HER2 IQFISH pharmdx Kód: K5731

HER2 IQFISH pharmdx Kód: K5731 4. kiadás A HER2 IQFISH pharmdx egy direkt fluoreszcens in situ hibridizációs (FISH) eljárás a HER2 génamplifikáció kvantitatív meghatározásához formalinban fixált, paraffinba ágyazott (FFPE) emlőrákos szövetmintákban, valamint gyomor-adenokarcinomában beleértve a gyomornyelőcső határon lévő adenokarcinómákat is szenvedő páciensekből származó, formalinnal fixált, paraffinba ágyazott (FFPE) szövetmintákban. Az eljárás kiegészítő eszközként alkalmazható a HercepTest mellett olyan betegek kivizsgálásra, akiknél Herceptin kezelést terveznek. A készlet 20 vizsgálatra elegendő reagenst tartalmaz. P04090HU_02/K573111-2 65/1. o.

Tartalom Oldal Javasolt alkalmazás... 4 Összegzés és magyarázat emlő... 5 Az eljárás elve emlő... 5 Reagensek emlő... 5 Mellékelt anyagok... 5 Szükséges, de nem biztosított anyagok... 7 Óvintézkedések emlő... 7 Tárolás emlő... 11 A minta előkészítése emlő... 11 Paraffinba ágyazott metszetek... 11 HASZNÁLATI UTASÍTÁS emlő... 12 A. A reagensek előkészítése emlő... 12 A.1 Előkezelő oldat... 12 A.2 Magas stringenciájú mosópuffer... 12 A.3 Mosópuffer... 12 A.4 Etanolsorozatok... 12 A.5 Pepszinoldat... 12 B. A festési eljárás emlő... 13 B.1 Az eljárással kapcsolatos megjegyzések... 13 B.2 A szövetek kezelése festés előtt... 13 B.3 Festési protokoll... 14 Minőség-ellenőrzés emlő... 18 A festés értelmezése emlő... 18 Korlátozások emlő... 20 Teljesítményjellemzők emlő... 20 Analitikai érzékenység... 20 Analitikai specificitás... 20 A robosztusságra vonatkozó vizsgálatok... 20 Megismételhetőség... 22 Reprodukálhatóság... 22 Klinikai alkalmazhatóság... 22 Hibaelhárítás emlő... 26 1. függelék emlő... 28 2. függelék emlő... 30 3. függelék emlő... 31 Összegzés és magyarázat gyomor... 32 Az eljárás elve gyomor... 32 Reagensek gyomor... 32 Mellékelt anyagok... 32 P04090HU_02/K573111-2 65/2. o.

Szükséges, de nem biztosított anyagok... 34 Mikroszkóp és tartozékai... 34 Óvintézkedések gyomor... 35 Tárolás gyomor... 37 A minta előkészítése gyomor... 38 Paraffinba ágyazott metszetek... 39 HASZNÁLATI UTASÍTÁS gyomor... 40 A. A reagensek előkészítése gyomor... 40 A.1 Előkezelő oldat... 40 A.2 Magas stringenciájú mosópuffer... 40 A.3 Mosópuffer... 40 A.4 Etanolsorozatok... 40 A.5 Pepszinoldat... 40 B. A festési eljárás - gyomor... 41 B.1 Az eljárással kapcsolatos megjegyzések... 41 B.2 A szövetek kezelése festés előtt... 41 B.3 Festési protokoll... 42 Minőség-ellenőrzés gyomor... 45 A festés értelmezése gyomor... 45 Korlátozások gyomor... 48 Teljesítményjellemzők gyomor... 48 Analitikai érzékenység... 50 Analitikai specificitás... 50 A robosztusságra vonatkozó vizsgálatok... 51 Megismételhetőség... 52 Reprodukálhatóság... 52 Klinikai alkalmazhatóság... 53 Hibaelhárítás gyomor... 54 4. függelék gyomor... 57 5. függelék gyomor... 59 6. függelék gyomor... 61 7. függelék gyomor... 62 Hivatkozások... 63 Szimbólumok magyarázata... 65 P04090HU_02/K573111-2 65/3. o.

Javasolt alkalmazás In vitro diagnosztikai használatra. A HER2 IQFISH pharmdx egy direkt fluoreszcens in situ hibridizációs (FISH) eljárás, amely a HER2 génamplifikáció kvantitatív meghatározására szolgál formalinnal fixált, paraffinba ágyazott (FFPE) emlőrákos szövetmintákban, valamint olyan FFPE mintákban, amelyek gyomor-adenokarcinomában beleértve a gyomor-nyelőcső határon lévő adenokarcinómákat is szenvedő páciensekből származnak. A HER2 IQFISH pharmdx kiegészítő eszközként alkalmazható a HercepTest mellett olyan betegek kivizsgálásra, akiknél Herceptin (trasztuzumab) kezelést terveznek (lásd a Herceptin terméktájékoztatóját). Az emlőrákos betegek esetében a HER2 IQFISH pharmdx eljárással nyert eredmények a jelenleg használt klinikopatológiai információk mellett nyújtanak segítséget a II. stádiumú nyirokcsomó-pozitív emlőrákban szenvedő páciensek prognózisának felállításában. Ebben a dokumentumban gyomorrákként utalunk a gyomor adenokarcinómájára is, beleértve a gyomor-nyelőcső határon lévő adenokarcinómákat. Az emlőrák esetében történő alkalmazással kapcsolatban lásd az 5 31 oldalakat. A gyomorrák esetében történő alkalmazással kapcsolatban lásd a 32 62 oldalakat. Fontos: Kérjük, vegye figyelembe az emlőrák és a gyomorrák szöveteire vonatkozó eltéréseket, különösen a festődés értékelését ismertető szakaszban. P04090HU_02/K573111-2 65/4. o.

Emlőrák Összegzés és magyarázat emlő A humán HER2 gén (amely ERBB2 vagy NEU néven is ismert) a 17-es kromoszómán helyezkedik el, és a HER2 fehérjét vagy a p185 HER2 receptort kódolja. A HER2 fehérje egy membránreceptor tirozinkináz, amely homológ az epidermális növekedésifaktor-receptorral (EGFR vagy HER1) (1-2). A HER2 gén 2 példányban van jelen minden normál diploid sejtben. Az emlőrákos betegek egy részénél a HER2 gén a malignus transzformáció és a tumorfejlődési folyamat részeként amplifikálódik (3-8). A HER2 gén amplifikációja általában a HER2 fehérje fokozott expressziójához vezet az emlőráksejtek felületén (9). A HER2 gén amplifikációját és/vagy fehérjéjének emelkedett mértékű expresszióját az emlőrákok 25 30%-ában kimutatták. Ez a receptorszám-növekedés rossz prognózisra, fokozott kiújulási kockázatra és rövidebb túlélési időre utal. Több tanulmány igazolta, hogy a HER2-státusz korrelál bizonyos kemoterápiás kezelési protokollokra való érzékenységgel, illetve rezisztenciával (10). A HER2 fehérje fokozott expressziójának vagy a HER2 gén amplifikációjának kimutatása alapvető fontosságú a HER2 fehérje egy monoklonális antitestével, a Herceptin -nel, történő kezelés megkezdése szempontjából. Klinikai tanulmányok igazolták, hogy azoknál a betegeknél a leghasznosabb a Herceptin terápia, akiknek daganatában megfigyelhető a HER2 protein fokozott expressziója és/vagy a HER2 gén amplifikációja(11). Az eljárás elve emlő A HER2 IQFISH pharmdx készlet a formalinban fixált, paraffinba ágyazott szövetmetszet-minták FISH vizsgálatához szükséges valamennyi fontos reagenst tartalmazza. Paraffinmentesítés és rehidrálás után a mintákat előkezelő oldatban melegítik, amit a pepszin felhasználásával végzett proteolitikus emésztés követ. A melegítési és proteolitikus előkezelési lépéseket ebben a készletben egy PNS (polinukleinsav) (12) és DNS technológia kombinációján alapuló, azonnal felhasználható IQISH próbakeverék alkalmazása követi. Ez a próbakeverék egyrészt egy 218 kb nagyságú régiót többek között a 17-es kromoszómán lévő HER2 gént lefedő, Texas Red festékkel megjelölt DNS próbák keverékéből áll, másrészt a 17-es kromoszóma centromer régiójára (CEN-17) irányuló, fluoreszceinnel megjelölt PNS próbák keverékéből. A két célszekvencia specifikus hibridizációja világosan látható piros színű fluoreszcens jelet eredményez minden egyes HER2 gén lókuszán, és ugyancsak jól látható, de zöld színű fluoreszcens jelet eredményez valamennyi 17-es kromoszóma centromer régióján. Alapos (magas stringenciájú oldattal történő) mosást követően a mintákat DAPI (4-6-diamidino-2-fenilindol) tartalmú fluoreszcens rögzítőszerrel rögzítik, majd fedőlemezzel látják el. Megfelelő szűrőkkel ellátott fluoreszcencia mikroszkóp segítségével (lásd a 3. függeléket), lokalizálják a tumorsejteket, majd megszámlálják a piros (HER2) és zöld (CEN-17) jeleket. Ezt követően kiszámítják a HER2/CEN-17 arányt. Az elemzett szövetmetszetben lévő normál sejtek az előkezelés és a hibridizáció hatékonyságának belső pozitív kontrolljaként szolgálnak. A részleteket illetően lásd A festődés értékelése című szakaszt. Az interaktív elektronikus képzéshez (e-learning) kérjük, használja a HER2 IQFISH pharmdx e- learning programot, amely segítségével a labortechnikusok, patológusok és tudósok pontosan és gyorsan elsajátíthatják a HER2 IQFISH pharmdx készlettel történő optimális eredmények eléréséhez szükséges ismereteket: www.dako.com Reagensek emlő Mellékelt anyagok Az alább felsorolt anyagok 20 vizsgálathoz elegendőek (egy vizsgálat egy darab, 22 x 22 mm-es célterület feldolgozását jelenti). Az elvégezhető vizsgálatok számát a következő mennyiségek alapján számítottuk: lemezenként 250 µl (5 8 csepp) a 2A üvegből, 10 µl a 3. üvegből és 15 µl az 5. üvegből. A 3. és 5. üvegben lévő oldatok viszkózus állagúak, ezért előfordulhat, hogy P04090HU_02/K573111-2 65/5. o.

Emlőrák ezeket rövid ideig centrifugálni kell egy mikrocentrifugában, a biztosított reagens teljes felhasználása érdekében. A készlet 10 különálló festési folyamathoz elegendő anyagot tartalmaz (pepszinimmerziós módszer esetében ez a mennyiség csak négy különálló festési folyamathoz elegendő). A HER2 IQFISH pharmdx készletet szárazjégen szállítják. Ha kézhezvételkor található szárazjég a csomagolásban, biztos lehet benne, hogy a készlet komponensei nem voltak kitéve szállítás közben magas hőmérsékleti hatásnak. Előfordulhat, hogy a készlet egyes összetevői nem fagynak meg. Ez nem fogja befolyásolni a HER2 IQFISH pharmdx készlet teljesítményét. 1. üveg 2A. üveg Előkezelő oldat (20x) 150 ml, 20-szoros koncentrációjú MES (2-[N-morfolino]-etánszulfonsav) puffer. Pepszin 4 x 6,0 ml, azonnal felhasználható Pepszinoldat, ph 2,0; stabilizátort és antimikrobiális hatóanyagot tartalmaz. 2B. üveg 3. üveg 4. üveg 5. üveg 6. üveg Pepszinhígító (10x) 24 ml, 10-szeres koncentrációjú Hígítópuffer, ph 2,0; antimikrobiális hatóanyagot tartalmaz. HER2/CEN-17 IQISH próbakeverék 0,2 ml, azonnal felhasználható Texas Red festékkel megjelölt HER2 DNS próbák és fluoreszceinnel megjelölt CEN-17 PNS próbák keveréke; IQISH hibridizációs pufferben kerül kiszállításra. Magas stringenciájú mosópuffer (20x) 150 ml, 20-szoros koncentrációjú SSC (konyhasós nátrium-citrát) puffer, detergenssel (Tween-20). Fluoreszcens rögzítőszer 0,4 ml, azonnal felhasználható Fluoreszcens rögzítőszer, amely 500 µg/l DAPI-t (4-6-diamidino-2-fenilindolt) tartalmaz. Mosópuffer (20x) 500 ml, 20-szoros koncentrációjú Tris/HCl puffer. Fedőlemez-tömítés 1 cső, azonnal felhasználható Oldat a fedőlemezek eltávolítható tömítéseihez. MEGJEGYZÉS: A készlet következő reagensei felcserélhetők a K5799 kódszámú Dako Histology FISH Accessory kit megfelelő reagenseivel: előkezelő oldat (20x), pepszin, pepszinhígító (10x), magas stringenciájú mosópuffer (20x), fluoreszcens rögzítőszer, mosópuffer (20x) és fedőlemez-tömítés. P04090HU_02/K573111-2 65/6. o.

Emlőrák Szükséges, de nem biztosított anyagok Laboratóriumi reagensek Desztillált vagy ionmentesített víz Etanol, 96%-os Xilol vagy xilolszubsztituensek Laboratóriumi eszközök Abszorbens kendők Szabályozható pipetták Kalibrált merülő hőmérő (mérési tartomány: 37 100 C) Kalibrált felületi hőmérő (mérési tartomány: 37 100 C) Fedőlemezek (22 mm x 22 mm) Csipeszek Vegyifülke Dako Hybridizer (S2450-es vagy S2451-es kóddal)* Fűtőblokk vagy hibridizáló kemence* Hibridizáló párakamra* Mikrocentrifuga Tárgylemezek, Dako Silanized Slides (kód: S3003), vagy poli-l-lizin bevonatú tárgylemezek (lásd A minta előkészítése című szakaszt) Festőedények vagy fürdők Időzítő (amely alkalmas 2 15 perces időközök mérésére) Vortex keverő Vízfürdő fedéllel (a hőmérsékletet 37 (±2) C-on, 63 (±2) C-on, valamint 95 C és 99 C között képes megtartani) Érzékelővel ellátott mikrohullámú sütő, amennyiben az előkezelést mikrohullámú sütővel végzik (lásd B3. Festési protokoll. 1. lépés: Előkezelés, B módszer) * Fűtőblokk vagy hibridizáló kemence denaturálás (66 (±1) C) és hibridizálás (45 (±2) C) céljára, amely párakamrával kombinálva a Dako Hybridizer alternatívájaként használható. Mikroszkóp és tartozékai Szűrők fluoreszcencia mikroszkóphoz: DAPI és FITC/Texas Red kettős szűrő, vagy FITC és Texas Red monoszűrő további részletekért lásd a 3. függeléket Fényforrásként 100 wattos higanylámpát használó fluoreszcencia mikroszkópot kell használni. Más fényforrások nem javasoltak ezekkel a szűrőkkel való használatra Mikroszkóptárgylemez-tartó (kartontálca felnyitható tetővel 20 tárgylemezhez, vagy ehhez hasonló). Óvintézkedések emlő 1. In vitro diagnosztikai használatra 2. Csak szakképzett felhasználók részére! 3. 1. üveg, Pre-Treatment Solution (20x), nem kell figyelmeztető felirattal ellátni. Foglalkozásszerű felhasználók részére igény esetén anyagbiztonsági adatlapot biztosítunk. 4. 2A. üveg, Pepsin, tartalma 5-<10% propan-2-ol, 0.1-<0.3% pepszin A, 0.011-<0.1% 5- chloro-2-methyl-4-isothiazolin-3-one és 2-methyl-2H-isothiazol-3-one. 2A. üveg figyelmeztető címkével van ellátva: P04090HU_02/K573111-2 65/7. o.

Emlőrák Veszély H314 H317 P280 P304 + P340 + P310 P301 + P310 + P331 P303 + P361 + P353 + P310 P305 + P310 P405 P501 Súlyos égési sérülést és szemkárosodást okoz. Allergiás bőrreakciót válthat ki. Védőkesztyű/védőruha/szemvédő/arcvédő használata kötelező. BELÉLEGZÉS ESETÉN: Az érintett személyt friss levegőre kell vinni, és olyan nyugalmi testhelyzetbe kell helyezni, hogy könnyen tudjon lélegezni. Azonnal forduljon TOXIKOLÓGIAI KÖZPONTHOZ/orvoshoz. LENYELÉS ESETÉN: Azonnal forduljon TOXIKOLÓGIAI KÖZPONTHOZ/orvoshoz. TILOS hánytatni. HA BŐRRE (vagy hajra) KERÜL: Az összes szennyezett ruhadarabot azonnal le kell vetni. A bőrt le kell öblíteni vízzel/zuhanyozás. Azonnal forduljon TOXIKOLÓGIAI KÖZPONTHOZ/orvoshoz. SZEMBE KERÜLÉS ESETÉN: Azonnal forduljon TOXIKOLÓGIAI KÖZPONTHOZ/orvoshoz. Elzárva tárolandó. A tartalom/edény hulladékként történő elhelyezését a helyi, regionális, országos és nemzetközi szabályozásokkal összhangban kell elvégezni. 5. 2B. üveg, Pepsin Diluent (10-szeres koncentrációjú), tartalma 50-<75% propan-2-ol, és 5- <10% 2-amino-2-(hydroxymethyl) propane-1,3-diol hydrochloride. 2B. üveg figyelmeztető címkével van ellátva: Danger H225 H319 H336 P280 P210 P241 P304 + P340 P303 + P361 + P353 P235 P501 Fokozottan tűzveszélyes folyadék és gőz. Súlyos szemirritációt okoz. Álmosságot vagy szédülést okozhat. Védőkesztyű használata kötelező. Szemvédő/arcvédő használata kötelező. Hőtől, forró felületektől, szikrától, nyílt lángtól és más gyújtóforrástól távol tartandó. Tilos a dohányzás. Robbanásbiztos elektromos/szellőztető/világító/berendezés használandó. BELÉLEGZÉS ESETÉN: Az érintett személyt friss levegőre kell vinni, és olyan nyugalmi testhelyzetbe kell helyezni, hogy könnyen tudjon lélegezni. HA BŐRRE (vagy hajra) KERÜL: Az összes szennyezett ruhadarabot azonnal le kell vetni. A bőrt le kell öblíteni vízzel/zuhanyozás. Hűvös helyen tartandó. A tartalom/edény hulladékként történő elhelyezését a helyi, regionális, országos és nemzetközi szabályozásokkal összhangban kell elvégezni. 6. 3. üveg, HER2/CEN-17 IQISH Probe Mix, tartalma 10-<25% ethylene carbonate, és 3- <5% sodium chloride. 3. Üveg üveg figyelmeztető címkével van ellátva: P04090HU_02/K573111-2 65/8. o.

