A CYLINDROSPERMOPSIS RACIBORSKII NITROGÉNKÖTŐ KÉKALGA SZAPORODÁSA KÜLÖNBÖZŐ NITROGÉNFORRÁSOKON Présing Mátyás 1, Kenesi Gyöngyi 1, Hesham M. Shafik 1,2, Kovács W. Attila 1 és Herodek Sándor 1 1 MTA Balatoni Limnológiai Kutatóintézet 2 Szuezi Csatorna Egyetem, Botanika Tanszék, Ismailia, Egyiptom Összefoglalás. P-limitált kemosztátokban vizsgáltuk az NH 4 + - és NO 3 - -tartalmú, ill. N-mentes tápoldatok hatását a C. raciborskii növekedésére, sejtösszetételére és N 2 - kötésére. A hígítási arányt változtatva egyre nagyobb növekedési sebességeknél értünk el állandósult állapotokat. Az átfolyási sebességet növelve a P-limitáció enyhült, csökkentek a PN/PP és a PC/PP arányok, majd a maximális növekedési arányt megközelítve az optimális Redfield értékhez tartottak. A C/N arányok a kis növekedési sebességeknél nem tértek el jelentősen a Redfield értéktől, a hígítási arányt növelve ez az érték csökkent, NH 4 + jelenlétében a legnagyobb mértékben, de NO 3 - jelenlétében is jelentősen. A PC/PN arány csökkenését a PN-tartalom növekedése okozta, mivel a PCtartalom nem változott jelentősen. A karotinoid/klorofill-a arány a növekedési sebességgel csökkent, ahogy a klorofill-a tartalom növekedett. A legkisebb növekedési sebességektől eltekintve a kizárólag légköri N 2 -nel ellátott tenyészetek biomasszája jelentősen elmaradt az NH 4 + -mal ill. NO 3 - -tal ellátottakétól, mivel az oldott N-formák jelenléte csökkentette az algasejtek fenntartásához szükséges ún. minimális foszfortartalmat (Q ). A maximális növekedési sebesség (µ * max) is kisebb volt NH 4 + vagy NO 3 - hiányában. Az eltérő növekedési jellemzőket az okozhatta, hogy a N 2 -kötés folyamata, a heterociták kiépítése és a N 2 -kötéshez szükséges enzimek szintézise foszfor-, és energiaigényes folyamat. A N 2 kötését az oldott N-formák gátolták, a NO 3 - részben, míg az NH 4 + képes volt annak teljes blokkolására is. Bevezetés, célkitűzés A Balaton foszforterhelésének csökkenésével csökkent a tó trofitása, a Cylindrospermopsis raciborskii biomasszája is mérséklődött. Ennek ellenére továbbra is indokolt e Balatonban nem őshonos faj metabolizmusának vizsgálata, hiszen Közép-Európa legnagyobb sekélyvizű tavában előfordulhatnak nitrogénhiányos időszakok (Présing és mtsai 21), csökkenhet a tóban a fitoplankton fajeloszlását befolyásoló N/P arány (Bulgakov és Levich 1999) is. Mindkét tényező a cianobaktériumoknak, különösen a nitrogénkötőknek kedvez, amelyek nyáron még mindig a fitoplankton meghatározó tömegét alkotják. Bőséges P-ellátottság mellett végzett kísérletek szerint (Sprőber és mtsai + - 23) NH 4 és NO 3 jelenléte nem befolyásolja jelentősen a faj
növekedését. Nem ismert, hogy az eltérő energia- és foszforigényű N- formák hogyan befolyásolják a faj növekedési jellemzőit. Munkánkkal arra kerestünk választ, hogy a tóra jellemző P-limitált körülmények között az eltérő N-formák hogyan befolyásolják a faj anyagcseréjét és versenyképességét; továbbá, hogy az NH 4 + ill. a NO 3 - - milyen mértékben gátolja a nitrogénkötést. A tervezett vizsgálatokhoz a tápoldatot folyamatosan a tenyészethez adagoló, ún. kemosztát rendszerek a legalkalmasabbak, segítségükkel tetszőleges növekedési sebesség