9. Előadás Fehérjék

Előzmények Peptidkémia Analitikai kémia Protein kémia 1901 E.Fischer : Gly-Gly 1923 F. Pregl : Mikroanalitika 1952 Stein and Moore : Aminosav analizis 1932 Bergman és Zervas : Benziloxikarbonil csoport 1963 B. Merrifield : Szilárd fázisú peptid szintézis Kromatográfia Elektroforézis Röntgen (X-ray) krisztallográfia 1954 P. Edman : Protein szekvenálás 1955 F. Sanger : Az inzulin priemr szerkezete 1988 Á. Furka : Kombinatorkus peptid szintézis NMR Tömeg spektroszkópia 1962 M.F. Perutz és J. C. Kendrew A myoglobin térszerkezete

A peptid kötés: amid kötés (E.Fischer, 1902) N-terminális C-terminális Dipeptid: 2 Oligopeptid : 2-15 Polipeptid: >15

Kötéstípusok a fehérjékben Kovalens Nem kovalens Amid Diszulfid - CO NH - - S S - Hidrofób, Van der Waals H-híd (inter és intra) ionos

Fehérjék szerkezetének meghatározása 1. Tisztítás homogén minta előállítása 2. Aminosavsorrend (primer szerkezet) meghatározása - aminosavösszetétel - aminosavsorrend - N-terminális aminosav - C-terminális aminosav 3. Térszerkezet (3D) meghatározása - szekunder (másodlagos) - tercier (harmadlagos, szupermásodlagos) - quaterner (negyedleges)

1. Fehérje izolálás gélelektroforézis (egy- és kétdimenziós) Salmonella thyphimurium SDS-PAGE, 200 µg protein, 3,5 x 0,8 cm Autoradigram, 2D, E. Coli proteinek, 10 µg, 14 C jelzett aminosav a táptalajban, 2,3 x 1,3 cm, exp. 825 h

Gélelektroforézis

Egydimenziós gélelektroforézis (méret szerint) HeLa sejtmag fehérjék Swiss-Prot

Fehérjék kimutatása, mennyiségi meghatározása a) Amino csoport kimutatás b) Biuret próba Reagens: CuSO 4 /NaOH λ = 540-550 nm c) Lowry-Hartree Reagens: biuret + 3 H 2 OxP 2 O 5 x13 WO 2 x5 MoO 3 10 H 2 O, Folin-Ciocalteu-fenol λ = 720-750 nm d) BCA (bicinoninic acid, Reagens: biuret + BCA λ = 562 nm e) Bradford reagens (trifenil-metion) λ = 595 nm

2. Primer szerkezet 1. Diszulfid-híd felbontása

2.1. Aminosav összetétel meghatározása 2.1.1. Hidrolizis O O NH 2 -CH 2 - C Gly-Ala H 2 O / 6M HCl 105 o C NH-CH-COOH CH 3 NH 2 -CH 2 - C glicin + OH NH-CH-COOH CH 3 alanin 2.1.2. Elválasztás, származékképzés Ioncserés kromatográfia, Rockefeller Intézet, 1950 Gyanta: vízben nem oldódó polimer SO 3- csoportokkal Detektálás: ninhidrin reakció, λ = 570 nm

2.1.3.1. Származékképzés és elválasztás Származékképzés: o-ftálaldehid Elválasztás:HPLC, Detektálás: λg = 360 nm λe = 455 nm Hunkapiller et al. Science, 1984

2.1.3.2. Származékképzés D/L-aminosav meghatározására NO2 NH * CH CONH2 O2N F 1-fluor-2,4-dinitrofenil- 5-L-Ala-amid (FDAA) CH3 + * H2N CH COOH Q (D,L) ph 9,0; 10 perc NO2 NH * CH CONH2 NO2 NH * CH CONH2 CH3 CH3 O2N * NH CH COOH O2N * NH CH COOH Q Q D,L-származék L,L-származék HPLC elválasztás

2. 2. Aminosav sorrend meghatározása 2.2.1. N-terminális 2.2.1.1. Sanger reakció, 1958, inzulin NO2 NO2 O2N 4 2 F + H2N CH CO - R NaHCO 3 O2N NH CH CO - R + HF 1-fluor-2,4-dinitro benzol NO2 NH CH CO - 6 M HCl NO2 NH CH COOH R R O2N O2N + aminosavak 2,4-dinitrofenil fehérje 2,4-dinitrofenil aminosav λ=254 nm

2.2.1.2. 1-dimetilamino-naftalin-5-szulfonil klorid (Dansyl-klorid, Hartley, 1963) H3C N CH3 + NH 2 -L-K-A-D-P-N-R-F-G-A-D-L-COOH O S O Cl H3C N CH3 bázis ph 7,5-8,0 O S O +HCl NH-L-K-A-D-P-N-R-F-G-A-D-L-COOH H3C N CH3 6 M HCl hidrolizis O S O NH-Leu-COOH + K, A, D, P, N, R, F, G-COOH (Dansyl-aminosav) λ g =360 nm λ e =480 nm

2.2.2. C-terminális NH 2 -L-K-A-D-P-N-R-F-G-A-D-L-COOH + H 2 N - NH 2 90 o C 20-100 óra + NH 3 -L CO -NH-NH 2, + NH 3 -K-CO-NH-NH 2... + NH 3 -L-COO - 2.3. Edman lebontás (P. Edman, Lund, 1950) 1. lépés: Reakció fenilizotiocianáttal (addició) 2. lépés: Hidrolizis 3. lépés: A feniltiohidantoin származék azonosítása

