1. Ioncserélt víz előállítása Az elektrolitos disszociáció során keletkező ionok elválasztására lehetőséget biztosít többek közt az ioncsere egyensúly is. Ez a megoszlási egyensúly egy ioncserélő gyanta, mint állófázis, és egy elektrolit oldat, mint mozgófázis között alakul ki. Az analitikai célokra is használható ioncserélők megfelelő funkciós csoportok térhálósított műgyanta (általában polisztiroldivinilbenzol kopolimer) vázon való kémiai megkötésével készülnek. Attól függően, hogy a műgyanta vázra jól, vagy kevésbé jól disszociáló csoportokat visznek fel, beszélünk erős vagy gyenge ioncserélőkről. Erős kationcserélők például az SO 3 H, gyengék a COOH csoportokat tartalmazó gyanták. Az anioncserélőknél a kvaterner aminocsoportokat tartalmazók erős, a primer aminocsoportokat tartalmazók gyenge ioncserélők. Kation-, ill. anioncserélők mellett léteznek amfoter (kevert) fázisok is, amelyek szerkezete pozitív és negatív töltésű ionizálható csoportokat is tartalmaz. Az elválasztás alapja a nrso 3 H + M n+ (RSO 3 ) n M + nh + illetve a nrn(ch 3 ) 3 OH + A n [(RN(CH 3 ) 3 ] n A + noh típusú egyensúly. Az ionok gyantához való kötődésének erőssége elsősorban az ion töltésétől, ill. az ion méretétől függ, és az ion polarizálhatósága is szerepet játszik. A feladat: A gyakorlat elején a használat előtt egy főzőpohárban legalább negyed órára áztasson be desztillált vízbe egy-egy nagyobb vegyszerkanálnyi ioncserélő gyantát. Erre a kondícionálásra azért van szükség, mert némely gyanta megduzzad és csak ezután érdemes az oszlopba tölteni. Közben készítsen elő kémcsöveket és a csapvíz ionjait mutassa ki a megfelelő reagens oldatokkal. A kloridiont ezüst-nitrát oldattal, a szulfátiont bárium-kloriddal, a kalciumionokat ammóniumoxaláttal. Tegye el a keletkezett oldatokat, hogy össze lehessen hasonlítani az ioncserélő oszlopról távozó oldattal. Szerelje fel Bunsen-állványra az ioncserélő oszlopot, helyezzen az aljára vattacsomót és töltse bele a gyantát legfeljebb a hattyúnyak magasságának 80%-áig. Mindkét gyantából egy-egy oszlopot készítsen. Ügyeljen arra, hogy az oszlop buborékmentes legyen és a gyantát mindig ellepje a folyadék. Az oszlop tetejére szereljen tölcsért, a lecsöpögő folyadék gyűjtésére használjon bürettafogóval rögzített kémcsöveket. 1. Vigyen fel az oszlopra csapvizet! A lecsöpögő oldatból gyűjtsön egy kémcsőnyit és öntse el. A következő félkémcsőnyi lecsöpögő oldatot ossza három részre. Ezekkel az oldatokkal is végezze el a kémcsőreakciókat, állapítsa meg az oldat kémhatását és a tapasztalatok alapján azonosítsa, hogy kation-, vagy anioncserélő volt-e a gyanta, esetleg vegyes. 2. A csapvíz lecsöpögtetését követően vigyen fel a kationcserélő oszlopra 25 ml 0,05 M CuCl 2 oldatot, az anioncserélőre 25 ml 0,4 mm K 2 Cr 2 O 7 oldatot. Mossa az oszlopokat 25-25 ml desztilláltvízzel. Végül mossa le a színes ionokat a kationcserélő oszlopról 10 ml reagens sósavval, az anioncserélő oszlopról 10 ml reagens NaOH oldattal. A jegyzőkönyvben szerepeljen: 1. Az ionok kimutatására használt reakciók egyenletei. 2. A berendezés rajza. 3. A kémcsőreakciók eredményei, a vizsgált lecsöpögő oldat kémhatása. 4. A 2. lépésben gyűjtött oldatok színe. Ennek magyarázata.