Emlőrák H319 P280 Figyelem P264 P305 + P351 + P338 Súlyos szemirritációt okoz. Védőkesztyű/védőruha/szemvédő/arcvédő használata kötelező. A használatot követően a kezet alaposan meg kell mosni. SZEMBE KERÜLÉS ESETÉN: Óvatos öblítés vízzel több percen keresztül. Adott esetben kontaktlencsék eltávolítása, ha könnyen megoldható. Az öblítés folytatása. 7. 4. üveg, Stringent Wash Buffer (20x), 10-<25% sodium chloride és 10-<20% 2-amino-2- (hydroxymethyl) propane-1,3-diol hydrochloride tartalmaz. 4. üveg figyelmeztető címkével van ellátva: H319 H315 P280 Figyelem P264 P305 + P351 + P338 Súlyos szemirritációt okoz. Bőrirritáló hatású. Védőkesztyű/védőruha/szemvédő/arcvédő használata kötelező. A használatot követően a kezet alaposan meg kell mosni. SZEMBE KERÜLÉS ESETÉN: Óvatos öblítés vízzel több percen keresztül. Adott esetben kontaktlencsék eltávolítása, ha könnyen megoldható. Az öblítés folytatása. 8. 6. üveg, Wash Buffer (20x), 10-<25% sodium chloride és 10-<20% trometamolt tartalmaz. 6. üveg figyelmeztető címkével van ellátva: H319 H315 P280 Figyelem P264 P305 + P351 + P338 Súlyos szemirritációt okoz. Bőrirritáló hatású. Védőkesztyű használata kötelező. Szemvédő/arcvédő használata kötelező. A használatot követően a kezet alaposan meg kell mosni. SZEMBE KERÜLÉS ESETÉN: Óvatos öblítés vízzel több percen keresztül. Adott esetben kontaktlencsék eltávolítása, ha könnyen megoldható. Az öblítés folytatása. 9. Coverslip Sealant, 100% arányban hidrogénezett könnyűbenzint (petróleumot) tartalmaz, és a következő felirattal látták el: Veszély H225 H304 H411 P280 P210 P241 Fokozottan tűzveszélyes folyadék és gőz. Lenyelve és a légutakba kerülve halálos lehet. Mérgező a vízi élővilágra, hosszan tartó károsodást okoz. Védőkesztyű használata kötelező. Szemvédő/arcvédő használata kötelező. Hőtől, forró felületektől, szikrától, nyílt lángtól és más gyújtóforrástól távol tartandó. Tilos a dohányzás. Robbanásbiztos elektromos/szellőztető/ világító/berendezés P04090HU_02/K573111-2 65/9. o.

Emlőrák P273 P301 + P310 + P331 P303 + P361 + P353 P235 P510 használandó. Kerülni kell az anyagnak a környezetbe való kijutását. LENYELÉS ESETÉN: Azonnal forduljon TOXIKOLÓGIAI KÖZPONTHOZ/orvoshoz. TILOS hánytatni. HA BŐRRE (vagy hajra) KERÜL: Az összes szennyezett ruhadarabot azonnal le kell vetni. A bőrt le kell öblíteni vízzel/zuhanyozás. Hűvös helyen tartandó. A tartalom/edény hulladékként történő elhelyezését a helyi, regionális, országos és nemzetközi szabályozásokkal összhangban kell elvégezni. 10. A mintákat (fixálás előtt és után), valamint minden velük érintkező anyagot potenciális fertőzésforrásként kell kezelni, és a megfelelő óvintézkedések betartásával kell ártalmatlanítani (16). A reagenseket soha ne szívja fel szájjal a pipettába, és ügyeljen arra, hogy a reagensek és a minták ne érintkezzenek a bőrrel és a nyálkahártyákkal. Ha a reagensek érzékeny területtel érintkeznek, mossa le bő vízzel. 11. A téves eredmények elkerülése érdekében gondoskodjon arról, hogy a reagensek mikrobiális szennyeződése a lehető legkisebb mértékű legyen. 12. A megadottól eltérő inkubációs idők, hőmérsékletek vagy módszerek hibás eredményekhez vezethetnek. 13. A megadottól eltérő szövetfixálási módok és mintavastagság befolyásolhatja a szövet morfológiáját és/vagy a jelintenzitást. 14. A HER2/CEN-17 IQISH próbakeverék hibridizálás közbeni párolgásának elkerülése érdekében gondoskodjon a hibridizációs kamra megfelelő páratartalmáról. 15. A reagensek hígítása optimális. A további hígítás a teljesítmény romlását eredményezheti. 16. Megfelelő személyi védőfelszerelést kell viselni a bőrrel való érintkezés és a szembejutás elkerülése érdekében. További információkért olvassa el a biztonsági adatlapot (MSDS). 17. A gyomorrák biopsziás mintáinak heterogén volta miatt fontos, hogy alaposan végigpásztázza az egész mintát a jeleloszlás felmérése érdekében, mielőtt kiválasztaná a jelszámlálási területet. 18. A nagyon kisméretű minták értékelése nem javasolt (vagyis a mintáknak ép morfológiával és kellő mennyiségű sejtmaggal kell rendelkezniük a számláláshoz). 19. Ha a HER2 FISH analízist biopsziás mintán hajtja végre, a HER2-státusz megbízható meghatározása érdekében ajánlatos több (7 8), a tumor különböző régióiból származó, értékelhető biopsziás mintát elemezni. 20. Egy adott biopsziás minta összes szöveti magjának azonosítása érdekében fontos megtekinteni a HE-módszerrel festett metszetet. 21. A pepszinimmerziós módszerhez kizárólag tiszta festőedényeket szabad használni (2. lépés, C módszer). P04090HU_02/K573111-2 65/10. o.

Emlőrák Tárolás emlő A HER2/CEN-17 IQISH próbakeverék (3. üveg) -18 C-on, sötét helyen tárolandó. Az összes többi reagenst 2 8 C-on, sötét helyen lehet tárolni. Az összes reagenst lehet fagyasztva tárolni. A reagensek legfeljebb 10 alkalommal történő lefagyasztása és felolvasztása nem befolyásolja a teljesítményüket. A pepszinre, a HER2/CEN-17 IQISH próbakeverékre, valamint a fluoreszcens rögzítőszerre (2A., 3. és 5. üveg) káros hatással lehet a magas hőmérséklet. Ne hagyja ezeket az anyagokat szobahőmérsékleten. A HER2/CEN-17 IQISH próbakeverékre, valamint a fluoreszcens rögzítőszerre (3. és 5. üveg) káros hatással lehet a túlzottan erős fény. Ne tárolja ezeket a komponenseket, illetve ne végezzen vizsgálatot erős fényben, például közvetlen napsütésben. A csomagoláson feltüntetett lejárati időn túl ne használja fel a készletet. Ha a reagenseket a terméktájékoztatóban leírtaktól eltérő feltételek között tárolják, akkor a felhasználónak validálnia kell a reagensek teljesítményét (14). Nincsenek olyan egyértelmű jelek, amelyekből megállapítható lenne, hogy a termék lebomlott. Emiatt fontos a vizsgált szövetmetszetben lévő normál sejtek kiértékelése is. Ha nem várt fluoreszcencia-mintázatot figyel meg, amely nem magyarázható a laboratóriumi eljárásokban rejlő eltérésekkel, és a HER2 QFISH pharmdx készlettel kapcsolatos problémára gyanakszik, akkor forduljon a Dako Műszaki szolgálatához. A minta előkészítése emlő A biopsziákból, kimetszésekből vagy reszekciókból származó mintákat úgy kell kezelni, hogy a szövet ép maradjon a FISH elemzés céljára. Minden minta esetében az immuncitokémiai festési eljárásokhoz rutinszerűen használt szövetfeldolgozási módszereket kell alkalmazni (15). Paraffinba ágyazott metszetek Kizárólag semlegesre pufferelt formalinban tartósított és paraffinba ágyazott szövetek használhatók. A mintákat például 3 4 mm-es szeletekre vágva 18 24 órán keresztül fixálja semlegesre pufferelt formalinban. A szöveteket ezután etanol és xilol sorozathígítású oldatában dehidrálják, majd legfeljebb 60 C-os olvasztott paraffinnal itatják át. A megfelelően fixált és beágyazott szövetek hűvös (15 25 C-os hőmérsékletű) helyen tárolva korlátlan ideig eltarthatók a metszetek elkészítéséig és tárgylemezre helyezéséig (15-16). Egyéb fixálószerek nem alkalmasak erre a célra. A szövetmintákból 4 6 µm vastagságú metszeteket kell készíteni. A HER2 génamplifikáció elemzéshez és a tumor jelenlétének ellenőrzéséhez szükséges lemezeket egyszerre készítse el. Ajánlott legalább 2 metszetből álló sorozatot készíteni, 1 hematoxillineozinnal festett (HE-festés) metszetet a tumor jelenlétének ellenőrzésére, és 1 metszetet a HER2 génamplifikációs elemzéshez. Ajánlott a szövetmetszeteket Dako Silanized Slides tárgylemezre (kód: S3003) vagy poli-l-lizin bevonatú tárgylemezre helyezni. A mintákat a metszetkészítést követő 4 6 hónapon belül ki kell értékelni, ha szobahőmérsékleten (20 25 C-on) tárolják őket. P04090HU_02/K573111-2 65/11. o.

Emlőrák HASZNÁLATI UTASÍTÁS emlő A. A reagensek előkészítése emlő Érdemes a következő reagenseket a festés előtt előkészíteni: A.1 Előkezelő oldat Előfordulhat, hogy az 1. üvegben kristályok láthatóak, de ezek szobahőmérsékleten feloldódnak. A reagens elkészítése előtt győződjön meg arról, hogy nincsenek benne kristályok. Desztillált vagy ionmentesített vízzel hígítson fel elegendő mennyiséget az 1. üveg tartalmából (a 20-szoros koncentrációjú előkezelő oldatból) 1:20 arányban. A fel nem használt hígított oldat 2 8 C-on egy hónapig tárolható. A hígított oldatot öntse ki, ha zavarossá válik. A.2 Magas stringenciájú mosópuffer Desztillált vagy ionmentesített vízzel hígítson fel elegendő mennyiséget a 4. üveg tartalmából (a 20-szoros koncentrációjú, magas stringenciájú mosópufferből) 1:20 arányban. A fel nem használt hígított puffer 2 8 C-on egy hónapig tárolható. A hígított puffert öntse ki, ha zavarossá válik. A.3 Mosópuffer Desztillált vagy ionmentesített vízzel hígítson fel elegendő mennyiséget a 6. üveg tartalmából (a 20-szoros koncentrációjú mosópufferből) 1:20 arányban. A fel nem használt hígított puffer 2 8 C-on egy hónapig tárolható. A hígított puffert öntse ki, ha zavarossá válik. A.4 Etanolsorozatok Készítsen 96%-os etanol oldatból 3 edényben 70%-os, 85%-os és 96%-os oldatot. Tárolja a lefedett edényeket szobahőmérsékleten vagy 2 8 C-on, és legfeljebb 200 tárgylemezhez használja az oldatokat. Az oldatokat öntse ki, ha zavarossá válnak. A.5 Pepszinoldat Pepszinoldatra csak a pepszinimmerziós módszer ( C módszer) alkalmazásakor van szükség. A pepszinoldatot a következőképpen készítse el: Egy hat metszetet befogadó edényhez készítsen 60 ml pepszinoldatot: Tegyen az edénybe 48 ml szoba-hőmérsékletű (20 25 C-os) desztillált vagy ionmentesített vizet. Adjon hozzá 6 ml hideg (2 8 C-os) 10-szeres koncentrációjú pepszinhígítót (2B. üveg). Adjon hozzá 6 ml hideg (2 8 C-os) pepszint (2A. üveg). Helyezze fel az edény fedelét, és tegye a pepszinoldatot vízfürdőbe, hogy hőmérséklete felmelegedjen 37 (±2) C-ra. Egy 24 metszetet befogadó edényhez készítsen 240 ml pepszinoldatot: Tegyen az edénybe 192 ml szoba-hőmérsékletű (20 25 C-os) desztillált vagy ionmentesített vizet. Adjon hozzá 24 ml hideg (2 8 C-os) 10-szeres koncentrációjú pepszinhígítót (2B. üveg). Adjon hozzá 24 ml hideg (2 8 C-os) pepszint (2A. üveg). Helyezze fel az edény fedelét, és tegye a pepszinoldatot vízfürdőbe, hogy hőmérséklete felmelegedjen 37 (±2) C-ra. A megfelelő hőmérsékletre hozott pepszinoldatot 5 órán belül fel kell használni. P04090HU_02/K573111-2 65/12. o.

Emlőrák B. A festési eljárás emlő B.1 Az eljárással kapcsolatos megjegyzések Használat előtt alaposan tanulmányozza át ezt az útmutatót, és alaposan ismerje meg az összes alkotóelemet (lásd Óvintézkedések). Használat előtt minden reagenst a meghatározott hőmérsékletre kell hozni az alábbiak szerint: 1. üveg: A hígított előkezelő oldatnak fel kell melegednie 95 99 C-ra, ha az előkezeléshez vízfürdőt használ (B3. Festési protokoll, 1. lépés: előkezelés, A módszer). Ha hőérzékelővel ellátott mikrohullámú sütőt használ az előkezeléshez (B3. Festési protokoll, 1. lépés: előkezelés, B módszer), a hígított előkezelő oldatnak el kell érnie a szobahőmérsékletet (20 25 C-ot). 2A. üveg: A pepszint 2 8 C-os hőmérsékleten kell alkalmazni (B3, Festési protokoll, 2. lépés: A és B módszer), és folyamatosan fenn kell tartani ezt a hőmérsékletét. 2B. üveg: A 10-szeres koncentrációjú pepszinhígítót 2 8 C-os hőmérsékleten kell alkalmazni (B3, Festési protokoll, 2. lépés: C módszer). 3. üveg: A -18 C-on tárolt HER2/CEN-17 IQISH próbakeverék két fázisra válik szét. A 3. üveg használata előtt gondoskodjon arról, hogy tartalma egy fázisú legyen úgy, hogy a próbakeveréket szobahőmérsékletre (20 25 C-ra) hozza, majd összekeveri. Szobahőmérsékleten (20 25 C-on) olvassza fel a 3. üveg tartalmát legfeljebb 30 perc alatt (erős fénytől védett helyen), majd alaposan keverje fel az üveg tartalmát egy vortex keverőben 2500-es fordulatszámon, 15 másodpercig. A 3. üveget felhasználás után azonnal tárolja -18 C-on. 4. üveg: Használat előtt a hígított, magas stringenciájú mosópufferből egy adagot egy edényben szobahőmérsékletre kell hozni, egy másik edényben egy másik adagot pedig 63 (±2) C -ra. 5. üveg: A fluoreszcens rögzítőszer 2 25 C közötti hőmérsékleten alkalmazható. 6. üveg: A hígított mosópuffert szobahőmérsékletre, 20 25 C-ra kell hozni. A fedőlemez-tömítés bármilyen, 2 25 C közötti hőmérsékleten alkalmazható. Valamennyi lépést a megadott hőmérsékleten kell végrehajtani. Az eljárás részét képezi a szövetmetszetek többszöri dehidrálása majd szárítása. Mielőtt továbbhaladna a következő lépésre, győződjön meg arról, hogy a szövetmetszetek teljesen szárazak-e. A szövetmetszetek szárítását ne hagyja az eljárás egyéb lépéseinek idejére. Ha a festési eljárást meg kell szakítania, akkor paraffinmentesítést követően a tárgylemezeket legfeljebb 1 órán át tárolhatja a mosópufferben szobahőmérsékleten (20 25 C-on) anélkül, hogy ez az eredményeket befolyásolná. B.2 A szövetek kezelése festés előtt Paraffinmentesítés és rehidrálás: Az elemzés elvégzése előtt a szövetmetszeteket a beágyazó anyag eltávolításához paraffinmentesíteni, majd rehidrálni kell. Ügyeljen arra, hogy a paraffin teljes mértékben el legyen távolítva. A visszamaradó beágyazó anyag fokozott nem specifikus festődést eredményez. Ezt a lépést szobahőmérsékleten (20 25 C-on) végezze. 1. Helyezze a tárgylemezeket xilolfürdőbe, és inkubálja őket 5 (±1) percig. Cseréljen fürdőt, és ismételje meg egyszer. 2. Ütögetéssel távolítsa el a felesleges folyadékot, és 2 (±1) percre helyezze a tárgylemezeket 96%-os etanolba. Cseréljen fürdőt, és ismételje meg egyszer. 3. Ütögetéssel távolítsa el a felesleges folyadékot, és 2 (±1) percre helyezze a tárgylemezeket 70%-os etanolba. Cseréljen fürdőt, és ismételje meg egyszer. 4. Ütögetéssel távolítsa el a felesleges folyadékot, majd helyezze a tárgylemezeket legalább 2 percre a hígított mosópufferbe (lásd a HASZNÁLATI ÚTMUTATÓ A.3 szakaszát). A B.3 szakasz Előkezelés című 1. lépésében foglaltak szerint kezdje meg a festési eljárást. A xilolos és alkoholos oldatokat legfeljebb 200 tárgylemez után cserélni kell. Xilolszubsztituensek használata megengedett. P04090HU_02/K573111-2 65/13. o.

Emlőrák MEGJEGYZÉS: A készletben található reagenseket és útmutatót az optimális teljesítmény eléréséhez állították össze. A reagensek további hígítása vagy az inkubálási hőmérséklet megváltoztatása hibás vagy ellentmondó eredményeket adhat. Az adott laboratóriumban alkalmazott eltérő szövetfeldolgozási módszerek és technikai eljárások érvénytelenné tehetik az assay eredményeit. B.3 Festési protokoll 1. lépés: Előkezelés Az előkezelés vagy az alább leírt A módszerrel, vízfürdő használatával, vagy másik lehetőségként érzékelővel ellátott mikrohullámú sütő használatával, az alább leírt B módszernek megfelelően történhet. A módszer: Vízfürdős előkezelés Töltse meg a festőedényeket, pl. a Coplin-tartályokat hígított előkezelő oldattal (lásd HASZNÁLATI ÚTMUTATÓ, A.1 szakasz). Helyezze a hígított előkezelő oldatot tartalmazó festőedényeket vízfürdőbe. Fűtse fel a vízfürdőt és az előkezelő oldatot 95 99 C-ra. A megfelelő hőmérséklet biztosítása érdekében kalibrált hőmérő segítségével mérje meg az edényben uralkodó hőmérsékletet. A hőmérséklet stabilizálása és a párolgás megakadályozása érdekében fedje le az edényeket. Merítse a szoba-hőmérsékletű, paraffinmentesített metszeteket a festőedényekben lévő előmelegített előkezelő oldatba. Ismételten ellenőrizze a hőmérsékletet, majd végezze el az inkubálást 10 (±1) percen át, 95 99 C-on. A tárgylemezekkel együtt vegye ki az egész edényt a vízfürdőből. Vegye le a fedelet, és hagyja a tárgylemezeket az előkezelő oldatban szobahőmérsékleten lehűlni 15 percen át. Helyezze át a tárgylemezeket egy hígított mosópuffert tartalmazó edénybe (lásd: HASZNÁLATI ÚTMUTATÓ, A.3 szakasz), 3 perces időtartamra, szobahőmérsékleten (20 25 C-on). Cserélje le a mosópuffert, és áztassa be a metszeteket további 3 percre. MEGJEGYZÉS: Az előkezelő oldatot kizárólag egyszeri felhasználásra szánták. Tilos újrafelhasználni. B módszer: Előkezelés érzékelővel ellátott mikrohullámú sütő segítségével Töltsön meg egy műanyag edényt szoba-hőmérsékletű (20 25 C-os) előkezelő oldattal. Merítse bele a paraffinmentesített metszeteket az előkezelő oldatba, fedje le az edényt egy lyukacsos fedéllel, és helyezze be a mikrohullámú sütőbe. Válassza ki a forrásérzékelő funkciót és egy olyan programot, amely a forrási hőmérséklet elérése után 10 percig működik*. A 10 perces inkubációt követően vegye ki a tárgylemezeket tartalmazó edényt a sütőből, vegye le a fedelét, és hűtse szobahőmérsékleten 15 percen át. Helyezze át a tárgylemezeket egy hígított mosópuffert tartalmazó edénybe, és áztassa őket 3 percig szobahőmérsékleten (20 25 C-on). Cserélje le a mosópuffert, és áztassa be a metszeteket további 3 percre. * A hőérzékelővel ellátott mikrohullámú sütő használata azt jelenti, hogy a sütőn kell lennie egy olyan érzékelőnek, valamint olyan programoknak, amelyek először felmelegítik az előkezelő oldatot annak forráspontjára, majd ezt követően megtartják a szükséges előkezelési hőmérsékletet (95 ºC felett), miközben megtörténik az előre beállított idő visszaszámlálása (10 (±1) perc). Egyes, érzékelővel ellátott mikrohullámú sütő modellek esetében előfordulhat, hogy nem lehetséges a visszaszámlálási idő szabadon történő beállítása. Ha az adott modellen kizárólag előre beállított programok vannak, akkor győződjön meg arról, hogy olyan programot választott ki, amely alkalmas a szükséges (95 ºC feletti) előkezelési hőmérséklet fenntartására legalább 10 (±1) percen át, és kézi vezérléssel leállítható a program 10 (±1) perc után. MEGJEGYZÉS: Az előkezelő oldatot kizárólag egyszeri felhasználásra szánták. Tilos újrafelhasználni. P04090HU_02/K573111-2 65/14. o.

