Természetes eredetű, potenciálisan biológiailag aktív - és C- prenilezett flavanonok szintézise Doktori (PhD) értekezés Kenéz Ágnes Témavezető: Prof. Dr. Antus Sándor Debreceni Egyetem Természettudományi Doktori Tanács Kémiai Tudományok Doktori Iskola Debrecen, 2007
Ezen értekezést a Debreceni Egyetem TTK Kémia Doktori iskola Természetes eredetű heterociklusos vegyületek című K/6 programja keretében készítettem a Debreceni Egyetem TTK doktori (PhD) fokozatának elnyerése céljából. Debrecen, 2007. február 08. Kenéz Ágnes jelölt Tanúsítom, hogy Kenéz Ágnes doktorjelölt 2002-2007 között a fent megnevezett Doktori Iskola K/6 programjának keretében irányításommal végezte munkáját. Az értekezésben foglalt eredményekhez a jelölt önálló alkotó tevékenységével meghatározóan hozzájárult. Az értekezés elfogadását javasolom. Debrecen, 2007. február 08. Dr. Antus Sándor tszv. egyetemi tanár, akadémikus témavezető
Köszönetnyílvánítás Köszönetemet szeretném kifejezni Dr. Antus Sándor akadémikus tanszékvezető egyetemi tanárnak, hogy munkámat irányította és értékes útmutatásaival segítette. Köszönettel tartozom a dolgozat összeállításában és megírásában nyújtott segítségéért is. Köszönetet mondok Dr. Juhász Lászlónak és Dr. Kónya Krisztinának a szakmai és technikai tanácsaikért, amelyekkel mindennapi munkámat segítették. Köszönettel tartozom Dr. Lenkey Bélának, hogy lehetőséget teremtett a farmakológiai vizsgálatokhoz, és megköszönöm Lestár Zsombornak ezen vizsgálatok kivitelezését. Köszönöm Balla Sárának az NMR spektrumok felvételét és kiértékelésükben nyújtott segítségét. Köszönetet mondok kedves kollégáimnak, hogy közvetlenül vagy közvetetten segítségemre voltak és támogatották munkámat (Dr. Gulácsi Katalinnak, Kertiné Ferenczi Renátának, Kerti Gábornak, Dr. Kurtán Tibornak, Czakó Zoltánnak, Magyar Lászlónénak, Varga Lajosnénak, Kupásné Fadgyas Katalinnak). Végül, de nem utolsó sorban szeretném megköszönni családomnak és barátaimnak a sok türelmet és bíztató szavakat, amellyel az elmúlt évek során támogattak munkám elvégzésében.
Kenéz Ágnes: Természetes eredetű, potenciálisan biológiailag aktív - és C-prenilezett flavanonok szintézise Tartalomjegyzék Tartalomjegyzék 1. Bevezetés 1 1.1. Flavonoidok és jelentőségük 1 1.2. Flavonoidok bioszintézise 5 2. Irodalmi előzmények 7 2.1. Prenilezett flavanonok előfordulása és biológiai hatása 7 2.2. Prenilezett flavanonok bioszintézise 8 2.3. Flavanonok szintézise 11 2.3.1. Racém flavanonok szintézise 11 2.3.2. ptikailag aktív flavanonok szintézise 15 2.4. Gombás megbetegedések és antifungális szerek 19 2.5. Antifungális hatású flavonoidok 24 3. Kísérleti munkám 26 3.1. Célkitűzés 26 3.2. -prenilezett flavanonok szintézise 27 3.2.1. Selinone szintézis I. 27 3.2.2. Selinone szintézis II. 30 3.2.3. Monotesone A szintézis I. 32 3.2.4. Monotesone A szintézis II. 34 3.2.5. Selinone és monotesone A analogonok szintézise 36 3.3. C-prenilezett flavanonok szintézise 40 3.3.1. Lonchocarpol A szintézise 40 3.3.2. Monotesone B szintézise 43 3.3.3. Lonchocarpol A és monotesone B analogonok szintézise 45 3.4. Kísérletek optikailag aktív flavanonok szintézisére 50 3.5. Farmakológiai vizsgálatok eredményei 53 4. Kísérleti rész 56 4.1. Alkilezések 56 4.1.1. Benzilezés 56
Kenéz Ágnes: Természetes eredetű, potenciálisan biológiailag aktív - és C-prenilezett flavanonok szintézise Tartalomjegyzék 4.1.2. Metoximetilezés 58 4.1.3. C-prenilezés 61 4.1.4. -prenilezés 62 4.1.5. Egyéb alkilezések 65 4.2. Kalkonok előállítása 67 4.3. Flavanonok előállítása 73 4.4. Észteresítés (acilezés, szulfonilezés) 79 4.5. Védőcsoport hasítások 81 4.5.1. Acetil (szulfonil) csoport(ok) eltávolítása 81 4.5.2. Benzil csoport(ok) eltávolítása 83 4.5.3. Metoximetil csoport(ok) eltávolítása 84 4.6. xidáció 88 5. Összefoglalás 89 6. Summary 93 7. Irodalomjegyzék 101 8. Függelék 114
Kenéz Ágnes: Természetes eredetű, potenciálisan biológiailag aktív - és C-prenilezett flavanonok szintézise Bevezetés 1. Bevezetés 1.1. Flavonoidok és jelentőségük A flavonoidok a növényvilág fenolos komponensei közé tartozó - heterociklusos vegyületek igen elterjedt csoportját alkotják. Nemcsak a növények változatos színvilágának kialakításában vesznek részt, de sokrétű biológiai aktivitásuk révén az emberi szervezetre is jótékony hatást gyakorolnak. Általánosságban flavonoid összefoglaló névvel azokat az oxigéntartalmú heterociklusos vegyületeket és velük rokon szerkezetű nyíltláncú származékokat illetik, amelyek difenilpropán vázat (C 6 -C 3 -C 6 ) tartalmaznak. Csoportosításuk nagy számuk és változatos szerkezetük miatt többféle szempont szerint történhet. A benzolgyűrűk elhelyezkedése alapján három szerkezeti izomert különböztetnek meg: 1,1- (neoflavonoidok, 1), 1,2- (izoflavonoidok, 2) és 1,3- difenilpropánvázas (flavonoidok, 3) vegyületeket (1. ábra). 3 1 2 2 2 3 1 1 3 2 3 1 1. ábra: Difenilpropán alapvázak Freudenberg [1] mutatott rá először, hogy ezekben a vegyületekben a propánváz oxidációs állapota jelenti a különbséget. Mindhárom természetes vegyületcsaládra jellemző a polihidroxiszubsztitúció, valamint jelentősek az - és C-alkil [metil-, prenil- (3,3-dimetilallil), geranil-, stb.] illetve a prenilcsoport gyűrűzáródása révén képződő 2,2-dimetil-2H-piránszármazékok is. A flavonoidok (3) legjelentősebb képviselői közé a flavanonok (4), flavonok (5), flavonolok (6), flavanonolok (7) és antocianidinek (8) tartoznak (2. ábra). 1
Kenéz Ágnes: Természetes eredetű, potenciálisan biológiailag aktív - és C-prenilezett flavanonok szintézise Bevezetés R R R' 4 R R' 5 6 H R' H H R R R' R' 7 8 2. ábra: Flavonoidok felosztása Napjainkig több mint négyezer, különböző növényekből izolált flavonoid szerkezetét határozták meg, és számosnak a szerkezetigazoló szintézisét is kidolgozták. Manapság pedig, a biológiailag aktív származékok körében, egyre nagyobb hangsúlyt fektetnek a hatás-szerkezet összefüggések tisztázására is. E vegyületcsalád biológiai jelentőségére magyar kutatók [2, 3] hívták fel a figyelmet, és az azóta eltelt évtizedekben a növénykémia egyik legintenzívebben vizsgált kutatási területévé vált a flavonoidkémia. A flavonoidok fontos élettani hatásaira először a C-vitamin felfedezése során (Szent-Györgyi, 1933) figyeltek fel. Szent-Györgyi és munkatársai rámutattak arra, hogy a hatás kifejtéséhez a C- vitamin mellett még más, növényi eredetű anyagok is szükségesek [2]. A szerkezetvizsgálatok során kiderült, hogy ezek az anyagok flavanon típusú vegyületek, a heszperetin (9) és az eriodiktiol (10) -glikozidjai (3. ábra). H H H H H H 9 CH 3 10 H 3. ábra: Heszperetin (9) és eriodiktiol (10) Az elmúlt évtizedekben számos tanulmány [4-6] foglalkozott a flavonoidok antioxidáns hatásával. E vizsgálatokból egyértelműen kiderült, hogy az 1,3-difenilpropanoid származékok körében a 4-oxo, a C-2, C-3 helyzetű kettős 2
