A Budai Termálkarszt Diana-Hygieiaforrásának. baktériumközösségek. Anda Dóra

A Budai Termálkarszt Diana-Hygieiaforrásának biofilmjében előforduló baktériumközösségek Környezettudományi TDK dolgozat készítette: Anda Dóra Biológus MSc, 2. évfolyam témavezető: Dr. Borsodi Andrea, docens Mikrobiológiai Tanszék EÖTVÖS LORÁND TUDOMÁNYEGYETEM TERMÉSZETTUDOMÁNYI KAR BIOLÓGIAI INTÉZET Budapest, 2014 1

Tartalomjegyzék 1. Bevezetés... 3 2. Irodalmi áttekintés... 4 2.1. A Gellért-hegy földtanának rövid ismertetése... 4 2.2. A Budai Termálkarszt (BTK) és a karsztjelenségek bemutatása... 5 2.3. A recens barlangokban élő prokarióták... 7 3. Célkitűzések... 9 4. Anyagok és módszerek... 10 4.1. Tenyésztésen alapuló közösségszerkezeti vizsgálatok... 11 4.2. Tenyésztéstől független közösségszerkezeti vizsgálatok... 14 5. Eredmények és értékelésük... 16 5.1. Tenyésztésen alapuló közösségszerkezeti vizsgálatok... 16 5.2. Tenyésztéstől független közösségszerkezeti vizsgálatok... 20 5.3. A Diana-Hygieia-forrás biofilm baktériumközösségének összehasonlítása más barlangok mikrobaközösségeivel... 23 6. Összefoglalás... 26 7. Irodalomjegyzék... 27 8. Köszönetnyilvánítás... 32 2

1. Bevezetés Hazánk karsztos területei fontos nemzeti értéket képviselnek többek között egyedülálló táji jellemzőik, természeti kincseik és tájgazdálkodási jelentőségük miatt is. A karsztos kőzetek kiváló víztározó és vízelvezető képességük révén jelentős felszín alatti vízbázisnak adnak otthont. A karsztos jelenségek mészkőben, dolomitban, gipszben, kősóban egyaránt előfordulhatnak. A kőzetek sokféleségén túl, a kőzet helyzete (fedett, fedetlen), a geográfiai helyzet és a genetikai tényezők eltérése más-más típusú karsztok kialakulását eredményezi. A felszín alatti víz által előidézett geomorfológiai jelenségek közül a karsztosodás a leginkább ismert és tanulmányozott folyamat. Az itt létrejövő barlangok kialakulásában többek között a karsztvíz kőzetoldó illetve a besodort kőzettörmelékek csiszoló hatása és a szénsavas víz vesz részt. Magyarország karszt szegénysége ellenére rendkívül változatos karsztjelenségeknek ad otthont. Hazánkban a hidrotermális karsztok közül a főleg triász fődolomitból és dachsteini mészkőből felépülő Budai Termálkarszt jelentős. A Gellért-hegy környékén fakadó források, mint, ahogy más források esetében is, jelzik a létrejöttüket befolyásoló domináns környezeti tényezőket. Ezen hévizes források a forrást tápláló áramlási rendszer nagy mélységben való felfűtődéséből származhatnak (MÁDL-SZŐNYI J. et al. 2013). A recens barlangokban élő mikroorganizmusok filogenetikai diverzitásának feltárása, a mikrobák barlangképződésben betöltött szerepe, illetve a hipogén folyamatokat befolyásoló tényezők megértése régóta foglalkoztatja a kutatókat. 3

2. Irodalmi áttekintés 2.1. A Gellért-hegy földtanának rövid ismertetése A 408 km 2 kiterjedésű Budai-hegység, melyet északról a Pilis, nyugatról a Zsámbékimedence, keletről a Duna, délről pedig a Budaörsi-medence határol, felszíni kőzetfácieseinek mintegy 53,5%-a felső triász korú fődolomit, 30%-a szintén felső triász korú dachsteini mészkő, 11,3%-a eocén nummulinás mészkő és 5,2%-a főleg negyedidőszaki édesvízi mészkő (JAKUCS L. 1994). 1. ábra. A Gellért-hegy és környezetének rétegsora (KORPÁS L. 2002) A Budai-hegységhez tartozó Gellért-hegy fő tömegét triász dolomit alkotja, melybe szervesanyag-dús agyagmárga, márga, illetve tűzköves dolomit és mészkő rétegek kerülnek. A felső eocén rétegsor mészkőanyagú konglomerátummal vagy tűzkő anyagú breccsával, homokkővel kezdődik, melynek márga mátrixa felfelé fokozatosan nő, és típusos Budai Márgába megy át. A tűzkőklasztos homokkő és a nummuliteszes mészkő (Szépvölgyi Mészkő 4

Formáció) is megjelenik. A budai márgára oligocén tardi agyag rakódott, melyet kiscelli agyag, majd törökbálinti homokkő követ. A negyedidőszakot édesvízi mészkő, lösz, lejtőtörmelék és folyóvízi kavics, homok képvisel, melyet az 1. ábra szemléltet (KORPÁS L. et al. 2002). 2.2. A Budai Termálkarszt (BTK) és a karsztjelenségek bemutatása A karszt szó jelentését már számos kutató megfogalmazta. JAKUCS L. (1971) szerint a karszt főleg és általában a mészkőnek, mint hegységet alkotó kőzetnek és a hozzákapcsolódó természeti jelenségeknek jellegzetes fejlődési állapota, formája, mely a sajátos kőzetminőségnek, a térben és időben változóan megnyilvánuló geológiai, geográfiai, klimatológiai és biológiai környezeti feltételek és okok történetének komplex hatásaként jött létre és alakul tovább. A karsztosodás pedig az a folyamat, amely a karsztfejlődés törvényszerű menetének, eseményeinek időbeli egymásra következéséből tevődik össze. A karsztjelenségek geomorfológiájáról az első tanulmányok az 1900-as évek elején jelentek meg (BÁRÁNY IK. 2011). Ezen karsztosodási jelenségeket számos hatótényező szabályozza és teszi komplexé: a víz oldó tevékenységén túl a kőzet fajtája, a tektonikus viszonyok és az éghajlati tényezők (JAKUCS L. 1971). A karsztos kőzetek a földfelszínnek a 10%-át, Magyarországon a nyílt karsztterületek 1350 km 2 -t, 1,45%-ot tesznek ki. A karsztvidékek kb. 80-90%-a mészkőkarszt (JAKUCS L. 1971). A mészkőfelszínek pusztulása során kialakuló felszín alatti karsztjelenségek legnagyobb méretű képződményei a barlangok, melyek kialakulásában a szénsavas vízoldó, illetve az ide bejutó kőzettörmelékek csiszoló hatásán túl, a kőzetfelszíneken bevonatot képező mikroorganizmusoknak is óriási szerep jut, mivel redoxi reakcióik révén aktív és passzív módon is befolyásolják a karsztokban végbemenő korróziós folyamatokat (NORTHUP, DE.- LAVOIE, KH. 2001). A mélyebb rétegekből a felszínre igyekvő természetes melegvizek gyakran különféle agresszivitású savakat (főleg kénsavat) és egyéb oldott vegyületeket is magukkal hozhatnak, amelyek így a kőzet mésztartalmát megtámadhatják és így a tiszta szénsavas melegvíz szelektív oldékonyságát leronthatják. A feltörő melegvizek kontaktzónájában átmelegedett kőzetövezetben a pórusvizekből aragonit és anhidrit rakódhat ki, és ezek az ásványok a hőhatás megszűntével térfogat nagyobbodással átalakulnak kalcittá és gipsszé. Eközben a megduzzadó, egyre terjedő anyag szétlazítja a kőzetet (JAKUCS L. 1971). 5