Emlőrák 2. lépés: Pepszin, azonnal felhasználható (RTU) vagy pepszinoldat A pepszin inkubálását az azonnal felhasználható (RTU) pepszincseppeknek a metszetekre történő közvetlen alkalmazásával lehet elvégezni szobahőmérsékleten (20 25 C-on) ( A módszer), vagy 37 C-on ( B módszer). Egy másik lehetőség, ha a metszeteket pepszinoldatba merítjük, és 37 (±2) C-on inkubáljuk ( C módszer). A és B módszer: Ütögetéssel távolítsa el a pufferfelesleget. Szálmentes törlővel (például abszorbens kendővel vagy gézlappal) óvatosan törölje körbe a mintát a rajta maradt folyadék eltávolítása, valamint a reagensek kijelölt területen belül tartása érdekében. A minta lefedéséhez 5 8 csepp (250 µl) hideg (2 8 C-os) pepszint használjon (a 2A. üvegből). A pepszint minden esetben 2 8 C-os hőmérsékleten tárolja. A módszer: Pepszin, azonnal felhasználható (RTU) Inkubálás 20 25 C-on Az inkubálást 5 15 percig végezze szobahőmérsékleten (20 25 C-on). Az 5 15 perces inkubálás a legtöbb minta esetében elegendő, de az optimális inkubálási idő függhet a korábbi szövetfixálási lépésektől és/vagy a minta vastagságától, és a felhasználónak kell azt meghatároznia. Ütögetéssel távolítsa el a pepszinfölösleget, és áztassa be 3 percre a metszeteket hígított mosópufferbe (lásd: HASZNÁLATI ÚTMUTATÓ, A.3 szakasz), szobahőmérsékleten (20 25 C-on). Cserélje le a hígított mosópuffert, és áztassa be a metszeteket további 3 percre. Folytassa a dehidrálással. B módszer: Pepszin, azonnal felhasználható (RTU) Inkubálás 37 C-on Helyezze a pepszines mintát egy 37 C-os fűtőblokkba pl. a Dako Hybridizerbe és inkubálja 3 5 percen át. A 3 5 perces inkubálás a legtöbb minta esetében elegendő, de az optimális inkubálási idő függhet a korábbi szövetfixálási lépésektől és/vagy a minta vastagságától, és a felhasználónak kell azt meghatároznia. Ütögetéssel távolítsa el a pepszinfelesleget, és áztassa be a metszeteket 3 percre hígított mosópufferbe, szobahőmérsékleten (20 25 C-on). Cserélje le a mosópuffert, és áztassa be a metszeteket további 3 percre. Folytassa a dehidrálással. A szövetmetszeteket sorozathígítású etanolban dehidrálja: 2 percen át 70%-os, 2 percen át 85%- os és 2 percen át 96%-os etanolban. Hagyja a szövetmetszeteket levegőn teljesen megszáradni. C módszer: Pepszinoldat A metszetek bemerítése 37 C-os pepszinoldatba A készlet négy különálló vizsgálathoz (60 ml pepszinoldat, hat metszetet befogadó kisebb edényhez) vagy egyetlen vizsgálathoz (240 ml pepszinoldat, 24 metszetet befogadó nagyobb edényhez) elegendő reagenst tartalmaz. Készítse el a pepszinoldatot az A.5 szakaszban leírt módon. Helyezze fel az edény fedelét, és tegye a pepszinoldatot vízfürdőbe, hogy hőmérséklete felmelegedjen 37 (±2) C-ra. Ellenőrizze, hogy a hőmérséklet stabilizálódott-e. A megfelelő hőmérséklet biztosítása érdekében kalibrált hőmérő segítségével mérje meg az edényben uralkodó hőmérsékletet. Ütögetéssel távolítsa el a mosópuffer-felesleget. Merítse a lemezeket a 37 (±2) C-os pepszinoldatba, és inkubálja őket 20 30 percig. Az 20 30 perces inkubálás a legtöbb minta esetében elegendő, de az optimális inkubálási idő függhet a korábbi szövetfixálási lépésektől és/vagy a minta vastagságától, és a felhasználónak kell azt meghatároznia. Ütögetéssel távolítsa el a pepszinfelesleget, és áztassa be a metszeteket 3 percre hígított mosópufferbe, szobahőmérsékleten (20 25 C-on). Cserélje le a mosópuffert, és áztassa be a metszeteket további 3 percre. Folytassa a dehidrálással. A szövetmetszeteket sorozathígítású etanolban dehidrálja: 2 percen át 70%-os, 2 percen át 85%- os és 2 percen át 96%-os etanolban. Hagyja a szövetmetszeteket levegőn teljesen megszáradni. P04090HU_02/K573111-2 65/15. o.

Emlőrák 3. lépés: HER2/CEN-17 IQISH próbakeverék A -18 C-on tárolt HER2/CEN-17 IQISH próbakeverék két fázisra válik szét. A 3. üveg használata előtt gondoskodjon arról, hogy tartalma egy fázisú legyen úgy, hogy a próbakeveréket szobahőmérsékletre (20 25 C-ra) hozza, majd összekeveri. Szobahőmérsékleten (20 25 C-on) olvassza fel a 3. üveg tartalmát legfeljebb 30 perc alatt (erős fénytől védett helyen), majd alaposan keverje fel az üveg tartalmát egy vortex keverőben 2500-as fordulatszámon, 15 másodpercig. A 3. üveget felhasználás után azonnal tárolja -18 C-on. Vigyen fel 10 µl HER2/CEN-17 IQISH próbakeveréket (3. üveg) a szövetmetszet közepére. Azonnal helyezzen fel egy 22 x 22 mm-es üveg fedőlemezt a próbakeverékre, és hagyja, hogy egyenletesen szétterüljön a fedőlemez alatt. Akadályozza meg a légbuborékok képződését. Ha légbuborékokat észlel, akkor azokat csipesz használatával finoman távolítsa el a szövettől. Ne felejtse el használat után azonnal visszatenni a 3. üveget -18 C-os tárolóhelyére. Zárja le a fedőlemezt a fedőlemez-tömítéssel úgy, hogy az utóbbit a fedőlemez szélei köré fecskendezi. A fedőlemez-tömítés nyúljon át a fedőlemezre és a tárgylemezre is, így alakítva ki tömítőréteget a fedőlemez körül. Ügyeljen arra, hogy a fedőlemez-tömítés teljesen lefedje a fedőlemez széleit. Készítse elő a Dako Hybridizer* készüléket (kód: S2450 vagy S2451) egy hibridizálási munkamenetre. Győződjön meg arról, hogy a Humidity Control Strips páratartalom-ellenőrző csíkok (kód: S2452) telítettek, és a lehető legjobb állapotban vannak a használathoz. Indítsa el a Hybridizert, és válasszon ki egy olyan programot, amely: 66 C-on és 10 percen át denaturálást, majd 45 C-on és 60 120 percen át hibridizálást végez. Helyezze be a tárgylemezeket a Hybridizer készülékbe, ellenőrizze, hogy a fedelet megfelelően lezárta-e, majd indítsa el a programot. A részleteket lásd a Dako Hybridizer kezelési útmutatójában. * A fent leírt feltételekkel azonos körülményeket biztosító más készülék is használható a denaturálás és hibridizálás elvégzésére. Helyezze a metszeteket egy 66 (±1) C-ra felfűtött lapos fém- vagy kőfelületre (fűtőblokkra vagy a hibridizációs kemence egyik blokkjára). A denaturálást pontosan 10 percen át végezze. Helyezze a tárgylemezeket előre felmelegített hibridizációs párakamrába. Helyezze fel a kamra fedelét, és inkubálja 45 (±2) C-on 60 120 percen át. Kérjük, vegye figyelembe, hogy a 37 C-os hibridizációs hőmérséklet nem felel meg az ebben a készletben található próbákkal történő használathoz. 4. lépés: Magas stringenciájú mosás Töltsön meg két festőedényt, pl. Coplin-tartályokat, hígított, magas stringenciájú mosópufferrel (lásd: HASZNÁLATI ÚTMUTATÓ, A.2 szakasz). Legalább 100 ml össztérfogat vagy tárgylemezenként 15 ml térfogat alkalmazása ajánlott mindkét edényben. Helyezze az egyik hígított, magas stringenciájú mosópuffert tartalmazó festőedényt szobahőmérsékleten a vegyifülkébe, a másikat pedig egy vízfürdőbe. Fűtse fel a vízfürdőt és a hígított, magas stringenciájú mosópuffert 63 (±2) C-ra. Ellenőrizze, hogy a hőmérséklet stabilizálódott-e. A hőmérséklet stabilizálása és a párolgás megakadályozása érdekében fedje le az edényt. A megfelelő hőmérséklet biztosítása érdekében kalibrált hőmérővel mérje meg a hőmérsékletet a vízfürdő edényében. A magas stringenciájú mosópuffer detergenst tartalmaz, és 63 C-os hőmérsékleten zavarossá válhat. Ez nem befolyásolja a teljesítményt. Csipesszel vagy kesztyűt viselve vegye ki a tárgylemezeket a hibridizációs kamrából, finoman távolítsa el a fedőlemez-tömítést és a fedőlemezt, majd egyesével helyezze a tárgylemezeket a szoba-hőmérsékletű előmosó edénybe. Amint eltávolította az összes fedőlemezt, helyezze át a tárgylemezeket a szoba-hőmérsékletű előmosó edényből a 63 (±2) C-os vízfürdőben lévő edénybe. P04090HU_02/K573111-2 65/16. o.

Emlőrák Amint behelyezte a tárgylemezeket a 63 (±2) C-os hígított, magas stringenciájú mosópufferbe, a vízfürdőbe, az időzítőt azonnal indítsa el. A magas stringenciájú mosást pontosan 10 percig végezze. Vegye ki a tárgylemezeket a magas stringenciájú mosópufferből, és áztassa be őket hígított mosópufferbe 3 percre, szobahőmérsékleten (20 25 C-on). Cserélje le a hígított mosópuffert, és áztassa be a metszeteket további 3 percre. A szövetmetszeteket sorozathígítású etanolban dehidrálja: 2 percen át 70%-os, 2 percen át 85%- os és 2 percen át 96%-os etanolban. Hagyja a szövetmetszeteket teljesen megszáradni. 5. lépés: Rögzítés Tegyen 15 µl DAPI tartalmú fluoreszcens rögzítőszert (5. üveg) a tárgylemez célterületére, majd helyezzen rá egy üveg fedőlemezt. MEGJEGYZÉS: A lemezeket rögzítés után 15 perccel vagy 7 napon belül bármikor ki lehet értékelni. Mindemellett, a lemezek kifakulhatnak, ha fény vagy magas hőmérséklet éri őket. Az elhalványulás minimalizálása érdekében tárolja a tárgylemezeket sötét helyen, -18 8 C-on. P04090HU_02/K573111-2 65/17. o.

Emlőrák Minőség-ellenőrzés emlő 1. A jeleknek világosnak, jól elkülönülőnek és könnyen értékelhetőnek kell lenniük. 2. A normál sejtek a festési folyamat belső kontrolljának lehetőségét biztosítják. A normál sejteken 1 2 jól látható zöld jelnek kell lennie, ami arra utal, hogy a CEN-17 PNS próba sikeresen hibridizálódott a 17. kromoszóma centromer régiójával. A normál sejteken 1-2 jól látható piros jelnek kell lennie, ami arra utal, hogy a HER2 DNS próba sikeresen hibridizálódott a HER2 amplikonnal. A szövetek metszése miatt néhány normál sejt a várható 2 jelnél kevesebbet fog tartalmazni az egyes színekből. Amennyiben a normál sejtekben nem észlelhető jeladás, akkor ez az assay eljárás hibájára utal, és az eredményeket érvénytelennek kell tekinteni. 3. A sejtmag morfológiájának épnek kell lennie, amikor az értékelést DAPI szűrővel végzik. A túl sok szellemképes sejt és általánosan rossz minőségű sejtmag-morfológia a minta túlemésztettségére utal, ami jelvesztéshez vagy a jel fragmentálódásához vezet. Az ilyen minták eredményeit érvénytelennek kell tekinteni. 4. Az egyes laboratóriumok közötti eltérések a szövetmintákon végzett fixálási, feldolgozási és beágyazási eljárásokban az eredmények változóak lehetnek, ami rendszeres belső kontrollok alkalmazását teszi szükségessé. A festés értelmezése emlő A kiértékelésre alkalmas szövet A vizsgálatot csak invazív karcinómás betegek mintáin szabad végezni. Ha egyazon mintában in situ és invazív karcinóma is megtalálható, akkor csak az invazív komponenst értékelje. Kerülje a nekrotikus területeket és azokat a részeket, ahol a sejtmag határvonalai nem egyértelműek. Ne vonjon be a vizsgálatba szubjektív megítélés alá eső sejtmagokat. Hagyja ki azokat a sejtmagokat is, amelyek gyenge jelintenzitásúak, háttérfestődésük pedig nem specifikus vagy túl erős. A jelek megszámlálása: Lokalizálja a tumort a HE-módszerrel festett tárgylemezen, majd ugyanazt a területet értékelje ki a FISH-eljárással festett lemezen is. Pásztázzon végig több tumorsejtes területet, hogy felmérje az esetleges heterogenitásokat. Válasszon ki egy olyan területet, amelyben jó a sejtmagok eloszlása. Kezdje az elemzést a kiválasztott terület bal felső kvadránsában, majd balról jobbra pásztázva, az alábbi irányelveknek megfelelően számolja meg minden egyes vizsgált sejtmag határon belül eső jeleit (lásd a 3. függeléket is). - Közelítse és távolítsa a fókuszt, hogy megtalálja az egyes sejtmagok minden egyes jelölődését. - Számláláskor az egyforma méretű, és egymástól legfeljebb a jelátmérőnek megfelelő távolságban levő két jelet tekintse egynek. - A nagyfokú HER2 génamplifikációt mutató sejtmagokban a HER2 jelek olyan közel kerülhetnek egymáshoz, hogy jelcsoportot hoznak létre. Ilyen esetekben a HER2 jeleket nem lehet megszámolni, de értéküket meg kell becsülni. Külön figyelmet kell fordítani a zöld jelekre, mert a HER2 jelcsoportok könnyen elfedheti a zöld jeleket, amelyek ezáltal nehezen láthatóvá válnak. Kétséges esetekben vizsgálja meg a zöld jeleket speciális FITC-szűrő segítségével. A számlálásnál ne vegye figyelembe a jelet nem adó sejtmagokat és azokat sem, amelyek csak egyszínű jelet adnak. Kizárólag azokat a sejtmagokat használja az értékeléshez, amelyek mindkét színből legalább egy FISH-jelet mutatnak. P04090HU_02/K573111-2 65/18. o.

Emlőrák Jelszámlálási útmutató 1 Ne számolja. A sejtmagok átfedik egymást, nem minden részük látható. 2 Két zöld jel: a számlálásnál ne vegye figyelembe a csupán egy színű jeleket kibocsátó sejtmagokat 3 3 zöld és 12 piros jelként számolandó (csoportos becslés) 4 1 zöld és 1 piros jelként kell számolni. Számláláskor az egyforma méretű, és egymástól legfeljebb a jelátmérőnek megfelelő távolságban levő két jelet számolja egynek 5 Ne számolja (túlemésztett vagy emésztetlen sejtmagok). vagy A sejtmagok közepéből hiányoznak a jelek (fánk alakú sejtmagok). 6 2 zöld és 3 piros jelként kell számolni. Számláláskor az egyforma méretű, és egymástól legfeljebb a jelátmérőnek megfelelő távolságban levő két jelet számolja egynek 7 1 zöld és 5 piros jelként kell számolni 8 3 zöld (1 zöld jel a fókuszon kívül) és 3 piros jelként számolandó. 9 A zöld jeleket elfedő piros jelcsoport, a zöld jeleket vizsgálja meg egy speciális FITC-szűrővel, vagy hagyja ki a számolásból Jegyezze fel az értékeket a 2. függelékben bemutatotthoz hasonló táblázatban. Szövetmintánként 20 sejtmag jeleit számolja meg; ha lehetséges, akkor elkülönülő tumorterületekről (17). Számolja ki a HER2/CEN-17 arányt oly módon, hogy elosztja a piros HER2 jelek teljes számát a zöld CEN-17 jelek teljes számával. A 2-nél nagyobb vagy azzal egyenlő HER2/CEN-17 arányt mutató mintákat HER2 génamplifikáltnak kell tekinteni (5, 17-19). A határértékre vagy a kritikus cut-off érték (1,8 2,2) közelébe eső minták eredményeinek kiértékelését óvatosan kell végezni. Ha az arány a határértékhez közel esik (1,8 2,2), akkor számolja meg 20 további sejtmag jeleit, és számolja ki újra az arányt a 40 sejtmagra vonatkozóan. Kétséges esetben az ilyen mintát tartalmazó tárgylemezt újra kell számolni. Határesetekben ajánlott, hogy a patológus és a kezelőorvos konzultáljon egymással. P04090HU_02/K573111-2 65/19. o.

Emlőrák Korlátozások emlő 1. A FISH eljárás egy többlépcsős folyamat, amely speciális szakképzettséget igényel a megfelelő reagensek kiválasztása, a szövetek kiválasztása, fixálása és feldolgozása, valamint a FISH tárgylemez előkészítése és a festési eredmények értelmezése terén. 2. A FISH eredményei függnek a szövetek festést megelőző kezelésétől és előkészítésétől. A nem megfelelő fixálás, mosás, szárítás, felfűtés, metszetkészítés, illetve más szövetekkel vagy folyadékokkal való szennyeződés befolyásolhatja a próba hibridizálását. Inkonzisztens eredményekhez vezethetnek a fixálási és beágyazási módszerek eltérései vagy a szövet inherens egyenetlenségei. 3. Optimális és reprodukálható eredmények elérése érdekében a szövetmetszeteket teljes mértékben paraffinmentesíteni kell. A paraffinmentesítést a festési eljárás kezdetén kell elvégezni. (Lásd a HASZNÁLATI ÚTMUTATÓ B.2 szakaszát.) 4. Kizárólag kalibrált hőmérsékletű vízfürdőt, fűtőblokkot és hibridizáló kemencét szabad használni. Egyéb típusú berendezések használata a HER2/CEN-17 IQISH próbakeverék hibridizálás alatti párolgását okozhatja, ezért ezeket a berendezéseket a felhasználónak validálnia kell. Teljesítményjellemzők emlő Analitikai érzékenység A HER2/CEN-17 IQISH próbakeverék érzékenységét 18 normál humán emlőepitéliumminta segítségével vizsgálták. A HER2 és a CEN-17 jelszámok arányát mintánként 20 sejtmag megszámlálása alapján számolták ki. A 18 normál humán emlőepitélium-minta esetében a HER2/CEN-17 arány értéke a 0,97 és 1,08 közötti tartományban mozgott. Analitikai specificitás A HER2/CEN-17 IQISH próbakeverékben lévő HER2 DNS próbákat úgy végszekvenálták és térképezték fel, hogy biztosan és teljesen lefedjenek egy 218 kb nagyságú szakaszt, amely tartalmazza a HER2 gént. A HER2/CEN-17 IQISH próbakeverékben lévő CEN-17 PNS próbákat egyenként és kombinációban is tesztelték annak ellenőrzésére, hogy specifikusan hibridizálódnak-e a 17-es kromoszóma centromer régiójával. Annak megítélésére, hogy alkalmas-e az assay kizárólag a célanyagok, vagyis a HER2 és a CEN-17 azonosítására, egyéb anyagokkal való interferencia nélkül, normál humán emlőepitélium-mintákat vizsgáltak meg a 3. üvegben lévő hibridizáló pufferrel, de próbakeverék nélkül. Összesen 18 mintát értékeltek a próbakeverékkel nem kapcsolatos jelek jelenlétének felmérése céljából. A 18 minta egyikében sem mutatták ki egyéb kromoszóma célszekvenciák jelenlétét, és interferenciát sem tapasztaltak szoros rokonságban lévő anyagokkal sem. A robosztusságra vonatkozó vizsgálatok A HER2 IQFISH pharmdx assay robusztusságát az előkezelési idő, a hőmérséklet és az előkezelési puffer felmelegítésére szolgáló módszerek (mikrohullámú sütő vagy vízfürdő), a pepszininkubációs idő és módszer (RTU pepszin vagy immerzió), a denaturációs hőmérséklet és idő, a hibridizálási idő, valamint a magas stringenciájú mosóoldattal történő mosási idő és hőmérséklet változtatásával tesztelték. A következő kísérleti feltételek mellett az eredmények között nem voltak szignifikáns különbségek: P04090HU_02/K573111-2 65/20. o.