1. lépés: Reakció fenilizotiocianáttal N = C = S NH 2 - CH CO -... + ph 8-9, 40 o C R S II NH - C - 2. lépés: Hidrolizis (H + /TFA) NH - CH CO -... R feniltiocarbamil származék anilinotiozolinon származék fenilhidantoin (PTH) aminosav

3. lépés: A feniltiohidantoin származék azonosítása

2.4. Fehérjék feldarabolása 2.4.1. Kémiai hasítás 2.4.1.1. Reakció brómciánnal (BrCN), Met - + H 2 O, H + NH 2 -CH-COOH (CH 2 ) 2 OH homoszerin

2.4.1.2. Reakció hidroxilaminnal (NH 2 - OH) Asp - Gly 2.4.1.3. Reakció 2-nitro-4-tiociano - benzoesav - Cys O 2 N HOOC N = C = S 2.4.2. Enzimatikus hasítás Terminológia (Schechter, Berger) -S4 S3 S2 S1 S1 S2 - S3 S4 enzim - P4 P3 P2 P1 P1 P2 - P3 P4 szubsztrát - P4 P3 P2 P1 OH + H- P1 P2 - P3 P4 Szerin proteázok: tripszin (Arg, Lys) P1, trombin, kimotripszin (Tyr, Trp, Phe) P1, elasztáz, kallikrein.. Cisztein proteáz: papain, actinidin... Karboxil proteáz: pepszin, katepszin D (lizoszoma), LysC (Lys) P1, GluC (Glu, Asp)... Aminoproteáz: AspN (Asp)P1... Metalloproteáz: temolizin, karboxipeptidáz A...

Primer szerkezet, aminosavsorrend - összegzés

Szerkezeti hierarchia

Az amid kötés Delokalizáció, 2 e, 3 atom - Gyenge N bázis - Erős H-híd - Részleges kettős kötés - Síkalkat - Cisz/transz izoméria Nomenklatúra

A Ramachandran térkép - bevezetés

A Ramachandran térkép

Másodlagos szerkezet típusai

A Ramachandran térkép - összefoglalás

Konformerek energiatartalma Források : kötéshossz (Ed) változatlan vegyértékszög (Eo) változatlan torziós szög (Eω) - változik Nem kötött atomok távolsága (Ew) Kötő elektronpárok kölcsönhatása (Eh) Elektrosztatikus kölcsönhatás ( Példa: E = Ed + Eo + Eω + Ew + Eh + Ee Fehérje 100 aminosavból a) ha: 10 konformáció/as lehetséges akkor: 10 100 konformer b) ha: 2 konformáció/as lehetséges akkor: 10 30 konformer

Szupermásodlagos szerkezetek Görög kulcs Béta kígyó Csoportosítás Alfa (α) Béta (β) csak alfa hélix csak béta réteg Alfa + béta ( α + β) hélix és réteg egymástól távol Alfa/béta (α/β) hélix és réteg egymással kölcsönhatásban

Negyedleges szerkezet - a kollagén

A protemika alapjai Eredet (taxonomia) Lizis 1. Fehérje-expresszió expresszió Sejtlizátum -nukleinsavak -fehérjék -lipidek -szénhidrátok... E lválasztás - elekroforézis - kromatográfia - UC Izolált fehérje Primer szerkezet - aminosavsorrend Szerkezetvizsgálat - kémiai, enzimatikus lebontás - MS - bioinformatika Annotáció Primer szerkezet -alegységek -poszt-transzlációsmodosulások Térszerkezet Lokalizáció Funkció(k) -Ca 2+ kötés -Znfinger -ATPkötés Rokonság más fehérjével Asszociáció betegséggel

A protemika alapjai Eredet (taxonómia) Fehérje expresszió lizis Sejtlizátum -nukleinsavak -fehérjék -lipidek -... Elválasztás (elektroforézis, UC...) Izolált fehérje Szerkezetvizsgálat (kémiai lebontás, MS.. Primer szerkezet (aminosavsorrend) Annotáció Alegységek Poszt-transzlációs Térszerkezet Lokalizáció Funkciók: fémion Kötődés, ATP kötés Rokonság más fehérjékhez Asszociáció betegséggel

Fehérje bioszintézise

A) Nem fehérje alkotó természetes aminosavak H 2 N C H COOH H 2 N C H 2 C H2 C H2 - CO 2 Glu dekarboxiláz C H2 C H2 γ-aminovajsav (GABA) HOOC HOOC Glu Lys/Met + C-vitamin (máj) H3C C H3 N + C H3 C H2 C H OH C H2 Karnitin Zsiranyagcsere Mitokondrium transzport Sejtpermeabilitás HOOC B) β H2N CH2 CH2 COOH α Állat, ember + Növény - béta-alanin C H3 HO C H2 C C H CO NH C H2 C H2 COOH H3C OH pantoténsav

C) D) H 2 N C H COOH C H 2 S H cisztein 1. CO 2 2. oxidáció (máj, B6) H 2 N C H 2 C H 2 SO 3 H taurin epesav alkotórész neurotranszmitter vérlemezke Állat Ember Növény migrén? + - H 2 N C H COOH (CH 2 ) 3 HN C NH 2 NH arginin argináz +H 2 O H 2 N C H COOH (CH 2 ) 3 NH 2 ornitin + H 2 N C H COOH H 2 N C NH 2 O +NH 3, + CO 2 karbamid (urea) urea ciklus (máj) hagyma, fokhagyma detoxifikáció (CH 2 ) 3 HN C NH 2 O citrulin (citrullus lat görögdinye)

E) C H 3 HN C H 2 COOH szarkozin (izom) H 2 N-CN C H 3 N H 2 C N C H 2 COOH NH kreatin. H 2 O (N-metil-guanidino-ecetsav) op: 303 o C izom H 2 PO 4 -NH - (kreatin-foszfát)