Kenéz Ágnes: Természetes eredetű, potenciálisan biológiailag aktív - és C-prenilezett flavanonok szintézise Bevezetés kötés [7] és az o-dihidroxicsoport jelenléte [8] a meghatározó az antioxidáns sajátságban. Elsősorban a B-gyűrű 3 - és 4 -helyzetű hidroxilcsoportjai tehetőek felelőssé az antioxidáns hatásért, mert nemcsak elektrontranszfer készségük révén egészítik ki a C-vitamin hatását, (4. ábra) hanem kelát gyűrűbe zárva megkötik a C-vitamin oxidációját gyorsító fémnyomokat, így segítik annak felszívódását és megakadályozzák a hidrogénperoxid Fenton-reakció révén történő bomlását. H A H C B H - H + H Ar B H - e + e Ar B H Ar 4. ábra: Flavonoidok antioxidáns hatása A flavonoidok, antioxidáns hatásuknak köszönhetően, képesek a szervezetben lévő agresszív szabadgyököket semlegesíteni és ezzel gátolják a sejtmembránok károsodását okozó lipid autoperoxidációt. A tudományos vizsgálatok során kiderült, hogy a flavonoidok nem csak a növényi sejtek molekuláris szintű működésének szabályozásában játszanak fontos szerepet, de számos, a népi gyógyászatban régóta használt növény fő alkotói is. Sokrétű biológiai hatásuk miatt hamar a gyógyszeripar figyelmének központjába kerültek, lehetséges rákellenes [9,10], kardiovaszkuláris [11], antibakteriális [12-15], antifungális [16-19] és gyulladásgátló [20,21] hatásuk révén jelentős gyógyszerkomponensekké váltak. Emellett egyes flavonoidok igen figyelemreméltó anti-hiv hatást [22,23] mutatnak, másoknak potenciális csontritkulást gátló hatása van [24] és számos, enzimrendszerek működését befolyásoló [25,26] származék is ismeretes. A flavonoid hatóanyagú gyógyszerek közül a legismertebb készítmények a Legalon (Madus) és a Rutascorbin (ICN, korábban Alkaloida Gy.). Az utóbbi hatóanyaga az érfal permeabilitását szabályzó anyag a rutin, (kvercetin 3--β-rutinozid, 11, 5. ábra), az előbbié pedig a lilavirágú máriatövisből (Silybum marianum) Wagner és munkatársai által izolált, májvédő 3
Kenéz Ágnes: Természetes eredetű, potenciálisan biológiailag aktív - és C-prenilezett flavanonok szintézise Bevezetés hatású flavanolignánok, a (+)-silychristin (12), a (+)-silydianin (13), a (+)-isosilybin (14) és a (+)-silybin (15) [27] keveréke (6. ábra). H R H 11 H H rutin (kvercetin-3--rutinozid) R=rutinóz (6--α L-ramnozil- β-d-glükóz) H H 3 C H 5. ábra: Rutin H H H H A flavanolignánok májvédő hatása elsősorban antioxidáns és szabadgyökfogó, valamint a májsejtek proteinszintézisét stimuláló tulajdonságaikkal hozható összefüggésbe. H H H H H H H 12 H H Me H H H H H H H Me H 13 Me H H H H H H H 14 H H H H H H H H H 15 H Me H 6. ábra: Flavanolignánok 4
Kenéz Ágnes: Természetes eredetű, potenciálisan biológiailag aktív - és C-prenilezett flavanonok szintézise 1.2. Flavonoidok bioszintézise Bevezetés Doktori munkám során természetes eredetű, potenciálisan biológiailag aktív flavanonok szintézisével és hatás-szerkezet összefüggés (SAR) vizsgálatával foglalkoztam, ezért a továbbiakban csak e vegyületcsalád bioszintézisét és szintézis irodalmát (2.3. fejezet) ismertetem röviden. A flavonoidok bioszintézisével foglalkozó tanulmányok (Hahlbrook és Grisebach, 1975; Ebel és Hahlbrook, 1982; Heller és Forkman, 1988; Halborne, 1988; Zaprometov, 1989; Stafford, 1990) általában megegyeznek abban, hogy kiindulási anyagként szénhidrátanyagcsere-termékeket feltételeznek. A flavonoidok biogenezisére a legvalószínűbbnek és általánosan elfogadottnak a 8. ábrán vázolt bioszintetikus út tekinthető [28-31]. A flavanon (4) formálisan az 1,3-difenilpropán (3) oxidációs termékének tekinthető, amely 2-hidroxiacetofenon (16) és benzaldehid származékok (17) Claisen-Schmidt kondenzációjában képződő 2 -hidroxikalkon (18) gyűrűzárásával keletkezik (7. ábra). R H + 16 17 R' R R' R H 7. ábra: Flavanonváz kialakulása A bioszintézis első lépéseiben a fenilalaninból, fenilalanin-ammónia-liáz (PAL) enzim által katalizált dezaminálással fahéjsav képződik, melynek hidroxilezését membránhoz kötött P450 monooxigenáz (fahéjsav-4-hidroxiláz, C4H) végzi (ezt adja a tirozin ammónia-liáz enzim (TAL) katalizálta tirozin dezaminálása is). Az így kialakult p-hidroxikumarilsav aktiválását 4-kumaroil-Co- A-vá a 4-kumarát-koenzim A ligáz (4CL) végzi. A növényekben a flavanonváz B-gyűrűje kalkon szintáz (CHS) segítségével 4-kumaroil-Co-A-ból, míg az A-gyűrű három, acetil-coa-ból és C 2-18 4 R' 5
Kenéz Ágnes: Természetes eredetű, potenciálisan biológiailag aktív - és C-prenilezett flavanonok szintézise Bevezetés ból acetil-coa-karboxiláz enzim (KE) hatására képződő malonil-co-a egységekből épül fel (8. ábra). Tirozin Fenilalanin Acetil-CoA C 4 H KE TAL PAL 4CL 3 SCoA H SCoA R 1 R 2 CHS H H H R 2 19-22 23-26 R 1 CHI H H A C 27-30 B R 2 R 1 izoflavonok, flavonolok, flavanolok, antocianidek, stb... Sorszám Származékok R 1 R 2 19, 23, 27 cinnamoil-coa/pinocembrin kalkon/pinocembrin H H 20, 24, 28 p-kumaroil CoA/naringenin kalkon/naringenin H H 21, 25, 29 kaffeoil-coa/eriodiktiol kalkon/eriodiktiol H H 22, 26, 30 feruloil-coa/homoeriodiktiol kalkon/homoeriodiktiol H CH 3 8. ábra: Flavonoid bioszintézis A flavanon alapváz prekurzora a körülményektől függően 2,4,4,6 - tetrahidroxikalkon vagy annak 6 -dezoxiszármazéka lehet. E kalkonok sztereospecifikus gyűrűzáródása a kalkon-izomeráz (CHI) enzim hatására következik be, és (2S)-flavanonszármazékok keletkeznek, melyek megfelelő enzimkatalízissel további flavonoidokká és izoflavonoidokká alakulhatnak tovább. 6