Emlőrák Előkezelés A módszer: 10 perces vízfürdő 95 C-on, 95 99 C-on, illetve 99 C-on, valamint 9, 10, illetve 11 perces vízfürdő 95 99 C-on Előkezelés B módszer: mikrohullámú sütő 9, 10, illetve 11 percig >95 C-on. Pepszines emésztés A módszer: 5, 10, illetve 15 perces inkubációs időkkel szobahőmérsékleten (20 25 C-on). Pepszines emésztés B módszer: 3, 4, illetve 5 perces inkubációs időkkel 37 C-on). Pepszines emésztés C módszer: 20, 25, illetve 30 perces inkubációs időkkel, amelyek mindegyikét 35, 37, illetve 39 C-os hőmérsékletekkel kombináltak. 10 perces denaturálás 65, 66, illetve 67 C-on, valamint 9, 10, illetve 11 perces denaturálás 66 C-on. 60, 90, és 120 perces hibridizálási idő 45 C-on. Magas stringenciájú 10 perces mosás 61, 63, illetve 65 C-on, valamint 9, 10, illetve 11 perces, 63 C-on történő mosás. Megjegyzés: A robosztusságra vonatkozó vizsgálatok esetében a festési eljárásnak egyszerre csak egyetlen paraméterét változtatták meg, a többi paramétert állandó értéken hagyták. Ajánlott ragaszkodni a festési eljárásban megadott időtartamokhoz és hőmérsékletekhez. A 60 perces hibridizálás nagy jelintenzitást eredményezett, amely azonban kissé alacsonyabb volt, mint a 90 és a 120 perces hibridizálás esetében. A többi idő/hőmérséklet kombináció esetében nem találtak szignifikáns különbségeket az eredmények között. A HER2 IQFISH pharmdx esetében a festési eljárási protokollban különféle hőelőkezelési, pepszines emésztési és hibridizálási időket lehet alkalmazni. Minden egyes kombinációs lehetőséget a HER2 gén státuszára vonatkozóan validáltak. A validálást 10 formalinnal fixált, paraffinba ágyazott (FFPE) humán emlőrákos szövetmintán végezték, mind a 12 kombinációs lehetőség esetében. Referenciaként a HER2 FISH pharmdx készletet (kód: 5331) használták. Az egyes mintákra vonatkozó HER2/CEN-17 arányokat az 1. táblázatban tüntettük fel. A 12 tesztvizsgálat és a referenciafestések kereszttáblázata 100%-os (10/10) általános egyezést igazolt a HER2 génstátuszban 78,3%-os alsó és 100%-os felső határral a kétoldalas, 95%-os megbízhatósági tartományban. A kappa érték 1,00 volt, a McNemars teszt pedig a torzítás hiányát igazolta (az 1,00 kétoldalas p-értéke). P04090HU_02/K573111-2 65/21. o.

Emlőrák 1.ábra Egyéni HER2/CEN-17 arányok a HER2 IQFISH pharmdx (Kód: K5731) készlettel lehetséges 12 protokoll kombinációs variációban (1 12 teszt), valamint a HER2 FISH pharmdx referenciakészlettel (kód: K5331) megfestett (R) 10 humán emlőrákminta esetében. A vízszintes vonal a 2,0-es cut-off értéket ábrázolja. Megismételhetőség A HER2/CEN-17 arány megismételhetőségét a HER2 IQFISH pharmdx assay segítségével vizsgálták, kilenc, nem amplifikált vagy amplifikált HER2 génstátuszos humán emlőrákminta egymást követő metszetein. Egyazon vizsgálati meneten belül az egyes minták háromhárom metszetét vizsgálták. Az átlagos variációs koefficiens 5,2%-os volt a nem amplifikált minták esetében (1% és 8% közötti tartomány) és 14%-os az amplifikált mintáknál (7% és 20% közötti tartomány). Összesen öt, különböző (3, 4, 5, 6, illetve 7 µm) vastagságú, négy humán emlőrákmintából származó, egymás után következő metszetet vizsgáltak meg a HER2 IQFISH pharmdx készlettel. A HER2/CEN-17 arány átlagos variációs koefficiense 7%-os volt (6% és 9% közötti tartomány). Reprodukálhatóság A HER2 IQFISH pharmdx assay tételek, illetve értékelők közötti reprodukálhatóságát három HER2 IQFISH pharmdx assay felhasználásával és három értékelő személlyel vizsgálták. A reprodukálhatóságot kilenc különböző, nem amplifikált vagy amplifikált HER2 génstátusszal rendelkező humán emlőrák mintán vizsgálták. A tételek közötti reprodukálhatóság átlagos variációs koefficiense 5%-os volt a nem amplifikált minták esetében (2% és 8% közötti tartomány) és 7,8%-os az amplifikált mintáknál (5% és 11% közötti tartomány). Az értékelők közötti reprodukálhatóság átlagos variációs koefficiense 3,2%-os volt a nem amplifikált minták esetében (0,2% és 6% közötti tartomány) és 2,8%-os az amplifikált mintáknál (2% és 4% közötti tartomány). Klinikai alkalmazhatóság A Dako HER2 FISH pharmdx készlet (kód: K5331) klinikai alkalmazhatóságát a Vysis PathVysion HER-2 DNS-próba készlettel vetették össze egy összehasonlító vizsgálatban. A vizsgálatban, II-III. stádiumú, nyirokcsomó-pozitív vagy nyirokcsomó- P04090HU_02/K573111-2 65/22. o.

Emlőrák negatív emlőrákban szenvedő betegekből származó 150 archivált mintát tanulmányoztak. A vizsgálat elsődleges célja a HER2 / 17-es kromoszóma centromer arányok közötti megfelelési mérték vizsgálata volt a Dako, illetve a Vysis készletekkel vizsgált 150 minta esetében, az általános megegyezési mérték, valamint a dichotomizált FISH eredmények közötti megegyezés tekintetében (+/- csoportok) egyaránt. Összesen 145 mintát hibridizáltak és értékeltek sikeresen, és ezek alkalmasak voltak a statisztikai elemzésre is. Az eredmények 2 x 2-es kereszttáblázata az 1. táblázatban látható. 1. táblázat. A Dako HER2 FISH pharmdx készlettel és a Vysis PathVysion HER-2 DNS-próba készlettel megvizsgált 145 emlőrák mintából származó dichotomizált eredmények. Mindkét készlet esetében, minden egyes mintában 60 sejtmagot értékeltek. Vysis Kit (-) amplifikált Vysis Kit (+) amplifikált Dako Kit (-) amplifikált Dako Kit (+) amplifikált Összeg 95 2 97 5 43 48 Összeg 100 45 145 A Dako és a Vysis tesztek közötti megfelelőség 95%-os volt, 92 99%-os megfelelőségi tartománnyal. A kappa-érték 0,89 volt. A két eljárás közötti szisztematikus torzításra vonatkozó McNemars teszt nem volt szignifikáns (p=0,22). A 2. ábra a 145 mintával végzett párosított megfigyelések pontdiagramját ábrázolja. P04090HU_02/K573111-2 65/23. o.

Emlőrák Scatter Párosított plot of megfigyelések paired observations pontdiagramja 12,00 DakoCytomation HER2 FISH pharmdx Kit Dako HER2 FISH pharmdx készlet 10,00 8,00 6,00 4,00 2,00 0,00 0,00 2,00 4,00 6,00 8,00 10,00 12,00 Vysis PathVysion HER-2 HER-2 DNS DNA próba Probe készlet Kit 2. ábra. Dako HER2 FISH pharmdx készlettel és Vysis PathVysion HER-2 DNS próba készlettel, HER2 génamplifikáció szempontjából megvizsgált 145 emlőrákos minta. Az eredményeket HER2 / 17-es kromoszóma centromer aránnyal fejezték ki. Mindkét készlet esetében, minden egyes mintában 60 sejtmagot értékeltek. A Dako HER2 FISH pharmdx és a Vysis PathVysion HER-2 DNS próba tesztek közötti általános megegyezést a páros megfigyelési logaritmusok (arányok) közötti különbség elemzésével, valamint a két teszt logaritmusának (arányának) lineáris regressziós analízisével vizsgálták. Megállapították, hogy a logaritmusok (arányok) páros megfigyelése közötti különbség szisztematikusan növekedett a HER2 / 17. kromoszóma centromer arányok összegével, és a magasabb arányok esetében a mért arány a DAKO eljárásban magasabb, mint a Vysis eljárás esetében. A Dako HER2 FISH pharmdx készlet esetében megfigyelt magasabb HER2 / 17. kromoszóma centromer arány a két eljárás közötti valódi különbséggel függhet össze, pl. azzal, hogy a Dako HER2 FISH pharmdx készlet nagyobb felbontóképessége magasabb arányokat eredményez a fokozott HER2 génamplifikációval járó esetekben. Mindemellett, mivel a két készlet vizsgálatát 2 különböző helyszínen végezték, laborok közötti eltérésekre is számítani lehet. Ezenkívül a szakirodalomban beszámoltak nagyobb mértékű ingadozásokról a fokozott amplifikációval járó esetekben, de úgy tartják, hogy ez klinikailag nem releváns (18). Ez a vizsgálat nem tette lehetővé a két eljárás szisztematikus különbségeinek több laboratóriumban történő tanulmányozását. Megemlítendő továbbá az is, hogy a két eljárás között megfigyelt eltérések hasonló mértékűek voltak, mint a Portability Study vizsgálatban megfigyelt, helyszínek közötti eltérések. P04090HU_02/K573111-2 65/24. o.

Emlőrák A Dako HER2 IQFISH pharmdx készletet (kód: K5731) 78 humán emlőrákos mintával végzett összehasonlító vizsgálatban hasonlították össze a Dako HER2 FISH pharmdx készlettel (kód: K5331). A két assay segítségével kapott HER2 státusz kereszttáblázata 98,7%-os általános egyezést mutatott, 94,2%-os alsó és 99,9%-os felső határral a 95%-os megbízhatósági tartományban. A kappa-érték 0,96 volt, 0,89-es alsó és 1,00 felső határral a 95%-os megbízhatósági tartományban. A McNemars teszttel kapott p-érték 1,00 volt, ami a két assay közötti torzítás hiányára utalt. P04090HU_02/K573111-2 65/25. o.

Emlőrák Hibaelhárítás emlő Probléma Valószínű ok Javasolt teendő 1. Nincs jel, vagy a jel gyenge 1a. A készletet magas hőmérséklet-hatásnak tették ki a szállítás vagy a tárolás ideje alatt 1b. A mikroszkóp nem működik megfelelően - nem megfelelő szűrőkészlet - nem megfelelő lámpa - a higanylámpa túl régi - piszkos és/vagy megrepedt kollektorlencsék - nem megfelelő immerziós olaj 1a. Ellenőrizze a tárolási körülményeket. Győződjön meg arról, hogy átvételkor volt még szárazjég a küldeményben. Győződjön meg arról, hogy a 3. üveget sötét helyen és -18 C-on tárolták. Győződjön meg arról, hogy a 2A. és az 5. üveget legfeljebb 2 8 C-on tárolták, sötét helyen. 1b. Ellenőrizze a mikroszkópot, és bizonyosodjon meg arról, hogy az alkalmazott szűrök alkalmasak a készlet fluorokrómjaival történő használatra, illetve, hogy a higanylámpa megfelelő, és nem használják hosszabb ideje, mint amennyi a várható élettartama. (lásd a 3. függeléket). Kétséges esetben vegye fel a kapcsolatot helyi mikroszkópbeszállítójával. 1c. Elhalványult jelek 1c. Kerülje a hosszas mikroszkópos vizsgálatot, és csökkentse minimálisra a túl erős fényexpozíciót. 1d. Nem megfelelőek az előkezelés feltételei 1e. A próbakeverék párolgása a hibridizálás ideje alatt 1d. Gondoskodjon arról, hogy az ajánlott előkezelési hőmérsékletet és időt alkalmazzák 1e. Gondoskodjon megfelelő páratartalomról a hibridizációs kamrában 2. Nincsenek zöld jelek 3. Nincsenek piros jelek 2a. A magas stringenciájú mosási feltételek nem megfelelőek 3a. Nem megfelelőek az előkezelés feltételei 2a. Bizonyosodjon meg arról, hogy az ajánlott magas stringenciájú mosási hőmérsékletet és időtartamot alkalmazták, továbbá, hogy a fedőlemezeket eltávolították a magas stringenciájú mosás elvégzése előtt 3a. Gondoskodjon arról, hogy az ajánlott előkezelési hőmérsékletet és időt alkalmazzák P04090HU_02/K573111-2 65/26. o.

Emlőrák Probléma Valószínű ok Javasolt teendő 4. Jelmentes területek 4a. A próbatérfogat túl kicsi 4a. Győződjön meg arról, hogy a próba térfogata elegendő-e a fedőlemez alatti terület lefedéséhez 4b. Légbuborékzárványok keletkeztek a próbakeverék alkalmazása vagy a rögzítés közben 4b. Akadályozza meg a légbuborékok képződését. Ha légbuborékokat észlel, akkor csipesz segítségével finoman ütögetve távolítsa el azokat 5. Túl erős háttérfestődés 6. Gyenge minőségű szövetmorfológia 7. Nagyfokú zöld autofluoreszcencia a tárgylemezen az FFPE szövet nélküli területeket is beleértve 5a. Nem megfelelő szövetfixálás 5b. A paraffinmentesítés nem tökéletes 5c. A magas stringenciájú mosás hőmérséklete túl alacsony 5d. A hibridizált részt túl hosszasan tették ki erős fénynek 6a. Nem megfelelő pepszinkezelés 6b. A nem megfelelő előkezelési körülmények az oldat homályosodását vagy zavarosodását eredményezhetik 6c. A túl hosszú pepszinkezelés vagy a nagyon vékony metszetek szellemképes vagy fánk alakú sejtek megjelenését eredményezhetik. 7. Lejárt vagy nem javasolt üveglemezek használata 5a Gondoskodjon arról, hogy kizárólag formalinnal fixált, paraffinba ágyazott szövetmetszeteket használjon 5b. Kövesse a B.2 szakaszban leírt paraffinmentesítési és rehidrálási eljárásokat 5c. Győződjön meg arról, hogy a magas stringenciájú mosás hőmérséklete 63 (±2) C 5d. Kerülje a hosszas mikroszkópos vizsgálatot, és csökkentse minimálisra a túl erős fényexpozíciót. 6a. Tartsa be az ajánlott pepszininkubációs időket. Lásd a B.3 szakasz 2. lépését. Bizonyosodjon meg arról, hogy a pepszint megfelelő hőmérsékleten végzik a kezelést. Lásd a B.1 szakaszt 6b. Gondoskodjon arról, hogy az ajánlott előkezelési hőmérsékletet és időt alkalmazzák 6c. Rövidítse le a pepszininkubációs időt. Lásd a B.3 szakasz 2. lépését. Gondoskodjon arról, hogy a metszet vastagsága 4 6 µm legyen. 7. Bizonyosodjon meg arról, hogy a bevonatos üveglemez (Dako Silanized Slides, kód: S3003, vagy poli-l-lizinnel bevont tárgylemezek) még nem járt le. MEGJEGYZÉS: Ha a probléma a fenti okok egyikének sem tulajdonítható, vagy ha az ajánlott korrekciós lépés nem oldja meg a problémát, további segítségért hívja a Dako Műszaki Szolgálatát. P04090HU_02/K573111-2 65/27. o.

Emlőrák 1. függelék emlő HER2 IQFISH pharmdx, kód: K5731 Ellenőrzőlista a protokollhoz A festési munkamenet naplóazonosítója: A munkamenet dátuma: HER2 IQFISH pharmdx (K5731) tétel: Minta azonosító száma: Készülék azonosító száma: Az 1 x mosópuffer (6. üveg, 1:20 hígítás) hígításának/lejáratának dátuma / A szövet fixálása semlegesre pufferelt formalinnal történt Igen Nem 1. lépés: Előkezelés Az előkezelő oldat (1. üveg, 1:20 hígítás) hígításának/lejáratának dátuma Az előkezelő oldat mért hőmérséklete (95 99 C), ha a vízfürdős módszert használják a melegítéshez Előkezelés (10 perc) és hűtés (15 perc) Mosás a mosópufferben (6. üveg, 1:20 hígítás) (2 x 3 perc) 2. lépés: Pepszin A pepszinkezelés (2. üveg) időtartama 37 C-on vagy A pepszinkezelés (2. üveg) időtartama szobahőmérsékleten (20 25 C-on) vagy A pepszinimmerzió időtartama 37 (±2) C-on Mosás a mosópufferben (6. üveg, 1:20 hígítás) (2 x 3 perc) A tárgylemezek dehidrálása (3 x 2 perc) sorozathígított etanolban és szárítás levegőn 3. lépés: HER2/CEN-17 IQISH próbakeverék Adja hozzá a próbakeveréket (3. üveg), helyezze fel a fedőlemezt, és zárja le a fedőlemez-tömítéssel Mért denaturálási hőmérséklet (66 (±1) C) C Denaturálás 10 percen át Mért hibridizálási hőmérséklet (45 (±2) C) C Hibridizálási idő (60 120 perc) 4. lépés: Magas stringenciájú mosás A magas stringenciájú mosópuffer (4. üveg, 1:20 hígítás) hígításának/lejáratának dátuma A magas stringenciájú mosópuffer mért hőmérséklete (63 (±2) C) Magas stringenciájú mosás (10 perc) a fedőlemezek eltávolítása után Mosás a mosópufferben (6. üveg, 1:20 hígítás) (2 x 3 perc) C A tárgylemezek dehidrálása (3 x 2 perc) sorozathígított etanolban és szárítás levegőn / / C perc perc perc perc C perc 5. lépés: Rögzítés Vigyen fel 15 μl fluoreszcens rögzítőszert (5. üveg), és helyezze fel a fedőlemezt P04090HU_02/K573111-2 65/28. o.

Emlőrák Megjegyzések: Dátum és aláírás, labortechnikus: P04090HU_02/K573111-2 65/29. o.

