlása a két részben közel azonos [5]. Koleszterin (23%) PE (18%) EC-tér Szfingomielin (18%) PC (17%) PS (7%) glikolipid (3%) egyéb (18%) IC-tér 1.2. ábra. A vvt membránlipidjeinek inhomogén elrendeződése (az ábra a [5, 10] alapján készült) 1.1.1.2. Membránfehérjék A membránok fontos összetevői a membránfehérjék. Singer és Nicolson [11] folyékony mozaik modellje (1.3. ábra) szerint a lipid kettős rétegbe különböző mértékben beágyazódnak a fehérje molekulák. A membrán külső vagy belső felszínén, 8

abba többé-kevésbé belemerülve helyezkednek el az un. perifériás membránfehérjék. A membránfehérjék másik csoportját alkotják az integráns fehérjék, amelyek áthatolnak (akár többször is) a lipid kettős rétegen. A fehérjemolekulák a sejtmembrán működésében alapvető szerepet játszanak. Specifikus transzportrendszerek kialakításával szabályozzák az anyagmozgásokat, részt vesznek a sejtek közötti kapcsolatok kialakításában, hozzájárulnak a sejtműködés szabályozásához. A membránfehérjék funkciójukból eredő változatos orientációja a hozzájárul a membránok aszimmetriájához. Működésüket a membránlipidek aszimmetrikus eloszlása is befolyásolja, valószínű, hogy ez működésüknek feltétele és esetleg szabályozó módja, hiszen optimális működésük meghatározott lipidkörnyezetet igényel. 1.3. ábra. A folyékony-mozaik membrán-modell (az ábrát a www.tulan.edu./~biochem/faculty/facfigs/fluidmosaic.htm file-ból szerkesztettem be) 1.1.2. A sejtmembrán funkciói A sejtmembrán funkciói közül a legfontosabbak a következők: a) Anyagtranszport a sejtmembránon keresztül b) Sejtek közötti kapcsolatok kialakítása és a sejtalak szabályozása c) A hormonok és az idegi hatások közvetítése receptorokon keresztül d) Membránpotenciál kialakítása és információtovábbítás Doktori munkámhoz ezek közül a sejtmembránon keresztül történő transzport kapcsolódik szorosan, ezért a többi membránfunkció ismertetésétől jelen munkámban eltekintek. A legtöbb anyag átjutása a biológiai membránokon erősen korlátozott, de a sejt számára szükséges anyagok felvétele és leadása biztosított. A membránok barrier tulajdonsága a lipid kettős réteg korlátozott permeabilitásának köszönhető. A 9

membránon, poláros anyagok nem, vagy csak nagyon kis mennyiségben képesek átjutni. Átjutnak viszont passzív diffúzióval a gázok és az apoláros, töltés nélküli anyagok. Valószínűleg az időről időre keletkező membránréseken passzív diffúzióval (illetve újabb elképzelések szerint az aquaporinok segítségével) átjut még a víz, illetve más kisméretű poláros molekula is. A legtöbb anyag membránon való átjutását integráns fehérjék, un. transzporterek biztosítják. Az integráns fehérjék által létrehozott transzport egyik fajtája a facilitált diffúzió: ilyenkor a transzport a koncentrációgrádiensnek megfelelően történik. A folyamat legfeljebb addig tarthat, amíg egyensúly alakul ki a membrán két oldalán, így ez a folyamat akkumulációhoz nem vezethet. Facilitált diffúziót valósít meg, pl. a vörösvértestekben a Glut-1 glükóz transzporter, amin keresztül a glükóz transzport 50000-szer gyorsabb, mint a glükóz passzív diffúziója a membránon keresztül. A vörösvértestek membránjában található a klorid-bikarbonát cseretranszporter is: klorid és bikarbonát antiportját végzi a koncentrációviszonyok által meghatározott irányban, ezáltal valósul meg a széndioxid szállítás a vvs-ben. A sejtek működéséhez létfontosságú számos olyan transzport, amelynek segítségével az elektrokémiai-grádienssel szemben mozognak az anyagok. A legtöbb ilyen transzport közvetlenül kapcsolt ATP hasításhoz, ami fedezi az energiaigényt, ezt nevezzük aktív transzportnak, amihez különböző enzimek, transzporterek működése társul: ilyen a sejtek Na + - és K + -ion koncentrációját meghatározó Na + /K + -ATP-áz, vagy a Ca 2+ szint fenntartásáért felelős Ca 2+ -ATP-áz. Vannak olyan transzporterek, amelyek működésénél az ATP hidrolízis nem közvetlenül része a folyamatnak. Ilyenkor az aktív transzport energiaigényét az fedezi, hogy egy másik anyag egyidejűleg, az elektrokémiai-grádiensnek megfelelően transzportálódik. E folyamatoknál, amelyeket másodlagos aktív transzportnak nevezünk, általában a Na + -ion egyidejű transzportja történik. Az ioncsatornákat általában membránfehérjék alakítják ki, rajtuk keresztül egy hidrofil csatornán át ionok áramlása lehetséges. A csatornát ezen integráns membránfehérjék konformációváltozása nyitja ill. zárja. Az ioncsatornák egyik csoportját a feszültségtől függő működésű csatornák, a másikat pedig a receptorként működő ioncsatornák alkotják. 10