2. Ionok mozgása elektromos erőtérben Egy oldat töltéssel rendelkező alkotórészei elektromos térben különböző sebességgel mozoghatnak. Azokat a módszereket, amelyek ezt a jelenséget használják ki a komponensek elválasztására, elektromigrációs módszereknek nevezzük. Elektromos erőtér hatására az ionok elmozdulása akár oldatban, akár gélben megvalósulhat és sokféle technika fejlődött ki, ami ezen alapul. A töltést sok esetben a ph is befolyásolja, hiszen gyenge elektrolitok esetében a protonált és deprotonált forma aránya a disszociációs állandó mellett a közeg ph-jától is függ, ezért az elektroforézisnél a ph állandóságának biztosítására puffert alkalmaznak. A töltés nagysága mellett az ion mérete, a közeg viszkozitása és a hőmérséklet is befolyásolja a mozgás sebességét. A közeg vezetőképességét is biztosítani kell elmozdulásra képes töltésekkel (alapelektrolit). A feladat: Egy 5x11 cm-es szűrőpapírcsíkon az 1. ábrának megfelelően egymástól 2 cm-re (a középvonaltól 1-1 cm-re) jelöljön ki ceruzával két-két pontot. Az egymás alatt lévő pontok távolsága legyen legalább 2 cm. Helyezze 10 percre a papírt az 0,5 mólos ammónium-nitrát oldatba, majd fektesse rá a petricsészére helyezett üveglapra. Krokodilcsipesszel rögzítse a grafitrudakat a papír két végéhez és az üveglaphoz. Fecskendővel tegyen 1-1 csepp kémszeroldatot a kijelölt pontokra. Ügyeljen rá, hogy a különböző pontokra felvitt oldatok ne folyhassanak össze. Az oldatok kiválasztásánál (1. táblázat) kövesse a gyakorlatvezető utasítását! A az anionokat (I, CrO 4 2, [Fe(CN) 6 ] 4, [Fe(CN) 6 ] 3 ), C a kationokat (Pb 2+, Hg 2+, Ag +, Cu 2+, Fe 3+, Zn 2+ ) jelenti. Csatlakoztassa a krokodilcsipeszeket röpzsinórokkal a 20-30V-os egyenfeszültségű feszültségforráshoz. Helyezzen óraüveget az elektródokkal összekötött papír fölé. 10-15 perc múlva megjelenik a csapadék. Az eredmény tartósan megmarad, ha a papírra merőlegesen folyatva a vizet eltávolítjuk az oldott formában jelenlévő ionokat, majd megszárítjuk a papírt. Jó, ha előbb odakészít mindent és gyorsan dolgozik, mert a kísérlet során a papírnak nem szabad kiszáradnia. 1. ábra. A kísérleti berendezés
1 táblázat. A kísérlethez felhasználható oldatpárok Kísérlet Oldat A C 1. KI Pb(NO 3 ) 2 2. KI Hg(NO 3 ) 2 3. KI HgCl 2 4. KI AgNO 3 5. K 2 CrO 4 Pb(NO 3 ) 2 6. K 4 [Fe(CN) 6 ] CuSO 4 7. K 4 [Fe(CN) 6 ] Fe(NO 3 ) 3 8. K 3 [Fe(CN) 6 ] Fe(NH 4 ) 2 (SO 4 ) 2 9. K 3 [Fe(CN) 6 ] ZnCl 2 A jegyzőkönyvben szerepeljen: 1. A kísérleti berendezés rajza, fontosabb paraméterei. 2. A papírra csöpögtetett oldatok összetétele, színe. 3. A keletkezett csapadékok színe, képlete. 4. Mi a magyarázata annak, hogy csak egy foltot lehet megfigyelni?
3. Ionok elválasztása papírkromatográfiával A papírkromatográfia a megoszlásos kromatográfiához tartozik. Az elválasztás alapja, hogy a minta komponensei különbözőképpen oszlanak meg a papír, mint állófázis, ill. az oldat, mint mozgó fázis között. Ily módon akár ionos vegyületek, akár disszociálatlan molekulák is szeparálhatók. 1. ábra Papírkromatográfia szemléltetése színekkel: a papírra tiszta anyagokat, ill. egy keveréket cseppentünk pontszerűen majd az oldószerbe tesszük. Az 1, 2, 4 alapszín, míg a 3 folt egy keverékszín. Az oldószer (mozgó fázis) felfelé halad. A megoszlási egyensúlyt befolyásolja a mozgó fázis és a vegyület polaritása valamint az álló fázis anyagi minősége is. A papírhoz erősebben kötődő anyagok lassabban mozognak, míg az oldószerben jól oldódó anyagok gyorsabban haladnak. Akkor lehet sikeresen elválasztásra felhasználni a jelenséget, ha a komponensek különböző sebességgel haladnak és egyik sem marad a startvonalon, ill. nem fut az oldószerfronttal együtt. Mielőtt az oldószerfront a papír végét elérné, ki kell venni azt az oldószerből. A komponensek által megtett utat a referenciákkal összehasonlítva valószínűsíthető, hogy a két vegyület azonos. Azonosításra többféle oldószerben való futtatás vagy egyéb bizonyíték kell. Az előrehaladás mértékét adott kromatográfiás körülmények között a retenciós faktorral (Rf) jellemezzük. A R f = B ahol A a vegyület által megtett út, B az oldószerfront távolsága a startvonaltól (ld. 