Emlőrák 2. függelék emlő HER2 IQFISH pharmdx, kód: K5731 Számlálási vázlat A festési munkamenet naplóazonosítója: A munkamenet dátuma: HER2 IQFISH pharmdx K5731, Tétel: Minta azonosító száma: Számlálja meg a jeleket 20 sejtmagban Sejtmag száma HER2 számérték (piros) CEN-17 számérték (zöld) Sejtmag száma 1 11 2 12 3 13 4 14 5 15 6 16 7 17 8 18 9 19 10 20 Összes (1 10) Összes (11 20) HER2 számérték (piros) CEN-17 számérték (zöld) A HER2/CEN-17 arány meghatározásához számlálja meg a HER2 jeleket és a CEN-17 jeleket ugyanazon 20 sejtmagban, és a HER2 jelek számának összegét ossza el a CEN-17 jelek számának összegével. Ha a HER2/CEN-17 arány a határérték közelébe (1,8 2,2) esik, akkor számláljon meg még 20 sejtmagot és ismét számítsa ki az arányt. A határértékre vagy a kritikus cut-off érték közelébe (1,8-2,2) eső arányt eredményező minták kiértékelését különös gonddal kell végezni (lásd a számlálási útmutatót). Végeredmény (1 20) HER2 CEN-17 HER2/CEN-17 arány Arány < 2: Nem figyelhető meg HER2 génamplifikáció Arány 2: HER2 génamplifikációt figyeltek meg Dátum és aláírás, labortechnikus: Dátum és aláírás, patológus: Számlálási útmutatások tekintetében lásd A festődés értékelése című szakaszt P04090HU_02/K573111-2 65/30. o.

Emlőrák 3. függelék emlő HER2 IQFISH pharmdx, kód: K5731 A fluoreszcencia mikroszkóp műszaki leírása A Dako a következő eszközök használatát ajánlja a HER2 IQFISH pharmdx, K5731 készlettel: 1. Mikroszkóp típusa Epifluoreszcencia mikroszkóp 2. Lámpa 100 wattos higanylámpa (vezessen nyilvántartást a használati időről). 3. Objektívek A szövetek szűrővizsgálatához 10-szeres nagyítású száraz fluoreszcenciás vagy 16-szoros nagyítású olajimmerziós fluoreszcenciás objektívek használhatók. A nagy erejű nagyításhoz és a jelek számlálásához kizárólag az olajimmerziós (pl. 100- szoros nagyítású) fluoreszcencia objektívek használata ajánlott. 4. Szűrők A szűrőket egyénileg alakították ki a különböző fluorokrómokhoz, így ezeket ennek megfelelően kell kiválasztani. A Dako speciális DAPI szűrő használatát ajánlja, magas minőségű Texas Red/FITC kettős szűrővel kombinációban. DAPI szűrő Texas Red/FITC kettős szűrő A Texas Red és FITC monoszűrőket az eredmények megerősítéséhez lehet használni. Fluorokróm Gerjesztő hullámhossz Kibocsátási hullámhossz FITC 495 nm 520 nm Texas Red 596 nm 615 nm Az egyes mikroszkóptípusokhoz különböző szűrők tartoznak, és a megfelelő szűrők használata kulcsfontosságú az értékelés szempontjából. Részletes információkért vegye fel a kapcsolatot a mikroszkóp szállítójával vagy a Dako képviselőjével. 5. Olaj Nem fluoreszkáló olaj Óvintézkedések Az 50 wattos higanylámpa használata nem ajánlott. Rodamin szűrőket nem lehet használni. Tripla szűrők használata nem ajánlott. Problémákat okozhat a fluoreszcens jelek értékelésekor, ha a mikroszkóp kialakítása nem optimális. Fontos, hogy a fényforrás ne legyen lejárva, valamint hogy az igazítása és fókuszálása megfelelő legyen. A vevőknek ellenőrizniük kell a higanylámpát, és követniük kell a gyártó lámpára vonatkozó utasításait. Az eredmények értékelése előtt el kell végezni a mikroszkóp karbantartását, és ellenőrizni kell, hogy a higanylámpa megfelelően van-e a helyére illesztve. Törekedni kell arra, hogy a mintát a lehető legkisebb mértékben tegyék ki a gerjesztő hullámhossz hatásának, hogy a fluoreszcencia elhalványulása minimális legyen. Javasoljuk, hogy a fluoreszcencia in situ hibridizálás megkezdése előtt beszélje meg az adott mikroszkóp beállítását a gyártóval, vagy tanulmányozza a szakirodalmat. P04090HU_02/K573111-2 65/31. o.

Gyomorrák Összegzés és magyarázat gyomor A humán HER2 gén (amely ERBB2 vagy NEU néven is ismert) a 17-es kromoszómán helyezkedik el, és a HER2 fehérjét vagy a p185 HER2 receptort kódolja. A HER2 fehérje egy membránreceptor tirozinkináz, amely homológ az epidermális növekedésifaktor-receptorral (EGFR vagy HER1) (1-2). A HER2 gén 2 példányban van jelen minden normál diploid sejtben. A HER2 fehérje túlzott mértékű expresszióját és a HER2 gén amplifikációját gyomorrákban számos tanulmányban kimutatták (áttekintés: (20)). IHC vagy FISH módszerrel a páciensek körülbelül 20%-ában mutatható ki a HER2-pozitivitás (20). Preklinikai in vitro és in vivo tanulmányok során bebizonyították, hogy a trasztuzumab (Herceptin ) hatékony különböző gyomorrák-modellekben, és ez több klinikai vizsgálat elindításához vezetett (20-24). Egy III. fázisú BO18255 tanulmányban, a ToGA vizsgálatban, inoperábilis, lokálisan előrehaladott, kiújuló és/vagy áttétes gyomor-adenokarcinómában vagy gyomor-nyelőcső határon lévő adenokarcinómában szenvedő HER2-pozitív betegeket randomizáltak 5-FU vagy capecitabin és ciszplatin kezelésre, külön, vagy trasztuzumabbal kombinációban. Azon páciensek esetében, akik trasztuzumabból és kemoterápiából álló kombinált kezelésben részesültek, az összesített túlélés (overall survival OS) statisztikailag szignifikáns növekedését figyelték meg (25). A trasztuzumab olyan humanizált monoklonális antitest, amely nagy affinitással kötődik a HER2 fehérjéhez, és kimutatták, hogy in vitro és in vivo is gátolja a HER2 fehérjét fokozott mértékben expresszáló humán tumorsejtek proliferációját (21-24). Az eljárás elve gyomor A HER2 IQFISH pharmdx készlet a formalinban fixált, paraffinba ágyazott szövetmetszet-minták FISH vizsgálatához szükséges valamennyi fontos reagenst tartalmazza. Paraffinmentesítés és rehidrálás után a mintákat előkezelő oldatban melegítik, amit a pepszin felhasználásával végzett proteolitikus emésztés követ. A melegítési és proteolitikus előkezelési lépéseket ebben a készletben egy PNS (polinukleinsav) (12) és DNS technológia kombinációján alapuló, azonnal felhasználható IQISH próbakeverék alkalmazása követi. Ez a próbakeverék egyrészt egy 218 kb nagyságú régiót többek között a 17-es kromoszómán lévő HER2 gént lefedő, Texas Red festékkel megjelölt DNS próbák keverékéből áll, másrészt a 17-es kromoszóma centromer régiójára (CEN-17) irányuló, fluoreszceinnel megjelölt PNS próbák keverékéből. A két célszekvencia specifikus hibridizációja világosan látható piros színű fluoreszcens jelet eredményez minden egyes HER2 gén lókuszán, és ugyancsak jól látható, de zöld színű fluoreszcens jelet eredményez valamennyi 17-es kromoszóma centromer régiójában. Alapos (magas stringenciájú oldattal történő) mosást követően a mintákat DAPI (4-6-diamidino-2-fenilindol) tartalmú fluoreszcens rögzítőszerrel rögzítik, majd fedőlemezzel látják el. Megfelelő szűrőkkel ellátott fluoreszcencia mikroszkóp segítségével (lásd a 3. függeléket), lokalizálják a tumorsejteket, majd megszámlálják a piros (HER2) és zöld (CEN-17) jeleket. Ezt követően kiszámítják a HER2/CEN-17 arányt. Az elemzett szövetmetszetben lévő normál sejtek az előkezelés és a hibridizáció hatékonyságának belső pozitív kontrolljaként szolgálnak. A részleteket illetően lásd A festődés értékelése című szakaszt. Az interaktív elektronikus képzéshez (e-learning) kérjük, használja a HER2 IQFISH pharmdx e- learning programot, amely segítségével a labortechnikusok, patológusok és tudósok pontosan és gyorsan elsajátíthatják a HER2 IQFISH pharmdx készlettel történő optimális eredmények eléréséhez szükséges ismereteket: www.dako.com Reagensek gyomor Mellékelt anyagok Az alább felsorolt anyagok 20 vizsgálathoz elegendőek (egy vizsgálat egy darab, 22 x 22 mm-es célterület feldolgozását jelenti). Az elvégezhető vizsgálatok számát a következő mennyiségek alapján számítottuk: lemezenként 250 µl (5 8 csepp) a 2A üvegből, 10 µl a 3. üvegből és 15 µl az 5. üvegből. A 3. és 5. üvegben lévő oldatok viszkózus állagúak, ezért előfordulhat, hogy P04090HU_02/K573111-2 65/32. o.

Gyomorrák ezeket rövid ideig centrifugálni kell egy mikrocentrifugában, a biztosított reagens teljes felhasználása érdekében. A készlet 10 különálló festési folyamathoz elegendő anyagot tartalmaz (pepszinimmerziós módszer esetében ez a mennyiség csak négy különálló festési folyamathoz elegendő). A HER2 IQFISH pharmdx készletet szárazjégen szállítják. Ha kézhezvételkor található szárazjég a csomagolásban, biztos lehet benne, hogy a készlet komponensei nem voltak kitéve szállítás közben magas hőmérsékleti hatásnak. Előfordulhat, hogy a készlet egyes összetevői nem fagynak meg. Ez nem fogja befolyásolni a HER2 IQFISH pharmdx készlet teljesítményét. 1. üveg 2A. üveg 2B. üveg 3. üveg 4. üveg 5. üveg 6. üveg Előkezelő oldat (20x) 150 ml, 20-szoros koncentrációjú MES (2-[N-morfolino]-etánszulfonsav) puffer. Pepszin 4 x 6,0 ml, azonnal felhasználható Pepszinoldat, ph 2,0; stabilizátort és antimikrobiális hatóanyagot tartalmaz. Pepszinhígító (10x) 24 ml, 10-szeres koncentrációjú Hígítópuffer, ph 2,0; antimikrobiális hatóanyagot tartalmaz. HER2/CEN-17 IQISH próbakeverék 0,2 ml, azonnal felhasználható Texas Red festékkel megjelölt HER2 DNS próbák és fluoreszceinnel megjelölt CEN-17 PNS próbák keveréke; IQISH hibridizációs pufferben kerül kiszállításra. Magas stringenciájú mosópuffer (20x) 150 ml, 20-szoros koncentrációjú SSC (konyhasós nátrium-citrát oldat) puffer, detergenssel (Tween-20). Fluoreszcens rögzítőszer 0,4 ml, azonnal felhasználható Fluoreszcens rögzítőszer, amely 500 µg/l DAPI-t (4-6-diamidino-2-fenilindolt) tartalmaz. Mosópuffer (20x) 500 ml, 20-szoros koncentrációjú Tris/HCl puffer. Fedőlemez-tömítés 1 cső, azonnal felhasználható Oldat a fedőlemezek eltávolítható tömítéseihez. P04090HU_02/K573111-2 65/33. o.

Gyomorrák MEGJEGYZÉS: A készlet következő reagensei felcserélhetők a K5799 kódszámú Dako Histology FISH Accessory kit megfelelő reagenseivel: előkezelő oldat (20x), pepszin, pepszinhígító (10x), magas stringenciájú mosópuffer (20x), fluoreszcens rögzítőszer, mosópuffer (20x) és fedőlemez-tömítés. Szükséges, de nem biztosított anyagok Laboratóriumi reagensek Desztillált vagy ionmentesített víz Etanol, 96%-os Xilol vagy xilolszubsztituensek Laboratóriumi eszközök Abszorbens kendők Szabályozható pipetták Kalibrált merülő hőmérő (mérési tartomány: 37 100 C) Kalibrált felületi hőmérő (mérési tartomány: 37 100 C) Fedőlemezek (22 mm x 22 mm) Csipeszek Vegyifülke Dako Hybridizer (S2450-es vagy S2451-es kóddal)* Fűtőblokk vagy hibridizáló kemence* Hibridizáló párakamra* Mikrocentrifuga Tárgylemezek, Dako Silanized Slides (kód: S3003), vagy poli-l-lizin bevonatú tárgylemezek (lásd A minta előkészítése című szakaszt) Festőedények vagy fürdők Időzítő (amely alkalmas 2 15 perces időközök mérésére) Vortex keverő Vízfürdő fedéllel (a hőmérsékletet 37(±2) C-on, 63 (±2) C-on, valamint 95 C és 99 C között képes megtartani) Érzékelővel ellátott mikrohullámú sütő, amennyiben az előkezelést mikrohullámú sütővel végzik (lásd B3. Festési protokoll. 1. lépés: Előkezelés, B módszer) * Fűtőblokk vagy hibridizáló kemence denaturálás (66 (±1) C) és hibridizálás (45 (±2) C) céljára, amely párakamrával kombinálva a Dako Hybridizer alternatívájaként használható. Mikroszkóp és tartozékai Szűrők fluoreszcencia mikroszkóphoz: DAPI és FITC/Texas Red kettős szűrő, vagy FITC és Texas Red monoszűrő további részletekért lásd a 3. függeléket Fényforrásként 100 wattos higanylámpát használó fluoreszcencia mikroszkópot kell használni. Más fényforrások nem javasoltak ezekkel a szűrőkkel való használatra. Mikroszkóptárgylemez-tartó (kartontálca felnyitható tetővel 20 tárgylemezhez, vagy ehhez hasonló). P04090HU_02/K573111-2 65/34. o.

Gyomorrák Óvintézkedések gyomor 1. In vitro diagnosztikai használatra 2. Csak szakképzett felhasználók részére! 3. 1. üveg, Pre-Treatment Solution (20x), nem kell figyelmeztető felirattal ellátni. Foglalkozásszerű felhasználók részére igény esetén anyagbiztonsági adatlapot biztosítunk. 4. 2A. üveg, Pepsin, tartalma 5-<10% propan-2-ol, 0.1-<0.3% pepszin A, 0.011-<0.1% 5- chloro-2-methyl-4-isothiazolin-3-one és 2-methyl-2H-isothiazol-3-one. 2A. üveg figyelmeztető címkével van ellátva: Veszély H314 H317 P280 P304 + P340 + P310 P301 + P310 + P331 P303 + P361 + P353 + P310 P305 + P310 P405 P501 Súlyos égési sérülést és szemkárosodást okoz. Allergiás bőrreakciót válthat ki. Védőkesztyű/védőruha/szemvédő/arcvédő használata kötelező. BELÉLEGZÉS ESETÉN: Az érintett személyt friss levegőre kell vinni, és olyan nyugalmi testhelyzetbe kell helyezni, hogy könnyen tudjon lélegezni. Azonnal forduljon TOXIKOLÓGIAI KÖZPONTHOZ/orvoshoz. LENYELÉS ESETÉN: Azonnal forduljon TOXIKOLÓGIAI KÖZPONTHOZ/orvoshoz. TILOS hánytatni. HA BŐRRE (vagy hajra) KERÜL: Az összes szennyezett ruhadarabot azonnal le kell vetni. A bőrt le kell öblíteni vízzel/zuhanyozás. Azonnal forduljon TOXIKOLÓGIAI KÖZPONTHOZ/orvoshoz. SZEMBE KERÜLÉS ESETÉN: Azonnal forduljon TOXIKOLÓGIAI KÖZPONTHOZ/orvoshoz. Elzárva tárolandó. A tartalom/edény hulladékként történő elhelyezését a helyi, regionális, országos és nemzetközi szabályozásokkal összhangban kell elvégezni. 5. 2B. üveg, Pepsin Diluent (10-szeres koncentrációjú), tartalma 50-<75% propan-2-ol, és 5- <10% 2-amino-2-(hydroxymethyl) propane-1,3-diol hydrochloride. 2B. üveg figyelmeztető címkével van ellátva: Danger H225 H319 H336 P280 P210 P241 P304 + P340 P303 + P361 + P353 Fokozottan tűzveszélyes folyadék és gőz. Súlyos szemirritációt okoz. Álmosságot vagy szédülést okozhat. Védőkesztyű használata kötelező. Szemvédő/arcvédő használata kötelező. Hőtől, forró felületektől, szikrától, nyílt lángtól és más gyújtóforrástól távol tartandó. Tilos a dohányzás. Robbanásbiztos elektromos/szellőztető/világító/berendezés használandó. BELÉLEGZÉS ESETÉN: Az érintett személyt friss levegőre kell vinni, és olyan nyugalmi testhelyzetbe kell helyezni, hogy könnyen tudjon lélegezni. HA BŐRRE (vagy hajra) KERÜL: Az összes szennyezett P04090HU_02/K573111-2 65/35. o.

Gyomorrák ruhadarabot azonnal le kell vetni. A bőrt le kell öblíteni vízzel/zuhanyozás. P235 Hűvös helyen tartandó. P501 A tartalom/edény hulladékként történő elhelyezését a helyi, regionális, országos és nemzetközi szabályozásokkal összhangban kell elvégezni. 6. 3. üveg, HER2/CEN-17 IQISH Probe Mix, tartalma 10-<25% ethylene carbonate, és 3- <5% sodium chloride. 3. üveg figyelmeztető címkével van ellátva: H319 P280 Figyelem P264 P305 + P351 + P338 Súlyos szemirritációt okoz. Védőkesztyű/védőruha/szemvédő/arcvédő használata kötelező. A használatot követően a kezet alaposan meg kell mosni. SZEMBE KERÜLÉS ESETÉN: Óvatos öblítés vízzel több percen keresztül. Adott esetben kontaktlencsék eltávolítása, ha könnyen megoldható. Az öblítés folytatása. 7. 4. üveg, Stringent Wash Buffer (20x), 10-<25% sodium chloride és 10-<20% 2-amino-2- (hydroxymethyl) propane-1,3-diol hydrochloride tartalmaz. 4. üveg figyelmeztető címkével van ellátva: H319 H315 P280 Figyelem P264 P305 + P351 + P338 Súlyos szemirritációt okoz. Bőrirritáló hatású. Védőkesztyű/védőruha/szemvédő/arcvédő használata kötelező. A használatot követően a kezet alaposan meg kell mosni. SZEMBE KERÜLÉS ESETÉN: Óvatos öblítés vízzel több percen keresztül. Adott esetben kontaktlencsék eltávolítása, ha könnyen megoldható. Az öblítés folytatása. 8. 6. üveg, Wash Buffer (20x), 10-<25% sodium chloride és 10-<20% trometamolt tartalmaz. 6. üveg figyelmeztető címkével van ellátva: H319 H315 P280 Figyelem P264 P305 + P351 + P338 Súlyos szemirritációt okoz. Bőrirritáló hatású. Védőkesztyű használata kötelező. Szemvédő/arcvédő használata kötelező. A használatot követően a kezet alaposan meg kell mosni. SZEMBE KERÜLÉS ESETÉN: Óvatos öblítés vízzel több percen keresztül. Adott esetben kontaktlencsék eltávolítása, ha könnyen megoldható. Az öblítés folytatása. 9. Coverslip Sealant, 100% arányban hidrogénezett könnyűbenzint (petróleumot) tartalmaz, és a következő felirattal látták el: Veszély P04090HU_02/K573111-2 65/36. o.