1.1.3. Modellmembránok A sejtmembránok szerkezetének és funkciójának tanulmányozására az egyik leggyakrabban alkalmazott modell az emberi vörösvértest. A vörösvértest egészséges önkéntes véradók véréből centrifugálással nagy mennyiségben nyerhető, hűtve tárolható, ezért alkalmazása nem igényli költséges sejttenyésztő laboratórium fenntartását. Másik előnye, hogy sejtmaggal és más intracelluláris organellummal nem rendelkezik, így megfelelő eljárás után centrifugálással olyan frakció különíthető el, amelyik csak plazmamembránt (ghost) tartalmaz [6, 12]. 1.4. ábra. Unilamelláris liposzóma sematikus rajza A sejtmembránok összetétele meglehetősen változatos és bonyolult. Ezért működésük megismerése sokszor hatékonyabb akkor, ha egyszerűbb mesterséges membránnal modellezzük őket. A sejtmembránok lipid kettős rétegét alkotó lipidek vizes fázisban spontán különböző lipid-víz rendszereket hoznak létre. Az elrendeződés egyrészt függ a lipid fajtájától, a lipid-víz aránytól, valamint az alkalmazott eljárás módjától. A leggyakrabban alkalmazott mesterséges modellmembránok a liposzómák és a sík bimolekuláris lipidmembránok (BLM) [5, 13]. A lipid kettős réteggel körülvett vezikulák, a liposzómák, kitűnően alkalmazhatók a kutatásban a membránok szerkezetének vizsgálatára, a membránra-ható vegyszerek hatásmódjának tanulmányozására, vagy transzportfolyamatok megfigyelésére. A liposzómáknak több csoportja létezik, amik közül a sejtmembránok modellezésére kis unilammelláris- (SUV), nagy unilammelláris- (LUV) és multilamelláris liposzómát (MLV) használnak. A liposzómák egy (SUV, LUV), vagy több (MLV) lipid kettős rétegből állnak, ami kisebb-nagyobb vizes térfogatot vesz körbe [14]. A SUV-ok 30-100 nm, a LUV-ok 100-1000 nm átmérővel rendelkeznek, az MLV mérete szintén változó, átmérőjük legalább 11

100 nm, de a m-es nagyságot is elérhetik. A liposzómák lipidösszetétele (bizonyos megszorításokkal) tág határok között szabadon változtatható, ezért kitűnően alkalmasak arra, hogy a membrán lipid molekulái és a membránra ható vegyszerek közötti kölcsönhatásokat akár molekuláris szinten tanulmányozzuk a segítségükkel. 1.2. A sejtmembránra ható vegyületek A sejtmembránnak a sejt életében meghatározó szerepe van; így a membránra ható vegyületek, melyek megváltoztatják a sejtmembrán szerkezetét és/vagy funkcióját, alapvetően befolyásolhatják a sejt működését. A különböző hatások közül az alábbiakban a pórusképzők hatásaival foglalkozom. 1.2.1. Pórusképző vegyületek a természetben Az egysejtűktől az emlősökig gyakran fordulnak elő az élővilágban olyan molekulák, melyek a sejtmembránon pórust hoznak létre, ezáltal megváltoztatják a membránon keresztül folyó transzportot, felborítják a sejt normális működését, és a sejt pusztulásához vezethetnek. A membrán permeabilitását fokozó anyagok általánosan alkalmazott eszközök az élőlények védekező rendszerében (host defense system) [15-18]. Ezek az anyagok a támadó kórokozók membránját károsítják, ezzel védve a gazdaszervezetet. Ugyanakkor egyes mikroorganizmusok méreganyagai is gyakran pórusképző molekulák, amik a megtámadott gazdaszervezetet károsítják [19-25]. A pórusképző molekulák szerkezete meglehetősen változatos, de általánosan jellemző rájuk, hogy amfifil szerkezetűek és egy, vagy több pozitív töltéssel rendelkeznek [15-19, 26-29]. Hatékonyságukat és hatásspektrumukat mind a molekulák szerkezete, mind a célmembrán lipidösszetétele befolyásolja. Az élőlények védekező rendszerében szerepet játszó pórusképző peptideken végzett kiterjedt kutatások rávilágítottak arra a tényre, hogy a kívánt hatás eléréséhez megfelelően pozícionált kationos molekularészekre van szükség [15, 16, 18]. Pl. seminalplasminnal és annak származékaival végzett kísérletek szerint a pozitív töltéssel rendelkező részek megfelelő elhelyezkedése meghatározó volt a hatás kialakulása szempontjából, és az antimikróbás hatás javult a nettó pozitív töltés emelkedésével [30, 31]. Egy, a halakra jellemző toxin, a pardaxin esetében azt tapasztalták, hogy ha a fehérje N-terminális végére egy pozitív töltés került, akkor nőtt az antibakteriális hatás, viszont csökkent a toxin által kiváltott hemolízis [32]. Egy másik pórusképző molekulával, a méhek mérgéből származó 12

melittinnel, valamint a marhából származó seminalplasminnal végzett tanulmányok szerint a hidrofób momentum is szerepet játszik a hatás kialakulásában [18, 33]. 1.2.2. Terápiás célra használt pórusképző vegyületek A természetben előforduló pórusképző mérgek közül többet a terápiában is használnak antimikróbás hatásuk miatt. Pl. a primicin (Ebrimicin) egy pozitív töltéssel rendelkező laktongyűrűből álló hatékony antibiotikum. Modell membránon és emberi vörösvértesten végzett vezetőképesség, ill. iontranszport mérések szerint a primicin dimer aggregátumokból álló csatornát hoz létre [34, 35]. A gramicidin A bár alkalmazása a gyakorlatban nem terjedt el az egyik legtöbbet vizsgált antibiotikus hatású póruképző molekula. Hasonlóan a primicinhez a membránon dimer formában képez csatornát [35, 36, 37]. 1.5. ábra. A gramicidin A dimerje által képzett csatorna felülnézete. A kép Epand et al. [38] munkájából szerkesztett kép Ge és mtsai [39] ESR spektroszkópiai és spektrum szimulációs eredményei alátámasztották, hogy a gramicidin A aggregálódik DPPC-ből készült lipid kettős rétegben akkor, ha a gramicidin/dppc molaris arány nagyobb, mint 1/15. Vizsgálataik a gramicidin A és a membránlipidek közötti kölcsönhatásokat molekuláris szinten világították meg. Megállapították, hogy a gramicidin aggregációjakor a közelében lévő membránrész szerkezete pillanatszerűen megváltozik, a lipidek mozgékonysága 13