Kenéz Ágnes: Természetes eredetű, potenciálisan biológiailag aktív - és C-prenilezett flavanonok szintézise Irodalmi előzmények 2. Irodalmi előzmények 2.1. Prenilezett flavanonok előfordulása és biológiai hatása Tekintve, hogy doktori munkám középpontjában természetes eredetű, prenilezett flavanonok szintézise és hatás-szerkezet összefüggéseinek vizsgálata állt, a továbbiakban, a teljesség igénye nélkül ilyen típusú vegyületek természetbeni előfordulását és biológiai aktivitását ismertetem. A természetben elterjedt flavanonok alkil oldalláncot, főként metil-, prenilés geranil-egység(ek)et tartalmazó polihidroxi vegyületek. Általában a flavanonváz (4) A- és B-gyűrűjén hordozzák az alkil funkciót közvetlenül a gyűrűhöz (C-alkil) vagy hidroxi csoporthoz (-alkil) kapcsolva. Ezen csoportok változatos szubsztitúciója révén nagyszámú természetes flavanonszármazék létezik. Az izolált származékok szerkezetfelderítése mellett számos esetben a szerkezetbizonyító szintézisüket is megoldották, valamint a biológiai aktivitással is rendelkező flavanonok körében hatás-szerkezet összefüggésekre irányuló vizsgálatok is készültek. A növényi extraktumokban a flavanonok mellett megjelennek a kalkon prekurzorok valamint a prenilezett flavanonszármazékok esetében a prenil csoport gyűrűzáródásával kialakuló pirán struktúrával rendelkező vegyületek valamint ezek átalakulási termékei is. A prenilcsoporttal és annak gyűrűzáródásával képződő, 2,2-dimetil-2Hpirán struktúrával rendelkező természetes flavanonok túlnyomó része C-prenilezett származék, melyek többsége sokrétű biológiai aktivitással is jellemezhető. Legtöbbjükre a flavonoidvázból eredő antioxidáns hatás jellemző [32], de több közleményben számolnak be antibakteriális [96] és antivirális hatású [33] C- prenilezett flavonoidokról is. Így pl. a likokalkon-c (31) hatásosnak bizonyult a Staphylococcus aureus ellen [34], míg a 2,5,6,7,-tetrahidroxi-8-lavandulil-4 - metoxi-6-prenilflavanon (32) teljesen gátolja e gomba kifejlődését [35] (9. ábra). 7
Kenéz Ágnes: Természetes eredetű, potenciálisan biológiailag aktív - és C-prenilezett flavanonok szintézise Irodalmi előzmények H Me H Me H H H H likokalkon-c 31 32 9. ábra Az irodalomban számos példa található antibakteriális [16,36], tumorellenes [37], antifungális [16,19], sőt anti-hiv aktivitású [23] valamint enzimműködést befolyásoló [26] prenilezett származékra is. 2.2. Prenilezett flavanonok bioszintézise Korai felfogások a prenil-lánc (3,3-dimetilallil) prekurzorának az izopentenil-difoszfátot (IPP) illetve a dimetilallil-difoszfátot (DMAPP)) tartották. Akkoriban az egyetlen, általánosan elfogadott, IPP-hez vezető folyamat a 10. ábrán bemutatott mevalonát út [38] volt. 8
Kenéz Ágnes: Természetes eredetű, potenciálisan biológiailag aktív - és C-prenilezett flavanonok szintézise Irodalmi előzmények 2 SCoA H SCoA H 2 C H SCoA + EnzSH HMG-CoA acetil-coa EnzSH SEnz HMG-CoA reduktáz NADPH H H 2 C H mevalonsav (MVA) 33 H 2 ATP H H NADPH H 2 C H 3-hidroxi-3-metilglutáraldehidsav 5 3 1 P ADP ATP 2 PP H H 4 H H - C R S 2 PP izopentenil PP (IPP) H 2 C izomeráz R H H H SCoA 3-hidroxi-3-metilglutáraldehidsav hemitioacetál PP dimetilallil PP (DMAPP) H R + R H C-prenil származék -prenil származék 10. ábra: Mevalonát-út A mevalonsavhoz (33) vezető út első lépésében két acetil-coa molekula Claisen kondenzációjával acetoacetil-coa keletkezik, amely egy harmadik acetil- CoA molekulával sztereospecifikus aldol reakcióban β-hidroxi-β-metilglutaril- CoA-vá (HMG-CoA) alakul át. Ebből 2 lépéses redukcióban keletkezik a mevalonsav (MVA) (33), amelynek alkoholos hidroxilcsoportjait két különböző ATP-függő enzim foszforilezi, majd az így kialakult difoszfát enzimatikus reakcióban széndioxidvesztést követő eliminációval izopentenil-difoszfáttá (IPP) alakul. Ennek izomerizációja szolgáltatja a dimetilallil-difoszfátot (DMAPP), amely a megfelelő fenolszármazékon (pl. polihidroxiflavanon) - és C-prenil oldalláncot alakíthat ki. 9
Kenéz Ágnes: Természetes eredetű, potenciálisan biológiailag aktív - és C-prenilezett flavanonok szintézise Irodalmi előzmények A közelmúltban azonban eubaktériumokban [39, 40] és zöldalgákban [41] felfedeztek egy mevalonát-független utat is. A két mód közötti különbség az IPP kialakulásában mutatkozik meg: a mevalonát út kiindulási anyaga acetil-co-a, míg a mevalonát-független út során glicerinaldehid foszfátból (GAP) képződő piruváton át vezet az út az IPP keletkezéséhez. Ezt az utat igazolja a 11. ábrán vázolt 13 C-izotópos vizsgálat is. Glükóz p-kumaroil-coa P H H H P GAP H malonil-coa H H H H CH P PEP CH piruvát acetil-coa H H H H P 1-dezoxixilulóz-5-P H CH H mevalonsav (33) (MVA) 2 5 1 PP 3 4 IPP PP 5 1 2 3 IPP glabrol (34) 4 PP DMAPP PP DMAPP 11. ábra: Mevalonát-független út 1998-ban Asada és munkatársai [42] az édesgyökérből (Glycyrrhiza glabra) egy prenilezett flavanonszármazékot, a glabrolt (34) izolálták, amelynek prenilcsoportjai a mevalonát-független úton alakulnak ki. Ezt a bioszintetikus út 13 C-izotópos nyomonkövetésével igazolták, amelynek során egyértelműen kiderült, hogy a gabrol (34) dimetilallil része a glicerinaldehid foszfát-piruvát úton keletkező DMAPP-ből származik. A két út közötti különbséget jól szemlélteti a 11. ábra, ahol a 13 C-izotópok eltérő helyzete egyértelműen jelzi az IPP (DMAPP) keletkezésének módját (a mevalonát-független úton keletkező DMAPP C-1 és C-5, 10
Kenéz Ágnes: Természetes eredetű, potenciálisan biológiailag aktív - és C-prenilezett flavanonok szintézise Irodalmi előzmények míg a mevalonát úton kialakuló DMAPP C-2, C-4 és C-5 helyzetben hordozza a fekete pontokkal jelölt 13 C-izotópokat). 2.3. Flavanonok szintézise 2.3.1. Racém flavanonok szintézise A doktori munkám során flavanonszármazékokat állítottam elő, ezért ennek részletes tárgyalása előtt fontosnak tartom a flavanonváz kialakításának irodalmát röviden áttekinteni. Jóllehet egyszerű kiindulási anyagokból elméletileg számos lehetőség van a C 6 -C 3 -C 6 flavanonváz (4) kialakítására, ezek közül leginkább kettő terjedt el a laboratóriumi gyakorlatban [43]: a.) a bioszintetikus útnak megfelelően fenolok (35) (C 6 egység) acilezése fahéjsavszármazékokkal (36) (C 6 -C 3 egység) b.) valamint C 6 -C 2 egység (2-hidroxiacetofenon 16) kondenzációja a C 6 -C 1 (benzaldehid 17) egységgel (12. ábra). R R H HC a + R' 35 36 R A C H HC b + R' 16 17 4 B R' 12. ábra: Flavanonváz kialakulása Mindkét esetben első lépésben nyílt láncú intermedierek képződnek, melyek megfelelő reagensek segítségével gyűrűzárással flavanonokká alakíthatók. Az a.) módszer kevésbé terjedt el a gyakorlatban, mivel a szubsztituált fenoloknak fahéjsavszármazékokkal végzett Friedel-Crafts reakciója általában alacsony hozammal vezet kalkonokhoz, amelyekből a flavanonok nyerhetők. 11