1. ábra). Amennyiben az elválasztandó komponensek nem színesek, különböző előhívási technikákat kell alkalmazni. Az oldószer nemcsak egy irányba haladhat, hanem például egy kör középpontjából sugárirányban is áramolhat akár a kapilláris erők, akár forgatás során fellépő centrifugális erő hatására. A feladat: A 4,5 x 8,5 cm-es kromatográfiás papírra a szélétől 1 cm-re húzza meg a startvonalat. Jelöljön ki rajta 4 starthelyet egymástól egyenletes távolságra. Ezekre kapilláris segítségével cseppentsen 3-3 pöttyintéssel reagens CuCl 2, MnCl 2, CoCl 2 oldatokat, valamint az ismeretlen összetételű elegyet. Minden oldathoz külön kapillárist használjon! A foltok ne kerüljenek fedésbe! A futtató kád aljába öntsön egy kevés futtatószert (6 mólos sósav és aceton 7:25 arányú elegye). A futtatószer szintje ne érje el a beleállítandó kromatográfiás papíron a startvonalat. Helyezze bele a papírt, majd fedje le a kádat a tetejével. Mielőtt végigfutna az oldószer, vegye ki a papírt, jelölje be ceruzával az oldószerfront helyzetét, és szárítsa meg elszívófülkében a papírt. Határozza meg a
retenciós faktorokat, jegyezze fel a színeket, majd tegye a papírt 6 mólos ammónia-oldat fölé a fülkében és fedje le egy negyedórára. Jegyezze fel a változásokat. A jegyzőkönyvben szerepeljen: 1. A vizsgált oldatokból készült ismeretlen oldott anyagainak megnevezése. 2. A tapasztalt színek és retenciós faktorok. 3. A keletkezett vegyületek képlete.
4. Vékonyrétegkromatográfia - retenciós faktort befolyásoló tényezők vizsgálata A vékonyrétegkromatográfiában a megoszlás a réteget alkotó állófázis és a kapilláriserők hatására mozgó folyadékfázis között alakul ki. A technikát széles körben alkalmazzák a mindennapi analitikai gyakorlatban elsősorban a gyors tájékozódást igénylő feladatokban. Ilyen lehet például a szerves reakciók követése, oszlopkromatográfiában a frakciók határainak meghatározása. Ritkábban preparatív vékonyrétegen választják el a nagyobb mennyiségű anyagot. Ilyen esetben a megosztófázis vastagabb rétegben van egy nagyobb lemezen és az anyagot a startvonal mentén viszik fel. Az elválasztás után a kívánt réteget lekaparják a lemezről, leoldják az anyagot a megosztófázisról és bepárlással vagy átkristályosítással nyerik ki az oldatból... A normál fázisú VRK esetében az álló fázis poláros, legtöbbször üveg, alumínium vagy poliészter felületre felvitt szilikagél. Nagyon poláros anyagok, mint például az alkoholok, aminok, ill. karbonsavak hidrogén-kötésekkel erősen kötődnek az állófázis felületén lévő a Si-OH csoportokhoz. Ezek az anyagok csak poláros oldószerekkel távolíthatók el a felületről. Ugyanakkor az apoláros anyagok gyengén kötődnek az állófázishoz, s így gyorsan haladnak felfelé az apoláros oldószerrel. 1. ábra. A retenciós faktor szemleltetése A mintát viszonylag tömény oldatban pontszerűen visszük fel a VRK lap szélétől kb. 1 cm-re (1. ábra) egy kapilláris segítségével, majd a lapot eluenst tartalmazó futtatóedénybe helyezzük. A mozgó fázis felfelé haladása közben a minta komponenesei megoszlanak a szilikagél és a mozgófázis között. A szilikagélhez erősebben kötődő vegyületek lassabban, míg az eluensben jobban oldódó anyagok gyorsabban haladnak. A másodrendű kölcsönhatások erősségében meglévő különbségek alapján a komponensek szétválnak. Az anyagokat az adott kromatográfiás rendszerben a retenciós faktorral jellemezzük, amit az alábbi egyenlet definiál: a R f = b ahol a a mérendő anyag által megtett út, b pedig az oldószefront távolsága a startponttól (ld. 1. ábra). A megoszlást alapvetően befolyásolja a futtatóelegy (eluens) polárossága. Az jó elválasztás feltétele, hogy a komponens elmozduljon az oldószer hatására, ugyanakkor ne fusson együtt az oldószerfronttal. Ha ezt egy oldószer nem tudja biztosítani, akkor oldószerelegyet célszerű