és tápanyag-ellátottság mellett vizsgálhatók a sejtek. A kemosztátokban a lombik tenyészeteknél sokkal jobban megközelíthető a tavakra és tengerekre jellemző viszonylag állandó és alacsony tápanyag-ellátottság. Lehetőség nyílik arra is, hogy segítségükkel vizsgáljuk, a külső tápanyag-ellátottság függvényében hogyan változik a vizsgált faj sejtösszetétele. Ennek ismerete nem csak a kísérlet során tapasztalt jelenségek magyarázatában segíthet, pl. ha számos algafaj esetén meghatározzák, hogy adott körülmények közt hogyan változhat a sejtösszetételük, akkor a természetes vizek tápanyag forgalmát is pontosabban leírhatjuk, a táplálék hálózatok működését mélyebben megérthetjük (Klausmeier és mtsai 24). Anyag és módszer A kísérleteket a korábban már részletesen közölt körülmények között végeztük (Kenesi és mtsai 26). A Balatonból izolált C. raciborskii (ACT 952) cianobaktérium törzzsel dolgoztunk. Előzetesen optimálisnak talált hőmérsékletet (26 ± 1 C) és fényt (1 µmol m -2 sec -1 intenzitású folytonos megvilágítás, Circline TM Cool White T9/32W/CW fénycső) biztosítottunk. Módosított BG-11 tápoldatot (2 µg/l PO 4 -P) adagoltunk a tenyészetekhez. Két kísérletsorozat esetén a tápoldat 4 µg/l NH 4 -N-t ill. NO 3 -N-t tartalmazott (N/P arány az optimális értéknél nagyobb, 2-as érték, ami erős foszforhiányt jelentett). A harmadik esetben a tápoldat nitrogénmentes volt, így az algák kizárólag a légköri nitrogén kötéséből fedezték N-szükségletüket. A hígítási arányt növelve egyre magasabb hígítási arányoknál értünk el állandósult állapotokat. A tenyészetek állapotát a következő jellemzők mérésével naponta ellenőriztük: hígítási arány, ph, klorofill-a és karotinoid koncentráció, optikai denzitás 75 nm-en. Az állandósult állapotok elérése után 3-5 napon keresztül a napi mérések kiegészültek a partikulált nitrogén (PN), partikulált szén (PC), száraztömeg, valamint az NH 4 -N, NO 3 -N, PO 4 -P,
TP koncentrációjának meghatározásával (Kenesi és mtsai 26). A kísérletek az algaszuszpenzió N 2 -kötő képességének mérésével zárultak. A 15 N 2 felhasználásán alapuló módszert a természetes fitoplanktonra alkalmazott technikából (Présing és mtsai 21) fejlesztettük tovább tömény algaszuszpenziókra alkalmas módszerré. Eredmények és értékelésük Algabiomassza A biomasszát jellemző paraméterek: PC, 75 nm-en mért optikai denzitás, klorofill-a és a karotinoidok koncentrációja mind a száraztömeghez hasonlóan változtak a hígítási aránnyal. A legkisebb növekedési sebességeknél a közepes hígítási arányokhoz képest alacsonyabb biomassza értékeket tapasztaltunk, amelyet az idősebb és a holt sejtek magasabb aránya okozhatott (Lee és Rhee 1997). A hígítási arányokat növelve kezdetben viszonylag állandó biomasszával voltak jellemezhetők a tenyészetek, majd a gyorsabb átfolyás miatt az algák egyre kisebb biomasszát voltak képesek fenntartani a kemosztátokban. A N 2 -kötő tenyészetek már kisebb hígítási aránynál kimosódtak a kemosztát edényekből. Oldott N-forma jelenlétében a biomasszák meghaladták a N 2 -kötőknél mért értékeket. (1. ábra). 125 NH4-N + N2 szárazanyag (mg/l) 1 75 5 25 NO3-N + N2 N2 1. ábra. A szárazanyag mennyiségének változása a hígítási sebességgel,5 1 1,5 A biomasszák változásában megfigyelt tendenciákat a Droop modell (Droop 1973) segítségével magyarázhatjuk, ami a sejtek növekedését a