Fővárosunk európai viszonylatban is kiemelkedő számú természetes úton feltörő termálvízforrással rendelkezik. A Dunántúli-középhegység karbonátos víztározó rendszeréhez tartozó Budai Termálkarszt egyik megcsapolódási területe a Gellért-hegy, ahol számos forrás fakad. A Gellért-hegyi forráscsoportra települt a Rác-fürdő, a Gellért-fürdő és a Rudas-fürdő is. Az utóbbi egyik forrása a Diana-Hygieia (2. ábra). 2. ábra. A Gellért-hegy északkeleti oldala, a fürdők és a piros ponttal jelzett Diana-Hygieia-forrás (PALOTAI M. et al. 2005 után módosítva) A felszín alatti vízáramlásokat hajtó egyik fontos erő a gravitáció. Ezen áramlásokat a topográfiai szintkülönbségek tartják mozgásban. A gravitáció által befolyásolt felszín alatti áramlási rendszerek típusai a következők lehetnek: lokális, köztes és regionális áramlások. Az előbbihez köthető a felszínről induló karsztjáratok kialakulása, melyek a csapadékkal a felszín alá jutó CO 2 oldó hatása révén keletkeznek és ezekből hidegvízű források fakadnak. Az utóbbihoz a mélybeli karsztosodás köthető, mely a felszíni csapadéktól független, innen meleg források fakadnak (TÓTH J. 1963). A Budai-hegység erőteljes összetöredezettsége és tektonikai széttagoltsága ad lehetőséget arra, hogy szabad utat kapjanak a fölfelé áramló termálvizek és arra is, hogy sűrű tektonikus barlanghálózat alakulhasson ki (JAKUCS L. 1994). 6

ERŐSS, A. et al. (2010) a BTK területén végeztek hidrogeológiai vizsgálatokat, mely során a Rózsadomb és a Gellért-hegy megcsapolódási területeit tanulmányozták. A Rózsadomb területén eltérő kémiai összetételű langyos (21-29 C) és meleg vizű (50-65 C) források kerülnek felszínre, míg a Gellért-hegy esetében közel azonos hőmérsékletű (35-47 C) és kémiai összetételű források fakadnak. A Rózsadomb területén az eltérő eredetű vizek egymást erősítő tulajdonsága oldotta ki a barlangokat. A Gellért-hegy kisebb üregeiben ez a hatás nem tudott érvényesülni, ezért itt a mikroorganizmusok jelentős kőzetoldó szerepe is feltételezhető. A BTK forrásvizeinek magas radioaktivitását már a múlt század elején feljegyezték, de ennek eredetére akkor még nem volt magyarázat (PALOTAI M. et al. 2005). A BTK-ban előforduló vaskiválásokhoz köthető magas rádiumtartalommal kapcsolatban ERŐSS, A. et al. (2010) végeztek hidrogeológiai vizsgálatokat. A vaskiválások adszorpciós képességének köszönhetően bennük egyes nyomelemek (pl. As, Pb, Cr, Cu, Ni, Zn, Mo, U) feldúsulhatnak (CASANOVA, J. et al. 1999, LE GUERN, C. et al. 2003). A legelterjedtebb rádium izotóp a természetben a 226 Ra, ami az uránsorozatba tartozik. A radon a rádiumból közvetlenül alfa-bomlással keletkezik. A rádium akkumulációját egyes japán meleg vizes források vas- és mangántartalmú biofilmjeiben is megfigyelték. A baktériumsejtek felszínén arzén és más nyomelemek jelenlétét is igazolták (FUJISAWA, A.- TAZAKI, K. 2003). A St. Placidus forrás (Svájc) esetében is magas radon tartalmat mértek, melynek okaként szintén a vas-mangán-oxihidroxidok kiváló rádium rezervoárként való működését állapították meg. A körülményeknek megfelelően a mikroorganizmusok megváltoztathatják a radionuklidok kémiai jellegét, oldhatósági és szorpciós tulajdonságait, ezáltal növelhetik vagy csökkenthetik a környezetben a radionuklidok koncentrációját (GAINON, F. et al. 2007). 2.3. A recens barlangokban élő prokarióták Számos tanulmány foglalkozott az utóbbi időben a recens barlangokban élő mikroorganizmusokkal és azok lehetséges szerepével (BARTON, HA. et al. 2007, PORTER, ML. et al. 2009, PAŠIĆ, L. et al. 2010). A kénsavas barlangképződéshez és a fehér cseppkőlefolyásokhoz a kén-, vas- és mangán-oxidáló baktériumok anyagcsere folyamataik révén közvetve és közvetlenül is hozzájárulhatnak (NORTHUP, DE.-LAVOIE, KH. 2001). Barlangi környezetekből tenyésztéses módszerekkel a legnagyobb számban az Actinobacteria törzs képviselőit mutatták ki, ezen kívül Alpha-, Beta- (köztük a Thiobacillus genuszhoz 7

közelálló baktériumokat), és Gammaproteobacteria osztályokba tartozó baktériumokat vontak tenyésztésbe világszerte. A ma már sokkal elterjedtebb tenyésztéstől független diverzitáselemző molekuláris eljárások során, például klónkönyvtárak elemzésével a Proteobacteria törzs, ezen belül is a Gammaproteobacteria osztály tagjai bizonyultak dominánsnak, a klónok között nagy számban voltak jelen még az Acidobacteria, a Nitrospirae és az Actinobacteria törzsek képviselői is (NORTHUP, DE.-LAVOIE, KH. 2001, PAŠIĆ, L. et al. 2010). Az Olaszországban található Frasassi barlangrendszerben és a Mexikói Villa Luz barlangban kialakult biofilmek molekuláris biológiai vizsgálata igazolta a már említett Thiobacillus fajok jelenlétét, melyek energiát a kén- vagy a szulfid-oxidációjából nyernek, és kénsav termelésük által járulnak hozzá a barlangi karbonátos kőzetek oldásához (HOSE, LD. et al. 2000, VLASCEANU, L. et al. 2000). A bakteriális szulfát-redukció asszimilatórikus és disszimilatórikus úton is végbemehet. A szulfátot szulfiddá redukáló anaerob szulfát-redukáló baktériumok (pl. Desulfobacter, Desulfocapsa) elektrondonorként szerves savakat, alkoholokat, hidrogént, míg elektronakceptorként szulfátot használnak, mely révén energiát nyernek. A szulfát redukciójának eredményeként végül H 2 S-at képeznek. A keletkező szulfid a környezetbe kerül, és később szerves molekulák SH-csoportjaként beépülhet a baktériumsejtekbe (RABUS, R. et al. 2006). EGEMEIER, SJ. (NORTHUP, DE.-LAVOIE, KH. 2001) tanulmányaiban arról számolt be, hogy a Lower Kane karsztos barlangrendszerben (Wyoming, USA) kimutatható kénhidrogén biogén eredetű. Ugyanebben a barlangban a molekuláris biológiai módszerekkel feltárt baktériumközösségek domináns tagjai az Epsilonproteobacteria osztály szulfát-redukáló képviselői voltak (ENGEL, AS. et al. 2004). A Movile barlangban (Románia) és a már említett Frasassi barlangokban végzett tanulmányok alapján a kemolitoautotróf, kén alapú anyagcserét folytató mikrobiális közösség olyannyira meghatározó, hogy elegendő energiát tud termelni ahhoz, hogy egy komplex barlangi ökoszisztémát is fenntartson (SARBU, SM. et al. 2000). A BTK-hoz tartozó Molnár János barlang és Rudas-Török-forrásbarlang baktériumközösségeinek szerkezetét korábban már vizsgálták molekuláris klónozás és pásztázó elektronmikroszkópia segítségével (BORSODI, A. et al. 2012). Előbbiben a Firmicutes törzsbe tartozó aerob és anaerob termofil baktériumokkal, utóbbiban a Deltaproteobacteria osztály kén- és szulfát-redukáló fajaival rokon klónok voltak dominánsak. Aerob vasoxidálókkal (Acidithiobacillus ferrooxidans), illetve anaerob vas-redukálókkal (Geothermobacterium ferrireducens) rokon szekvenciákat is kimutattak, így feltételezték, 8

hogy a vizsgált barlangokban a vas és a kén aerob és anaerob transzformációja is végbemehet különböző bakteriális közösségek aktivitása révén. 3. Célkitűzések Kutatásom célja a Budai Termálkarszt terültén található Diana-Hygieia-forrás biofilm baktériumközösségének diverzitás vizsgálata volt, amihez egymással párhuzamosan alkalmaztam tenyésztésen alapuló és molekuláris biológiai módszereket. A kétféle módszer együttes alkalmazásával a forrás környékén megtelepedő és feltehetően a karsztosodási folyamatokban is résztvevő baktériumközösségek összetételének minél teljesebb körű feltárására törekedtem. Célom volt továbbá az alkalmazott módszerek hatékonyságának és érzékenységének összehasonlítása illetve a forrás biofilmjében előforduló baktériumközösségek összevetése más, hasonló környezettel rendelkező barlangok mikrobaközösségeivel. 9