alkalmazni. Néhány oldószer növekvő polaritás szerinti sorrendjét az 1. táblázat tartalmazza. Főleg az illékony eluensek esetében fontos a futtatóedény oldószergőzzel való telítettsége. Zavaró lehet a víz jelenléte, mert ez az állófázishoz kötődve megváltoztatja a felület minőségét. 1. táblázat. Oldószerek polaritása Apoláros Erősen poláros ciklohexán petroléter pentán szén-tetraklorid benzol toluol kloroform etiléter Etil-acetát etanol aceton ecetsav metanol víz A szilikagélt amikor csak lehet csipesszel fogjuk meg, így elkerülhető a felületének elszennyezése. A vonalakat ceruzával húzzuk. A mintát próbáljuk meg tömény oldatban pontszerűen felvinni. A minta oldószerét akár hőlégfúvót is használva párologtassuk el, mert ez befolyásolhatja a kromatográfiás sajátságokat. Az eluens szintje feltétlenül a startvonal alatt legyen. Az oldószert ne futtassuk egészen a vékonyréteglap felső széléig, amikor kb. 1 cm-re van a szélétől, akkor vegyük ki a lapot az eluensből és jelöljük be ezt a szintet ceruzával. A futtatás alatt fedjük le a futtatóedényt pl. óraüveggel. Szines anyagok helye rögtön látható, színtelen anyagok UV lámpa alatt, vagy előhívó oldattal kezelve válnak láthatóvá. A foltok helyét rajzoljuk ceruzával körbe, mert később elhalványodhatnak, eltűnhetnek. A feladat: 1. Az eluens összetételének hatása Első lépésben határozza meg a ciklohexanon, a dietil-malonát, az 1-oktanol és az acetil-aceton elválasztásához legalkalmasabb futtatóelegy-összetételt. Ez azt az összetételt jelenti, amelyben a komponenesek elválása a legnagyobb mértékű, viszont egyik sem marad az alapvonalon, ill. nem fut az oldószerfronttal együtt. Ehhez négy egyforma befőttes üvegbe tegyen 10-15 ml futtatóelegyet a 2. táblázatban található összetételeknek megfelelően. Tegyen mindegyikbe szűrőpapírcsíkot, és nedvesítse meg az a futtatószerrel. A 5 x 8,5 cm es VRK lapok aljára 1 cm magasan húzza be ceruzával a startvonalat és jelöljön be rajta egymástól egyenletes távolságban 4 pontot. A kijelölt pontokra kapilláris segítségével vigyen fel 3-3 pöttyintésnyit ciklohexanon, dietil-malonát, 1-oktanol és acetil-aceton 1%-os diklórmetános oldataiból. Minden befőttes üvegbe tegyen egy ilyen VRK lapot, majd zárja le a befőttes üveget. Mielőtt az oldószerfront végigfutna, vegye ki a lapokat az elegyből. Azonnal jelölje be ceruzával az oldószerfrontot, majd szárítsa meg az elszívófülkében. Ezután merítse bele a lapokat csipesszel ánizsaldehidet tartalmazó előhívóoldatba. Csepegtesse le a fölösleges oldatot, a lapot fektesse rövid időre itatóspapírra. Majd szárítsa a lapokat hőlégfúvó segítségével. A melegítést addig végezze, míg az oktanol halvány, kékes foltja is elő nem jön. (Óvatosan, de füstölésig) A láthatóvá vált foltokat karikázza be. A befőttesüvegekben a futtatóelegyeket cserélje le a táblázatban található még nem vizsgált összetételű elegyekre és végezze el a futtatást ezekkel az elegyekkel is. Az eredmények alapján válassza ki a legjobb futtatóelegyet.
2. táblázat. A jellemző retenciós faktorok (R f ) az eluens összetételének függvényében Eluens ciklohexanon dietil-malonát acetil-aceton 1-oktanol (%éter:%pentán) 100:0 90:10 70:30 50:50 30:70 10:90 0:100 2. A futtatóedény vizsgálata A retenciós tényező érzékeny a futtatóedények oldószergőzzel való telítettségére is, amit a futtatóedény paraméterei, valamint a szűrőpapírcsík jelenléte határoznak meg. Ennek tanulmányozásához állítsa össze a 3. táblázatban található kísérleti összeállításokat, töltsön az edényekbe az előző feladatban meghatározott legjobb futtatóelegyből, majd az előzőekhez hasonlóan határozza meg a retenciós faktorokat. A választott összetételű futtatóelegyből egyszerre készítsen egy nagyobb adagot és as azt ossza szét az egyes futtatóedényekben! 3. táblázat Kísérlet futtatóedény szűrőpapírcsík fedő 1 befőttes üveg nincs nincs 2 befőttes üveg nincs műanyag lap 3 befőttes üveg van műanyag lap 4 befőttes üveg van csavaros tető 5 250 cm 3 -es magas főzőpohár nincs nincs 6 250 cm 3 -es magas főzőpohár van nincs 7 250 cm 3 -es magas főzőpohár van műanyag lap 8 250 cm 3 -es magas főzőpohár van óraüveg Az előhívó oldat készítése: 1 dm 3 etanolt tegyünk jeges fürdőbe, majd lassan, kevergetés közben adjunk hozzá 37,0 cm 3 tömény kénsavat, 11,1 cm 3 jégecetet és 27,4 cm 3 p-ánizsaldehidet. A jegyzőkönyvben szerepeljen: 1. A 2. táblázat kitöltve. 2. Az optimális futtatószerösszetétel 3. A második kísérletsorozatban tapasztaltakat, magyarázattal. (Melyikelrendezés előnyösebb és miért?)