limitáló tápanyag belső koncentrációjának függvényében írja le a * = * Q µ ( Q) µ max 1 Q összefüggéssel, ahol Q a belső foszforhányad; Q az a minimális belső foszforhányad, ami a sejtek fenntartásához szükséges; µ * az aktuális növekedési sebesség; µ * max a Droop modellből számolt maximális növekedési sebesség. növekedési arány (nap 1- ) 1,5 1,,5 NH 4 -N + N 2 NO 3 -N + N 2 N 2 2. ábra. A szárazanyagra vonatkoztatott belső foszforhányad (Q) értékei az egyes állandósult állapotoknál 5 1 Ha a telítési görbét az ábrázolt mérési pontokra illesztjük (2. ábra), meghatározhatjuk a fajra adott körülmények között jellemző paramétereket. (Q az x tengely metszéspontja; Q,NH 4 + = 1,61; Q,N2 = 2,32; Q,NO 3 - = 1,56; µ * max,nh4 + = 1,49; µ * max,n2 = 1,17; µ* max,no3- = 1,45). A paraméterek értékei megerősítik azt, ami a biomassza változásából is látható: az oldott N-nel ellátott tenyészetek azonos foszforellátottság mellett nagyobb biomasszát voltak képesek fenntartani. A légköri nitrogénnél könnyebben hasznosítható NH + - 4 és NO 3 jelenléte tehát csökkentette a sejtek minimális belső foszforhányadát. A maximális növekedési sebesség is nagyobb volt, mint oldott N-formák hiányában. A minimális foszforhányad csökkenését azzal magyarázhatjuk, hogy a légköri N 2 kötése energiaigényes folyamat, a heterociták kialakításához 15 Q (µg P/mg szárazanyag) 2
és a N 2 -kötéshez is ATP szükséges, valamint a heterociták foszfortartalma magasabb, mint a vegetatív sejteké. A nagyobb maximális növekedési sebességeket is az okozhatta, hogy oldott N- formák jelenlétében lecsökkent az algasejtek foszfor- és energiaigénye. A - NO 3 NH + 4 -vá redukálásához redukált koenzim szükséges. Sok algafaj esetén ezért a NO - 3 -tal ellátott sejtek növekedési jellemzői jelentősen elmaradnak az NH + 4 -mal ellátottakétól (Thompson és mtsai 1989), esetünkben csak enyhébb eltérést tapasztaltunk, hasonlóan a fajjal bőséges P-ellátottság mellett végzett kísérletekhez (Sprőber és mtsai 23). PN / PP PC / PP PC / PN Sejtösszetétel 25 2 15 1 5 2 15 1 5 7,5 5 2,5 NH 4 -N + N 2 NO 3 -N + N 2 N 2 --- Redfield érték,5 1 1,5 h h 3. ábra. A tápanyagarányok változásai PN/PP (A), PC/PP (B), PC/PN (C) a hígítási sebességgel (tömegarányban kifejezve) A kisebb és a közepes hígítási arányoknál a kemosztátokhoz adagolt P-t a sejtek szinte teljes mértékben felvették, erősebb volt a P-limitáció, A B C
mint a magasabb hígítási arányoknál. Az oldott N-formák ellátottsága is kedvezőtlenebb volt, mint a nagyobb átfolyási sebességeknél, így - kevésbé érvényesült a NO 3 és az NH + 4 hatása, kevésbé tértek el egymástól a tenyészetek jellemzői. A PC/PP és PN/PP arányok a P-limitáció enyhülésével csökkentek (3. A-B ábra), a maximális növekedési sebességet megközelítve az optimális tápanyag-ellátottságra jellemző Redfield értékhez (az ábrán szaggatott vonallal jelzett) tartottak, bár nem csökkentek az optimális érték alá. Ez is azt jelzi, hogy még a maximális növekedési sebesség közelében is a P határozta meg a sejtek növekedését. A magasabb növekedési sebesség