4. Anyagok és módszerek Az összehasonlító mikrobiológiai vizsgálatokhoz 2012. december 6-án került sor a mintavételre a BTK Diana-Hygieia-forrásrendszerben képződött biofilmből. Steril spatula segítségével a biofilm rétegből kaparékot vettünk, melyet egy steril, zárható üvegpalackba tettünk (3. ábra), és feltöltöttük az ottani forrásvízzel, így reprezentálva a mintavételi környezetet. A biofilm mintát a 4-6 órán belül végzett laboratóriumi feldolgozásig 6-8 C-on tároltuk. 3. ábra. A biofilm minta A forrásvíz kémiai paraméterinek mérését Barkács Katalin (ELTE TTK Kémiai Intézet) végezte, melyek a következők voltak: Hőmérséklet: 31,40 C ph: 6,88 O 2 : Na + : Ca 2+ : Mg 2+ : Fe 2+ : HCO 3 - : Cl - : SO 4 2- : 2,47 mg/l 128±2 mg/l 180±2 mg/l 57,3±2 mg/l 0,09±5 mg/l 520±1 mg/l 142±2 mg/l 332±2 ml/l 1. táblázat. Diana-Hygieia-forrás kémiai paramétereinek mérési eredményei 10

4.1. Tenyésztésen alapuló közösségszerkezeti vizsgálatok A biofilm minták laboratóriumi feldolgozásához steril víz felhasználásával tízes léptékű hígítási sort készítettem, majd ezek tagjaiból kétféle táptalajra 0,1 ml-0,1 ml-t szélesztettem. Az általam használt táptalajok a következők voltak: 1. R2A agar (DSMZ Medium 830, www.dsmz.de) Élesztőkivonat Proteóz pepton Kazein hidrolizátum Glükóz Oldható keményítő K 2 HPO 4 MgSO 4 x 7 H 2 O Agar Desztillált víz 0,50 g 0,50 g 0,50 g 0,50 g 0,50 g 0,30 g 0,05 g 20,00 g 1000,00 ml ph 7,2 2. Sphaerotilus-Leptothrix vasszulfát-tartalmú agar (DSMZ Medium 803, www.dsmz.de) Élesztőkivonat 1,00 g Pepton 1,50 g MgSO 4 x 7 H 2 O 0,20 g CaCl 2 0,05g FeNH 4 -citrát 0,50 g MnSO 4 x H 2 O 0,05 g FeSO 4 0,05 g Agar 20,00 g Desztillált víz 1000,00 ml ph 7,0-7,1 A már kifejlődött különálló telepeket a táplemezekkel azonos összetételű ferde agarra izoláltam (két hetes 28 C-os inkubáció után). 11

A baktériumtörzsek genotípusos vizsgálata során DNS-t izoláltam a tiszta tenyészetekből steril üveggyöngyös (Ø kb. 0,1 mm) fizikai feltárással, melynek során először 600 µl-es Eppendorf-csövekbe kb. 200 µl steril üveggyöngyöt tettem, majd steril dh 2 O hozzáadása után (100-100 µl) egy-egy oltókacsnyi biomasszát szuszpendáltam el a csövekben. A sejteket sejtmalommal tártam fel (2 perc, 30 Hz-en), majd az elegyet centrifugáltam (1 perc, 10000 rpm), és a DNS-t PCR készülékben 5 percig 99 C-on denaturáltam. A mintákat egy végső vortexelés és centrifugálás után (3 perc, 10000 rpm) - 22 C-on tároltam. A templát DNS ellenőrzésének céljából agaróz gélelektroforézist használtam. Először 1%-os agaróz gélt (80 ml 10xTBE puffer, valamint 0,80 g agaróz) készítettem, amelybe DNSbe interkalálódó festéket tettem. 3 µl töltőpuffert szuszpendálam fel 5 µl DNS mintával, majd a már szilárd gél zsebeibe töltöttem. A legelső zsebbe 3 µl hármas jelzésű molekulasúly markert mértem, így a DNS hossza megbecsülhetővé vált. A gélt 1xTBE pufferben 20 percig 100 mv-on futtattam. A csíkok detektálását UV fényben végeztem, mivel az interkalálódó festék a DNS molekula nagy árkába kötődve így válik láthatóvá. A baktériumtörzsekből kinyert DNS-ből a 16S rrns-t kódoló régiót polimeráz láncreakcióval (PCR) szaporítottam fel, 27f és 1401r Bacteria specifikus primer pár segítségével. A PCR premix összetétele a következő volt 50 µl térfogat/minta esetén: PCR puffer 5µl MgCl 2 4µl dntp 10µl Forward primer 0,5µl Reverz primer 0,5µl dh 2 O 28µl Taq polimeráz 1µl DNS templát 1µl 12

A PCR hőprofilja pedig a következő volt egy-egy ciklusra (összesen 32 ciklus): Primer denaturáció 95 C 5 perc Denaturáció 94 C 30 másodperc Anneláció 52 C 30 másodperc Extenzió 72 C 1 perc Végső extenzió 72 C 10 perc Hűtés 4 C A PCR termékek jelenlétét ismét agaróz gélelektroforézissel ellenőriztem, a fent leírt módszer szerint. Ezt követően a termékek ARDRA (Amplified Ribosomal DNA Restriction Analysis) mintázatainak vizsgálata következett. A felszaporított 16S rdns szakaszokat MspI és BsuRI restrikciós endonukleáz enzimekkel hasítottam. ARDRA premix összetétele a következő volt (minta/enzim): Puffer 2,5 µl dh 2 O 14,2 µl Enzim 0,3 µl A premixet PCR csövekbe mértem szét, melybe a PCR termékek is belekerültek, ezt vortexeltem, és a mintákat 3 órán keresztül 37 C-os vízfürdőben inkubáltam. Az emésztett DNS termékek detektálását agaróz gélelektroforézissel végeztem. 2%-os agaróz gélt használtam, melybe itt is interkalálódó festéket tettem. A 25 µl-es PCR termékekhez 5 µl töltőpuffert mértem, és ezt töltöttem a szilárd gél zsebeibe. A középső zsebekbe 5 µl 100-as jelzésű molekulasúly markert tettem. A gél futtatása 1xTBE oldatban 80 mv-on 80 percig történt. A DNS szakaszok detektálását UV fényben végeztem el, majd az eredményekről fényképet készítettem. Az eltérő hasítási mintázattal rendelkező ARDRA csoportokat CorelDRAW szoftver felhasználásával választottam szét egymástól. Azon törzsek PCR termékét, melyek egyedi hasítási mintázattal rendelkeztek EZ-10 Spin Column PCR Products Purification Kit (Bio Basic Inc.) segítségével megtisztítottam a gyártó utasításait követve. A tisztított PCR termékeket agaróz gélelektroforézissel detektáltam. A szekvenáló reakciót az LGC Genomics (Berlin, Németország) végezte. A kromatogramokat manuálisan korrigáltam a Chromas program (Technelysium Pty Ltd, Tewantin, Ausztrália) segítségével. A szekvenciák filogenetikai csoportosítását az EzTaxon (http://eztaxon-e.ezbiocloud.net) és az NCBI internetes adatbázisok segítségével végeztem. A filogenetikai analízist a MEGA 5.0 szoftverrel készítettem (TAMURA, K. et al. 2011). 13