Kenéz Ágnes: Természetes eredetű, potenciálisan biológiailag aktív - és C-prenilezett flavanonok szintézise Irodalmi előzmények A rezorcin (37) és a fahéjsav (38) reakciója polifoszforsav jelenlétében egyik legegyszerűbb példa az a.) módszerre. Talapatra és munkatársai [44] a reakciókörülmények optimalizálásával elfogadható hozammal (62%) állították elő a 7-hidroxiflavanont (39) ezen az úton (13. ábra). H H H H + H H H 37 38 39 13. ábra Rezorcin-monometil-éterből (40) és fahéjsavból (38) hasonló körülmények között azonban a 2 -hidroxi-4 -metoxikalkon (41) és 2 -metoxi-4 -hidroxikalkon (42) kromatográfiásan elválasztható keverékét igen alacsony hozammal (12%) kapták meg (14. ábra). H Me H H + Me H 40 38 H Me + 41 42 14. ábra Ichino és munkatársai [45] természetes eredetű kalkonszármazékok (45a, 47) alacsony hozamú szintézisét valósították meg ezzel a módszerrel alumíniumklorid jelenlétében. Gyűrűzáródást e reakciókörülmények között azonban nem tapasztaltak, és így a 3,4,5-trimetoxifenolból (43a) és a fahéjsav-kloridból (44), a helilandin B-hez (45a) illetve a fazanonhoz (46) jutottak (15. ábra). 12
Kenéz Ágnes: Természetes eredetű, potenciálisan biológiailag aktív - és C-prenilezett flavanonok szintézise Irodalmi előzmények Me Me Me Me Me Me AlCl 3 + Cl PhN 2 H H 43a 44 45a Br DMF K 2 C 3 Δ Me Me Me 39 Me Me Me BCl 3 Me Me H b.) módszer AlCl 3 CH 2 Cl 2 ipr PhN 2 ipr -70 o C H 43b 45b 46 15. ábra 2-hidroxiacetofenonok (16) és aromás aldehidek (17) kondenzációja lúgos közegben 2 -hidroxikalkonok (18) képződéséhez vezet, amelyek a közeg ph-jától függően a megfelelő flavanonokkal (4) vannak egyensúlyban (16. ábra). R 16 H + H R' 17 H R R' R H 18 4 16. ábra Az irodalomban számos, kalkonok flavanonná történő gyűrűzárására alkalmas módszer ismeretes. A legáltalánosabban elterjedt eljárások egyike a megfelelő kalkonszármazék alkoholos oldatának híg savas vagy lúgos kezelése [46], melynek során egyensúlyi folyamatban játszódik le a ciklizáció. Ez a gyűrűzárás alkoholos közegben kiváltható még cellit hordozóra felvitt KF-dal [47], cobalt (II)-Schiff bázis komplex-xel [48], nanokristályos Mg-dal [49], fénnyel [50-53], hő hatására [54], elekrolízissel [55], szilikagéllel [56], NiCl 2 /Zn/KIrendszerrel [57], zeolitokkal [58] is, de általában ezen reakciók hozama meglehetősen gyenge. R' 13
Kenéz Ágnes: Természetes eredetű, potenciálisan biológiailag aktív - és C-prenilezett flavanonok szintézise Irodalmi előzmények Direkt prekurzor lehet még a flaván-4-ol (47), amelynek oxidációja [59-61] vezet flavanon típusú vegyülethez. 3-Bróm-1-fenilprop-2-inil-aril-éterek (48) higany (II)-trifluoracetát jelenlétében [62] ugyancsak flavanonná alakulnak át. Szubsztituált benzaldehid származékok (17) 1-(2-hidroxifenil)-3-fenilpropán-1,3- dionokkal (49) lúgos közegben végzett kondenzációja [63] szintén flavanont (4) eredményez. R H ox Hg(CCF 3 ) 2 R' R Br 47 R' 4 48 bázis R'' + R R R' R' 49 H 17. ábra 1997-ben Dauzonne és Monneret olyan flavanonszintézist közöltek [64], amelyben intermedierként 3-klór-2,3-dihidro-3-nitro-2-fenil-4H-1-benzopirán-4-on származékok (50) szolgáltak. Ezeket gyökös láncreakcióban 2,2 - azobiszizobutironitril (AIBN) iniciátor jelenlétében óntributilhidriddel (Bu 3 SnH) jó hozammal flavanonná (4) tudták alakítani (18. ábra). R 1 R 2 50 N 2 Cl R 5 R 3 R 4 17 Bu 3 SnH / AIBN benzol, reflux, 4h 18. ábra Szubsztituált N,N-dialkilditiokarbamátok (51) és benzaldehid aminal típusú vegyületek (52) metanolos közegben enyhe körülmények között végzett kondenzációja is szubsztituált flavanonszármazékokhoz (53) vezet [65], melyek flavanonná (4) történő átalakítása könnyen megvalósítható (19. ábra). R 1 R 2 4 R 5 R 3 R 4 14
Kenéz Ágnes: Természetes eredetű, potenciálisan biológiailag aktív - és C-prenilezett flavanonok szintézise Irodalmi előzmények R 2 R 3 -CHR 4 R 5 S NR 2 R 2 S NR 52 2 S H -R 4 H; -R 5 H R 3 S R 1 R 1 51 53 19. ábra A flavon (5) redukciója flavanonná (4) preparatív szempontból elhanyagolható. A prenilcsoport flavanonvázra történő bevezetése általában kétféle módon történik. Az irodalomban leírt szintézisek egy részében a flavanonváz kialakítása után vezették be ezt a csoportot, míg más esetekben már a megfelelő szintonok hordozták a prenil funkciót. Érdemes megjegyezni, hogy míg az első esetben keverék kialakulása nehezíti a szintézist, addig a második módszernél a flavanonváz felépítése a prenil csoport sérülését vonhatja maga után. 2.3.2. ptikailag aktív flavanonok szintézise Bár célkitűzéseinkben jórészt racém prenilezett flavanon származékok szintézise szerepelt (lásd 3.1. fejezet), de a Candida albicans-sal szemben mutatott antifungális hatás részletesebb tanulmányozása érdekében kísérleteket tettünk optikailag aktív flavanonok előállítására is. Ennek tárgyalása előtt röviden összefoglalom az ilyen jellegű kutatások legfőbb eredményeit. A flavanon optikailag aktív formában enzimatikus úton, kinetikus rezolválással vagy enantioszelektív módszerekkel állítható elő. Az előbbi módszert alkalmazta Izumi [60] is, aki sütőélesztővel redukálva rezolválta a racém flavanont, illetve racém cisz-4-acetoxiflaván enantioszelektív hidrolízisét Pseudomonas (PS, Amano) lipázzal megvalósítva oxidációval jutott a kívánt enantiomerhez. 1997-ben racém 4-(aciloxi)imino flavanon származékok enantioszelektív, különböző lipáz enzimekkel történő rezolválását is leírták [66]. 2004-ben Ramadas és Krupadanam (±)-cisz-flavan-4-olok Candida cylindracea lipázzal történő enantiszelektív 15
Kenéz Ágnes: Természetes eredetű, potenciálisan biológiailag aktív - és C-prenilezett flavanonok szintézise Irodalmi előzmények acilezésével optikailag aktív flavan-4-ol származékokat (ee: 55-99%) nyert, melyek Mn 2 -os oxidációja a flavanon (4) enantiomereket jó hozammal szolgáltatta [67]. Enantioszelektív szintézismódszerre is számos példát találunk az irodalomban. 1970-ben Bognár és mtsai [68] flavanon-oximból kiindulva racém 4- aminoflavánt állítottak elő, amelyből D-(+)-kámfor-10-szulfonát- és dibenzoil-d-(- )-tartarát-sókat képeztek, és így rezolválták a cisz-4-aminoflaván-hidroklorid enantiomerjeit. Ezek dezaminálásával képzett flavan-4-olok nátrium dikromátos oxidációjával a kívánt flavanon enantiomereket nyerték. 1986-ban Saengchantara és Wallace [69,70] (S)-2-metilkromanon (58) szintézisét lítium-dimetilkuprát (S)-3-(p-tolilszulfinil)kromonra (56) történő diasztereoszelektív konjugált addíciójával oldották meg. Az (S)-3-(ptolilszulfinil)kromont (56) a 20. ábrán látható reakcióséma szerint állították elő. Me 1) Me S ptol LDA Ar 2) Ph 3 CBF 4 H 54 55 56 Ar = 3,4-dimetoxibenzil H Me S ptol HC 2 Na 58 20. ábra Me 1) Al/Hg 2) PDC Me 2 CuLi S ptol H S ptol Me 57 Metilszalicilátot (54) az (R)-(+)-metil-p-tolilszulfoxid lítium származékával reagáltatva ketoszulfidot képeztek, melyből tritil fluoroborátos védőcsoport hasítás után a kromon prekurzorát (55) kapták. Ebből a már ismert ecetsav-hangyasav vegyes anhidrid-nátriumformiátos módszerrel alakították ki a kromongyűrűt (56). A lítium-dimetilkuprát diasztereoszelektív konjugált addíciója után 24%-os hozammal izolálták a megfelelő 2-metilkromonszármazékot (57), amelyről a szulfoxid részt alumínium amalgámos módszerrel távolították el. A karbonilcsoport részleges redukcióját piridínium dikromátos oxidációval küszöbölték ki, így 16