nagymértékben csökken. Azt tapasztalták, hogy a szénhidrogén lánc végén spinjelölt lipidek nagy negatív rendparaméterrel voltak jellemezhetők, ami arra utal, hogy a lipidláncok végei jelentősen meghajoltak. Ezt azzal magyarázták, hogy valószínüleg a gramicidin A csatornák és a lipidek hidrofób részei nem illeszkednek jól egymáshoz, un. hidrofób mismatch-hatás mutatkozik. Feltehetőleg a pontatlan illeszkedés és a gramicidin A dehidráló hatása együttesen eredményezik a szerkezet megváltozását (H II - fázis kialakulása) [39]. Blaskó és mtsai [40] emberi vörösvértest membránon nyert transzport kinetikai eredményei alapján a gramicidin A csatornák meghatározott élettartammal rendelkeznek. A gramicidin A-val kezelt membrán 86 Rb + -ra vonatkozó megnövekedett permeabilitása 30 o C-on 90 perc után lecsökkent, amiből a csatornák inaktiválódására következtettek [41]. 30 o C-on a 86 Rb + -ra vonatkozó megnövekedett permeabilitás rövidebb idő alatt csökkent, mint 20 o C-on, ezzel szemben 6 o C-on állandó permeabilitást tapasztaltak, ami arra utal, hogy a pórusok inaktivációja a hőmérséklettől függő folyamat [41]. Normál, csökkentett és megnövelt koleszterin tartalmú vörösvértest membránon Schagina és mtsai [42] azt tapasztalták, hogy abban az esetben, ha a membrán koleszterin tartalma 30%-kal nagyobb volt a normál vörösvértesténél, akkor a permeabilitás csökkenése hamarabb következett be. A csökkentett koleszterin tartalmú vörösvértesten a permeabilitás a mérés ideje alatt nem változott. A fentiek alapján az inaktiváció sebessége a koleszterin tartalom emelésével növekedett, amiből arra következtettek, hogy a pórusok inaktivációjában a gramicidin A és a koleszterin közötti kölcsönhatásoknak kulcsszerepe van [42]. Ezt a következtetést különböző lipidösszetételű modell membránon nyert eredmények is alátámasztották. Dioleilfoszfatidilkolinból és valamilyen szterolból (koleszterin, vagy ergoszterin, vagy szitoszterin, vagy 7-dehidro-koleszterin) készült BLM-n nyert eredmények szerint a gramicidin A csatornák akkor inaktiválódtak, ha a membrán olyan szterolt tartalmazott, amelynek B gyűrűjén mindkét kettős kötés jelen volt. Ez arra utal, hogy a pórusok inaktivációjához a gramicidin és koleszterin B gyűrűjének második kettős kötése közötti kölcsönhatásra van szükség [42]. A Streptomyces nodosus által termelt amphotericin B ugyancsak sokat vizsgált pórusképző molekula [43]. Az amphotericin B a membrán szterol komponenséhez kötődik, és több molekulából álló komplex kialakításával képezi a csatornát [44-48]. 14

Jelentős antibakteriális hatással rendelkezik, de főként gombaölő hatását használják ki a szisztémás (invazív) gombás fertőzések kezelésére (2.1.2. fejezet) [45, 49]. 1.3. Gombás fertőzések és gyógyításuk 1.3.1. A Gombás fertőzések jelentősége 1.3.1.1. A gombás fertőzések és kórokozóik Az emberi gombafertőzések között megkülönböztetünk felületi-, subcutan- és mély (szisztémás, vagy invazív) mycosisokat. Szisztémás jellegű megbetegedés ugyan, de sokszor külön tárgyalják, az un. opportunista mycosisokat. Kórokozóik egészséges embereket általában nem betegítenek meg, a fertőzéshez valamilyen további tényező szükséges. Ezek alapján a gombás fertőzések kórokozói két nagy csoportra oszthatók. Az első a föltétlen patogének csoportja, amelyek általában ép szövetben, szervben ill. szervezetben okoznak mycosist, szemben a második csoportba sorolható un. fakultatív patogénekkel. A fakultatív patogének jellemzően csak gyengült, vagy hiányos immun-, ill. hormonműködés esetén okoznak megbetegedést, amit opportunista mycosisnak is nevezünk. A föltétlen patogének által okozott mycosisok A felületi mycosisok kórokozói (pl.: Epidermophyton-, Trichophytonés Microsporum fajok) az elszarusodott felületi szöveteket támadják meg (bőr, haj, köröm). A subcutan mycosisokat okozó gombák (pl.: Sporothrix schenkii, Phialophora verrucosa, Phialophora pedrosi, Cladosporium carrionii, és Madurella fajok) a talajban élő fajok, a subcutisba kell jutniuk eredményes fertőzés létrehozásához. A szisztémás mycosisok kórokozói általában a talajban szaprofita életmódot folytató gombák, ezek spóráinak belégzése vezet a fertőzéshez. Az első elváltozások ezért általában a tüdőben keletkeznek, gyakran spontán gyógyuló tüdőgyulladás formájában. Krónikus forma ritkán alakul ki, ilyenkor a fertőzés direkt módon, 15

vagy a véráram útján terjedhet, és bármelyik szerv fertőződhet. Ezek a fertőzések emberről emberre általában nem terjednek. Szisztémás mycosist okozhat, pl. a Coccoidioides immitis, a Histoplasma capsulatum, a Blastomyces dermatitidis, és a Paracoccidioides brasiliensis [50]. A fakultatív patogének által okozott szisztémás mycosisok kórokozói a természetben igen elterjedt szaprofiták, pl. a különböző Candida és Aspergillus fajok, a Cryptococcus neoformans és a Zygommyceták [50]. 1.3.1.2. A szervezet védekezési mechanizmusai Az emberi szervezet gombák ellen való védekezésében szerepet játszanak mind aspecifikus, mind specifikus védelmi mechanizmusok. Az aspecifikus védekezési rendszerben az első védelmi vonal a bőr. A bőr épsége mellett a normál flóra is szerepet játszik a gombák visszaszorításában. Mivel a szisztémás mycosisok fő behatolási kapuja a tüdő, ezért az ellenük való védekezésben fontos a légúti hámszövetek csillóinak a szerepe és az alveoláris makrofágok működése. A vérben az aspecifikus védekezés tényezői között ki kell emelni a fagocitózist. A védekezésben szerepe van a komplementrendszernek, a parenchymás szervek (máj, lép), a nyirokcsomók és a csontvelő makrofágjainak és még sok egyéb tényezőnek. A specifikus védekezésben nagyobb szerepet tulajdonítanak a celluláris mechanizmusoknak, mint a humorális válaszoknak. 1.3.1.3. Hajlamosító tényezők Bizonyos hajlamosító tényezők hatására a gombás fertőzések (elsősorban az opportunista mycosisok) valószínűsége jelentősen megemelkedik. Hajlamosító betegségek a veleszületett-, ill. szerzett immunhiányos állapotok (pl.: AIDS, neutropenia), a tumorok (főleg az előrehaladott szolid tumorok ill. leukemiák), a diabetes mellitus, a krónikus alkoholizmus és kábítószer-élvezet. Mesterségesen előidézett hajlamosító tényező a kortikoszteroidok és a szélesspektrumú antibiotikumok hosszan tartó adagolása, a citosztatikus kezelés, a sugárkezelés, az égési sérülések és a katéterezés. 16