4.2. Tenyésztéstől független közösségszerkezeti vizsgálatok A közösségi DNS-t DNS izoláló kit segítségével (Ultra Clean Soil DNA Isolation Kit, Mo-Bio), a protokollnak megfelelően vontam ki, majd kék-fehér szelekción (SAMBROOK, J.- RUSSELL, DW. 2001) alapuló módszerrel klónkönyvtárat hoztam létre. Azokat a telepeket tudtam használni a továbbiakban, melyek vektorral transzformáltak voltak, tehát ampicillin tartalmú táptalajon növekedtek, és az inzert DNS-t tartalmazták, így X-gal jelenlétében fehér színűek voltak. A 16S rdns egy szakaszát 27f és 1401r primerekkel PCR során felsokszoroztam, ekkor a Taq DNS polimeráz túlnyúló adenin nukleotidokat tesz az amplikonokra terminális transzferáz aktivitása miatt, így a PCR termékek alkalmassá válnak a TA-klónozó vektorokba történő ligálásra. A ligálás után a PCR termékeket 4 C-on 24 órán át inkubáltam, majd E.coli JM109 sejtekbe transzformáltam. A PCR csövek tartalmát (2-2 µl), illetve a kompetens sejteket 5 percig jégre tettem, ebből 50 µl-t a ligálást tartalmazó csövekbe mértem, majd ezt is jégre tettem 20 percig. Ezután következett a 45 másodpercnyi hősokk 42 C-os vízfürdőben, majd ismét jégre tettem a mintákat 2 percig. A csövekbe 950 µl SOC médiumot pipettáztam, majd 37 C-on 1,5 óráig inkubáltam. 100 µl-eket szélesztettem LB tápagarra, ami XGal-lal és IPTG-vel kezelt ampicillint tartalmazott. Ezt is 37 C-os inkubáció követte 24 órán át. A fehér telepeket steril fogpiszkálóval átpontoztam LB tápagarra, és ismét 24 órán át inkubáltam. A klónokat tartalmazó telepek feltárása 30-30 µl HPLC tisztaságú vízben történt, 5 perces, 98 C-os inkubálással 96 lyukú mikrotiter lemezen (PCR plate). A lemezeket 3 percig 5000 rpm-en centrifugáltam a sejttörmelékek kiülepítésének céljából és -20 C-on tároltam a feldolgozásig. Az inzert szekvencia kinyerése céljából a DNS izolátumokból két PCR-t végeztem. Az első PCR-t M13 primerekkel végeztem (vektorra specifikus), míg a nested PCR-t 27f és 1401r primerekkel. A PCR premix összetétele a következő volt 25 µl térfogat/minta esetén: PCR puffer 2,5µl MgCl 2 2µl dntp 5µl Forward primer 0,25µl Reverz primer 0,25µl Taq polimeráz 0,5µl DNS templát 0,5µl 14

Mindkét PCR hőprofilja, illetve a PCR termékek restrikciós enzimekkel való hasítása a tenyésztéses közösségszerkezeti vizsgálatoknál leírtak szerint történt. ARDRA premix összetétele a következő volt 20 µl térfogat/minta esetén: Puffer 2µl dh 2 O 7,76µl Enzim 0,24µl Templát 10µl Az egyes hasítási mintázatok csoportosítására és a szekvenciák elemzésére a tenyésztéses vizsgálatoknál már leírtak szerint került sor. 15

5. Eredményekésértékelésük A2012decemberébenaDiana-Hygieia-forásnálgyűjtötbiofilmmintamikrobiológiai vizsgálatasoránkétféletáptalajfelhasználásával47baktériumtörzsetvontamtenyésztésbe, továbbálétrehoztamésfeldolgoztamegy192tagúmolekulárisklónkönyvtárat. 5.1. Tenyésztésenalapulóközöségszerkezetivizsgálatok A47tenyészetbőlavizsgálatoksorán36-otsikerülttisztatenyészetetformájában fenntartani.abaktériumtörzsekbőlizoláltdns16srrns-tkódolórégiójánakfelszaporítása után,arestrikcióshasítássalkapotsávmintázatokalapján23ardracsoportotkülönítetem el. Az ARDRAcsoportokegy-egyreprezentánsábólszármazó DNS-ekbázisorendjének elemzéseutánkerültsorabaktériumtörzsekazonosítására. Azazonosítottörzsek9%-nak bázisorendjekevesebb,mint97%-banegyezetmegazeztaxonadatbázisbanszereplőfajok típustörzseinekbázisorendjével,amialapjánfeltételezhető,hogyezekazáltalamizolált baktériumtörzsek új baktériumfajok képviselői lehetnek. A tenyésztésen alapuló vizsgálatokkal a következő taxonómiai csoportok képviselőit sikerült azonosítanom: Actinobacteria,Firmicutes,Alphaproteobacteria,BetaproteobacteriaésGammaproteobacteria (4.ábra). 3% 8% 8% 64% 17% Actinobacteria Alphaproteobacteria Betaproteobacteria Gammaproteobacteria Firmicutes 4.ábra.ADiana-Hygieia-forásbólszármazóbiofilmbőltenyésztésbevontbaktériumtörzseknagyobb taxonómiaicsoportok(filogenetikaitörzsekésaproteobacteriaesetébenosztályok)szerinti megoszlása 16

A filogenetikai törzsek szintjén a Firmicutes törzs képviselői kerültek elő legnagyobb arányban (64%), ezen belül is a Bacillus (43%) nemzetségek fajai voltak leggyakoribbak. Ezt követték a Bacillus nemzetséggel közel rokon nemzetségek Ammoniphilus (39%), majd a Paenibacillus (17%) képviselői. Az általam kapott eredményekkel ellentétben egyéb barlangi környezetekből tenyésztésbe vont baktériumtörzsek esetében az Actinobacteria törzs képviselőinek domináns előfordulása volt jellemző (BARTON, HA. et al. 2007, PORTER, ML. et al. 2009). Ugyanakkor eredményeimmel megegyezően más barlangi biofilmekből is tenyésztésbe vonták az Alphaproteobacteria, a Betaproteobacteria és a Gammaproteobacteria osztályok képviselőit (BARTON, HA. et al. 2007, PORTER, ML. et al. 2009). Az EzTaxon program segítségével meghatározott baktériumtörzsek nemzetségek és a tenyésztéshez használt táptalajok szerinti megoszlását az 5. ábra szemlélteti. Az ábráról látható, hogy az alkalmazott táptalajok eltérő szelektivitással rendelkeztek. A vasszulfáttartalmú tápagar alkalmazásával nagyobb taxonómiai diverzitást tártam fel, hiszen ezen a táptalajon 8, míg az R2A táptalajon csak 5 nemzetség képviselőit sikerült tenyésztésbe vonni. 25 Baktériumtörzsek száma 20 15 10 5 0 DHB-V DHB-R A baktériumtörzsek táptalajok szerinti csoportosítása Pseudomonas Paenibacillus Nocardioides Ensifer Curvibacter Cupriavidus Bacillus Ammoniphilus Aminobacter 5. ábra. A Diana-Hygieia-forrásból származó biofilmből tenyésztésbe vont baktériumtörzsek nemzetségek szerinti megoszlása a tenyésztéshez használt táptalajok függvényében (DHB= Diana-Hygieia biofilm; R=R2A és V=Vasszulfát-tartalmú táptalajok) 17