Kenéz Ágnes: Természetes eredetű, potenciálisan biológiailag aktív - és C-prenilezett flavanonok szintézise Irodalmi előzmények regenerálták a kívánt optikailag aktív 2-metilkromanont (58). Ez a módszer azonban nem volt alkalmas az (R)-5,7-dimetoxiflavanon szintézisére, ugyanis a 2- fenil-3-(p-tolilszulfinil)kromanon instabilitása miatt nem a megfelelő flavanon, hanem a flavon képződött [71]. Solladie csoportja a Wallace módszert továbbfejlesztve [72] állította elő a (+)-(R)-5-hidroxi-6-(hidroximetil)-7-metoxi-8-metilflavanont (60) (21. ábra). Az (S)-5,7-dimetoxi-8-metil-3-(p-tolilszulfinil)kromenonra (59) dilítium tetraklórkuprát katalizátor jelenlétében PhMgBr-dal vezették be a fenil csoportot, majd a szintézis további lépéseiben a szulfoxid részt alumíniumamalgámos redukcióval eltávolították. Az így kapott flavanon részleges demetilezése, majd ezt követő hidroximetilezése után izolálták a kívánt (+)-R-60 származékot. Me Me 59 S ptol PhMgBr Li 2 CuCl 4 Me Me S ptol Ph 21. ábra Hodgetts [73] az aromatáz enzim működését gátló, természetes (-)- pinostrobin (63) szintézisét valósította meg, a könnyen hozzáférhető, metoximetil csoporttal védett 3,5-dimetoxifenolból (61) kiindulva. Ezt reagáltatta tercbutillítium jelenlétében a (R)-(+)-etil-3-hidroxi-3-fenilpropionátból képzett Weinreb amiddal (62), majd az így kapott ketonból a védőcsoportok eltávolítása után intramolekuláris Mitsunobu reakcióval alakította ki a flavanon gyűrűt (22. ábra). Me H Me Me Me TBS H + (Me)MeN tbuli Ph MM TBS Ph Me MM Me 61 62 63 22. ábra 2002-ben Noda és Watanabe egy rendkívül hatékony, mindkét enantiomer előállítására alkalmas szintézismódszert közöltek [74]. A szintézis kulcslépésében, H 60 Ph Ph 17
Kenéz Ágnes: Természetes eredetű, potenciálisan biológiailag aktív - és C-prenilezett flavanonok szintézise Irodalmi előzmények a C3, C4 helyzetű szén-szén kötés kiépítését a szalicilaldehidből képzett ditián származék (64) és az optikailag aktív sztirén oxid közötti reakcióval oldották meg, melynek során az epoxid gyűrű felnyílik. Az ezt követő intramolekuláris Mitsunobu reakció, majd hidrolízis után nagy enantiomertisztasággal és jó hozammal jutottak a megfelelő enantiomerekhez (65a, b) (23. ábra). S S S S BuLi R 2 H sztirén oxidok HH R1 64 65a, b R 2 R1 65a 65b R 1 R 2 H Ph Ph H 23. ábra Munkánk során a Kawasaki és mtsai által leírt aszimmetrikus szintézisútra támaszkodtunk [75]. 18
Kenéz Ágnes: Természetes eredetű, potenciálisan biológiailag aktív - és C-prenilezett flavanonok szintézise Irodalmi előzmények H R rezolválás H 66 66a (S) (R) fenol Mitsunobu-reakció 67a fenol 67b H oxidáció H 68a 68b gyûrûzárás 4a 4b (R) (S) 24. ábra Japán kutatók a megfelelő királis prekurzorokat (66a,b) lipáz katalizált kinetikus rezolválással állították elő, majd ezeket fenollal Mitsunobu körülmények között reagáltatták. Az így nyert származékokat (67a,b) karbonsavvá (68a,b) oxidálták majd ezekből gyűrűzárással nyerték a balra és jobbra forgató flavanont (4a,b) (24. ábra). 2.4. Gombás megbetegedések és antifungális szerek Doktori munkám során az - és C-prenilezett flavanonszármazékok szintézise mellett a Candida albicans-sal szemben mutatott antifungális hatásuk in vitro vizsgálataival is foglalkoztam, és ezért röviden ismertetem a humán gombás megbetegedések és azon belül is főleg a kandidózisok típusait, valamint a jelenleg forgalomban lévő gombaellenes készítmények hatóanyagait [124]. 19
Kenéz Ágnes: Természetes eredetű, potenciálisan biológiailag aktív - és C-prenilezett flavanonok szintézise Irodalmi előzmények A gombás fertőzések jelentős része a gazdaszervezet és a gomba szoros fizikai kapcsolata és egyéb tényezők együttes hatására alakul ki. Kandidózis gyűjtőnéven a sarjadzógombák osztályába tartozó, Candida nemzetség (1. táblázat) által okozott fertőzéseket foglalják össze. 1. Táblázat: A Candida nemzetség gyakoribb kórokozó fajai Kórokozó Gyakoriság (%) C. albicans 70-80 C. glabrata 5-25 C. parapsilosis 5-25 C. tropicalis 5-15 C. krusei 3-10 C. guilliermondii 1-3 C. kefyr 1-3 C.famata <1 A Candida albicans egy teljesen ártalmatlan emésztőgomba, amely a legtöbb ember bélrendszerében megtalálható. Jelenléte egészséges szervezetben kifejezetten hasznos, mivel fontos szerepet játszik az emésztési folyamatokban. A szervezetben lévő mikroorganizmusok (baktériumok, gombák) közötti egyensúlyi állapot bizonyos tényezők hatására esetenként felbomlik, és ez a Candida albicans elszaporodásához, és ezáltal Candida-betegség kialakulásához vezethet. Civilizációs népbetegségnek is nevezik, mivel kiváltó okai között elsősorban a felgyorsult életvitel miatt kialakuló helytelen táplálkozási szokásokat, a mozgásszegény életmódot és az állandó stresszt említik. A gyakran és feleslegesen alkalmazott antibiotikumok és különböző hormon- vagy szteroidkészítmények is kiválthatják az immunrendszer meggyengülését. Így a bélrendszerben elszaporodó gombák szétterjedhetnek a test más területeire is (nyelőcső-, vizeletkiválasztó-, légzőrendszer-, szem-, központi idegrendszer, szív- és érrendszeri kandidózis). Diagnózisukat sokszor a tünetek rendkívüli változatossága és együttes fellépése is nehezíti (2. táblázat). 20