5. Klorofill a és b elválasztása vékonyrétegen A növényekben a fotoszintézis a kloroplasztokban lévő kromofórok segítségével történik. Ezek a színelnyelő anyagok a klorofillek, a karotinoidok és a xantofillek. A klorofill a az elsődleges színanyag, a többiek csak másodlagos szerepet játszanak. A kísérletben spenótból és egy szobanövény leveléből izolált színanyagokat fogjuk elválasztani vékonyrétegen. A kromatográfia XX. század eleji felfedezése is a növényi színezékekhez köthető. M. Cvet, orosz botanikus levelekből készített kivonatát kalcium-karbonát rétegen engedte át, amikor sárga és zöld sávokat figyelt meg. A jelenség részletesebb vizsgálata indította el a mai hatékony eljárások kifejlesztéséhez szükséges kutatásokat. Név Szerkezet Szín O klorofill a zöld R=CH 3 klorofill b N N - N CO 2 H O O R=CHO xantofill R Mg 2+ - világoszöld N OH sárga ß-karotin HO sárga feofitin szürkészöld A feladat: 1. A mintaelőkészítés Fél gramm fagyasztott spenótot (illetve fél gramm friss zöld levelet), fél gramm vízmentes magnézium-szulfátot, és egy gramm tengeri homokot alaposan összedörzsölünk egy mozsárban (5-10 perc). Az így kapott világoszöld szilárd, porszerű anyagot spatulával egy rövid kémcsőbe tesszük, 2 cm 3 acetonnal alaposan elkeverjük (üvegbot), majd 10 percig parafilmmel lefedve állni hagyjuk. Az acetonos oldat tisztáját Pasteur pipettával leszedjük, másik rövid kémcsőbe tesszük, majd újabb adag acetonnal átmossuk a szilárd anyagot és a tisztáját ismét leszedjük, egyesítjük az előbb leszedett extraktummal. 2. Elválasztás vékonyrétegen Az acetonos extraktumot kapilláris segítségével 3,5x10 cm-es vékonyréteglapokra felvisszük, majd óraüveggel lefedett futtatóhengerben 60% petrolétert (fp. 35-60 ºC), 16% ciklohexánt, 10% etil-acetátot, 10% acetont, 4 % metanolt tartalmazó oldószerelegyben kromatografáljuk. Az elúció sorrendje a következő: ß-karotin (Rf=0,95), klorofill a (Rf=0,44), klorofill b (Rf=0,32), xantofill (Rf=0,16). Az Rf értékek tájékoztató jellegűek. 3. Fémionok eltávolítása A maradék extraktumokba 500-500 mg Amberlyst kationcserélő gyantát teszünk. Összekeverjük, majd 3 percig lezárva állni hagyjuk. Ezután az előzőek szerint kromatografáljuk. Az oldatból eltűnt a klorofill a és helyette megjelent a feofitin a (Rf=0,60) és a feofitin b
(Rf=0,49). Ez az átalakulás az állás során is bekövetkezik, a magnéziumionok elvesztésével a klorofillból feofitin keletkezik. A jegyzőkönyvben szerepeljen: 1. A főbb komponensek retenciós faktorai 2. A kationcserélő hatásának megfigyelései
6. Sav-bázis indikátorok elválasztása vékonyrétegen A gyakorlathoz a 4. Vékonyrétegkromatográfia - retenciós faktort befolyásoló tényezők vizsgálata című gyakorlat elméleti bevezetőjének ismerete szükséges. A sav-bázis indikátorok olyan festékanyagok, amelyeknek a színe a kémhatástól függően változik. Ezek általában gyenge savak, vagy bázisok, amelyeknek protonált és deprotonált formája különböző színű (II.8. ábra). A színváltozás ph értékét a megfelelő pk a határozza meg. A feladat: Először nézze meg reagens sósavval, ill. nátrium-hidroxiddal átitatott szűrőpapírra cseppentve az indikátor oldatok színét. Az indikátorokat és az ismeretlent kapilláris segítségével egymástól egyenlő távolságban vigye fel az 5,5 x 8,5 cm-es VRK lapok startvonalára, majd határozza meg az indikátorok retenciós faktorát 2-propanolból és 25%-os ammónia vizes oldatából frissen készített 6:1 arányú eluensben. Minden indikátorhoz új kapillárist használjon! Futtató edényként 250 ml-es alacsony típusú főzőpoharat használjon óraüveggel lefedve. A kapott foltokat szárítás után karikázza be, mert van olyan, amelyik savas közegben elszíntelenedik. Jegyzőkönyvében rögzítse a színeket is! Ezután 1 mól/dm 3 koncentrációjú sósavba merítse bele gyorsan a VRK lapokat és figyelje meg a bekövetkező színváltozást! 1. táblázat. A gyakorlaton az alábbi indikátorok 1%-os metanolos oldatai vizsgálandók Indikátor R f Szín savas oldatban Szín lúgos oldatban Szín metanolban Alizarin vörös Kongó vörös Bróm-krezolzöld Metil-krezolvörös p-nitrofenol A jegyzőkönyvben szerepeljen: 4. Az 1. táblázat kitöltve. 5. A vizsgált oldatokból készült ismeretlen oldott anyagainak megnevezése.