Az R2A agar jellemzője, hogy a barlangi környezetekhez hasonlóan szerves tápanyagokban szegény, így lehetőséget nyújt a lassú növekedésű baktériumok kitenyésztésére is, amelyeket gazdagabb táptalajon a gyorsan növő fajok képviselői elnyomnának. A tenyésztéses vizsgálatokhoz azért választottam a vasszulfát-tartalmú agart, mert a korábbi vizsgálatok eredményei alapján a vas bakteriális oxidációja feltehetően fontos szerepet játszik a BTK barlangképződési folyamataiban. A Rudas-fürdő Török-forrás biofilmjének elektronmikroszkópos vizsgálatával BORSODI, A. et al. (2012) egyes fonalas baktériumok felszínén vastartalmú vegyületeket tartalmazó gömböket mutattak ki. Ezek a biofilm alkotó vasbaktériumok a ferro-ionokat ferri-ionokká oxidálják, és sejtfelszínükön felhalmozzák. Az 5. ábrán az is látható, hogy az alkalmazott táptalajok segítségével a kifejezetten vasoxidáló baktériumfajok képviselőit nem sikerült tenyésztésbe vonni. A vasszulfát-tartalmú agarról legnagyobb számban az ellenálló endospórát képző Bacillus nemzetség képviselői kerültek elő, melyeknek nagy többsége aerob heterotróf kemoorganotróf anyagcserét folytat. Az elsősorban talajokban és vizekben előforduló Bacillus fajok endospóráik révén a kedvezőtlen környezeti feltételek eltűrésére képesek, viszont könnyen alkalmazkodnak a laboratóriumi tenyészfeltételekhez. A Bacillus nemzetség képviselői közül többek között a Bacillus oceanisediminis (ZHANG, J. et al. 2010) és a Bacillus beringensis (YU, Y. et al. 2011) fajok képviselőit azonosítottam, melyek közül előbbit a Dél-kínai-tenger üledékéből, utóbbit a Bering-tengerből írták le. A szintén a Firmicutes törzshöz tartozó aerob, endospórát képző Ammoniphilus oxalaticus faj képviselőit is nagy számban izoláltam, főként az R2A táptalajról. A növekedésükhöz energiaforrásként nagy koncentrációjú ammónium- és oxalát-ionokat igénylő baktériumfaj típustörzsét sóska rizoszférából és korhadó fákból izolálták (ZAITSEV, GM. et al. 1998). A meghatározott törzseket és a velük legközelebbi rokonságban álló típustörzseket a neighbour-joining módszerrel készült filogenetikai törzsfa (6. ábra) szemlélteti. 18

6. ábra. A Diana-Hygieia-forrásból származó biofilmből tenyésztésbe vont baktériumtörzsek és a velük legközelebbi filogenetikai rokonságban lévő baktériumfajok neighbour-joining módszerrel készült filogenetikai törzsfája feltüntetve a típustörzsek reprezentánsainak számaival és a táptalaj típusokkal (R=R2A és V=Vasszulfát-tartalmú táptalaj) 19

5.2. Tenyésztéstől független közösségszerkezeti vizsgálatok A 192 molekuláris klónt restrikciós enzimekkel végzett hasításuk, majd agaróz gélelektroforézissel kapott mintázatuk alapján 119 ARDRA csoportba soroltam, melyből 20 major (kettőnél nagyobb taglétszámú) és 99 minor csoportot különítettem el. Közülük 124 molekuláris klón bázissorrend elemzésére került sor, melyeket a következő taxonómiai csoportok képviselőiként azonosítottam: Alphaproteobacteria, Betaproteobacteria, Gammaproteobacteria, Deltaproteobacteria, Chloroflexi, Ignavibacteriae, Nitrospirae, Firmicutes és Actinobacteria (7. ábra). 7. ábra. A Diana-Hygieia-forrás biofilmjéből származó 16S rdns alapú klónkönyvtár feldolgozásának eredményeként kapott filogenetikai csoportok százalékos megoszlása A tenyésztéstől független vizsgálat eredményeképpen a vizsgált minta diverzebb mikrobaközösségről árulkodott. A molekuláris klónozásos módszer alkalmazásával számos, eddig tenyésztésbe még nem vont, illetve általam tenyésztéssel nem azonosított taxon jelenlétét igazoltam a Diana-Hygieia-forrás biofilm baktériumközösségében. A biofilm mintában legnagyobb arányban a Deltaproteobacteria osztály (28%) képviselői voltak jelen, ezt a Nitrospirae törzs (22%) követte. A Firmicutes törzs képviselői a molekuláris klónok között jóval kisebb arányban (17%) képviseltették magukat, mint a tenyészetekben (64%). A tenyésztéses vizsgálatok során kapott második legnagyobb csoport a Gammaproteobacteria volt (17%), a klónkönyvtár esetén eddig egyetlen képviselőjét azonosítottam a denitrifikációra is képes kén-oxidáló Thiohalomonas denitrificans fajt, melyet sós mocsári üledékből írtak le (SOROKIN, DY. et al. 2007). A Chlorobi törzshöz tartozó 20

Ignavibacterium album fajjal rokon klónok jelenlétét a BTK Rudas-fürdő Török-forrásában és a Molnár János barlangban is viszonylag nagy gyakorisággal mutatták ki (BORSODI, A. et al. 2012). A Diana-Hygieia-forrásban az Ignavibacterium filogenetikai csoportnak eddig szintén egyetlen képviselőjét azonosítottam. Ezt a mérsékelten termofil, anaerob baktériumfajt egy japán hévforrásból kifejlődött bevonatból írták le (IINO, T. et al. 2010). A már leírt baktériumfajokkal legnagyobb szekvencia egyezést mutató molekuláris klónok különböző taxonómiai csoportokba való besorolását az 2. táblázat foglalja össze. A DHB klónkönyvtárban a leggyakoribb Deltaproteobacteria osztályba tartozó klónok a legnagyobb szekvencia egyezést a vas-redukáló Desulfuromonas alkaliphilus és a termofil szulfát-redukáló Desulfosoma profundi baktériumfajokkal mutatták. Utóbbi egy szigorúan anaerob anyagcserét folytató termofil baktérium, melyet egy franciaországi geotermikus forrásból írtak le (GRÉGOIRE, P. et al. 2012). A korábbi vizsgálatok eredményei alapján a Rudas-fürdő Török-forrásban a deltaproteobaktériumok között szintén gyakoriak voltak a Desulfuromonas, a Geobacter és a Geothermobacter fajok képviselői (BORSODI, A. et al. 2012). A Geobacter fajokat tengeri, forrásvízi élőhelyek üledékeiből izolálták, gyakoriak a felszínalatti vizekben, így fontos szereplői a biofilmekben is zajló vasvegyületek redukciós átalakulásának. Ezek a baktériumok energiatermelésük során növelik a környezet redukált vas koncentrációját, így elősegíthetik a vasat és ként tartalmazó szulfidásványok, pl. a biogén pirit képződését (COATES, JD. et al. 1996). A DHB klónok között a Deltaproteobacteria osztályba tartozó Geobacter sulfurreducens fajjal rokon szekvenciákat is sikerült azonosítani (2. táblázat). Ezt a hidrogén és acetát oxidálására képes disszimilatórikus vas-redukáló baktériumot korábban számos felszín alatti környezetből kimutatták (METHE, BA. et al. 2003). Ez a sugárrezisztens baktérium radioaktív fémek bioremediációjában való tevékenysége, áramtermelő képessége, szolubilis fémekkel való csapadék képzése (pl. uránnal) és indirekt mechanizmuson keresztüli technécium redukciója miatt is jelentős (LLOYD, JR. et al. 2002). 21