Kenéz Ágnes: Természetes eredetű, potenciálisan biológiailag aktív - és C-prenilezett flavanonok szintézise 2. Táblázat: Kandidózisok - tünetek Irodalmi előzmények Kandidózis helye Tünetek Bőr és nyálkahártya bőrgyógyászati panaszok: csalánkiütés, hajhullás, hajzsírosodás, korpásodás, stb. Gyomor-bélrendszer gyomortáji panaszok: gyomorégés, haspuffadás, vastagbél-gyulladás Nemi szervek nőgyógyászati, urológiai panaszok: makacs petefészek-, prosztatagyulladás, stb. Központi idegrendszer idegrendszeri tünetek: fáradékonyság, depresszió, koncentrációképesség csökkenése, alvászavarok, stb Légzőrendszer hörghurut, tüdőgyulladás Szív- és érrendszer szívizom- és perikardum fertőzés Vizeletkiválasztó rendszer hólyag-és vesegyulladás Egyéb asztma, élelmiszer-allergiák, stb., allergiás reakciók, látásromlás, ízületi bántalmak, hiperaktivitás, stb A gombás megbetegedések (nemcsak a kandidózisok) kezelésére általában a következő típusú vegyületcsaládokat használják (3. táblázat és 25. ábra). 21
Kenéz Ágnes: Természetes eredetű, potenciálisan biológiailag aktív - és C-prenilezett flavanonok szintézise 3. Táblázat: Gombaellenes hatóanyagok (példák) Gombaellenes hatóanyagok Példák Irodalmi előzmények Festékek Fukszin, brillantzöld Halogénezett fenol- és Pentaklórfenol, nátriumparaklórbenzoát benzolszármazékok Hidrokinolin származékok Vioform (jódoxikinolin), klorozán Kéntartalmú vegyületek Cinkpirition, tolnaftát Alkoholok, aldehidek, savak Etanol, formaldehid, bórax, ecetsav Kvaterner ammóniumsók Benzalkonium klorát, sterogenol Piridonszármazékok Ciklopiroxol amin (69) Morfolinszármazékok Amorolfin (70) Antimikotikus antibiotikumok Grizeofulvin Polién antibiotikumok Nystatin (71), pimaricin, amfotericin B (72) Antimetabolitok 5-fluorocitozin (flucitozin) (73) Azolvegyületek Klotrimazol, mikonazol (74), ekonazol (75), bifonazol, ketokonazol (76), flukonazol (77), itrakonazol (78) Allil-aminszármazékok Naftifin, terbinafin (79) Egyéb készítmények Kálium-jodid 22
Kenéz Ágnes: Természetes eredetű, potenciálisan biológiailag aktív - és C-prenilezett flavanonok szintézise Irodalmi előzmények H N N 70 H H H H H H H H 69 H CH 3 H H H H H H H 71 N NH 2 F H 2 N H H Cl N N Cl 74 72 Cl Cl H 2 N H H Cl Cl Cl Cl N N N H 73 76 N N N N N H F Cl N N 75 Cl N N N N N N 77 F Cl N N N 78 N N N 79 25. ábra: Gombaellenes hatóanyagok 23
Kenéz Ágnes: Természetes eredetű, potenciálisan biológiailag aktív - és C-prenilezett flavanonok szintézise 2.5. Antifungális hatású flavonoidok Irodalmi előzmények Az előző fejezetben ismertetett változatos szerkezetű, nagyrészt gyógyszer hatóanyagként már forgalomban lévő antifungális szerek mellett egyre inkább előtérbe kerülnek a flavonoidok, mint lehetséges gombaellenes anyagok. Mielőtt azonban részletesebben tárgyalnánk a flavonoidok antifungális aktivitását, különbséget kell tennünk fungicid (gombaölő) és fungisztatikus (gomba növekedését gátló) hatás között. Míg a forgalomban lévő gombaellenes szerek között számos gombaölő hatású található, addig a flavonoidok körében inkább a fungisztatikus hatás a jellemző [76]. Tsuchiya és munkatársai [77] szintetikus kalkonszármazékok Candida fajok elleni antifungális hatását tanulmányozva megállapították, hogy a biológiai hatásért maga a kalkonváz és a 2,2,4-helyzetű hidroxilcsoportok tehetők felelőssé. Kimutatták ugyanis, hogy a hidroxilcsoportok alkilezése valamint a kalkonok gyűrűzárása a fungisztatikus hatás megszűnését okozza. Alavez-Solano és mtsai a Lonchocarpus oaxacensis trópusi fa gyökéréből izolált prenilezett 3-hidroxiflavanon, a jayacanol (80) (26. ábra) esetében tapasztaltak szignifikáns fungisztatikus hatást [76]. H H H H H 80 26. ábra: jayacanol Meglehetősen sok tanulmány [78] foglalkozik a flavonoidok antifungális hatásának szerkezeti feltételeivel, ezidáig mégsem sikerült egyértelmű kapcsolatot találni az adott molekula szerkezete és gombaellenes hatása között. Az általánosítást nehezíti az a tény is, hogy egy vegyület gombaellenes hatása mindig fajspecifikus, azaz az antifungális hatás csak az adott fajjal együtt jellemzi a 24
Kenéz Ágnes: Természetes eredetű, potenciálisan biológiailag aktív - és C-prenilezett flavanonok szintézise Irodalmi előzmények molekulát. Weindenbörner [79] különböző gombákon végzett vizsgálatai során megállapította, hogy a szubsztituálatlan flavon és flavanon nagyobb antifungális hatást mutat, mint a hidroxilált flavon származékok. Később azt is megállapította [80], hogy a flavon szerkezet hatásosabb számos gomba ellen, mint a flavanonváz. Néhány gomba esetében meglepő módon nem találtak lineáris összefüggéseket a flavonkoncentráció és az antifungális hatás között. Aida és mtsai [81] az ugyancsak antifungális aktivitással rendelkező apigeninidinből (81) 7-metoxi származékát (82) állították elő és azt találták, hogy az jóval nagyobb fungicid hatást mutat, mint az alkilláncot nem tartalmazó apigeninidin. Hasonlóan, a 7-metoxiapigeninidin (82) szintéziséhez használt sakuranetin (83) [82] is jobban gátolta a Pyricularia oryzae spóráinak csírázását, mint prekurzora, a naringenin (84) (27. ábra). H R 81 H R 82 Me 81, 82 Cl H H H Me H 83 84 H H 27. ábra: apigeninidin (81), 7-metoxiapigeninindin (82), sakuranetin (83), naringenin (84) A legújabban kvantumkémiai számításokkal is igyekeznek teljesebb képet adni a flavanonvázat tartalmazó antifungális hatású vegyületek hatásmechanizmusáról és a velük szemben támasztott szerkezeti követelményekről [83]. 25
Kenéz Ágnes: Természetes eredetű, potenciálisan biológiailag aktív - és C-prenilezett flavanonok szintézise Kísérleti munkám 3. Kísérleti munkám 3.1. Célkitűzés 1998-ban Hostettmann és munkatársai, kutatócsoportunkkal együttműködve a Zimbabwe-ban honos, Dipterocarpacea-félék közé tartozó Monotes engleri növény diklórmetános extraktumából 4 prenilezett flavanont (85-88) izoláltak (28. ábra) és vizsgálták antifungális hatásukat [84]. Ezen flavonoidok a Selinum vaginatum clarke-ből már korábban izolált [85] selinone [(±)-85] valamint a már ismert lonchocarpol A racemátja [(±)-87] továbbá két új flavanonszármazék, a monotesone A balraforgató izomerje [(-)-86], és a racém monotesone B [(±)-88] voltak. A Candida albicans-on végzett vizsgálatok során csak az -prenilezett vegyületek (85,86) mutattak figyelemreméltó fungisztatikus hatást. R 1 H H R 2 85-88 R 5 R 3 R 4 4. Táblázat: Monotes engleri-ből izolált flavanonok Név R 1 R 2 R 3 R 4 R 5 85 Selinone H H H Pre H 86 Monotesone A H H H Pre H 87 Lonchocarpol A Pre Pre H H H 88 Monotesone B Pre Pre H H H 28. ábra Doktori munkámban ezen flavanonszármazékok szintézisét, a hatás-szerkezet összefüggések vizsgálataihoz szükséges analogonok előállítását és antifungális hatásuk vizsgálatát tűztük ki célul. 26