1.3.2. A humán terápiában alkalmazott gomba elleni szerek A gombafertőzések elleni küzdelmet nehezíti, hogy eukaryota gazdaszervezetben (emberi) kell a szintén eukaryota gombák ellen szelektíven ható szereket alkalmazni, amire kevesebb lehetőség nyílik, mint a prokaryota baktériumok estében. A humán terápiában alkalmazott gomba elleni szerek hatásmódjukat tekintve négy nagy csoportra oszthatók: Sejtmembrán-funkciót gátlók: megváltoztatják a membrán permeabilitását, ilyenek pl. a polién makrolidok Sejtmembrán-szintézist gátlók: az ergoszterol bioszintézisét gátolják, pl.: azolok, morfolinok, allylaminiok, thiocarbamátok Nukleinsav-szintézist gátló: flucytosin mitózist gátló: griseofulvin [45]. Sejtmembrán-funkciót gátló szerek: polién makrolidok A polién makrolidok közé tartozik a szisztémás fertőzésben alkalmazott heptaén az amphotericin B, ami a sejtmembránon pórust hoz létre, ezáltal a membrán permeabilitása megnő, a sejt homeosztázisa felborul, és ez a sejt irreverzibilis károsodását vonja maga után. Az amphotericin B a gomba membránjában jelenlévő ergoszterolhoz kötődik, ám a kötődés nem teljesen szelektív, ezért némiképpen kötődik az emberi sejtmembrán koleszterinjéhez is, ami hozzájárul az Amphotericin B súlyos mellékhatásaihoz. Igen gyakori a magas láz (40 o C) és a fejfájás. Gyakoriak az emésztőszervi mellékhatások, így a hányinger, hányás. Maradandó szövődményként jelentkezhet veseártalom. Felléphet heveny májártalom és csontvelő-károsodás. A szert ma már liposzómába zárt formában és lipid-komplexként is alkalmazzák, így a rendkívül erőteljes mellékhatások csökkenthetők [51-53]. Lokális kezelésre alkalmazott makrolid a nystatin. Hasonlóan az amphotericin B- hez megváltoztatja a membrán permeabilitását, zavart okoz a transzportban. Erősen toxikus, ezért parenterálisan nem alkalmazzák. Helyi kezelésre használt makrolid gombaölő a candicidin [54, 55] és a szem gombás megbetegedéseiben alkalmazott natamycin [56]. Sejtmembrán szintézisét gátló szerek: 17

Azolok: A helyi és a szisztémás gombás fertőzések gyógyításában egyaránt alkalmazzák az imidazol származékokat. Az imidazol származékok szintetikus vegyületek, melyek a gombák ergoszterol bioszintézisét gátolják. Megváltozik a gombamembrán szerkezete, a sejt anyagtranszportja és több membránhoz kötött enzim működése. Magyarországon lokális kezelésre használják a clotrimazolt (Canesten), a miconazolt (Daktarin, Mycosolon), és az econazolt (Pevaryl) a bőr és a hüvely gombás fertőzéseiben. Szintén helyileg alkalmazzák a széles hatásspektrumú és rövidebb kezelési időt igénylő bifonazolt (Mycospor). Szisztémás fertőzésben is alkalmazott imidazol származék a ketokonazol (Nizoral), aminek erős mellékhatásai lehetnek; így hányás, hasi fájdalom, idegrendszeri tünetek és a szteroid anyagcsere zavara. Szisztémás gombás fertőzések kezelésére jól bevált szerek a triazolok: a fluconazol (Diflucan) és az itroconazol (Orungal). Hatásmódjuk, hasonlóan az imidazol származékokéhoz, az ergoszterol bioszintézis gátlása. Allylaminok: A terbinafin a squalen-epoxidáz enzim gátlásán keresztül akadályozza az ergoszterin-szintézist. A szert szisztémás fertőzésekben alkalmazzák. Morfolinok: Az amolorfin (Loceril) a C17 reduktáz és a C7-C8 izomeráz gátlása révén szintén az ergoszterol szintézist gátolja. Carbamátok: Lokális kezelésre használják a tolnaftátot (Digifungin, Chinofungin). Nukleinsav szintézisét gátló szer: Szisztémás fertőzések kezelésére alkalmazzák a flucytosint, ami a gombasejtekben fluoruracillá, majd fluor-dezoxi-uridilsavvá alakul és gátolja timidilát szintetázt. A szelektív hatás annak köszönhető, hogy az emlőssejtekben kevés fluorcitozin (flucytosin) alakul át fluoruracillá. Gyakran együtt alkalmazzák amphotericin B-vel, így csökkenthető az amphotericin B dózisa. A flucytosin is okozhat mellékhatásokat, melyek közül legfontosabb a csontvelő depresszió. Mitózist gátló szer: A benzofurán származék griseofulvin (Grizeofulvin) fungisztatikus hatással rendelkezik. Az osztódás során a mikrotubulusokhoz kapcsolódik, ami az osztódási 18

