Száloptika, endoszkópok Optikai mikroszkópok a diagnosztikában Elektronmikroszkópia, fluorescens és konfokális mikroszkópia PTE-ÁOK Biofizikai ntézet Czimbalek Lívia 2009.03.16. Száloptika, endoszkópok Értékes diagnosztikus technikák közbeni gyógyító beavatkozásokat. elősegítik a vizsgálat A száloptikás eszközök megjelenése forradalmasította sok betegség diagnózisát, a kezelés módjait. Endoszkóp a belső üreges szervek vizsgálatára szolgáló eszköz. A száloptikás endoszkópot először 1957-ben alkalmazták. Optikai alapismeretek John Tyndall: a fény láthatóan elhajlik a sarkok körül (kísérlettel igazolta 1854-ben) Optikai alapismeretek A száloptika eszközökben a fénytovábbítás hasonló alapelven történik, vagyis a teljes belső visszaverődés elvén. Fénytovábbító száloptika nyaláb Fénytovábbító száloptika nyaláb Egyes fénytovábbító üvegnyaláb hossza: 12-22 m. videoendoszkópok! miniatűr TV kamera nagy felbontóképességű, színes, jó minőségű kép, A videoscope szondájában: tárgyoptika. A tárgyoptika microchip CCD - képalkotó lapocska A fénytovábbító száloptika nyaláb néhány ezer db. kb. 30 mikron vastagságú üvegszálból áll. A szálak rendezetlenül futnak, inkoherens elrendezésben. A nyaláb egy hajlékony fémspirál köpennyel van burkolva. CCD analóg jel Kép a monitoron! processzor (analóg jel-digitalizálás) Színes képalkotás: RGB szekvenciális Real time rendszerű CAD-program: 3D mérési eljárás 1
Képalkotó száloptikai nyaláb Fénytovábbító száloptika nyaláb koherensen rendezett optikai szálak által szállított kép elemi szálak : 40-50 ezer Azonos geometriai alakzat a szál mindkét végén! A kép minősége: -szálak mérete, -mennyisége, -rendezettsége! A megvilágításhoz szükséges fényt a fényforrás és az endoszkóp között nem száloptika, hanem folyadék közeg szállítja. Elektronmikroszkópia Transzmissziós elektronmikroszkópia (TEM) Az 50-100 kev energiájú elektronoknak rövid a hullámhosszuk, elektromos és mágneses térrel jól fókuszálhatók. A leképezés valósághűsége: -felbontóképesség -kontraszt. Elektronoptikai kép: elektronoknak a szilárd test atommagjain, illetve elektronjain való rugalmas szóródásának, és elhajlásának következménye. Felbontása: 0,2-0,3nm. Minta: 10-100nm vastagságú metszet. Elektronmikroszkópia Pásztázó elektronmikroszkópia (SEM) Egy jól fókuszált elektronnyalábbal a minta felületét letapogatják (végigpásztázzák). A mintáról visszaérkező elektronokkal (a TVképernyőjéhez hasonlóan) egy katódsugárcső fényintenzitását vezérlik. A mintán végigseprő elsődleges elektronok: - -visszaszóródnak, -másodlagos (szekunder) elektronokat váltanak ki. A szekunder elektronok a minta domborzati viszonyairól adnak rendkívül éles, nagyfelbontású képet. A visszaszórt elektronok a minta összetételével arányos képekként jeleníthetõk meg (nagyobb tömegű atomok jobban visszaverik az elektronokat, az elektronképen világosabbnak látszanak ). Pásztázó elektronmikroszkópia (SEM) A szekunder elektronok - a minta felszínének geometriája. A képernyőn megjelenő kép nagy mélységélességű (a kristály csúcsa és töve egyaránt éles). Olyan plasztikus képek nyerhetők vele, melyeket sem a fénymikroszkóppal, sem transzmissziós elektronmikroszkóppal nem lehet előállítani. Ez az előny azonban a felbontóképesség rovására megy, mert SEM-el legfeljebb 10-ezerszeres nagyítású éles képet készíthetünk. Felbontása: kb. 5 nm, szemben a TEM 0,2 nm felbontásával. Konfokális mikroszkópia Konfokális feltéttel ttel ellátott epifluoreszcens lézer pásztázó mikroszkóp p (CLSM) 2