Gyomorrák H225 H304 H411 P280 P210 P241 P273 P301 + P310 + P331 P303 + P361 + P353 P235 P510 Fokozottan tűzveszélyes folyadék és gőz. Lenyelve és a légutakba kerülve halálos lehet. Mérgező a vízi élővilágra, hosszan tartó károsodást okoz. Védőkesztyű használata kötelező. Szemvédő/arcvédő használata kötelező. Hőtől, forró felületektől, szikrától, nyílt lángtól és más gyújtóforrástól távol tartandó. Tilos a dohányzás. Robbanásbiztos elektromos/szellőztető/ világító/berendezés használandó. Kerülni kell az anyagnak a környezetbe való kijutását. LENYELÉS ESETÉN: Azonnal forduljon TOXIKOLÓGIAI KÖZPONTHOZ/orvoshoz. TILOS hánytatni. HA BŐRRE (vagy hajra) KERÜL: Az összes szennyezett ruhadarabot azonnal le kell vetni. A bőrt le kell öblíteni vízzel/zuhanyozás. Hűvös helyen tartandó. A tartalom/edény hulladékként történő elhelyezését a helyi, regionális, országos és nemzetközi szabályozásokkal összhangban kell elvégezni. 10. A mintákat (fixálás előtt és után), valamint minden velük érintkező anyagot potenciális fertőzésforrásként kell kezelni, és a megfelelő óvintézkedések betartásával kell ártalmatlanítani (16). A reagenseket soha ne szívja fel szájjal a pipettába, és ügyeljen arra, hogy a reagensek és a minták ne érintkezzenek a bőrrel és a nyálkahártyákkal. Ha a reagensek érzékeny területtel érintkeznek, mossa le bő vízzel. 11. A téves eredmények elkerülése érdekében gondoskodjon arról, hogy a reagensek mikrobiális szennyeződése a lehető legkisebb mértékű legyen. 12. A megadottól eltérő inkubációs idők, hőmérsékletek vagy módszerek hibás eredményekhez vezethetnek. 13. A megadottól eltérő szövetfixálási módok és mintavastagság befolyásolhatja a szövet morfológiáját és/vagy a jelintenzitást. 14. A HER2/CEN-17 IQISH próbakeverék hibridizálás közbeni párolgásának elkerülése érdekében gondoskodjon a hibridizációs kamra megfelelő páratartalmáról. 15. A reagensek hígítása optimális. A további hígítás a teljesítmény romlását eredményezheti. 16. Megfelelő személyi védőfelszerelést kell viselni a bőrrel való érintkezés és a szembejutás elkerülése érdekében. További információkért olvassa el a biztonsági adatlapot (MSDS). 17. A gyomorrák biopsziás mintáinak heterogén volta miatt fontos, hogy alaposan végigpásztázza az egész mintát a jeleloszlás felmérése érdekében, mielőtt kiválasztaná a jelszámlálási területet. 18. A nagyon kisméretű minták értékelése nem javasolt (vagyis a mintáknak ép morfológiával és kellő mennyiségű sejtmaggal kell rendelkezniük a számláláshoz). 19. Ha a HER2 FISH analízist biopsziás mintán hajtja végre, a HER2-státusz megbízható meghatározása érdekében ajánlatos több (7 8), a tumor különböző régióiból származó, értékelhető biopsziás mintát elemezni. 20. Egy adott biopsziás minta összes szöveti magjának azonosítása érdekében fontos megtekinteni a HE-módszerrel festett metszetet. 21. A pepszinimmerziós módszerhez kizárólag tiszta festőedényeket szabad használni (2. lépés, C módszer). Tárolás gyomor A HER2/CEN-17 IQISH próbakeverék (3. üveg) -18 C-on, sötét helyen tárolandó. Az összes többi reagenst 2 8 C-on, sötét helyen lehet tárolni. Az összes reagenst lehet fagyasztva tárolni. P04090HU_02/K573111-2 65/37. o.

Gyomorrák A reagensek legfeljebb 10 alkalommal történő lefagyasztása és felolvasztása nem befolyásolja a teljesítményüket. A pepszinre, a HER2/CEN-17 IQISH próbakeverékre, valamint a fluoreszcens rögzítőszerre (2A., 3. és 5. üveg) káros hatással lehet a magas hőmérséklet. Ne hagyja ezeket az anyagokat szobahőmérsékleten. A HER2/CEN-17 IQISH próbakeverékre, valamint a fluoreszcens rögzítőszerre (3. és 5. üveg) káros hatással lehet a túlzottan erős fény. Ne tárolja ezeket a komponenseket, illetve ne végezzen vizsgálatot erős fényben, például közvetlen napsütésben. A csomagoláson feltüntetett lejárati időn túl ne használja fel a készletet. Ha a reagenseket a terméktájékoztatóban leírtaktól eltérő feltételek között tárolják, akkor a felhasználónak validálnia kell a reagensek teljesítményét (13). Nincsenek olyan egyértelmű jelek, amelyekből megállapítható lenne, hogy a termék lebomlott. Emiatt fontos a vizsgált szövetmetszetben lévő normál sejtek kiértékelése is. Ha nem várt fluoreszcencia-mintázatot figyel meg, amely nem magyarázható a laboratóriumi eljárásokban rejlő eltérésekkel, és a HER2 QFISH pharmdx készlettel kapcsolatos problémára gyanakszik, akkor forduljon a Dako Műszaki szolgálatához. A minta előkészítése gyomor A gyomor adenokarcinómájából vett mintákat, beleértve a gyomor-nyelőcső átmenetből származó biopsziákat, kimetszett szöveteket és rezekátumokat is, megfelelően kell kezelni annak érdekében, hogy a szövetet FISH elemzés céljára megőrizzük. Minden minta esetében az immuncitokémiai festési eljárásokhoz rutinszerűen használt szövetfeldolgozási módszereket kell alkalmazni (14). Kis biopsziás minták vizsgálata esetében ügyeljen arra, hogy az intakt tumormorfológia megmaradjon, illetve, hogy elegendő sejtmag legyen a jelszámláláshoz. Ha a HER2 FISH analízist biopsziás mintán hajtja végre, a HER2-státusz megbízható meghatározása érdekében ajánlatos több (7 8), a tumor különböző régióiból származó, értékelhető biopsziás mintát elemezni. P04090HU_02/K573111-2 65/38. o.

Gyomorrák Paraffinba ágyazott metszetek Kizárólag semlegesre pufferelt formalinban tartósított és paraffinba ágyazott szövetek használhatók. A mintákat például 3 4 mm-es szeletekre vágva 18 24 órán keresztül fixálja semlegesre pufferelt formalinban. A biopsziás mintákat a ToGA vizsgálat során 6 8 órán át fixálták (a tanulmányra vonatkozóan lásd: (25)). A szöveteket ezután etanol és xilol sorozathígítású oldatában dehidrálják, majd legfeljebb 60 C-os olvasztott paraffinnal itatják át. A megfelelően fixált és beágyazott szövetek hűvös (15 25 C-os hőmérsékletű) helyen tárolva korlátlan ideig eltarthatók a metszetek elkészítéséig és tárgylemezre helyezéséig (14, 15). Egyéb fixálószerek nem alkalmasak erre a célra. A szövetmintákból 3 6 µm vastagságú metszeteket kell készíteni. A HER2 génamplifikáció elemzéshez és a tumor jelenlétének ellenőrzéséhez szükséges lemezeket egyszerre készítse el. Ajánlott legalább 2 metszetből álló sorozatot készíteni, 1 hematoxillin-eozinnal festett (HE-festés) metszetet a tumor jelenlétének ellenőrzésére, és 1 metszetet a HER2 génamplifikációs elemzéshez. Ajánlott a szövetmetszeteket Dako Silanized Slides tárgylemezre (kód: S3003) vagy poli-l-lizin bevonatú tárgylemezre helyezni. A mintákat a metszetkészítést követő 4 6 hónapon belül ki kell értékelni, ha szobahőmérsékleten (20 25 C) tárolják őket. P04090HU_02/K573111-2 65/39. o.

Gyomorrák HASZNÁLATI UTASÍTÁS gyomor A. A reagensek előkészítése gyomor Érdemes a következő reagenseket a festés előtt előkészíteni: A.1 Előkezelő oldat Előfordulhat, hogy az 1. üvegben kristályok láthatóak, de ezek szobahőmérsékleten feloldódnak. A reagens elkészítése előtt győződjön meg arról, hogy nincsenek benne kristályok. Desztillált vagy ionmentesített vízzel hígítson fel elegendő mennyiséget az 1. üveg tartalmából (a 20-szoros koncentrációjú előkezelő oldatból) 1:20 arányban. A fel nem használt hígított oldat 2 8 C-on egy hónapig tárolható. A hígított oldatot öntse ki, ha zavarossá válik. A.2 Magas stringenciájú mosópuffer Desztillált vagy ionmentesített vízzel hígítson fel elegendő mennyiséget a 4. üveg tartalmából (a 20-szoros koncentrációjú, magas stringenciájú mosópufferből) 1:20 arányban. A fel nem használt hígított puffer 2 8 C-on egy hónapig tárolható. A hígított puffert öntse ki, ha zavarossá válik. A.3 Mosópuffer Desztillált vagy ionmentesített vízzel hígítson fel elegendő mennyiséget a 6. üveg tartalmából (a 20-szoros koncentrációjú mosópufferből) 1:20 arányban. A fel nem használt hígított puffer 2 8 C-on egy hónapig tárolható. A hígított puffert öntse ki, ha zavarossá válik. A.4 Etanolsorozatok Készítsen 96%-os etanol oldatból 3 edényben 70%-os, 85%-os és 96%-os oldatot. Tárolja a lefedett edényeket szobahőmérsékleten vagy 2 8 C-on, és legfeljebb 200 tárgylemezhez használja az oldatokat. Az oldatokat öntse ki, ha zavarossá válnak. A.5 Pepszinoldat Pepszinoldatra csak a pepszinimmerziós módszer ( C módszer) alkalmazásakor van szükség. A pepszinoldatot a következőképpen készítse el: Egy hat metszetet befogadó edényhez készítsen 60 ml pepszinoldatot: Tegyen az edénybe 48 ml szoba-hőmérsékletű (20 25 C-os) desztillált vagy ionmentesített vizet. Adjon hozzá 6 ml hideg (2 8 C-os) 10-szeres koncentrációjú pepszinhígítót (2B. üveg). Adjon hozzá 6 ml hideg (2 8 C-os) pepszint (2A. üveg). Helyezze fel az edény fedelét, és tegye a pepszinoldatot vízfürdőbe, hogy hőmérséklete felmelegedjen 37 (±2) C-ra. Egy 24 metszetet befogadó edényhez készítsen 240 ml-nyi pepszinoldatot: Tegyen az edénybe 192 ml szoba-hőmérsékletű (20 25 C-os) desztillált vagy ionmentesített vizet. Adjon hozzá 24 ml hideg (2 8 C-os) 10-szeres koncentrációjú pepszinhígítót (2B. üveg). Adjon hozzá 24 ml hideg (2 8 C-os) pepszint (2A. üveg). Helyezze fel az edény fedelét, és tegye a pepszinoldatot vízfürdőbe, hogy hőmérséklete felmelegedjen 37 (±2) C-ra. A megfelelő hőmérsékletre hozott pepszinoldatot 5 órán belül fel kell használni. P04090HU_02/K573111-2 65/40. o.

Gyomorrák B. A festési eljárás - gyomor B.1 Az eljárással kapcsolatos megjegyzések Használat előtt alaposan tanulmányozza át ezt az útmutatót, és alaposan ismerje meg az összes alkotóelemet (lásd Óvintézkedések). Használat előtt minden reagenst a meghatározott hőmérsékletre kell hozni az alábbiak szerint: 1. üveg: A hígított előkezelő oldatnak fel kell melegednie 95 99 C-ra, ha az előkezeléshez vízfürdőt használ (B3. Festési protokoll, 1. lépés: előkezelés, A módszer). Ha hőérzékelővel ellátott mikrohullámú sütőt használ az előkezeléshez (B3. Festési protokoll, 1. lépés: előkezelés, B módszer), a hígított előkezelő oldatnak el kell érnie a szobahőmérsékletet (20 25 C-ot). 2A. üveg: A pepszint 2 8 C-os hőmérsékleten kell alkalmazni (B3, Festési protokoll, 2. lépés, A és B módszer), és folyamatosan fenn kell tartani ezt a hőmérsékletét. 2B. üveg: A 10-szeres koncentrációjú pepszinhígítót 2 8 C-os hőmérsékleten kell alkalmazni (B3, Festési protokoll, 2. lépés, C módszer. 3. üveg: A -18 C-on tárolt HER2/CEN-17 IQISH próbakeverék két fázisra válik szét. A 3. üveg használata előtt gondoskodjon arról, hogy tartalma egy fázisú legyen úgy, hogy a próbakeveréket szobahőmérsékletre (20 25 C-ra) hozza, majd összekeveri. Szobahőmérsékleten (20 25 C-on) olvassza fel a 3. üveg tartalmát legfeljebb 30 perc alatt (erős fénytől védett helyen), majd alaposan keverje fel az üveg tartalmát egy vortex keverőben 2500-es fordulatszámon, 15 másodpercig. A 3. üveget felhasználás után azonnal tárolja -18 C-on. 4. üveg: Használat előtt a hígított, magas stringenciájú mosópufferből egy adagot egy edényben szobahőmérsékletre kell hozni, egy másik edényben egy másik adagot pedig 63 (±2) C -ra. 5. üveg: A fluoreszcens rögzítőszer 2 25 C közötti hőmérsékleten alkalmazható. 6. üveg: A hígított mosópuffert szobahőmérsékletre, 20 25 C-ra kell hozni. A fedőlemez-tömítés bármilyen, 2 25 C közötti hőmérsékleten alkalmazható. Valamennyi lépést a megadott hőmérsékleten kell végrehajtani. Az eljárás részét képezi a szövetmetszetek többszöri dehidrálása majd szárítása. Mielőtt továbbhaladna a következő lépésre, győződjön meg arról, hogy a szövetmetszetek teljesen szárazak-e. A szövetmetszetek szárítását ne hagyja az eljárás egyéb lépéseinek idejére. Ha a festési eljárást meg kell szakítania, akkor paraffinmentesítést követően a tárgylemezeket legfeljebb 1 órán át tárolhatja a mosópufferben szobahőmérsékleten (20 25 C-on) anélkül, hogy ez az eredményeket befolyásolná. B.2 A szövetek kezelése festés előtt Paraffinmentesítés és rehidrálás: Az elemzés elvégzése előtt a szövetmetszeteket a beágyazó anyag eltávolításához paraffinmentesíteni, majd rehidrálni kell. Ügyeljen arra, hogy a paraffin teljes mértékben el legyen távolítva. A visszamaradó beágyazó anyag fokozott nem specifikus festődést eredményez. Ezt a lépést szobahőmérsékleten (20 25 C-on) végezze. 1. Helyezze a tárgylemezeket xilolfürdőbe, és inkubálja őket 5 (±1) percig. Cseréljen fürdőt, és ismételje meg egyszer. 2. Ütögetéssel távolítsa el a felesleges folyadékot, és 2 (±1) percre helyezze a tárgylemezeket 96%-os etanolba. Cseréljen fürdőt, és ismételje meg egyszer. 3. Ütögetéssel távolítsa el a felesleges folyadékot, és 2 (±1) percre helyezze a tárgylemezeket 70%-os etanolba. Cseréljen fürdőt, és ismételje meg egyszer. 4. Ütögetéssel távolítsa el a felesleges folyadékot, majd helyezze a tárgylemezeket legalább 2 percre a hígított mosópufferbe (lásd a HASZNÁLATI ÚTMUTATÓ A.3 szakaszát). A B.3 szakasz Előkezelés című 1. lépésében foglaltak szerint kezdje meg a festési eljárást. P04090HU_02/K573111-2 65/41. o.

Gyomorrák A xilolos és alkoholos oldatokat legfeljebb 200 tárgylemez után cserélni kell. Xilolszubsztituensek használata megengedett. MEGJEGYZÉS: A készletben található reagenseket és útmutatót az optimális teljesítmény eléréséhez állították össze. A reagensek további hígítása vagy az inkubálási hőmérséklet megváltoztatása hibás vagy ellentmondó eredményeket adhat. Az adott laboratóriumban alkalmazott eltérő szövetfeldolgozási módszerek és technikai eljárások érvénytelenné tehetik az assay eredményeit. B.3 Festési protokoll 1. lépés: Előkezelés Az előkezelés vagy az alább leírt A módszerrel, vízfürdő használatával, vagy másik lehetőségként érzékelővel ellátott mikrohullámú sütő használatával, az alább leírt B módszernek megfelelően történhet. A módszer: Vízfürdős előkezelés Töltse meg a festőedényeket, pl. a Coplin-tartályokat hígított előkezelő oldattal (lásd HASZNÁLATI ÚTMUTATÓ, A.1 szakasz). Helyezze a hígított előkezelő oldatot tartalmazó festőedényeket vízfürdőbe. Fűtse fel a vízfürdőt és az előkezelő oldatot 95 99 C-ra. A megfelelő hőmérséklet biztosítása érdekében kalibrált hőmérő segítségével mérje meg az edényben uralkodó hőmérsékletet. A hőmérséklet stabilizálása és a párolgás megakadályozása érdekében fedje le az edényeket. Merítse a szoba-hőmérsékletű, paraffinmentesített metszeteket a festőedényekben lévő előmelegített előkezelő oldatba. Ismételten ellenőrizze a hőmérsékletet, majd végezze el az inkubálást 10 (±1) percen át, 95 99 C-on. A tárgylemezekkel együtt vegye ki az egész edényt a vízfürdőből. Vegye le a fedelet, és hagyja a tárgylemezeket az előkezelő oldatban szobahőmérsékleten lehűlni 15 percen át. Helyezze át a tárgylemezeket egy hígított mosópuffert tartalmazó edénybe (lásd: HASZNÁLATI ÚTMUTATÓ, A.3 szakasz), 3 perces időtartamra, szobahőmérsékleten (20 25 C-on). Cserélje le a mosópuffert, és áztassa be a metszeteket további 3 percre. MEGJEGYZÉS: Az előkezelő oldatot kizárólag egyszeri felhasználásra szánták. Tilos újrafelhasználni. B módszer: Előkezelés érzékelővel ellátott mikrohullámú sütő segítségével Töltsön meg egy műanyag edényt szoba-hőmérsékletű (20 25 C-os) előkezelő oldattal. Merítse bele a paraffinmentesített metszeteket az előkezelő oldatba, fedje le az edényt egy lyukacsos fedéllel, és helyezze be a mikrohullámú sütőbe. Válassza ki a forrásérzékelő funkciót és egy olyan programot, amely a forrási hőmérséklet elérése után 10 percig működik*. A 10 perces inkubációt követően vegye ki a tárgylemezeket tartalmazó edényt a sütőből, vegye le a fedelét, és hűtse szobahőmérsékleten 15 percen át. Helyezze át a tárgylemezeket egy hígított mosópuffert tartalmazó edénybe, és áztassa őket 3 percig szobahőmérsékleten (20 25 C-on). Cserélje le a mosópuffert, és áztassa be a metszeteket további 3 percre. * A hőérzékelővel ellátott mikrohullámú sütő használata azt jelenti, hogy a sütőn kell lennie egy olyan érzékelőnek, valamint olyan programoknak, amelyek először felmelegítik az előkezelő oldatot annak forráspontjára, majd ezt követően megtartják a szükséges előkezelési hőmérsékletet (95 ºC felett), miközben megtörténik az előre beállított idő visszaszámlálása (10 (±1) perc). Egyes, érzékelővel ellátott mikrohullámú sütő modellek esetében előfordulhat, hogy nem lehetséges a visszaszámlálási idő szabadon történő beállítása. Ha az adott modellen kizárólag előre beállított programok vannak, akkor győződjön meg arról, hogy olyan programot választott ki, amely alkalmas a szükséges (95 ºC feletti) előkezelési hőmérséklet fenntartására legalább 10 (±1) percen át, és kézi vezérléssel leállítható a program 10 (±1) perc után. P04090HU_02/K573111-2 65/42. o.