7. Sav-bázis indikátorok elválasztása oszlopkromatográfiásan A hagyományos oszlopkromatográfia körülbelül 10 mg és 10 g közötti tömegű anyag tisztítására szolgál. Az anyag mennyiségétől függ az oszlop mérete és a felhasznált oldószer mennyisége. A viszonylag nagy oldószerigény miatt ez egy drága tisztítási mód. Bár ritkán vékonyréteget is használnak preparatív célú elválasztásokra, de az esetek többségében mégis inkább oszlopon végzik a tisztítást. (A VRK esetében természetesen vastag rétegű lemez szükséges és a mintát nem pontszerűen, hanem egy vékony vonalban visszük fel a lemezre. Az elúció után a kívánt komponenshez tartozó sávot (réteget) lekaparjuk, majd ebből való kioldással és az így kapott oldat bepárlásával nyerjük ki az anyagunkat.) Kisebb oszlopokat szárazon is megtölthetünk, de a nagyobb oszlopok esetében a megosztófázist apoláros oldószerben duzzasztjuk, majd ezt a szuszpenziót visszük rá lehetőleg buborékmentesen az oszlopra. Az oszlop aljára vattát és homokréteget, vagy üvegfrittet teszünk. A tetejét is védheti homokréteg vagy szűrőpapírlapka. Így biztosítható, hogy az oszlop alja ill. teteje vízszintes legyen, ami az éles elválasztás egyik feltétele. Ne hagyjuk kiszáradni az oszlopot! A töltet legtöbbször szilika (SiO 2 ), ritkábban alumina (Al 2 O 3 ), esetleg Florisil (Mg 2 SiO 4 ) vagy egyéb kromatográfiás megosztófázis. A töltet tömege az elválasztandó elegy tömegének legalább 25-szöröse legyen, de akár százszorosa is lehet. A mintát minél keskenyebb sávban visszük rá az oszlop tetejére, és az eluenssel hajtjuk végig az oszlopon. A leoldást a vékonyrétegkromatográfiával ellentétben nemcsak egyfajta oldószereleggyel hajthatjuk végre (izokratikus), hanem lehetőség van az oldószer összetételének folyamatos változtatására, polaritásának fokozatos növelésére is (gradiens elúció). A minta komponensei különböző sebességgel haladnak és sávokra válnak szét. Különböző frakciókat szedünk, amelyek tisztaságát akár VRK-val is ellenőrizhetjük. A műveleteket az 1. ábra foglalja össze. Az oszloptöltés, a mintafelvitel és a leoldás során ügyeljen arra, hogy ne legyen soha száraz a fázis. 1. ábra. Az oszlopkromatografálás lépései
Az eluens a gravitáció hatására csöpög le az oszlopról, de ha elég jó az elválás (nagy a retenciós faktorok különbsége) akkor nyomáskülönbség létrehozásával meggyorsíthatjuk a műveletet (flash kromatográfia). Illékony oldószereknél nem célszerű vákuumot alkalmazni, mert az oldószer elpárolog és az anyag nem kívánt helyekre kristályosodik ki. Ilyen esetben jobb, ha az oszlop tetejére gyakorolt túlnyomással hozzuk létre a nyomáskülönbséget. Erre többféle berendezést használhatunk, amelyekből két példa a 2. ábrán látható. 2. ábra. Flash kromatográfiás berendezések A feladat: A kísérlet két részből áll, a vékonyréteg- és az oszlopkromatográfiás elválasztásból. Ezért a gyakorlathoz a 4. Vékonyrétegkromatográfia - retenciós faktort befolyásoló tényezők vizsgálata című gyakorlat elméleti bevezetőjének ismerete szükséges. 1. Vékonyrétegkromatográfiás rész 5,5 x 8,5 cm-es VRK lap aljára 1 cm magasságban húzza meg ceruzával a startvonalat. Ezen egymástól egyenletes távolságra jelöljön ki 7 pontot. A kijelölt pontokra kapilláris segítségével vigyen fel 1-1 pöttynyit a következő anyagok 3 mg/ml-es metanolos oldataiból:fluoreszcein, brómkrezolzöld, metilvörös, fuxin, rodamin B, metilénkék és ezek közös oldatából. Minden oldathoz új kapillárist használjon! 250 ml-es alacsony főzőpohár aljára öntsön annyi futtatószert (2-propanol és ecetsav 15:2 elegye), hogy a folyadékszint ne érje el a beleállított VRK lapokra felvitt anyagok foltjait. Mielőtt az oldószerfront végigfutna, vegye ki a lapokat az elegyből és azonnal jelölje be ceruzával az oldószerfrontot. Határozza meg az egyes komponensek retenciós faktorait. A vékonyréteget ezután mártsa bele reagens nátrium-hidroxid oldatba és jegyezze fel a színváltozásokat. 2. Oszlopkromatográfiás rész Kis főzőpohárba tegyen 1,5 nagyobb vegyszerkanál szilikagélt. Öntse rá víz, 1-propanol és aceton 1:1:1 arányú elegyét. Hagyja állni legalább negyedórán át. Tulipántölcsér szárának aljába tegyen vattacsomót, majd töltse rá buborékmentesen a duzzasztott szilikagélt. Annyit tegyen az oszlopba, hogy elférjen a szárban, de azt közel teljesen töltse fel. A szilikagél leülepedése után a fölösleges oldószer nagyját Pasteur pipettával távolítsa el. Az utolsó cseppek lecsepegése pedig nyomással segíthető.