Kenéz Ágnes: Természetes eredetű, potenciálisan biológiailag aktív - és C-prenilezett flavanonok szintézise Kísérleti munkám 3.2. -prenilezett flavanonok szintézise 3.2.1. Selinone szintézis I. Az optikailag aktív selinone-t [(-)-85] először a Selinum vaginatum clarkeből Seshadri és munkatársai [85] izolálták, a racém anyag szintézisét pedig Wagner és mtsai [86,88] valósították meg. A nehezen hozzáférhető floracetofenon 4--βneohesperidozidját (89) lúgos közegben (vízmentes etanol/kh-oldat) 4 -(γ,γdimetilalliloxi)benzaldehiddel (90) kondenzáltatva a megfelelő kalkonszármazékot (91) kapták, amelynek piridines közegben történő gyűrűzárásával az 5,7-dihidroxi- 4 -(3,3-dimetilalliloxi)flavanon-7--β-(2--α-L-ramnopiranozil-Dglükopiranozid)-ot képezték. A cukorrészt savas hidrolízissel nem tudták a 3,3- dimetilalliloxi csoport károsodása nélkül eltávolítani, ezért ezt enzimatikus úton, naringinázzal hajtották végre (29. ábra). H CH H R 89 H + 90 R = β-neohesperidóz (2--α L-ramnozil- β-d-glükóz) H H H H 3 C H H H KH EtH R H 29. ábra H H selinone (85) 91 1. Piridin 2. Naringináz Mivel ez a módszer az acetofenonszármazék (89) hozzáférhetősége és az egyes lépések során fellépő veszteségek miatt preparatív szempontból nem túl hatékony, megkíséreltünk új módszert kidolgozni a racém selinone [(±)-85] előállítására. Kiindulási anyagaink a kereskedelmi forgalomban kapható 2,4,6-27
Kenéz Ágnes: Természetes eredetű, potenciálisan biológiailag aktív - és C-prenilezett flavanonok szintézise Kísérleti munkám trihidroxiacetofenon (floracetofenon) és a 4-hidroxibenzaldehid voltak, amelyekből a racém selinone [(±)-85] szintézisét két módon valósítottuk meg. Az első szintézisúton, Wagner módszeréhez hasonlóan, a klasszikus kalkon-flavanon utat követve jutottunk el a racém selinone-hoz [(±)-85] (30. ábra). MM CH MM i ii + MM H MM H 92 93 90 H H iii H H H 94 selinone 85 i: KH, etanol/25 C, ii: 10%-os HCl, metanol; iii: NaAc, metanol/ 30. ábra: Selinone szintézis I. Tekintettel arra, hogy trihidroxiacetofenonok kalkon képződéséhez vezető Claisen- Schmidt kondenzációja védőcsoport alkalmazása nélkül egyáltalán nem vagy nehezen végezhető el, a floracetofenonból az irodalomban leírt szokásos alkilezési körülmények között (vízmentes aceton, izzított K 2 C 3, metoximetilklorid) bisz(metoximetoxi)-származékot (92) állítottuk elő. Mivel a prenil csoport bevezetését a szintézis elejére terveztük, a 4-hidroxibenzaldehidből vízmentes acetonban, izzított K 2 C 3 jelenlétében prenil-bromiddal prenilezett származékot (90) képeztünk. Ezen származékok (92+90) lúgos közegben végzett Claisen- Schmidt kondenzációja (vízmentes etanol/kh-oldat) a megfelelő kalkonszármazékot (93) közepes hozammal (46%) adta. A védőcsoportok eltávolítását és a gyűrűzárást úgynevezett one-pot reakcióban enyhe savas körülmények között szerettük volna megvalósítani. A reakcióból azonban három terméket izoláltunk. A kívánt racém selinone [(±)-85] (13%) mellett ugyanis annak 28
Kenéz Ágnes: Természetes eredetű, potenciálisan biológiailag aktív - és C-prenilezett flavanonok szintézise Kísérleti munkám 7-metoximetil-éterét (95) (23%) valamint deprenilezett származékát, a (±)- naringenint (84, 37%) is izoláltuk (31. ábra). H H 85 H H MM H 95 84 H 31. ábra: (±)-selinone (85), (±)-7-MM-selinone (95), (±)-naringenin (84) Az átalakulás vékonyréteg kromatográfiás követése azt mutatta, hogy először a karbonilcsoport melletti metoximetil csoport lehasadása következik be, és az így kapott kalkonszármazékból (94a) (32. ábra) a 95 flavanont kaptuk meg. Megállapítottuk, hogy a selinone prekurzora könnyen deprenileződik (94b 94c), és így a nátrium-acetátos gyűrűzárás során a (±)-naringenin (84) keletkezik. A reakcióidő csökkentésével valamint enyhébb savas hidrolízissel (5%-os sósavoldat/25 C/napok) sikerült a prenilcsoport lehasadását visszaszorítanunk, azonban ekkor a 95 származék (60%) lett a reakció főterméke. E vegyületről szobahőmérsékleten történő savas hidrolízissel nem tudtuk a metoximetil csoportot lehasítani, melegítésre pedig a vegyület bomlását figyeltük meg. Toluolban 50 Con, Amberlyst-15 gyanta alkalmazásával a (±)-selinone [(±)-85] képződése mellett szintén jelentős mértékű deprenileződést is észleltünk (85 84). Az óntetrakloriddal (SnCl 4 ) vagy bórtrifluoriddal (BF 3 ) diklórmetános közegben - 10 C-on végzett védőcsoport hasítási kísérleteink sem vezettek eredményre. 29
Kenéz Ágnes: Természetes eredetű, potenciálisan biológiailag aktív - és C-prenilezett flavanonok szintézise 93 Kísérleti munkám A 10% HCl MeH H H NaAc MM MM 94a H H B 10% HCl MeH 95 H C H H 94b 10% HCl MeH H H 94c H NaAc NaAc H H Amberlyst-15 H toluol H 85 84 H 32. ábra A prenilcsoport metoximetil csoportéval összevethető savérzékenysége miatt arra kényszerültünk, hogy másik szintézismódszert dolgozzunk ki a racém selinone [(±)-85] hatékony előállítására. 3.2.2. Selinone szintézis II. A racém selinone [(±)-85] előállítására kidolgozott szintézis stratégiánkat, a metoximetil csoportok lehasítása során fellépő problémák miatt úgy módosítottuk, hogy a prenil funkciót a flavanonváz kiépítése után alakítottuk ki. Az új szintézisút egyes lépéseit a 33. ábrán vázoltuk. 30
Kenéz Ágnes: Természetes eredetű, potenciálisan biológiailag aktív - és C-prenilezett flavanonok szintézise Kísérleti munkám H CH H + i ii MM 92 H MM Bn 96 MM MM Bn 97 Ac Ac H v iii iv Ac Ac 98 Bn 99 100 Bn Ac H vi H Ac H 101 selinone 85 i: KH, etanol/25 C, ii: 1. 10%-os HCl, metanol/ 2. NaAc, metanol/ ; iii: Ac 2, vízm. piridin/25 C; iv: H 2 -Pd/C, metanol/25 C; v: 3-metilbut-2-én-1-ol, Ph 3 P, DIAD, vízm. THF/25 C; vi: NaMe, vízm. metanol/25 C 33. ábra: Selinone szintézis II. Kiindulási anyagaink ez esetben is a floracetofenon és a 4- hidroxibenzaldehid voltak. Floracetofenonból a már előzőekben ismertetett módon, bisz(metoximetoxi)-származékot (92) képeztük, melyet p-benziloxibenzaldehiddal (96) lúgos közegben (vízmentes etanol/kh) kondenzáltatva 2 - hidroxikalkonszármazékot (97) kaptuk. A 97 kalkonszármazék metoximetil védőcsoportjait a négyes helyzetű benzil csoport sérülése nélkül, savas hidrolízissel (metanol, 10%-os HCl-oldat/ ) távolítottuk el. Az így képzett trihidroxikalkonszármazékot, izolálás nélkül, metanolos közegben nátrium-acetát jelenlétében a 98 flavanonná alakítottuk. Az így kapott 4 --benzil naringeninből (98) ecetsavanhidriddel, piridines közegben peracetát származékát (99) képeztük, melyről a benzil csoportot katalitikus hidrogénezéssel távolítottuk el (99 100). Az ily módon szabaddá vált hidroxilcsoportra a prenilcsoportot Mitsunobu körülmények között vezettük be (101). A szintézis utolsó lépésében a 101 származék acetil csoportjait Zemplén-féle elszappanosítással lehasítva jutottunk a 31