Gyomorrák MEGJEGYZÉS: Az előkezelő oldatot kizárólag egyszeri felhasználásra szánták. Tilos újrafelhasználni. 2. lépés: Pepszin, azonnal felhasználható (RTU) vagy pepszinoldat A pepszin inkubálását az azonnal felhasználható (RTU) pepszincseppeknek a metszetekre történő közvetlen alkalmazásával lehet elvégezni szobahőmérsékleten (20 25 C-on) ( A módszer) vagy 37 C-on ( B módszer). Egy másik lehetőség, ha a metszeteket pepszinoldatba merítjük, és 37 (±2) C-on inkubáljuk ( C módszer). A és B módszer: Ütögetéssel távolítsa el a pufferfelesleget. Szálmentes törlővel (például abszorbens kendővel vagy gézlappal) óvatosan törölje körbe a mintát a rajta maradt folyadék eltávolítása, valamint a reagensek kijelölt területen belül tartása érdekében. A minta lefedéséhez 5 8 csepp (250 µl) hideg (2 8 C-os) pepszint használjon (a 2A. üvegből). A pepszint minden esetben 2 8 C-os hőmérsékleten tárolja. A módszer: Pepszin, azonnal felhasználható (RTU) Inkubálás 20 25 C-on Az inkubálást 5 15 percig végezze szobahőmérsékleten (20 25 C-on). Az 5 15 perces inkubálás a legtöbb minta esetében elegendő, de az optimális inkubálási idő függhet a korábbi szövetfixálási lépésektől és/vagy a minta vastagságától, és a felhasználónak kell azt meghatároznia. Ütögetéssel távolítsa el a pepszinfölösleget, és áztassa be 3 percre a metszeteket hígított mosópufferbe (lásd: HASZNÁLATI ÚTMUTATÓ, A.3 szakasz), szobahőmérsékleten (20 25 C-on). Cserélje le a hígított mosópuffert, és áztassa be a metszeteket további 3 percre. Folytassa a dehidrálással. B módszer: Pepszin, azonnal felhasználható (RTU) Inkubálás 37 C-on Helyezze a pepszines mintát egy 37 C-os fűtőblokkba pl. a Dako Hybridizerbe és inkubálja 3 5 percen át. A 3 5 perces inkubálás a legtöbb minta esetében elegendő, de az optimális inkubálási idő függhet a korábbi szövetfixálási lépésektől és/vagy a minta vastagságától, és a felhasználónak kell azt meghatároznia. Ütögetéssel távolítsa el a pepszinfelesleget, és áztassa be a metszeteket 3 percre hígított mosópufferbe, szobahőmérsékleten (20 25 C-on). Cserélje le a mosópuffert, és áztassa be a metszeteket további 3 percre. Folytassa a dehidrálással. A szövetmetszeteket sorozathígítású etanolban dehidrálja: 2 percen át 70%-os, 2 percen át 85%- os és 2 percen át 96%-os etanolban. Hagyja a szövetmetszeteket levegőn teljesen megszáradni. C módszer: Pepszinoldat A metszetek bemerítése 37 C-os pepszinoldatba A készlet négy különálló vizsgálathoz (60 ml pepszinoldat, hat metszetet befogadó kisebb edényhez) vagy egyetlen vizsgálathoz (240 ml pepszinoldat, 24 metszetet befogadó nagyobb edényhez) elegendő reagenst tartalmaz. Készítse el a pepszinoldatot az A.5 szakaszban leírt módon. Helyezze fel az edény fedelét, és tegye a pepszinoldatot vízfürdőbe, hogy hőmérséklete felmelegedjen 37 (±2) C-ra. Ellenőrizze, hogy a hőmérséklet stabilizálódott-e. A megfelelő hőmérséklet biztosítása érdekében kalibrált hőmérő segítségével mérje meg az edényben uralkodó hőmérsékletet. Ütögetéssel távolítsa el a mosópuffer-felesleget. Merítse a lemezeket a 37 (±2) C-os pepszinoldatba, és inkubálja őket 20 30 percig. Az 20 30 perces inkubálás a legtöbb minta esetében elegendő, de az optimális inkubálási idő függhet a korábbi szövetfixálási lépésektől és/vagy a minta vastagságától, és a felhasználónak kell azt meghatároznia. Ütögetéssel távolítsa el a pepszinfelesleget, és áztassa be a metszeteket 3 percre hígított mosópufferbe, szobahőmérsékleten (20 25 C-on). Cserélje le a mosópuffert, és áztassa be a metszeteket további 3 percre. Folytassa a dehidrálással. P04090HU_02/K573111-2 65/43. o.

Gyomorrák A szövetmetszeteket sorozathígítású etanolban dehidrálja: 2 percen át 70%-os, 2 percen át 85%-os és 2 percen át 96%-os etanolban. Hagyja a szövetmetszeteket levegőn teljesen megszáradni. 3. lépés: HER2/CEN-17 IQISH próbakeverék A -18 C-on tárolt HER2/CEN-17 IQISH próbakeverék két fázisra válik szét. A 3. üveg használata előtt gondoskodjon arról, hogy tartalma egy fázisú legyen úgy, hogy a próbakeveréket szobahőmérsékletre (20 25 C-ra) hozza, majd összekeveri. Szobahőmérsékleten (20 25 C-on) olvassza fel a 3. üveg tartalmát legfeljebb 30 perc alatt (erős fénytől védett helyen), majd alaposan keverje fel az üveg tartalmát egy vortex keverőben 2500-as fordulatszámon, 15 másodpercig. A 3. üveget felhasználás után azonnal tárolja -18 C-on. Vigyen fel 10 µl HER2/CEN-17 IQISH próbakeveréket (3. üveg) a szövetmetszet közepére. Azonnal helyezzen fel egy 22x22 mm-es üveg fedőlemezt a próbakeverékre, és hagyja, hogy egyenletesen szétterüljön a fedőlemez alatt. Akadályozza meg a légbuborékok képződését. Ha légbuborékokat észlel, akkor azokat csipesz használatával finoman távolítsa el a szövettől. Ne felejtse el használat után azonnal visszatenni a 3. üveget -18 C-os tárolóhelyére. Zárja le a fedőlemezt a fedőlemez-tömítéssel úgy, hogy az utóbbit a fedőlemez szélei köré fecskendezi. A fedőlemez-tömítés nyúljon át a fedőlemezre és a tárgylemezre is, így alakítva ki tömítőréteget a fedőlemez körül. Ügyeljen arra, hogy a fedőlemez-tömítés teljesen lefedje a fedőlemez széleit. Készítse elő a Dako Hybridizer* készüléket (kód: S2450 vagy S2451) egy hibridizálási munkamenetre. Győződjön meg arról, hogy a Humidity Control Strips páratartalom-ellenőrző csíkok (kód: S2452) telítettek, és a lehető legjobb állapotban vannak a használathoz. Indítsa el a Hybridizert és válasszon ki egy olyan programot, amely: Végezzen 66 C-on és 10 percen át denaturálást, majd 45 C-on és 60 120 percen át hibridizálást. Helyezze be a tárgylemezeket a Hybridizer készülékbe, ellenőrizze, hogy a fedelet megfelelően lezárta-e, majd indítsa el a programot. A részleteket lásd a Dako Hybridizer kezelési útmutatójában. * A fent leírt feltételekkel azonos körülményeket biztosító más készülék is használható a denaturálás és hibridizálás elvégzésére. Helyezze a metszeteket egy 66 (±1) C-ra felfűtött lapos fém- vagy kőfelületre (fűtőblokkra vagy a hibridizációs kemence egyik blokkjára). A denaturálást pontosan 10 percen át végezze. Helyezze a tárgylemezeket előre felmelegített hibridizációs párakamrába. Helyezze fel a kamra fedelét, és inkubálja 45 (±2) C-on 60 120 percen át. Kérjük, vegye figyelembe, hogy a 37 C-os hibridizációs hőmérséklet nem felel meg az ebben a készletben található próbákkal történő használathoz. 4. lépés: Magas stringenciájú mosás Töltsön meg két festőedényt, pl. Coplin-tartályokat, hígított, magas stringenciájú mosópufferrel (lásd: HASZNÁLATI ÚTMUTATÓ, A.2 szakasz). Legalább 100 ml össztérfogat vagy tárgylemezenként 15 ml térfogat alkalmazása ajánlott mindkét edényben. Helyezze az egyik hígított, magas stringenciájú mosópuffert tartalmazó festőedényt szobahőmérsékleten a vegyifülkébe, a másikat pedig egy vízfürdőbe. Fűtse fel a vízfürdőt és a hígított, magas stringenciájú mosópuffert 63 (±2) C-ra. Ellenőrizze, hogy a hőmérséklet stabilizálódott-e. A hőmérséklet stabilizálása és a párolgás megakadályozása érdekében fedje le az edényt. A megfelelő hőmérséklet biztosítása érdekében kalibrált hőmérővel mérje meg a hőmérsékletet a vízfürdő edényében. A magas stringenciájú mosópuffer detergenst tartalmaz, és 63 C-os hőmérsékleten zavarossá válhat. Ez nem befolyásolja a teljesítményt. Csipesszel vagy kesztyűt viselve vegye ki a tárgylemezeket a hibridizációs kamrából, finoman távolítsa el a fedőlemez-tömítést és a fedőlemezt, majd egyesével helyezze a tárgylemezeket a szoba-hőmérsékletű előmosó edénybe. P04090HU_02/K573111-2 65/44. o.

Gyomorrák Amint eltávolította az összes fedőlemezt, helyezze át a tárgylemezeket a szoba-hőmérsékletű előmosó edényből a 63 (±2) C-os vízfürdőben lévő edénybe. Amint behelyezte a tárgylemezeket a 63 (±2) C-os edénybe, a vízfürdőbe, az időzítőt azonnal indítsa el. A magas stringenciájú mosást pontosan 10 percig végezze. Vegye ki a tárgylemezeket a magas stringenciájú mosópufferből, és áztassa be őket hígított mosópufferbe 3 percre, szobahőmérsékleten (20 25 C-on). Cserélje le a hígított mosópuffert, és áztassa be a metszeteket további 3 percre. A szövetmetszeteket sorozathígítású etanolban dehidrálja: 2 percen át 70%-os, 2 percen át 85%-os és 2 percen át 96%-os etanolban. Hagyja a szövetmetszeteket teljesen megszáradni. 5. lépés: Rögzítés Tegyen 15 µl DAPI tartalmú fluoreszcens rögzítőszert (5. üveg) a tárgylemez célterületére, majd helyezzen rá egy üveg fedőlemezt. MEGJEGYZÉS: A lemezeket rögzítés után 15 perccel vagy 7 napon belül bármikor ki lehet értékelni. Mindemellett, a lemezek kifakulhatnak, ha fény vagy magas hőmérséklet éri őket. Az elhalványulás minimalizálása érdekében tárolja a tárgylemezeket sötét helyen, -18 8 C-on. Minőség-ellenőrzés gyomor 1. A jeleknek világosnak, jól elkülönülőnek és könnyen értékelhetőnek kell lenniük. 2. A normál sejtek a festési folyamat belső kontrolljának lehetőségét biztosítják. A normál sejteken 1 2 jól látható zöld jelnek kell lennie, ami arra utal, hogy a CEN-17 PNS próba sikeresen hibridizálódott a 17. kromoszóma centromer régiójával. A normál sejteken 1-2 jól látható piros jelnek kell lennie, ami arra utal, hogy a HER2 DNS próba sikeresen hibridizálódott a HER2 amplikonnal. A szövetek metszése miatt néhány normál sejt a várható 2 jelnél kevesebbet fog tartalmazni az egyes színekből. Amennyiben a normál sejtekben nem észlelhető jeladás, akkor ez az assay eljárás hibájára utal, és az eredményeket érvénytelennek kell tekinteni. 3. A sejtmag morfológiájának épnek kell lennie, amikor az értékelést DAPI szűrővel végzik. A túl sok szellemképes sejt és általánosan rossz minőségű sejtmag-morfológia a minta túlemésztettségére utal, ami jelvesztéshez vagy a jel fragmentálódásához vezet. Az ilyen minták eredményeit érvénytelennek kell tekinteni. 4. A kiértékelésre alkalmas tumorsejtek száma legalább 20. 5. Az egyes laboratóriumokban a szövetmintákon végzett fixálási, feldolgozási és beágyazási eljárások eltérése módosíthatja az eredményeket, ezért a Dako által biztosított kontrollminták mellett szükséges a rendszeres belső kontrollok alkalmazása. A festés értelmezése gyomor A kiértékelésre alkalmas szövet Lokalizálja a tumort a HE-módszerrel festett tárgylemezen, majd ugyanazt a területet értékelje ki a FISH-eljárással festett lemezen is (DAPI szűrővel). Kizárólag a gyomorrákban ill. a gyomornyelőcső átmenet rákjában szenvedő betegek mintáit értékelje. Ha egyazon mintában megtalálható intesztinális metaplázia és gyomor adenokarcinóma is, akkor csak a karcinóma komponenst értékelje. Kerülje az erősen gyulladt és a nekrotikus területeket, valamint azokat a részeket, ahol a sejtmag határvonalai nem egyértelműek. Ne vonjon be a vizsgálatba szubjektív megítélés alá eső sejtmagokat. Hagyja ki azokat a sejtmagokat is, amelyek gyenge jelintenzitásúak, háttérfestődésük pedig nem specifikus vagy túl erős. P04090HU_02/K573111-2 65/45. o.

Gyomorrák Először a teljes FISH módszerrel festett szakaszt értékelje, majd az ennek megfelelő területet a HE-módszerrel festett metszeten. A FISH festésű metszeten végzett számlálást megelőzően jegyezze fel az általános jeleloszlást (hogy homogén-e vagy heterogén) a jelszámlálási adatlapra. Ha a jeleloszlás heterogén, jegyezze fel, hogy van-e fokális amplifikáció vagy egysejtes amplifikáció (mozaik típusú). 1) Homogén jeleloszlás Ha a jeleloszlás homogén, számolja meg 1-2 reprezentatív tumorterületről származó 20 sejtben a kromoszóma centromereket (zöld jelek) és a HER2 géneket (piros jelek). 2) Heterogén jeleloszlás Ha a jeleloszlás heterogén, értékeljen a kiválasztott területekről származó összesen 20 sejtet, az alábbiak szerint: A) Ha fokális amplifikáció van jelen, akkor amplifikált sejtes területeket kell kiválasztani az értékeléshez. B) Ha mozaik típusú eloszlás vagy amplifikált, poliszomális és diszomális sejtek vannak jelen, az értékelést az amplifikált sejtes területeken végezze. Ezeken a területeken nem csak az amplifikált sejteket, hanem a szomszédos területek nem amplifikált sejtjeit is értékelni kell, összesen 20 sejtet. Ha lehetséges, ne válasszon egymást átfedő területeket. A bakteriális DNS festődést hagyja figyelmen kívül A gyomorszövetben elszórtan jelenlévő egyes specializált sejtek (mastocyták és makrofágok) jelentős mértékben festődnek a HER2 próbával a bakteriális DNS jelenléte miatt. Ez a sejtek erős piros színű fluoreszcenciáját okozza, amely egyértelműen elkülöníthető a magas HER2 génamplifikációval rendelkező sejtektől. A jelek megszámlálása: Miután kiválasztotta a területet a jelszámláláshoz, kezdje el az elemzést a 20 egymással szomszédos sejtmag egyikében, majd végezze el a számlálást sejtenként úgy, hogy csak azokat a sejtmagokat hagyja ki, amelyek nem felelnek meg a minőségi kritériumoknak. Az alábbi irányelveknek megfelelően számolja meg minden egyes vizsgált sejtmag határon belül eső jeleit (lásd a 7. függeléket is). - Közelítse és távolítsa a fókuszt, hogy megtalálja az egyes sejtmagok minden egyes jelölődését. - Számláláskor az egyforma méretű, és egymástól legfeljebb a jelátmérőnek megfelelő távolságban levő két jelet tekintse egynek. Ahhoz, hogy két jelet különállónak tekintsünk a közöttük lévő távolság legalább egy normál méretű jel átmérőjével egyenlő kell legyen. Ha a két jel közötti távolság a jelátmérőnél kisebb, számláláskor a két jelet egynek kell tekinteni. - A nagyfokú HER2 génamplifikációt mutató sejtmagokban a HER2 jelek olyan közel kerülhetnek egymáshoz, hogy jelcsoportot hoznak létre. Ilyen esetekben a HER2 jeleket nem lehet megszámolni, de értéküket meg kell becsülni. Külön figyelmet kell fordítani a zöld jelekre, mert a pirosher2 jelcsoportok könnyen eltakarhatják a zöld jeleket, amelyek ezáltal nehezen láthatóvá válnak. Kétséges esetekben vizsgálja meg a zöld jeleket speciális FITC-szűrő segítségével. Ne vegye figyelembe a számlálásnál a jelet nem adó sejtmagokat és azokat sem, amelyek csak egyszínű jelet adnak. Kizárólag azokat a sejtmagokat használja az értékeléshez, amelyek mindkét színből legalább egy FISH-jelet mutatnak. P04090HU_02/K573111-2 65/46. o.

Gyomorrák Jelszámlálási útmutató 1 Ne számolja. A sejtmagok átfedik egymást, nem minden részük látható. 2 Két zöld jel: a számlálásnál ne vegye figyelembe a csupán egy színű jeleket kibocsátó sejtmagokat 3 3 zöld és 12 piros jelként számolandó (csoportos becslés) 4 1 zöld és 1 piros jelként kell számolni. Számláláskor az egyforma méretű, és egymástól legfeljebb a jelátmérőnek megfelelő távolságban levő két jelet számolja egynek 5 Ne számolja (túlemésztett vagy emésztetlen sejtmagok). vagy A sejtmagok közepéből hiányoznak a jelek (fánk alakú sejtmagok). 6 2 zöld és 3 piros jelként kell számolni. Számláláskor az egyforma méretű, és egymástól legfeljebb a jelátmérőnek megfelelő távolságban levő két jelet számolja egynek 7 1 zöld és 5 piros jelként kell számolni 8 3 zöld (1 zöld jel a fókuszon kívül) és 3 piros jelként számolandó. 9 A zöld jeleket elfedő piros jelcsoport, a zöld jeleket vizsgálja meg egy speciális FITC-szűrővel, vagy hagyja ki a számolásból Jegyezze fel az értékeket az 5. és 6. függelékben bemutatotthoz hasonló táblázatban. Szövetmintánként 20 sejtmag jeleit számolja meg; ha lehetséges, akkor elkülönülő tumorterületekről. Számolja ki a HER2/CEN-17 arányt oly módon, hogy elosztja a piros HER2 jelek teljes számát a zöld CEN-17 jelek teljes számával. A 2-nél nagyobb vagy azzal egyenlő HER2/CEN-17 arányt mutató mintákat HER2 génamplifikáltnak kell tekinteni (26). A határértékre vagy a kritikus cut-off érték (1,8 2,2) közelébe eső minták eredményeinek kiértékelését óvatosan kell végezni. Ha az arány a határértékhez közel esik (1,8 2,2), akkor számolja meg 40 további sejtmag jeleit, és számolja ki az arányt a 40 sejtmagra vonatkozóan. Ha számlálás eredménye továbbra is a határértéken marad, a második értékelés eredménye tekintendő érvényesnek. A második számlálás során, a jobb tájékozódás érdekében, bele kell venni az értékelésbe egy immunohisztokémiai HER2 festést is, amennyiben ez rendelkezésre áll. Kétséges esetben az ilyen mintát tartalmazó tárgylemezt újra kell számolni. Határesetekben ajánlott, hogy a patológus és a kezelőorvos konzultáljon egymással. P04090HU_02/K573111-2 65/47. o.