Az oszlop tetejére Pasteur pipettával vigyen fel 1 cseppet az indikátorkeverékből. Nyomás alkalmazásával segítheti az oldat oszlopra kerülését. Miután a teljes mintamennyiség bekerült az oszlopba, töltsön rá a duzzasztáshoz is használt 1:1:1 arányú 1-propanol víz - aceton elegyből. A kromatográfiás folyamat ezt követően is nyomással gyorsítható. Ügyeljen arra, hogy eközben az oszlop ne kerüljön szárazra! A jegyzőkönyvben szerepeljen: 3. A főbb komponensek retenciós faktorai 4. Az oszlopkromatográfiás összeállítás rajza. 5. Az oszlopon kialakuló sávok színei sorrendben.
8. Karvonok izolálása fodormenta és édeskömény olajokból A hagyományos oszlopkromatográfia körülbelül 10 mg és 10 g közötti tömegű anyag tisztítására szolgál. Az anyag mennyiségétől függ az oszlop mérete és a felhasznált oldószer mennyisége. A viszonylag nagy oldószerigény miatt ez egy drága tisztítási mód. Bár ritkán vékonyréteget is használnak preparatív célú elválasztásokra, de az esetek többségében mégis inkább oszlopon végzik a tisztítást. (A VRK esetében természetesen vastag rétegű lemez szükséges és a mintát nem pontszerűen, hanem egy vékony vonalban visszük fel a lemezre. Az elúció után a kívánt komponenshez tartozó sávot (réteget) lekaparjuk, majd ebből való kioldással és az így kapott oldat bepárlásával nyerjük ki az anyagunkat.) Kisebb oszlopokat szárazon is megtölthetünk, de a nagyobb oszlopok esetében a megosztófázist apoláros oldószerben duzzasztjuk, majd ezt a szuszpenziót visszük rá lehetőleg buborékmentesen az oszlopra. Az oszlop aljára vattát és homokréteget, vagy üvegfrittet teszünk. A tetejét is védheti homokréteg vagy szűrőpapírlapka. Így biztosítható, hogy az oszlop alja ill. teteje vízszintes legyen, ami az éles elválasztás egyik feltétele. Ne hagyjuk kiszáradni az oszlopot! A töltet legtöbbször szilika (SiO 2 ), ritkábban alumina (Al 2 O 3 ), esetleg Florisil (Mg 2 SiO 4 ) vagy egyéb kromatográfiás megosztófázis. A töltet tömege az elválasztandó elegy tömegének legalább 25-szöröse legyen, de akár százszorosa is lehet. A mintát minél keskenyebb sávban visszük rá az oszlop tetejére, és az eluenssel hajtjuk végig az oszlopon. A leoldást a vékonyrétegkromatográfiával ellentétben nemcsak egyfajta oldószereleggyel hajthatjuk végre (izokratikus), hanem lehetőség van az oldószer összetételének folyamatos változtatására, polaritásának fokozatos növelésére is (gradiens elúció). A minta komponensei különböző sebességgel haladnak és sávokra válnak szét. Különböző frakciókat szedünk, amelyek tisztaságát akár VRK-val is ellenőrizhetjük. A műveleteket az 1. ábra foglalja össze. Az oszloptöltés, a mintafelvitel és a leoldás során ügyeljen arra, hogy ne legyen soha száraz a fázis. 1. ábra. Az oszlopkromatografálás lépései Az eluens a gravitáció hatására csöpög le az oszlopról, de ha elég jó az elválás (nagy a retenciós faktorok különbsége) akkor nyomáskülönbség létrehozásával meggyorsíthatjuk a