mellett a sejtek intenzívebb sejtosztódást és fehérjeszintézist végeznek. Ez azzal jár, hogy a sejtekben magasabb a nukleinsav-tartalom (döntően RNS), amely a P-tartalom növekedését jelentős mértékben okozhatta. A N 2 -kötő tenyészetek PC/PP és PN/PP arányai alacsonyabbak voltak, ez a magasabb P-igényüket mutatja. Mivel végig P-limitált körülmények közt dolgoztunk, a PC/PN arányok nem tértek el jelentősen a Redfield értéktől (3. C ábra). A hígítási arányt növelve nagyobb mértékben érvényesült az eltérő energiatartalmú N- formák hatása. A PC/PN arány lecsökkent, különösen NH + 4 jelenlétében, amiért a PN/szárazanyag hányados növekedése felelős. A PC tartalom nem változott jelentősen a hígítási aránnyal egyik nitrogénforma esetén sem. A nagy hígítási arányú oldott N-táplálású kísérletek esetén a PN tartalmat feltehetően a sejtszuszpenzióban oldott nagy mennyiségű, könnyen felvehető oldott N-forma növelte meg. (4. A-B ábra). PN/szárazanyag PC/szárazanyag 6% 5% 4% 3% 15% 1% 5% %,5 1 1,5 hígítási arány (nap-1) NH 4 -N+N 2 NO 3 -N+N 2 N 2,5 1 1,5 A B 4. ábra. A szárazanyagra vonatkoztatott PC (A), PN (B) értékek változása a hígítási sebességgel (tömegarányban kifejezve)
A karotinoid/klorofill-a arány a PC/PN arányhoz hasonlóan csökkent a növekedési sebességgel (5. ábra). A csökkenést legnagyobb részben a klorofill-a tartalom növekedése okozta, ami a PN-tartalommal párhuzamosan változott (6. A-B ábra). A karotinoid-tartalom a PCtartalomhoz hasonlóan viszonylag állandó volt. Hozzánk hasonlóan más szerzők (Heath és mtsai 199, Liu és mtsai 1999) is tapasztalták a PC/PN és a karotinoid/klorofill-a egyidejű csökkenését a növekedési sebesség fokozásával, amikor a maximális növekedési sebességhez közelítve a karotinoid/klorofill-a arány 1 körüli értékhez tartott. karotinoidok / klorofill-a 4 3 2 1 NH 4 -N+N 2 NO 3 -N+N 2 N 2 5. ábra. A karotinoid/klorofill-a arány változása a hígítási sebességgel,5 1 1,5 Számos kísérlet esetén tapasztalták ez nem csak N-limitáció esetén igaz, hogy a tápanyaglimitáció enyhülésével ill. a növekedési sebesség fokozódásával a PN-tartalom és a klorofilltartalom növekszik. A fotoszintetikus apparátus növelése teszi lehetővé a gyors sejtszintézishez szükséges nagy mennyiségű redukált koenzim és energia előállítását. Számos kísérlet esetén tapasztalták a PN és a klorofill-a változása közti korrelációt. P-limitált kemosztátokban Anabaena flos-aquae-val végzett kísérletek során (Rhee és Lederman 1983) a két jellemző közt szoros korrelációt tapasztaltak. A fotoszintetikus apparátus magasabb N- tartalmú fehérjékből áll, de gyorsabb növekedés esetén a sejtek fehérjeés nukleinsav tartalma is növekszik, ez is a PN-tartalom növekedését okozza. A maximális növekedési sebesség közelében az algák