Kenéz Ágnes: Természetes eredetű, potenciálisan biológiailag aktív - és C-prenilezett flavanonok szintézise Kísérleti munkám racém selinone-hoz [(±)-85] (95%), melynek minden spektrális adata megegyezett a Monotes engleri-ből izolált természetes anyagéval. 3.2.3. Monotesone A szintézis I. A Monotes engleri-ből izolált másik -prenilezett flavanonszármazék, a racém monotesone A [(±)-86] szintézisét a (±)-selinone [(±)-85] szintézisével párhuzamosan, mindkét módon megkíséreltük. H H H monotesone A 86 34. ábra: Monotesone A Kiindulási anyagaink, a floracetofenon és a monotesone A szerkezetének megfelelően, a 3,4-dihidroxibenzaldehid voltak. Elsőként a metoximetil csoportokkal részlegesen blokkolt 92 acetofenon származékot állítottuk elő, melynek Claisen-Schmidt reakciója a négyes helyzetben szelektíven -prenilezett protokatechualdehiddel (102) a megfelelő kalkonszármazékot (103) (25%) adta (35. ábra). MM CH MM MM i + H H MM 92 102 103 H H i: 50% KH, etanol, 25 C 35. ábra: Monotesone A szintézis I. kalkonképzés A 3-hidroxi-4-preniloxibenzaldehidet (102) protokatechualdehidből vízmentes DMS-ban számított mennyiségű NaH jelenlétében prenil-bromiddal végzett regioszelektív alkilezéssel nyertük. Feltételezhető volt ugyanis, hogy a 32
Kenéz Ágnes: Természetes eredetű, potenciálisan biológiailag aktív - és C-prenilezett flavanonok szintézise Kísérleti munkám protokatechualdehid négyes helyzetű savanyú hidroxilcsoportja reagál a NaH-del, majd ezt követően a prenil-bromiddal és így a kívánt 4- preniloxiprotokatechualdehid szelektíven képződik (35%). Minthogy e 102 vegyület 1 H-NMR spektruma nem szolgált kellően biztos információval a prenil csoport helyzetéről, ezért szerkezetét kémiai korrelációval is bizonyítottuk. A bizonyítékot a vanillinből és izovanillinből prenilezéssel (vanillin 104, izovanillin 105) illetve a 102 vegyület metilezésével nyert származékok (102 104) (36. ábra) olvadáspontjainak és NMR adatainak összehasonlítása szolgáltatta (5. táblázat). CH CH CH Br MeI, K 2 C 3 H CH 3 absz. aceton CH 3 K 2 C 3 104 absz. aceton 102 H vanillin CH CH 5.Táblázat CH 3 H izovanillin Br absz. aceton K 2 C 3 CH 3 δ(ppm) p. ( C) Vegyület CH 3 CH 3 -CH 2 CH 2-H 5-H 6-H CH v 104 1,79 49,5-3,92 4,68 5,51 7,43 7,41 6,97 9,84 1,76 50,5 102 104 1,79 47,5-3,92 4,68 5,51 7,43 7,41 6,97 9,84 1,76 48,5 iv 105 1,79 3,95 4,63 5,52 7,43 7,42 6,97 9,84 olaj 1,76 36. ábra: Prenilezett benzaldehid származékok 105 A 103 kalkonszármazék savas hidrolízisekor, hasonlóan a racém selinone [(±)-85] szintézisénél tapasztaltakhoz, a metoximetil csoportok eltérő lehasadási 33
Kenéz Ágnes: Természetes eredetű, potenciálisan biológiailag aktív - és C-prenilezett flavanonok szintézise Kísérleti munkám készsége és a prenilcsoport sérülése miatt csak a monotesone A 7-metoximetil éterét (106) tudtuk előállítani (55%) (37. ábra). H H 103 ii MM H H iii MM H 7-MM-monotesone A (106) ii: HCl, metanol/ iii: NaAc, metanol/ 37. ábra: Monotesone A szintézis I. védőcsoport hasítás, gyűrűzárás 3.2.4. Monotesone A szintézis II. A racém selinone [(±)-85] előállítására kidolgozott hatékonyabb módszerrel is megkíséreltük a (±)-monotesone A [(±)-86] szintézisét. Meglepő módon a protokatechualdehidből képzett 4-(benziloxi)-3- (metoximetoxi)benzaldehid (108) (protokatechualdehid 107 108) a metoximetil csoportokkal részlegesen blokkolt 92 acetofenonnal etanolos közegben káliumhidroxid jelenlétében lassan reagált (120 h) és alacsony hozammal (39%) szolgáltatta a megfelelő (E)-2 -hidroxikalkont (109). A teljesen blokkolt floracetofenon származékból (110) és a 4-(benziloxi)-3- (metoximetoxi)benzaldehidből (108) etanolos közegben, porított nátriumhidroxiddal illetve porított kálium-hidroxiddal vízmentes dimetilformamidban azonban a 111 kalkonszármazék már jó hozammal (88%, 60%) képződött (38. ábra). 34
Kenéz Ágnes: Természetes eredetű, potenciálisan biológiailag aktív - és C-prenilezett flavanonok szintézise Kísérleti munkám CH CH i H H protokatechualdehid Bn 107 ii H R CH R MM + iii MM MM MM MM Bn 92, 110 108 109, 111 R 92, 109 H 110, 111 MM Bn MM i: NaH, vízmentes DMS, BnCl ii: MMCl, K 2 C 3, vízmentes aceton iii: a: vízmentes etanol, 10%-os KH-oldat, 5 nap, 39%; b: vízmentes etanol, NaH (por), argon atmoszféra, 5h, 25 C, 88% vagy vízmentes DMF, KH (por), argon atmoszféra, 1h, 25 C, 60% 38. ábra: Monotesone A szintézis II. kalkonképzés Mindkét kalkon (109 és 111) metoximetil védőcsoportjainak savas hidrolízissel történő eltávolítása és azt követő nátrium-acetátos gyűrűzárása a kívánt hidroxiflavanont (112) szolgáltatta. A racém selinone [(±)-85] szintéziséhez hasonló módon a 112 származék szabad hidroxilcsoportjait acetilezéssel blokkoltuk, majd az így nyert peracetát származék (113) benzilcsoportját katalitikus hidrogénezéssel távolítottuk el (113 114) (39. ábra). 35
Kenéz Ágnes: Természetes eredetű, potenciálisan biológiailag aktív - és C-prenilezett flavanonok szintézise Kísérleti munkám 109, 111 ii H H H iii Ac Ac Ac 112 Bn 113 Bn Ac Ac iv Ac v Ac Ac 114 H 115 Ac H vi H H (±)-monotesone A [(±)-86] ii: 1. HCl, metanol/ 2. NaAc, metanol/ ; iii: Ac 2, vízmentes piridin, 25 C; iv: H 2 - Pd/C, metanol, 25 C; v: 3-metilbut-2-én-1-ol, Ph 3 P, DIAD, vízmentes diklórmetán, 25 C; vi: NaMe, vízmentes metanol, 25 C 39. ábra: Monotesone A szintézis II flavanonok A szabad hidroxilcsoportra Mitsunobu körülmények között vezettük be a prenilcsoportot, ami jó termeléssel (46%) adta a racém peracetil-monotesone A-t (115). E 115 vegyület Zemplén-féle elszappanosítása után kapott racém monotesone A [(±)-86] valamennyi spektrális adata megegyezett a Monotes engleri-ből izolált (-)-monotesone A paramétereivel. 3.2.5. Selinone és monotesone A analogonok szintézise A későbbiekben részletesen tárgyalt farmakológiai vizsgálatokhoz és a hatás-szerkezet összefüggések felderítése érdekében racém selinone [(±)-85] és monotesone A [(±)-86] különböző módon szubsztituált származékait is (116-120, 40. ábra) előállítottunk az előzőekben ismertetett eljárások szerint. Így a racém 36