orsók töréséhez vezet. A hatóanyag zöme a körömben, és a hajban halmozódik fel, a testnedvekben és a szövetekben, kis koncentrációban van jelen. Egyéb lokális gombás fertő zések kezelésére alkalmazott szerek Helyi kezelésre használják a ciclopirox olamint (Batrafen), a haloprogint és az undecilénsav sóit (Lubex, Zincundan) [45]. Újabb gombaellenes szerek Gombás fertőzések helyi kezelésére használják a ciclopirox olaminhoz hasonló fungicid hatású szintetikus rilopirox-ot. Szintén helyileg alkalmazzák a két újabb imidazol származékot, a lanoconazolt és az eberconazolt. [57] Szisztémás fertőzésekben is alkalmazott újabb triazol származék a voriconazol, mely hatékonynak bizonyult a komoly problémát jelentő, sokszor a legtöbb gombaölő hatóanyagra már rezisztens aspergillosisok kezelésében is.[58] Az allylaminokhoz hasonló hatásmóddal rendelkező butenafint sikerrel alkalmazzák gombás fertőzések helyi kezelésére [57]. A glucaszintetázt gátló vegyületek, mint pl. a cilofungin, gomba ellenes hatása már in vitro és állatkísérleten is bizonyított [59.] Új lehetőséget jelentenek a gombás fertőzések elleni küzdelemben a kifejlesztés alatt álló kitin szintézist gátlók, mint pl. a nikkomycin [60]. Napjainkban egyre több beteg rendelkezik a szisztémás gombás fertőzésekre hajlamosító tényezők valamelyikével, ami maga után vonja ezek előfordulásának rohamos növekedését. A hatékony gyógyszerek száma viszonylag kevés, a mellékhatások súlyossága és gyakorisága viszont jelentős. Az egyre szélesebb körben alkalmazott gyógyszeres kezelés következményeként pedig egyre nő a forgalomban lévő hatóanyagokra rezisztens patogén gombák előfordulása. Mindezek alapján újabb gombaölő szerek kifejlesztése szükséges humán terápiás célra. 1.4. A ciklusos lipodepszipeptidek Egy újabb pórusképző vegyület család a Pseudomonas syringae pv. syringae által termelt ciklusos lipodepszipeptidek (CLP-k). A baktériumtörzs számos növényi betegségért tehető felelőssé [61-66]. Toxinjai, a ciklusos lipodepszipeptidek azonban 19

növénykárosító hatásaik mellett jelentős gombaölő és baktérium ellenes hatással is rendelkeznek [65, 67-74], ami elsősorban a gombaellenes terápia számára teszi őket ígéretes vegyületekké. A ciklusos lipodepszipeptidek tagjai különböző hatásspektrummal és hatáserősséggel rendelkeznek, amit eltérő szerkezetükkel lehet magyarázni. 1.4.1. A ciklusos lipodepszipeptidek szerkezete A CLP-k szerkezetük szerint két nagy csoportra oszthatók, a syringomycineket [26-28], a syringotoxint [75], a syringostatinokat [28] és a pseuodomycineket [76] tömörítő nonapeptidek, valamint a syringopeptinek családjára [77]. Mindkét csoportra igaz, hogy a toxin-molekulák egy poláros fejcsoportból és egy apoláris farok részből Syringomycin E Ser Dab+ Dab + CH 3 (CH 2 ) 8 CH(OH) CH 2 CO Ser Arg + (4-Cl)Thr (3-OH)Asp - Dhb Phe Syringotoxin Dab + Gly Hse CH 3 (CH 2 ) 10 CH(OH) CH 2 CO Ser Orn + (4-Cl)Thr (3-OH)Asp - Dhb Thr Syringopeptin-22A Ala Ser Val CH 3 (CH2) 6 CH(OH) CH 2 CO Thr Ala T y r Dab + Dab + 1.6. ábra. Az általam vizsgált CLPk sematikus szerkezete 20

állnak; de az apoláris egység mérete és a poláros rész töltése különböző. A nonapeptidek kilenc aminosavból álló poláros lakton gyűrűjéhez egy hidroxizsírsavlánc kapcsolódik. Az általunk vizsgált syringomycin E (1.6. ábra) három pozitív és egy negatív töltést tartalmazó lakton gyűrűjéhez egy 3-hidroxi-dodekánsav szénhidrogén lánc kapcsolódik. A syringotoxin szénhidrogén lánca két szén atommal hosszabb, fejcsoportja pedig eggyel kevesebb pozitív töltéssel rendelkezik, mint az SRE (1.6. ábra). A syringopeptinek esetében a fejcsoportot egy kisebb, csak nyolc aminosavból álló lakton gyűrű képezi, amit azonban egy nagy, jobbára apoláris aminosavból álló 14-17 tagú egység köt össze a hidroxi-zsírsavlánccal. A harmadik, általunk vizsgált CLP, a syringopeptin22a (1.6. ábra) nyolc aminosavból álló gyűrűje két pozitív töltést tartalmaz, amit egy 14 aminosavból álló apoláris jellegű egység köt össze a 3-hidroxi-dekánsav szénhidrogén lánccal. 1.4.2. A ciklusos lipodepszipeptidek biológiai hatásai A CLP-k támadáspontja a sejtmembrán, hatásukra a membrán több funkciója, úgy mint az iontranszport, a H + -ATP-áz aktivitás, a fehérjefoszforiláció megváltozik [65, 78]. Valószínűleg a CLP-k összes biológiai hatása arra vezethető vissza, hogy a membránon csatornát hoznak létre, amin keresztül az ionok többé-kevésbé szabadon áramolnak az extarcelluláris és az intracelluláris tér között [20, 22, 23]. Vörösvértesten és modell membránon az általunk vizsgált mindhárom CLP ioncsatornát hoz létre [20-24, 79-83], ám biológiai hatásaik különbözőek. A növénykárosító hatásért elsősorban a syringopeptineket teszik felelőssé, az SRE és az ST ebből a szempontból kevésbé hatékonynak bizonyult [61, 62]. Ugyanakkor az antimikróbás hatás hátterében valószínűleg inkább a syringomycinek állnak [61, 68]. A CLP-k hatástalannak bizonyultak a vizsgált Gram negatív baktériumokra nézve, míg a Gram pozitív baktériumok változó érzékenységet mutattak a SP-kkel szemben [61]. Minden vizsgált CLP gátolta a gombák növekedését, de a különböző gombafajok érzékenysége eltérő a különböző CLP származékokkal szemben [61, 68]. A kialakuló hatást a membrán lipidösszetétele, különösen szterol- és szfingolipid tartalma jelentősen befolyásolja [70, 84-86]. A membránlipidek szerepét a CLP-k hatásában modell membránon is igazolták. Dalla Serra és mtsai [23] megvizsgálták a CLP-k membrán-permeabilitást növelő hatását liposzómákon, és azt tapasztalták, hogy a permeabilitást növelő aktivitás függ a 21