2. táblázat. A leírt baktériumfajokkal legnagyobb szekvencia egyezést mutató molekuláris klónok különböző taxonómiai csoportokba való besorolása Reprezentatív klónok Klónok száma Hasonlóság (%) Legközelebbi publikált faj Forrás Hasonlóság (%) Legközelebbi leírt faj Actinobacteria DHB1-E1 1 97% (907/931) tenyésztésbe nem vont baktérium klón HDB SIPO427 (HM187085) Alphaproteobacteria DHB1-D9 1 97% (903/928) tenyésztésbe nem vont baktérium klón HDB SIOZ407 (HM186746) Betaproteobacteria DHB1-A9 1 99% (621/626) tenyésztésbe nem vont baktérium klón KZNMV-30-B39 (FJ712609) DHB1-H8 3 99% (811/821) tenyésztésbe nem vont baktérium klón KZNMV-30-B39 (FJ712609) DHB1-C7 1 96% (916/955) tenyésztésbe nem vont baktérium klón KPF200711-146 (EU881106) DHB2-D4 2 99% (926/936) tenyésztésbe nem vont baktérium klón KZNMV-30-B39 (FJ712609) Deltaproteobacteria DHB1-A2 1 97% (804/825) tenyésztésbe nem vont baktérium klón BacC-s 063 (EU335205) DHB1-A3 2 98% (507/520) tenyésztésbe nem vont baktérium klón HDB SIOT1045 (HM186569) DHB1-H4 1 97% (853/877) tenyésztésbe nem vont baktérium klón p26f24ok (FJ478897) Gammaproteobacteria DHB1-G3 1 90% (761/842) tenyésztésbe nem vont baktérium klón Nit5A0622 503 (FJ628257) Nitrospirae DHB1-D4 1 99% (896/904) tenyésztésbe nem vont baktérium klón CV82 (DQ499318) DHB1-F5 2 99% (899/911) tenyésztésbe nem vont baktérium klón CV82 (DQ499318) Hanford környéki (Washinton, USA) geol. talaj alatti telített zóna Hanford környéki (Washinton, USA) geol. talaj alatti telített zóna Földközi-tenger közeli Kazan iszapvulkán Földközi-tenger közeli Kazan iszapvulkán erdei talaj Földközi-tenger közeli Kazan iszapvulkán 94% (877/932) Gaiella occulta (JF423906) 82% (709/866) Rhodospirillum oryzae (AM901295) 94% (586/626) 93% (760/821) Propionivibrio limicola (AJ307983) Azovibrio restrictus (AF011346) 90% (860/955) Sterolibacterium denitrificans (AJ306683) 92% (860/936) Zoogloea caeni (DQ413148) C telített talaj aggregátum 86% (710/823) Geobacter sulfurreducens (AE017180) Hanford környéki (Washinton, USA) 79% (407/513) geol. talaj alatti telített zóna Desulfovibrio vulgaris (AE017285) prérin található magas fű 85% (741/875) Geobacter sulfurreducens (AE017180) anoxikus fjord sós vize (Nitinat Lake) 91% (765/839) Thiohalomonas denitrificans (EF117909) mikrobiális biofilm 95% (863/904) mikrobiális biofilm 95% (863/911) Nitrospira calida (HM485589) Nitrospira calida (HM485589) 22

A DHB klónkönyvtárból nagy arányban sikerült kimutatni a Nitrospirae törzshöz tartozó termofil, nitrit-oxidáló Nitrospira calida baktériumfajjal rokon klónszekvenciákat. Ezt a fajt szintén egy geotermikus hőforrásból írták le (LEBEDEVA, EV. et al. 2011). A geotermikus környezetekben a Nitrospirae törzs képviselőinek dominanciájáról először MARKS, CR. et al. (2012) számoltak be a Hot Springs Nemzeti Park artézi forrásának biofilmjeiben. 5.3. A Diana-Hygieia-forrás biofilm baktériumközösségének összehasonlítása más barlangok mikrobaközösségeivel Eredményeimet más barlangi környezetekben végzett tenyésztéstől független molekuláris vizsgálatokkal (PORTER, ML. et al. 2009, VLASCEANU, L. et al. 2000, BORSODI, A. et al. 2012) összehasonlítva megállapítható, hogy a barlangi biofilmekben a Proteobacteria törzs tagjai fordultak elő a leggyakrabban és a legnagyobb arányban (3. táblázat). A Proteobacteria törzsön belül a DHB klónkönyvtárra is jellemző Deltaproteobacteria osztály dominanciát (28%) karsztos barlangok biofilmjeiből először a Rudas-fürdő Törökforrásbarlangnál (RTB; 44%) írták le (BORSODI, A. et al. 2012). Más barlangokban gyakran (pl. Frasassi barlangrendszer, Olaszország; Parsarjeva jama barlang, Szlovénia; Tito Bustillo barlang, Spanyolország és Wind Cave barlang, Dél-Dakota, USA) az általánosan előforduló Gammaproteobacteria osztály képviselőinek domináns jelenlétét mutatták ki. Az azonos molekuláris módszerekkel vizsgált BTK barlangi biofilmek (DHB, RTB és Molnár János barlang, MJB) esetében a Gammaproteobacteria osztályba tartozó klónok relatív kis részarányban (DHB 1%; MJB 4% és RTB 8%) voltak jelen a közel megegyező taglétszámú klónkönyvtárakban. Egyes romániai, olaszországi és egyesült államokbeli kénsavas alapú hipogén barlangképződéseknél a mikrobiális biofilmekben az Epsilon- és a Gammaproteobacteria osztályba tartozó, szulfid-oxidáló kemolitotróf fajokba sorolt molekuláris klónok alkották a többséget. A DHB klónok között a számos esetben (pl. Movile Cave barlang, Románia; Frasassi barlangrendszer, Olaszország; Cesspool Cave barlang, Virginia, USA; Lower Kane Cave barlang, Wyoming, USA) szintén jellemző Epsilonproteobacteria osztály tagjait eddig még nem tudtam kimutatni. Egy kivételtől eltekintve (Tito Bustillo barlang, Spanyolország) a Betaproteobacteria osztály képviselői minden barlangi környezetben előfordultak. Az osztályhoz tartozó klónok között gyakran fordultak elő a kén-oxidáló Thiobacillus nemzetség képviselői. 23

3. táblázat. A Diana-Hygieia-forrásból származó biofilm baktériumközösség genetikai diverzitásának összehasonlítása más barlangok mikrobaközösségeivel BTK, Diana-Hygieia-forrás BTK, Molnár János barlang BTK, Rudas-fürdő, Török-forrás Movile barlang, Románia Aquificae + Thermodesulfobacteria + + Chloroflexi + + + + + + + Nitrospirae + + + + + + Cyanobacteria + + Chlorobi + + + + Alphaproteobacteria + + + + + + + Betaproteobacteria + + + + + + + + + + Gammaproteobacteria + + + + + + + + + + + Deltaproteobacteria + + + + + + + + + Epsilonproteobacteria + + + + Firmicutes + + + + + + Actinobacteria + + + + + + + + Planctomycetes + + + + + + + Acidobacteria + + + + + + Bacteroidetes + + + + + + + + + Verrucomicrobia + + + + + + + Gemmatimonadetes + + Frasassi barlangrendszer, Olaszország Lower Kane Cave, USA Cesspool barlang, USA Parsarjeva jama barlang, Szlovénia Altamira barlang, Spanyolország Tito Bustillo barlang, Spanyolország Wind Cave barlang, USA 24