A konfokális mikroszkóp p előnyei fluoreszcensen jelölt lt minták k vizsgálat latára alkalmas jobb felbontású képet ad optikai szeletelés 3D képek, ha a minta szemitranszparens néhány ny 100μm m vastagságú minták k rutinszerű vizsgálata digitális képalkotk palkotás in vivo kísérletek k A konfokális elv A hagyományos mikroszkópokkal szemben, a konfokális mikroszkópnál egyszerre csak a minta egy pontját világítják meg. A konfokális képalkotás lényege, hogy a rendszer csak a fókuszsíkból jövõ fényt detektálja. Egy konfokális rendszer vázlatav Legtöbb esetben egy több hullámhosszú lézer szolgál fényforrásként. [Ar-ion: 457nm (ibolya), 488nm (kék),514nm (zöld), ;He-Ne: 633nm (vörös).] A fényútba helyezett szûrõkkel kiválasztható a kívánt hullámhosszú gerjesztés. A lézer fényét egy dikroikus tükör a pásztázó tükrökre vetíti. A dikroikus tükröt a használt lézer hullámhosszának függvényében kell megválasztani, mégpedig úgy, hogy visszaverje a lézer fényét, de átengedje a mintából visszatérõ fluoreszcenciát. A mintából eredõ fluoreszcens fény ugyanazon az úton, visszafelé halad, és áthalad az elsõ dikroikus tükrön, amely átengedi a gerjesztõ fénynél magasabb hullámhosszú fluoreszcenciát. A második tükör a fluoreszcencia különbözõ színû komponenseit szétválasztja, és különbözõ detektorokhoz irányítja. A rendszer fontos eleme a számítógép által vezérelt fókuszmotor, amely az optikai szeletelés során meghatározott határok között pontosan eltolja a fókuszsíkot, miközben a koordinátákat a számítógép rögzíti. A mintából érkezõ fluoreszcens jel gyakran igen gyenge. A felvett kép jobb minõségû lesz, ha a rendszer több fényt gyűjt egy adott pontból, vagyis a nyaláb többet idõz egy pontban. Ez azt jelenti, hogy a pásztázás lassúbb, egy kép felvétele pedig hosszabb idõt vesz igénybe. Sokszor, különösen kinetikai méréseknél, kompromisszumot kell kötnünk a pásztázás gyorsasága és a képminõség között. A kettős jelölés lehetősége Alkalmas detektorral mérhetõ a mintán áthaladt fény intenzitása, amely alapján a rendszer létrehoz egy transzmissziós képet. 3
A kettős jelölés feltétele Képkészítés A konfokális mikroszkóp által készített képek digitálisak. A folytonos képet a digitalizálás során véges számú képpontra osztják fel, a végsõ képet pedig sorokban és oszlopokban elhelyezkedõ képpontok, az ún. pixelek alkotják. Az egyes képpontok fényességét egy 256 árnyalatból álló skálán adják meg, ahol 0 a fekete, 255 a fehér, a közöttük lévõ értékek pedig köztes árnyalatokat jelentenek. A digitális kép tehát egy pontrács. Képkezelő eljárások Végezetül néhány példa fényesség, kontraszt, küszk szöb simítás és s szűrés nagyítás és s kicsinyítés színt ntáblák, álszínek 3D képalkotk palkotás Végezetül néhány példa anizotrópia mérése konfokális mikroszkóppal 4
Polarizáció Gerjesztő fény A fény f transzverzális hullám, tehát polarizálhat lható Síkban poláros (polarizált) lt) fény Gerjesztést st követk vető relaxáci ciós folyamatok λ fluor > λ gerjesztés A fluoreszcencia polarizált molekula Poláros gerjesztő fény abszorpciós vektor emissziós vektor A polarizációfok jellemzése Polarizáci ció p = + Anizotrópia Fotoszelekció r = + 2 Előnye: az anizotrópia additív! Miről ad információt az anizotrópia? Molekuláris (mozgékonyság) mobilitás Korrekció fluoriméteres mérésnél Molekuláris méret, alak, flexibilitás Közeg fluiditása Rendparaméterek (pl. lipid kettősrétegekben, membránokban) r = G + G = HV 2G HH 5
Anizotrópia mérése konfokális mikroszkópban Fluoriméterben Átlagérték (egy populáció anizotrópiája) Sejtek esetén nehézkes és pontatlan a fényszórás zavaró hatása miatt. Konfokális mikroszkópban Egyedi sejteken mérve és csak a minta kiválasztott szeletét gerjesztve a fényszórás zavaró hatása megszűnik. Anizotrópia kép létrehozása (térbeli eloszlás)! A konfokális rendszer szükséges módosításai Polarizációs nyalábosztó polarizátor síkelforgató Kísérletes fejlesztések Polarizációs síkelforgató elhelyezése a gerjesztő fényútba Korrekció konfokális rendszerben A különböző fényutak miatt más, mint fluoriméterben. Fluoriméter Konfokális mikroszkóp Emissziós polarizációs nyalábosztó elhelyezése az emissziós fényútba Gerjesztő fény G = HV HH Gerjesztő fény G = HV HH 6