liposzóma lipidösszetételétől. Az SRE és az ST szterol-mentes liposzómán csak enyhe, ezzel szemben a SP teljes permeabilitás növekedést okozott tiszta foszfatidilkolin liposzómán is [23]. Feigin és mtsai [79] BLM-en nyert eredményei szintén igazolták a szterolok szerepét az SRE pórusképző aktivitásában. Megállapították, hogy a koleszterin csökkenti az SRE csatornaképző aktivitását. Megállapították továbbá, hogy az SRE kétféle pórust hoz létre, nagyot és kicsit, és a nagy csatorna hat kis csatornából álló oligomer. A csatornák sugara 1 nm-nek adódott [21, 79, 87]. A ciklusos lipodepszipeptidek lízist idéztek elő vörösvértesten és dohány protoplaszton [22, 23, 61, 64, 68]. A lízis valószínűleg a szabad ionáramlás következtében kialakuló kolloid ozmotikus mechanizmus eredménye [22]. A CLP-nek a sejtek lízisét okozó hatására vonatkozóan az irodalmi adatok ellentmondásosak, ami feltehetően néhány, ma még nem pontosan ismert tényező következménye. Hutchinson és mtsai [22] dohány protoplaszton végzett vizsgálatai szerint a syringomycinek és a syringopeptinek egyforma hatáserősséggel rendelkeznek, ezzel szemben Iacobellis és mtsai [64] szerint a SP aktivitása a többszöröse a SR-ének. Dalla Serra és mtsai [23] összehasonlították a CLP-k hemolizáló hatását humán és nyúl vörös vértesten, az SRE-t találták a leghatékonyabbnak, a ST-t kevésbé aktívnak és a SP bizonyult a leggyengébbnek. Hutchinson és mtsai [22] megfigyelései szerint a SP lizáló képessége csak 85%-a volt a syringomycinének ló vörösvértesten. Ezzel szemben Lavermicocca és mtsai [61] arról számoltak be, hogy birka vvt-n a SP hemolizáló hatása a legerősebb, ennél gyengébb az SRE-é és a leggyengébb a ST aktivitása. Ez utóbbit Sorensen és mtsai [68] eredményei is alátámasztják. A ciklusos lipodepszipeptidek csatornaképző tulajdonságára vonatkozó további információk, mint pl. a csatornaképzés hatékonysága, a csatornák élettartama, nyerhetők vörösvértesten végzett transzport-kinetikai vizsgálatokkal. A munkacsoportunk által korábban vizsgált SRE a transzport-kinetikai eredmények alapján pórust hozott létre vörösvértest membránon. Az SRE pórusképző aktivitása növekedett, amikor a membrán koleszterin tartalmát csökkent [80]. Az SRE pórusok 37 o C-on és 20 o C-on inaktiválódtak, ám 8 o C-on stabilnak bizonyultak vörösvértest membránon [81]. 37 o C-on 15 perc után, 20 o C-on 40 perc után inaktiválódtak az SRE csatornák [81]. BLM-en nyert eredmények is igazolták az SRE illetve az ST pórusok hőmérséklettől függő inaktivációját [81, 83], viszont az SP22A pórusok nem inaktiválódtak sem vvt-n, sem BLM-en [82]. Az SP22A és az ST hasonlóan az SRE- 22

hez kétféle csatornát hozott létre BLM-en, nagyot és kicsit [82, 83]. A nagy csatornák 5-6 kis csatornából álló oligomerek, melyek egyszerre nyílnak, ill. záródnak [82, 83]. Az antimikróbás terápia alapja a szelektív toxicitás: az alkalmazott gyógyszernek a kórokozót a gazdaszervezet károsítása nélkül kell elpusztítania. Erre a gombás fertőzések esetében még kevesebb lehetőség van, mint a baktérium fertőzések esetében, hiszen eukariota szervezeten belül kell a szintén eukariota gombákat elpusztítani, vagy legalább a szaporodásukat megakadályozni. A szelektív toxicitás érdekében szükség van arra, hogy a CLP-k és a sejtmembrán közötti molekuláris kölcsönhatásokat feltérképezzük. Ezáltal lehetőség nyílhat a humán terápia számára legmegfelelőbb CLP származék kiválasztására, illetve hasznos információt nyerhetünk a racionális hatóanyag tervezés számára. A CLP-k és a membránlipidek közötti molekuláris kölcsönhatások jól vizsgálhatók elektron spin rezonancia spektroszkópiai (ESR) módszerrel. 1.5. Elektronspin rezonancia spektroszkópia Az elektronspin rezonancia spektroszkópia (ESR) olyan molekulák és azok környezetének vizsgálatára alkalmas, amelyek párosítatlan elektronspinnel rendelkeznek. Ilyen természetes anyagok, pl. a sejtekben különböző okokból keletkező szabadgyökök, de léteznek szintetikusan előállított, un. spinjelölő molekulák is. A ma leggyakrabban alkalmazott spinjelölők általában egy nitroxid szabadgyököt (NO. ), tartalmaznak, amit a jelölő másik alkalmas csoportjai térbelileg úgy takarnak, hogy csökkentsék a redox reakciók esélyét. Ezáltal az amúgy igen reaktív, és ezért rövid élettartamú szabadgyök reakcióképessége csökken, és így alkalmassá válik arra, hogy ESR módszerrel információt szerezhessünk a spinjelölő mozgási állapotáról és környezetének tulajdonságairól. A sejt- ill. modell membránba (liposzóma) spinjelölt zsirsavat juttatva vizsgálható a membrán fluiditása azaz a lipidek mozgási és forgási szabadsága, irányítottságuk, valamint a jelölő környezetének polaritása és mindezek változása a membrán lipidösszetételének és pl. a hozzáadott hatóanyag minőségének függvényében [88-8]. 23