A Nitrospirae törzs tagjai az összehasonlított 11 barlangi környezet közül 6 helyen voltak megtalálhatóak. A RTB és a MJB esetében a törzs képviselői elenyészőnek bizonyultak, kevesebb, mint 10%-ban képviseltették magukat, míg a DHB-ben a második legnagyobb csoportot adták (22%). A szlovéniai Parsarjeva jama barlang klónkönyvtárában a Nitrospirae törzs tagjai szintén jelentős arányban fordultak elő (15,2%). A MJB-ban legnagyobb arányban a Firmicutes törzs fordult elő (40%), ami a DHB klónok esetében csak 17% volt. A Firmicutes törzs (kis GC tartalmú Gram-pozitív baktériumok) nagyarányú képviseletét karsztos barlangok között először szintén a MJB esetében írták le (BORSODI, A. et al. 2012). Az Actinobacteria törzs (nagy GC tartalmú Grampozitív baktériumok) tagjai a BTK mintákban közel azonos részarányban (DHB 15%; MJB 11% és RTB 12%) fordultak elő. Számos más barlanghoz (Altamira barlang és Tito Bustillo barlang, Spanyolország; Parsarjeva jama barlang, Szlovénia; Wind Cave barlang, Dél-Dakota, USA) hasonlóan valamennyi BTK mintában (DHB, MJB és RTB) előfordultak a Chloroflexi törzs (zöld nemkén baktériumok) képviselői is. A BTK-hoz tartozó RTB és MJB klónkönyvtárak vizsgálata a DHB-hez képest diverzebb közösséget mutatott. Az eltérő bakteriális közösségszerkezet kialakulásához feltehetően a Diana-Hygieia-forrás sajátos fizikai-kémiai tulajdonságai, például a biofilmben megfigyelhető vaskiváláshoz köthető magas rádiumtartalom is hozzájárulhat. Ennek igazolásához azonban még további vizsgálatok szükségesek. 25

6. Összefoglalás A Budai Termálkarszthoz tartozó Diana-Hygieia-forrás biofilmjéből tenyésztésen alapuló és tenyésztéstől független molekuláris módszerekkel végeztem filogenetikai diverzitáselemzést. A tenyésztéses vizsgálat során szerves tápanyagban szegény és vasszulfát-tartalmú táptalaj felhasználásával összesen 47 baktériumtörzset izoláltam. A baktériumtörzseket a 16S rrns gén bázissorrend elemzése alapján a Proteobacteria, a Firmicutes és az Actinobacteria törzsek 9 nemzetségének képviselőiként azonosítottam. A tenyésztésen alapuló vizsgálatok eredményei a Firmicutes (64%) dominanciával eltértek az eddigi barlangi környezetekből izolált elsősorban Actinobacteria és Proteobacteria törzsek dominanciájától. A szintén 16S rrns gén alapú molekuláris klónozással a Proteobacteria, az Actinobacteria, a Nitrospirae, a Firmicutes, a Chlorobi és Chloroflexi törzsek képviselőinek jelenlétét igazoltam. A molekuláris klónok a legnagyobb szekvencia egyezést hasonló környezetekből származó (pl. iszapvulkánok, geotermikus hőforrások) tenyésztésbe nem vont szekvenciákkal mutatták. A BTK Molnár János barlang Firmicutes és Rudas-Török-forrás Deltaproteobacteria dominanciája mellett a Diana-Hygieia-forrás biofilm klónkönyvtárának a Nitrospirae törzs nagyarányú képviselete látszik, mely az első két forrásbarlang esetében elenyészőnek bizonyult. A Diana-Hygieia-forrásban észlelt sajátos bakteriális közösségszerkezet okának felderítésére és az itt előforduló kemolitotróf vas (III)-redukálók, termofil nitrit-oxidálók és szulfát-redukáló baktériumok szerepének megismerésére még további vizsgálatok szükségesek. 26

7. Irodalomjegyzék BÁRÁNY IK. 2011: A karsztökológiai kutatások jelentősége napjainkban.- Karsztfejlődés. 16. pp. 39-50. BARTON, HA.-TAYLOR, NM.-KREATE, MP.-SPRINGER, AC.-OEHRLE, SA.-BERTOG, JL. 2007: The Impact of host rock geochemistry on bacterial community structure in oligotrophic cave environments.- Int. J. Speleol. 36. pp. 93-104. BORSODI, AK.-KNÁB, M.-KRETT, G.-MAKK, J.-MÁRIALIGETI, K.-ERŐSS, A.- MÁDL-SZŐNYI, J. 2012: Biofilm bacterial communities inhabiting the cave walls of the Buda Thermal Karst System, Hungary.- Geomicrobiology Journal. 29 (7). pp. 611-627. CASANOVA, J.-BODÉNAN, F.-NÉGREL, P.-AZAROUAL, M. 1999: Microbial control on the precipitacion of modern ferrihydrite and carbonate deposits from the Cézallier hydrothermal springs (Massif Central, France).- Sediment. Geol. 126. pp. 125-145. COATES, JD.-PHILLIPS, EJ.-LONERGAN, DJ.-JENTER, H.-LOVLEY, DR. 1996: Isolation of Geobacter species from diverse sedimentary environments.- Appl. Environ. Microbiol. 62. pp. 1531-1536. ENGEL, AS.-PORTER, ML.-KINKLE, BK.-KANE, TC. 2001: Ecological assessment and geological significance of microbial communities from Cesspool Cave, Virginia. Geomicrobiol. J. 18. pp. 259-274. ENGEL, AS.-STERN, LA.-BENNETT, PC. 2004: Microbial contributions to cave formation: New insights into sulfuric acid speleogenesis.- Geology. 32. pp. 369 372. ERŐSS, A. 2010: Characterization of fluids and evaluation of their effects on karst development at the Rózsadomb and Gellért Hill, Buda Thermal Karst, Hungary.- Doktori disszertáció, ELTE. 171p. ERŐSS, A.-MÁDL-SZŐNYI, J.-SURBECK, H.-HORVÁTH, Á.-GOLDSCHEIDER, N.- CSOMA, AÉ. 2012: Radionuclides as natural tracers for the characterization of fluids in regional discharge areas, Buda Thermal Karst, Hungary.- Journal of Hydrology. 426-427. pp. 124-137. 27

FUJISAWA, A.-TAZAKI, K. 2003: The radioactive microbial mats In case of Misasa hot springs in Tottori Prefecture.- In: Kamata N, editor. Proceedings: International Symposium of the Kanazawa University 21st Century COE Program Vol. 1. Kanazawa University, Kanazawa, Japan. pp. 328-331. GAINON, F.-GOLDSCHEIDER, N.-SURBECK, H. 2007: Conceptual model for the origin of high radon levels in spring waters the example of the St. Placidus spring, Grisons, Swiss Alps.- Swiss Journal of Geosciences/Eclogae Geologicae Helvetiae. 100 (2). pp. 251-262. GRÉGOIRE, P.-FARDEAU, ML.-GUASCO, S.-LAGIÈRE, J.-CAMBAR, J.-MICHOTEY, V. 2012: Desulfosoma profundi sp. nov., a thermophilic sulfate-reducing bacterium isolated from a deep terrestrial geothermal spring in France.- Antonie Van Leeuwenhoek. 101 (3). pp. 595-602. HOSE, LD.-PALMER, AN-PALMER, MV.-NORTHUP, DE.-BOSTON, PJ.-DUCHENE, HR. 2000: Microbiology and geochemistry in a hydrogen-sulphide rich karst environment.- Chem. Geol. 169. pp. 399 423. IINO, T.-MORI K.-UCHINO, Y.-NAKAGAWA, T.-HARAYAMA, S.-SUZUKI, K. 2010: Ignavibacterium album gen. nov., sp. nov., a moderately thermophilic anaerobic bacterium isolated from microbial mats at a terrestrial hot spring and proposal of Ignavibacteria classis nov., for a novel lineage at the periphery of green sulfur bacteria.- Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 60. pp. 1376-1382. JAKUCS L. 1971: A karsztok morfogenetikája. A karsztfejlődés varienciái.- Akadémiai Kiadó, Budapest. 312 p. JAKUCS L. 1994: A Budai-hegység hidrotermális karsztja.- Földr. Ért. 43. pp. 235-246. KORPÁS L.-FODOR L.- MAGYARI Á.- DÉNES GY.-ORAVECZ J. 2002: A Gellért-hegy földtana, karszt-és szerkezetfejlődése.- Karszt és Barlang. 1-2. pp. 57-93. LE GUERN, C.-BARANGER, P.-CROUZET, C.-BODÉNAN, F.-CONIL, P. 2003: Arsenic trapping by iron oxyhydroxides and carbonates at hydrothermal spring outlets.- Appl. Geochem. 18. pp. 1313-1323. 28