biomasszája jelentősen lecsökkent (1. ábra), így nagyobb mennyiségű fény érte az egyes algasejteket, melyek mérsékelték fotoszintetikus apparátusukat. Ez okozhatta a pigment- és a PN-tartalom enyhe visszaesését (6. A-B ábra). 12 A 15 B µ g PN/mg sz.a. 8 4 µ g kl-a /mg sz.a. 1 5 7 NH 4 -N+N 2 NO 3 -N+N 2 N 2,5 1 1,5,5 1 1,5 6. ábra. A szárazanyagra vonatkoztatott PN (A) és klorofill-a értékek (B) változása a hígítási sebességgel N 2 -kötés A hígítási arányt növelve a kizárólag légköri N 2 -nel ellátott tenyészetek esetén a N 2 -kötés biomasszára vonatkoztatott sebessége fokozódott (7. ábra), amit a javuló P-ellátottság tett lehetővé. Így az egyre gyorsabban növekedő sejtek képesek voltak N-szükségletüket a N 2 kötéséből fedezni. A hígítási arányt növelve, az energetikailag kedvezőbb N-formák egyre erősebben gátolták a N 2 kötését. A NO 3 - részben, míg az NH 4 + teljes mértékű gátlásra is képes volt. Ez egybeesett a legmagasabb PN-tartalom értékekkel, ezért valószínűsíthető, hogy a gátlást az alga N-tartalmának növekedése okozta. A feltételezést irodalmi adatok is alátámasztják, bár a tápoldatbeli oldott N-formák magas koncentrációja közvetlenül is gátolhatta a N 2 - kötést (Sprőber és mtsai 23, Yakunin és mtsai 1995). A Balatonban a C. raciborskii a tápanyagokért más fajokkal verseng; az oldott nitrogénformák jelenléte a nitrogén kötésére képtelen algafajok növekedésének nagyobb mértékben kedvezhetne, így a nitrogénterhelés növelésével a faj biomasszája csökkenhet.
µ g N2 mg sz.a. -1 óra -1 2,4 1,8 1,2,6, NH 4 -N+N 2 NO 3 -N+N 2 N 2,5 1 1,5 7. ábra. A N 2 -kötési sebesség szárazanyagra vonatkoztatott mennyiségének változása a hígítási sebességgel Irodalom Bulgakov N.G., Levich A.P. (1999) The nitrogen: phosphorus ratio as a factor regulating phytoplankton community structure. Arch. Hydrobiol. 146: 3-22. Droop M.R. (1973) Some thougth on nutrient limitation in algae. J. Phycol. 17: 257-265. Heath M.R., Richardson K, Kiørboe T. (199) Optical assessment of phytoplankton nutrient depletion. Arch. Hydrobiol. 146: 3-22. Kenesi Gy., Présing M., Shafik H.M., Kovács W.A., Herodek S. (26) A Cylindrospermopsis raciborskii fonalas cianobaktérium N 2 -kötésének és nitrogénfelvételének vizsgálata foszforlimitált kemosztátokban. Hidrol. Közlöny 86: 56-6. Klausmeier C.A., Litchman E., Daufresne T., Levin S.A. (24) Optimal N:P stoichiometry of phytoplankton. Nature 429: 171-174. Lee D.Y., Rhee G.Y. (1997) Kinetics of cell in the cyanobacterium Anabaena flosaquae and the production of dissoved organic carbon. J. Phycol. 33: 991-998. Liu H., Bidigara R.R., Laws E., Landry M.R., Campbell L. (1999) Cell cycle and physiological characteristics of Synechococcus (WH783) in chemostat culture. Marine Ecology Prog. Ser. 189: 17-25. Présing M., Herodek S., Preston T., Vörös L. (21) Nitrogen uptake and the importance of internal nitrogen loading in Lake Balaton. Freshwater Biol. 46: 125-139. Rhee G.Y., Lederman T.C. (1983) Effects of nitrogen sources on P-limited growth of Anabaena flos-aquae. J. Phycol. 19: 179-185. Sprőber P., Shafik H.M., Présing M., Kovács W.A., Herodek S. (23) Nitrogen uptake and fixation in the cyanobacterium Cylindrospermopsis raciborskii under different nitrogen conditions. Hydrobiologia 56-59: 169-174.
Thompson P.A., Levasseur M.E., Harrison P.J. (1989) Light-limited growth on ammonium vs. nitrate: What is the advantage for marine phytoplankton? Limnol. Oceanogr. 34: 114-124. Yakunin A.F., Troshina O.Y., Gogotov I.N. (1995) Relationship between nitrogenase synthesis and C/N ratio in the nitrogen fixing cyanobactetrium Anabaena variabilis. Microbiology 64: 1-12.