2. CÉLKITŰZÉSEK A Pseudomonas syringae pv. Syringae növényi kórokozó baktérium által termelt pórusképző toxinok a ciklusos lipodepszipeptidek (CLP-k). A CLP-k növénykárosító hatásaik mellett jelentős gombaölő és baktérium ellenes hatással is rendelkeznek [65, 67-74], ami elsősorban a gombaellenes terápia számára teszi őket ígéretes vegyületekké. A ciklusos lipodepszipeptidek tagjai különböző hatásspektrummal és hatáserősséggel rendelkeznek, amit eltérő szerkezetükkel lehet magyarázni. A szelektív toxicitás elérése érdekében szükséges a szerkezet és a funkció közötti kapcsolatok megismerése, a különböző származékok hatásainak összehasonlító vizsgálata. A legtöbbet tanulmányozott CLP a syringomycin E (SRE). Munkacsoportunk korábbi eredményei szerint az SRE pórusokat hoz létre humán vörösvértesten (vvt) membránban, és a vvt-k egy részét hemolizálta. A több monomerből felépülő SRE csatornák 37 o C-on és 20 o C- on időben inaktiválódtak, viszont 8 o C-on, a vvt membránlipidjeinek fő-fázisátalakulási hőmérséklete alatt, inaktiváció nem volt tapasztalható. A CLP-k szerkezete és hatása közötti összefüggések megismerése érdekében két másik CLP származék, a syringopeptin22a (SP22A) és a syringotoxin (ST) hatásait vizsgáltuk. Munkánk során célul tűztük ki: I.1. I.2. I.3. I.4. a syringopeptin22a (SP22A) és a syringotoxin (ST) vörösvértest membránjára gyakorolt permeabilizáló hatásának tanulmányozását; a permeabilitás növekedés hőmérséklettől és koncentrációtól való függésének vizsgálatát; a pórusok inaktivációjának transzportkinetikai modell segítségével történő leírását; a CLP-k pórusképző tulajdonságainak vizsgálatát, különös tekintettel a pórusok inaktivációjára, oligomerizációjára; A CLP-k molekuláris hatásmechanizmusának közelebbi megismerése érdekében liposzóma rendszereken tanulmányozni kívántuk: II.1. a telített foszfolipideket tartalmazó kis unilamelláris (SUV) és multilamelláris (MLV) liposzómákon a CLP-k membránfluiditásra gyakorolt hatását; 24

II.2. II.3. II.4. II.5. hogy milyen molekuláris dinamikai paraméterek változásai feleltethetők meg a membránfluditás változásának; a különböző CLP-k hatásait a szerkezeti hasonlóság és eltérés következményeként SUV rendszereken, valamint a hőmérséklet szerepét a CLP-k hatásában; hogy a membránlipidek zsírsavláncában jelenlévő telítetlen kötések, ill. a membrán koleszterin tartalma mennyiben módosítják a CLP-k liposzómákkal való kölcsönhatását; hogy CLP-k által kiváltott irreverzibilis fluiditás változás a lipid kettősréteg milyen strukturális változásának feleltethető meg. 25

3. ANYAGOK ÉS MÓDSZEREK 3.1. Anyagok 3.1.1. Anyagok humán vörösvértesten mért iontranszporthoz Vörösvértesten végzett iontranszport vizsgálatainkhoz egészséges donortól származó, Na-citrát alvadásgátóval kezelt és felhasználás előtt legfeljebb négy napig tárolt humán vért használtunk. A vér mosásához, a hematokrit (H) beállításához és a CLP törzsoldatok hígításához mesterséges szérumot használtunk, aminek összetétele (mmol/l): 3.2 KCl, 138 NaCl, 1 CaCl 2, 1 MgCl 2, 27 glükóz, ph = 6,8-ra 3-(Nmorpholino)-propánszulfonsavval (MOPS) állítva. Iontranszport méréshez radioaktív nyomjelzőként 86 Rb + izotópot használtunk ( energia: 1,078 MeV). A rubídium ion a fiziológiás szempontból fontosabb kálium ion analógjának tekinthető. A hemoglobin (Hgb) cianomethemoglobin formájában történő spektrofotometriás méréséhez Quicklyser II reagenst és Cellpack puffer oldatot használtunk (Symex, Toa Medical Electronics). A Quicklyser II reagens összetétele (mmol/l): KCN: 846, Nitroprusszid-Na: 1,7; a Cellpack puffer oldat összetétele pedig (mmol/l): NaCl:109, Na-tetraborát: 1, Bórsav: 16, K 2 -EDTA 0,5. 3.1.2. Anyagok ESR spektroszkópiai vizsgálatokhoz Liposzómák készítéséhez szintetikus dipalmitoil-foszfatidilkolint (DPPC), dimirisztoil-foszfatidilkolint (DMPC), dioleil-foszfatidilkolint (DOPC), valamint L- tojáslecitint és koleszterint használtunk, melyeket a Sigma Chemical Co-tól szerezünk be, a vegyületek tisztasága legalább 99%-os volt. Liposzóma preparálásához foszfáttal pufferelt (ph = 7,4) izotóniás sóoldatot (PBS) használtunk. Az oldatot tablettából (Oxoid LTD, Hampshire, England) készítettük. Spinjelölőként 5-doxyl-, 7-doxyl-, és 12-doxyl-sztearinsav (ICN Biomedicals Inc Ohio), valamint 16-doxyl-sztearinsav (Sigma Chem. Co) és 4-(N,N-dimetil-N- 26