LEBEDEVA, EV.-OFF, S.-ZUMBRÄGEL, S.-KRUSE, M.-SHAGZHINA, A.-LÜCKER, S.- MAIXNER, F.-LIPSKI, A.-DAIMS, H.-SPIECK, E. 2011: Isolation and characterization of a moderately thermophilic nitrite oxidizing bacterium from a geothermal spring.- FEMS Microbiol. Ecol. 75 (2). pp. 195-204. LLOYD, JR.-CHESNES J.-GLAUSER, S.-BUNKER DJ.-LIVENS FR.-LOVLEY DR. 2002: Reduction of actinides and fisson products by Fe(III)-reducing bacteria.-geomicrobiol. J. 19. pp. 103-120. MÁDL-SZŐNYI J. 2013: Hidrogeológia.- ELTE Természettudományi Kar - Általános és Alkalmazott Földtani Tanszék, Hidrogeológia és Geotermia Műhely, Budapest. 170 p. MARKS, CR.-STEVENSON, BS.-RUDD, S.-LAWSON, PA. 2012: Nitrospira dominated biofilm within a thermal artesian spring: a case for nitrification driven primary production in a geothermal setting.- Geobiology. 10 (5). pp. 457-466. METHE, BA.-NELSON, KE.-EISEN, JA.-PAULSEN, IT.-NELSON, W.-HEIDELBERG, JF.-WU, D.-WU, M.-WARD, N.-BEANAN, MJ.-DODSON, RJ.-MADUPU, R.- BRINKAC, LM.-DAUGHERTY, SC.-DEBOY, RT.-DURKIN, AS.-GWINN, M.- KOLONAY, JF.-SULLIVAN, SA.-HAFT, DH.-SELENGUT, J.-DAVIDSEN, TM.- ZAFAR, N.-WHITE, O.-TRAN, B.-ROMERO, C.-FORBERGER, HA.-WEIDMAN, J.-KHOURI, H.-FELDBLYUM, TV.-UTTERBACK, TR.-VAN AKEN, SE.- LOVLEY, DR.-FRASER, CM. 2003: Genome of Geobacter sulfurreducens: metal reduction in subsurface environments.- Science. 302. pp. 1967 1969. NORTHUP, DE.-LAVOIE, KH. 2001: Geomicrobiology of caves: a review. Geomicrobiol. J. 18. pp. 199 222. PALOTAI M.-MÁDL-SZŐNYI J.-HORVÁTH Á. 2005: A budapesti Gellért- és a Józsefhegy felszín alatti vizeiben mért radon- és rádiumtartalom lehetséges forrásai.- Általános Földtani Szemle. 29. pp. 25 40. PAŠIĆ, L.-KOVČE, B.-SKET, B.-HERZOG-VELIKONJA, B. 2010: Diversity of microbial communities colonizing the walls of a Karstic cave in Slovenia.- FEMS Microbiol. Ecol. 71. pp. 50-60. 29

PORTER, ML.-ENGEL, AS.-KANE, TC.-KINKLE, BK. 2009: Productivity-diversity relationships from chemolithoautotrophically based sulfidic karst systems.- Int. J. Speleol. 28. pp. 27-40. RABUS, R.-HANSEN, TA.-WIDDEL, F. 2006: Dissimilatory sulfate- and sulfur-reducing Prokaryotes.- In: DWORKIN, M.-FALKOW, S.-ROSENBERG, E.-SCHLEIFER, KH.- STACKEBRANDT, E.(eds.): The Prokaryotes. A Handbook on the Biology of Bacteria.- Springer, New York. pp. 659-768. SAMBROOK, J.-RUSSELL, DW. 2001: Molecular cloning: a laboratory manual. Chapter 8: In vitro amplification of DNA by the polymerase chain reaction.- Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York. 545 p. SARBU, SM.-GALDENZI, S.-MENICHETTI, M.-GENTILE G. 2000: Geology and biology of Grotte di Frasassi (Frasassi Caves) in Central Italy, an ecological multidisciplinary study of a hypogenic underground karstsystem. In: WILKENS, H.-CULVER, D.- HUMPHREYS, W. (eds): Ecosystems of the world, Vol. 30: Subterranean Ecosystems.- Elsevier Science, Oxford, UK. pp. 361 381. SOROKIN, DY.-TOUROVA, TP.-BRAKER, G.-MUYZER, G. 2007: Thiohalomonas denitrificans gen. nov., sp. nov. and Thiohalomonas nitratireducens sp. nov., novel obligately chemolithoautotrophic, moderately halophilic, thiodenitrifying Gammaproteobacteria from hypersaline habitats.- Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 57 (Pt 7). pp. 1582-1589. TAMURA, K.-PETERSON, D.-PETERSON, N.-STECHER, G.-NEI, M.-KUMAR, S. 2011: MEGA5: Molecular evolutionary genetics analysis using maximum likelihood, evolutionary distance, and maximum parsimony methods.- Molecular Biology and Evolution. 28. pp. 2731-2739. TÓTH J. 1963: Theoretical Analysis of Groundwater Flow in Small Drainage Basins.- J. Geoph. Res. 68 (16). pp 4795-4812. VLASCEANU, L.-SARBU, SM.-ENGEL, AS.-KINKLE, BK. 2000: Acidic cave-wall biofilms located in the Frassari Gorge, Italy.- Geomicrobial. J. 17. pp.125-140. 30

YU, Y.-LI, HR.-ZENG, YX.-CHEN, B. 2011: Bacillus beringensis sp. nov., a psychrotolerant bacterium isolated from the Bering Sea.- Antonie Van Leeuwenhoek. 99 (3). pp. 551-557. ZAITSEV, GM.-TSITKO, IV.-RAINEY, FA.-TROTSENKO, YA.-UOTILA, JS.- STACKEBRANDT, E.-SALKINOJA-SALONEN, MS. 1998: New aerobic ammonium-dependent obligately oxalotrophic bacteria: description of Ammoniphilus oxalaticus gen. nov., sp. nov. and Ammoniphilus oxalivorans gen. nov., sp. nov.- Int. J. Syst. Bacteriol. 48 (Pt 1). pp. 151-163. ZHANG, J.-WANG, J.-FANG, C.-SONG, F.-XIN, Y.-QU, L.-DING, K. 2010: Bacillus oceanisediminis sp. nov., isolated from marine sediment.- Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 60 (Pt 12). pp. 2924-2929. Internetes hivatkozások: http://www.dsmz.de http://www.ezbiocloud.net http://www.ncbi.nih.gov 31

8. Köszönetnyilvánítás Szeretném megköszönni Dr. Márialigeti Károlynak, hogy a Mikrobiológiai Tanszéken lehetőséget biztosított TDK munkám elkészítéséhez. Köszönettel tartozom témavezetőmnek, Dr. Borsodi Andreának rengeteg hasznos szakmai tanácsáért, a fáradhatatlan segítőkészségéért, amelyet TDK munkám elkészítése közben tapasztaltam. Hálával tartozom Krett Gergelynek, akihez bármikor fordulhattam segítségért és hasznos tanácsokért. Köszönöm Büki Gabriellának a munkám során felmerült kérdések készséges megválaszolását. Szeretném megköszönni a Mikrobiológiai Tanszék dolgozóinak támogatásukat. Ezúton szeretnék köszönetet mondani Mádlné Dr. Szőnyi Juditnak és Dr. Erőss Anitának a geológiai és hidrogeológiai segítségért. Köszönöm Dr. Barkács Katalinnak a forrásvíz kémiai paramétereinek mérését. Kutatásomat az Országos Tudományos Kutatási Alapprogramok (OTKA) NK 101356 pályázat anyagi támogatásával végeztem. 32