műveletet (flash kromatográfia). Illékony oldószereknél nem célszerű vákuumot alkalmazni, mert az oldószer elpárolog és az anyag nem kívánt helyekre kristályosodik ki. Ilyen esetben jobb, ha az oszlop tetejére gyakorolt túlnyomással hozzuk létre a nyomáskülönbséget. Erre többféle berendezést használhatunk, amelyekből két példa a 2. ábrán látható. 2. ábra. Flash kromatográfiás berendezések A feladat: A kísérlet két részből áll, a vékonyréteg- és az oszlopkromatográfiás elválasztásból. Ezért a gyakorlathoz a 4. Vékonyrétegkromatográfia - retenciós faktort befolyásoló tényezők vizsgálata című gyakorlat elméleti bevezetőjének ismerete szükséges. 1. Vékonyrétegkromatográfiás rész A mentaolajat a menta (menta spicata) virágából vízgőzdesztillációjával nyerik. Bár a mentaolajban legalább 28 komponens van, ebből csak hármat lehet könnyen izolálni: a (+)- limonént, a L-(-)-karvont és a (1R,2R,4R)-dihidro-karvolt. 3. ábra. Az izolálandó vegyületek szerkezete és R f értékei (etil-acetát:hexán=1:9 eluens szilikagél felületen) O OH (+)-L-limonén L-(-)-karvon (1R,2R,4R)-dihidro-karvol 0,79 0,39 0,16 3 x 8,5 cm-es VRK lap aljára 1 cm magasságban húzza meg ceruzával a startvonalat. Ezen jelöljön ki 2 pontot. A kijelölt pontokra kapilláris segítségével vigyen fel 3-3 pöttynyit fodormenta- és édesköményolaj 50-szeres hígítású, hexános oldatából. Minden oldathoz új
kapillárist használjon! 250 ml-es alacsony főzőpohár aljára öntsön annyi futtatószert (etil-acetáthexán 1:9 elegye), hogy a folyadékszint ne érje el a beleállított VRK lapokra felvitt anyagok foltjait. Helyezzen a főzőpohárba szűrőpapírt és itassa át a futattószerrel! Mielőtt az oldószerfront végigfutna, vegye ki a lapokat az elegyből és azonnal jelölje be ceruzával az oldószerfrontot. A lapot szárítsa meg, majd merítse permanganátos előhívó oldatba. Az olefinekkel a permanganát mangán-dioxiddá redukálódik, ami barna foltot eredményez a lapon. A retenciós faktorok alapján határozza meg a komponenseket. Ebben segíthet a 4. ábra is. 4. ábra. A vékonyrétegek az UV lámpa alatt, ill. a permanganátos előhívás után. A minta (s) mellett a kereskedelemből beszerzett standard anyagok (l=limonén, c=karvon d=dihidro-carvol) láthatók. Gyakran látható R f =0,24 értéknél egy folt, valamint tömény mintánál még két másik komponens is megjelenhet (R f =0,53 és 0,47). Az előhívó oldat készítése: Oldjon fel 3 g kálium-permanganátot, 20 g kálium-karbonátot és 5 cm 3 5%-os nátrium-hidroxid vizes oldatát 300 cm 3 desztillált vízben. 2. Oszlopkromatográfiás rész Kis főzőpohárba tegyen 1,5 nagyobb vegyszerkanál szilikagélt. Öntsön rá hexánt. Hagyja állni legalább negyedórán át. Tulipántölcsér szárának aljába tegyen vattacsomót, majd töltse rá buborékmentesen a duzzasztott szilikagélt. Annyit tegyen az oszlopba, hogy elférjen a szárban, de azt közel teljesen töltse fel. A szilikagél leülepedése után a fölösleges oldószer nagyját Pasteur pipettával távolítsa el. Az utolsó cseppek lecsepegése pedig nyomással segíthető. Az oszlop tetejére Pasteur pipettával vigyen fel 0,5 cm 3 hexánban oldott negyed gramm édeskömény- vagy fodormentaolajat. Nyomás alkalmazásával segítheti az oldat oszlopba kerülését. Az elúciót 25 cm 3 hexánnal kezdje, majd 15 cm 3 etil-acetáttal folytassa. A kromatográfiás folyamat ezt követően is nyomással gyorsítható. Ügyeljen arra, hogy eközben az oszlop ne kerüljön szárazra!a lecsöpögő oldatot 5-5 cm 3 -enként külön kémcsőbe gyűjtse. A frakciók összetételét vizsgálja meg az előző pontban leírt vékonyréteg kromatográfiás módszerrel ezúttal 5,5 x 8,5 cm-es vékonyréteg lapon. A jegyzőkönyvben szerepeljen: 6. A főbb komponensek mért retenciós faktorai 7. Az egyes frakciók összetétele 8. Az oszlopkromatográfiás összeállítás rajza.