hexadecil)ammónium-2,2,6,6 -tetrametilpiperidin-1-oxyl-jodid (Molecular Probes Inc., OR, USA) jelölőt használtunk. A lipidek oldásához analitikai tisztaságú etanolt, metanolt és kloroformot (Reanal, Magyarország) alkalmaztunk. 3.1.3. Ciklikus lipodepszipeptidek A tisztított [90] ciklikus lipodepszipeptidek Dr. Jon Y. Takemoto professzortól (Department of Biology, Utah State University, Logan, UT, USA) származnak. A CLPket 18 o C-on tároltuk, 10-3 mmol/l-es sósavban oldva törzsoldatokat készítettünk belőlük, melyek koncentrációja SRE esetén 2 mg/ml, SP22A és ST esetén 1 mg/ml volt. 3.2. Módszerek 3.2.1. Hemolízis meghatározása A CLP hozzáadása előtt (A o ) és meghatározott inkubációs idők után vett vérminták vörösvértest koncentrációját (A), hematokrit értékét (H o és H), a sejtek térfogatát (V o és V) 16 paraméteres hematológiai automatával (COBAS MICROS OT 18, Roche, Franciaország) határoztuk meg. A vvt szuszpenzió paramétereit, így vvtszámát, hematokritját, vvt méreteloszlását és Hgb tartalmát, valamint a lízis mértékét a hematológiai automata segítségével határoztuk meg. A lízis mértékét a hatóanyag hozzáadása előtt és után mért vvt szám különbségéből számoltuk ki és %-os értékben adtuk meg. 3.2.2. Iontranszport mérés humán vörösvértesten 3.2.2.1. 86 Rb + passzív transzport Adott mennyiségű vért 37 o C-on 1,5 órán keresztül 86 Rb + -mal inkubáltuk (0,25-0,5 MBq/ml vér). Az inkubálás során a 86 Rb + aktív transzport révén a vvt intracelluláris (IC) terébe jutott. Centrifugálás és a felülúszó eltávolítása után az EC térben maradt 86 Rb + eltávolítása érdekében a vörösvértesteket háromszor mostuk mesterséges szérumoldatban, majd ugyanebbe az oldatba szuszpendáltuk a vörösvértesteket, hogy a hematokrit (H) 0,4-0,5 legyen. A mosást az EC térben maradt 86 Rb + kontamináció 27

eltávolítása mellett az is indokolta, hogy elkerüljük a CLP-k és a szérumfehérjék közötti esetleges kölcsönhatásokat. A megfelelően gyors és hatékony keverés érdekében a CLP törzsoldat adott mennyiségét (100-1000 l) felhígítottuk mesterséges szérumoldattal (5-6 ml) oldattal és az így nyert oldatot gondosan összekevertük a vér adott mennyiségével (12-16 ml). Ezután a hematokrit érték 0,3-0,4 volt. A hatóanyag koncentráció ST esetében 2x10 6-1.3 10 7 molekula/vvt (39.4-256.3 g/ml vvt), SP22A estében pedig 4x10 5-1 10 8 molekula/vvt (17-4300 g/ml vvt) volt. A CLP-vel kezelt vér-szuszpenziót óvatos keverés közben adott hőmérsékleten, 37 o C, 20 o C, vagy 8 o C-on inkubáltuk. A szuszpenzióból adott időközönként mintát vettünk és a vvt-ket centrifugálással elkülönítettük az EC folyadéktól. A felülúszó aktivitását szcintillációs számláló (Gamma Művek, Magyarország) segítségével határoztuk meg. A felülúszó aktivitása arányos a vörösvértestekből az EC térbe transzportálódott 86 Rb + mennyiséggel, így mérése alkalmas a transzport jellemzésére. A t idő alatt kiáramlott 86 Rb + mennyiséget (N t ) a szuszpenzió teljes 86 Rb + tartalmának százalékában fejeztük ki [(1 ml vér EC terének aktivitása)/(1 ml vér aktivitása) 100]. A kiáramlás az izotópkoncentráció kiegyenlítődésének irányába megy végbe, egyensúly esetén az extracelluláris 86 Rb + százalékos mennyiségét N -nek jelöljük. H hematokrit esetén az extracelluláris tér térfogata 1-H, az intracellurális tér víztérfogata pedig 0,68 H; ugyanis a vörösvértest térfogatának ~ 32%-át a hemoglobin térfogata teszi ki. Egyensúlyi ioneloszlásnál az extracelluláris és intracelluláris 86 Rb + koncentráció megegyezik: c EC = c IC, így N / 100 1 N / 100. 1 H 0. 68H A fenti egyenlet átrendezése után N az: N képlet segítségével számolható. 1 H 1 0. 32H 100 A t = 0 időben kontamináció és lízis következtében az EC térben lévő 86 Rb + százalékos mennyiségét N o -lal jelöltük [40]. 28

3.2.2.2. Hemoglobin transzport A vörösvértestekből kiáramlott hemoglobin mennyiségének meghatározásához a mintákat lecentrifugáltuk és a felülúszó hemoglobin koncentrációját hematológiai automata segítségével meghatároztuk. A 1,3 mmol/l-nél kisebb Hgb koncentrációk mérését az automata érzékenysége nem tette lehetővé, ezért az ennél kisebb koncentrációk meghatározásához az automata mérési eljárásával analóg módszert alkalmaztunk. A felülúszóból vett mintát Sysmex Microcellcounter F-800 (Japán) félautomata által használt Cellpack oldattal hígítottuk, majd a Hgb-t a félautomata Quicksilver II reagens oldatának 2-3 cseppjével cián-methemoglobinná alakítottuk. Az oldatok cián-methemoglobin koncentrációval arányos optikai denzitását 545 nm-nél spektrofotometriai módszerrel mértük (Perkin-Elmer-Lamda UV-VIS spektrofotométer). A minták Hgb koncentrációját a COBAS MICROS OT hematológiai automata standard művér szuszpenzió segítségével készített kalibrációs egyenesről olvastuk le. 3.2.2.3. Permeabilitási együttható A permeabilitási együtthatót a (pórusoknak megfelelő) sebességi állandójából (k p ) számoltuk [91] 86 Rb + transzport összefüggés segítségével, ahol p k V p S V IC IC V EC V EC V EC : 1 ml vvt szuszpenzió EC térfogata, V IC : 1 ml szuszpenzióban a sejtek IC víztérfogata (V IC = A 0,68 V, ahol A az 1 ml szuszpenzióban lévő sejtek száma, V pedig egy vvt átlagos térfogata) S: a membrán felülete (A egy vvt átlagos felülete: 1,37 10-6 cm 2 [92]). 3.2.3. Kinetikai modell a transzportfolyamatok leírására A CLP-k hatására bekövetkező 86 Rb + -efflux adatainak kiértékelésére kinetikai modellt dolgoztunk ki. A modellben figyelembe vettük, hogy a transzport két úton 29