Gyomorrák Korlátozások gyomor 1. A FISH eljárás egy többlépcsős folyamat, amely speciális szakképzettséget igényel a megfelelő reagensek kiválasztása, a szövetek kiválasztása, fixálása és feldolgozása, valamint a FISH tárgylemez előkészítése és a festési eredmények értelmezése terén. 2. A FISH eredményei függnek a szövetek festést megelőző kezelésétől és előkészítésétől. A nem megfelelő fixálás, mosás, szárítás, felfűtés, metszetkészítés, illetve más szövetekkel vagy folyadékokkal való szennyeződés befolyásolhatja a próba hibridizálását. Inkonzisztens eredményekhez vezethetnek a fixálási és beágyazási módszerek eltérései vagy a szövet inherens egyenetlenségei. 3. Optimális és a szövetmetszeteket teljes mértékben paraffinmentesíteni kell. A paraffinmentesítést a festési eljárás kezdetén kell elvégezni. (Lásd a HASZNÁLATI ÚTMUTATÓ B.2 szakaszát.) 4. Kizárólag kalibrált hőmérsékletű vízfürdőt, fűtőblokkot és hibridizáló kemencét szabad használni. Egyéb típusú berendezések használata a HER2/CEN-17 IQISH próbakeverék hibridizálás alatti párolgását okozhatja, ezért ezeket a berendezéseket a felhasználónak validálnia kell. Teljesítményjellemzők gyomor Háttér A trasztuzumab (Herceptin ) biztonságosságát és hatékonyságát egy klinikai vizsgálatban (a ToGA vizsgálatban) igazolták (25). A vizsgálat inoperábilis, lokálisan előrehaladott, kiújuló és/vagy áttétes gyomor- vagy gyomor-nyelőcső határon lévő adenokarcinómában szenvedő HER2-pozitív betegekkel végzett nyitott, randomizált, multicentrikus, III. fázisú klinikai vizsgálat. A ToGA vizsgálatban HER2 pozitívnak azokat a mintákat tekintették, amelyek IHC-pozitívak (3+) (HercepTest, Dako) és/vagy HER2 FISH pozitívak voltak (HER2/CEN-17 2,0) (HER2 FISH pharmdx készlet, Dako (kód: K5331)). A vizsgálatba történő bevonás után a pácienseket random módon csoportokba osztották, amelyek kemoterápiás (5-FU vagy capecitabin és ciszplatin) vagy kemoterápiát és trasztuzumabot magában foglaló, kombinált kezelésben részesültek. A vizsgálat elsődleges végpontja az összesített túlélés (overall survival OS) volt. A vizsgálatban összesen 594 beteget randomizáltak, 584 beteg kapta meg a vizsgálati gyógyszert, és lett a teljes analízis halmazba (FAS) sorolva. Az elsődleges végpont tekintetében a kemoterápiát és trasztuzumabot magában foglaló kombinált kezelés statisztikailag előnyösebbnek bizonyult, mint az önmagában alkalmazott kemoterápia. Az OS mediánja 11,1 hónapról 13,8 hónapra emelkedett (p=0,0046) 0,74-es kockázati aránnyal (95%-os CI: 0,60 0,91). Az OS Kaplan-Meier görbéi a 3. ábrán láthatók. P04090HU_02/K573111-2 65/48. o.

Gyomorrák Túlélési valószínűség 1,0 0,9 0,8 0,7 0,6 Logaritmikus besorolású (logrank) teszt P = 0,0046 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0 11,1 13,8 Idő (hónapok) Megmaradt szám Fluoro/Cisp Tras/Fluoro/Cisp Kezelési csoport Fluoro/Cisp Tras/Fluoro/Cisp 3. ábra. Az OS Kaplan-Meier görbéje (n=584). A HER2-státusz tekintetében az előre meghatározott feltáró alcsoport-elemzéseket akkor végezték el, amikor az adatok rendelkezésre álltak, és kiegészítésképpen post hoc két új HER2 alcsoportot határoztak meg az IHC pontozás alapján: 1. csoport ( alacsony HER2- expressziójú csoport ): 2. csoport ( magas HER2-expressziójú csoport ): IHC 0/FISH+ és IHC 1+/FISH+ (n=131) IHC 2+/FISH+ és IHC 3+ (FISH+ vagy FISH- vagy FISH nincs eredmény) (n = 446) Amikor az OS primer analízisét post hoc megismételték, a magas HER2-expressziójú csoport (n = 446) esetében a kombinált kezelés jótékony hatása még nagyobb volt. A kemoterápia és trasztuzumab kombinált kezelésben részesülő betegek csoportjának medián OS-értéke 16,0 hónapra emelkedett, szemben a csak kemoterápiában részesülő betegek 11,8 hónapos értékével. Ezen analízis kockázati aránya 0,65-re csökkent (95%- os konfidenciaintervallum: 0,51 0,83). A magas HER2-expressziójú csoport OS értékeinek Kaplan-Meier görbéi a 4. ábrán láthatók. P04090HU_02/K573111-2 65/49. o.

Gyomorrák Túlélési valószínűség 1,0 0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0 11,8 16,0 Idő (hónapok) Megmaradt szám Fluoro/Cisp Tras/Fluoro/Cisp Kezelési csoport Fluoro/Cisp Tras/Fluoro/Cisp 4. ábra. A magas HER2-expressziójú csoport (n=446) OS értékeinek Kaplan-Meier görbéje. A BO18255 vizsgálat egyaránt igazolta a HercepTest és a HER2 FISH pharmdx készlet klinikai alkalmazhatóságát a HER2 státusz meghatározására, inoperábilis, lokálisan előrehaladott, kiújuló és/vagy áttétes gyomor-adenokarcinómában vagy gyomor-nyelőcső határon lévő adenokarcinómában szenvedő betegeknél. Analitikai érzékenység A HER2/CEN-17 IQISH próbakeverék analitikai érzékenységét 18 gyomoradenokarcinóma minta segítségével vizsgálták. A HER2 és a CEN-17 jelszámok arányát a tumort körülvevő egészséges szövetből származó 20 sejtmag megszámlálása alapján számolták ki. A 18 gyomor-adenokarcinóma minta esetében a HER2/CEN-17 arány 0,95 és 1,06 között mozgott. Analitikai specificitás A HER2/CEN-17 IQISH próbakeverékben lévő HER2 DNS próbákat úgy végszekvenálták és térképezték fel, hogy biztosan és teljesen lefedjenek egy 218 kb nagyságú szakaszt, amely tartalmazza a HER2 gént. A HER2/CEN-17 IQISH próbakeverékben lévő CEN-17 PNS próbákat egyenként és kombinációban is tesztelték annak ellenőrzésére, hogy specifikusan hibridizálódnak-e a 17-es kromoszóma centromer régiójával. Annak megítélésére, hogy alkalmas-e az assay kizárólag a célanyagok, vagyis a HER2 és a CEN-17 azonosítására, egyéb anyagokkal való interferencia nélkül, gyomoradenokarcinóma mintákat vizsgáltak meg a 3. üvegben lévő hibridizáló pufferrel, de próbakeverék nélkül. Összesen 18 mintát értékeltek a próbakeverékkel nem kapcsolatos jelek jelenlétének felmérése céljából. A 18 minta egyikében sem mutatták ki egyéb kromoszóma célszekvenciák jelenlétét, és interferenciát sem tapasztaltak szoros rokonságban lévő anyagokkal sem. P04090HU_02/K573111-2 65/50. o.

Gyomorrák A robosztusságra vonatkozó vizsgálatok A HER2 IQFISH pharmdx assay robusztusságát az előkezelési idő, a hőmérséklet és az előkezelési puffer felmelegítésére szolgáló módszerek (mikrohullámú sütő vagy vízfürdő), a pepszininkubációs idő és módszer (RTU pepszin vagy immerzió), a denaturációs hőmérséklet és idő, a hibridizálási idő, valamint a magas stringenciájú mosóoldattal történő mosási idő és hőmérséklet változtatásával tesztelték. A következő kísérleti feltételek mellett az eredmények között nem voltak szignifikáns különbségek: Előkezelés A módszer: 10 perces vízfürdő 95 C-on, 95 99 C-on, illetve 99 C-on, valamint 9, 10, illetve 11 perces vízfürdő 95 99 C-on Előkezelés B módszer: mikrohullámú sütő 9, 10, illetve 11 percig > 95 C-on. Pepszines emésztés A módszer: 5, 10, illetve 15 perces inkubációs időkkel szobahőmérsékleten (20 25 C-on). Pepszines emésztés B módszer: 3, 4, illetve 5 perces inkubációs időkkel 37 C-on). Pepszines emésztés C módszer: 20, 25, illetve 30 perces inkubációs időkkel, amelyek mindegyikét 35, 37, illetve 39 C-os hőmérsékletekkel kombináltak. 10 perces denaturálás 65, 66, illetve 67 C-on, valamint 9, 10, illetve 11 perces 66 Con történő denaturálás. Hibridizálás 60, 90 és 120 percen át 45 C-on. Magas stringenciájú 10 perces mosás 61, 63, illetve 65 C-on, valamint 9, 10, illetve 11 perces, 63 C-on történő mosás. Megjegyzés: A robosztusságra vonatkozó vizsgálatok esetében a festési eljárásnak egyszerre csak egyetlen paraméterét változtatták meg, a többi paramétert állandó értéken hagyták. Ajánlott ragaszkodni a festési eljárásban megadott időtartamokhoz és hőmérsékletekhez. A HER2 IQFISH pharmdx esetében a festési eljárási protokollban különféle hőelőkezelési, pepszines emésztési és hibridizálási időket lehet alkalmazni. Minden egyes kombinációs lehetőséget a HER2 gén státuszára vonatkozóan validáltak. A validálást 10, formalinnal fixált, paraffinba ágyazott (FFPE) humán gyomor- és a gyomor-nyelőcső határon lévő adenokarcinómából származó szövetmintán végezték, mind a 12 kombinációs lehetőség esetében. Referenciaként a HER2 FISH pharmdx készletet (kód: 5331) használták. Az egyes mintákra vonatkozó HER2/CEN-17 arányokat az 5. táblázatban tüntettük fel. A 12 tesztvizsgálat és a referenciafestések kereszttáblázata 100%-os (10/10) általános egyezést igazolt a HER2 génstátuszban, 78,3%-os alsó és 100%-os felső határral a kétoldalas, 95%-os megbízhatósági tartományban. A kappa érték 1,00 volt, a McNemars teszt pedig a torzítás hiányát igazolta (az 1,00 kétoldalas p- értéke). P04090HU_02/K573111-2 65/51. o.

Gyomorrák 5. ábra Egyéni HER2/CEN-17 arányok a HER2 IQFISH pharmdx készlettel (kód: K5731) lehetséges 12 protokoll kombinációs variációban (1 12 teszt), valamint a HER2 FISH pharmdx referenciakészlettel (kód: K5331) megfestett (R) 10 humán gyomor-adenokarcinóma minta esetében. A vízszintes vonal a 2,0-es cut-off értéket ábrázolja. Megismételhetőség A HER2/CEN-17 arány megismételhetőségét a HER2 IQFISH pharmdx assay segítségével vizsgálták, kilenc, nem amplifikált vagy amplifikálther2 génstátuszos gyomor-adenokarcinóma minta egymást követő metszetein. Egyazon vizsgálati meneten belül az egyes minták három-három metszetét vizsgálták. Az átlagos variációs koefficiens 3,5%-os volt a nem amplifikált minták esetében (1% és 5% közötti tartomány) és 2,8%-os az amplifikált mintáknál (1% és 5% közötti tartomány). Az egymást követő, különböző (2, 3, 4, 5, 6, illetve 7 µm) vastagságú gyomoradenokarcinóma mintákon végzett megismételhetőségi vizsgálatot a HER2 IQFISH pharmdx készlettel végezték. A HER2/CEN-17 arány átlagos variációs koefficiense 4,5%-os volt (3% és 6% közötti tartomány), azaz ugyanabban a tartományban mozgott, mint az azonos vastagságú szövetek esetében előre meghatározott elfogadhatósági kritériumok szerinti értékek. Reprodukálhatóság A HER2 IQFISH pharmdx assay tételek, illetve értékelők közötti reprodukálhatóságát három HER2 IQFISH pharmdx assay felhasználásával és három értékelő személlyel vizsgálták. A reprodukálhatóságot kilenc különböző, nem amplifikált vagy amplifikált HER2 génstátusszal rendelkező gyomor-adenokarcinóma mintán vizsgálták. A tételek közötti reprodukálhatóság átlagos variációs koefficiense 3,8%-os volt a nem amplifikált minták esetében (2% és 7% közötti tartomány) és 1,8%-os az amplifikált mintáknál (1% és 3% közötti tartomány). Az értékelők közötti reprodukálhatóság átlagos variációs koefficiense 4,3%-os volt a nem amplifikált minták esetében (3% és 5% közötti tartomány), és 4,4%-os az amplifikált mintáknál (2% és 7% közötti tartomány). A gyomor-adenokarcinóma minták 78,8%-a reszekcióból, 22,2%-a pedig biopsziából származott. A minták 55,6%-át a gyomorból, 44,4%-ukat pedig a gyomor-nyelőcső átmenetből nyerték. P04090HU_02/K573111-2 65/52. o.

Gyomorrák Klinikai alkalmazhatóság A Dako HER2 IQFISH pharmdx készlet (kód: K5731) klinikai alkalmazhatóságát egy Dako HER2 FISH pharmdx készlettel (kód: K5331) történő összehasonlító vizsgálatban tanulmányozták. A vizsgálatban 79, különböző adenokarcinóma szövettípusú gyomorrák mintát (azaz gyomor-, illetve gyomor-nyelőcső határon lévő adenokarcinómákat), illetve homogén vagy heterogén (fokális vagy mozaik) eloszlást mutató, reszekcióból vagy biopsziából származó mintákat vizsgáltak meg. Az összes tumor HER2 fehérje expressziós státuszát megvizsgálták Dako HercepTest (kód: K5207) segítségével. A vizsgálatba bevettek mind a négy IHC pontozási csoportból (0, 1+, 2+, 3+) származó mintákat. A két assay segítségével kapott HER2 státusz kereszttáblázata 98,7%-os általános egyezést mutatott, 94,2%-os alsó és 99,9%-os felső határral a 95%-os megbízhatósági tartományban. A kappa-érték 0,97 volt, 0,92-es alsó és 1,00 felső határral a 95%-os megbízhatósági tartományban. A McNemars teszttel kapott p-érték 1,00 volt, ami a két assay közötti torzítás hiányára utalt. P04090HU_02/K573111-2 65/53. o.

Gyomorrák Hibaelhárítás gyomor Probléma Valószínű ok Javasolt teendő 1. Nincs jel, vagy a jel gyenge 2. Nincsenek zöld jelek 1a. A készletet magas hőmérséklet-hatásnak tették ki a szállítás vagy a tárolás ideje alatt 1b. A mikroszkóp nem működik megfelelően - nem megfelelő szűrőkészlet - nem megfelelő lámpa - a higanylámpa túl régi - piszkos és/vagy megrepedt kollektorlencsék - nem megfelelő immerziós olaj 1a. Ellenőrizze a tárolási körülményeket. Győződjön meg arról, hogy átvételkor volt még szárazjég a küldeményben. Győződjön meg arról, hogy a 3. üveget sötét helyen és -18 C-on tárolták. Győződjön meg arról, hogy a 2A. és az 5. üveget legfeljebb 2 8 C-on tárolták, sötét helyen. 1b. Ellenőrizze a mikroszkópot, és bizonyosodjon meg arról, hogy az alkalmazott szűrök alkalmasak a készlet fluorokrómjaival történő használatra, illetve, hogy a higanylámpa megfelelő, és nem használják hosszabb ideje, mint amennyi a várható élettartama. (lásd a 7. függeléket). Kétséges esetben vegye fel a kapcsolatot helyi mikroszkópbeszállítójával. 1c. Elhalványult jelek 1c. Kerülje a hosszas mikroszkópos vizsgálatot, és csökkentse minimálisra a túl erős fényexpozíciót. 1d. Nem megfelelőek az előkezelés feltételei 1e. A próbakeverék párolgása a hibridizálás ideje alatt 2a. A magas stringenciájú mosási feltételek nem megfelelőek 1d. Gondoskodjon arról, hogy az ajánlott előkezelési hőmérsékletet és időt alkalmazzák 1e. Gondoskodjon megfelelő páratartalomról a hibridizációs kamrában 2a. Bizonyosodjon meg arról, hogy az ajánlott magas stringenciájú mosási hőmérsékletet és időtartamot alkalmazták, továbbá, hogy a fedőlemezeket eltávolították a magas stringenciájú mosás elvégzése előtt 3. Nincsenek piros jelek 3a. Nem megfelelőek az előkezelés feltételei 3a. Gondoskodjon arról, hogy az ajánlott előkezelési hőmérsékletet és időt alkalmazzák P04090HU_02/K573111-2 65/54. o.

Gyomorrák Probléma Valószínű ok Javasolt teendő 4. Jelmentes területek 4a. A próbatérfogat túl kicsi 4a. Győződjön meg arról, hogy a próba térfogata elegendő-e a fedőlemez alatti terület lefedéséhez 5. Túl erős háttérfestődés 6. Gyenge minőségű szövetmorfológia 4b. Légbuborékzárványok keletkeztek a próbakeverék alkalmazása vagy a rögzítés közben 5a. Nem megfelelő szövetfixálás 5b. A paraffinmentesítés nem tökéletes 5c. A magas stringenciájú mosás hőmérséklete túl alacsony 5d. A hibridizált részt túl hosszasan tették ki erős fénynek 6a. Nem megfelelő pepszinkezelés 6b. A nem megfelelő előkezelési körülmények az oldat homályosodását vagy zavarosodását eredményezhetik 6c. A túl hosszú pepszinkezelés vagy a nagyon vékony metszetek szellemképes vagy fánk alakú sejtek megjelenését eredményezhetik. 4b. Akadályozza meg a légbuborékok képződését. Ha légbuborékokat észlel, akkor csipesz segítségével finoman ütögetve távolítsa el azokat 5a. Gondoskodjon arról, hogy kizárólag formalinnal fixált, paraffinba ágyazott szövetmetszeteket használjon 5b. Kövesse a B.2 szakaszban leírt paraffinmentesítési és rehidrálási eljárásokat 5c. Győződjön meg arról, hogy a magas stringenciájú mosás hőmérséklete 63 (±2) C 5d. Kerülje a hosszas mikroszkópos vizsgálatot és csökkentse minimálisra a túl erős fényexpozíciót. 6a. Tartsa be az ajánlott pepszininkubációs időket. Lásd a B.3 szakasz 2. lépését. Bizonyosodjon meg arról, hogy a pepszint megfelelő hőmérsékleten kezelik. Lásd a B.1 szakaszt 6b. Gondoskodjon arról, hogy az ajánlott előkezelési hőmérsékletet és időt alkalmazzák 6c. Rövidítse le a pepszininkubációs időt. Lásd a B.3 szakasz 2. lépését. Gondoskodjon arról, hogy a metszet vastagsága 3 6 µm legyen. P04090HU_02/K573111-2 65/55. o.

Gyomorrák Probléma Valószínű ok Javasolt teendő 7. Nagyfokú zöld autofluoreszcencia a tárgylemezen az FFPE szövet nélküli területeket is beleértve 7. Lejárt vagy nem javasolt üveglemezek használata 7. Bizonyosodjon meg arról, hogy a bevonatos üveglemez (Dako Silanized Slides, kód: S3003, vagy poli-l-lizinnel bevont tárgylemezek) még nem járt le. MEGJEGYZÉS: Ha a probléma a fenti okok egyikének sem tulajdonítható, vagy ha az ajánlott korrekciós lépés nem oldja meg a problémát, további segítségért hívja a Dako Műszaki Szolgálatát. P04090HU_02/K573111-2 65/56. o.

Gyomorrák 4. függelék gyomor HER2 IQFISH pharmdx, kód: K5731 Ellenőrzőlista a protokollhoz A munkamenet dátuma: HER2 IQFISH pharmdx (K5731) tétel: Minta azonosító száma: Készülék azonosító száma: A festési munkamenet naplóazonosítója: Az 1 x mosópuffer (6. üveg, 1:20 hígítás) hígításának/lejáratának dátuma / A szövet fixálása semlegesre pufferelt formalinnal történt Igen Nem 1. lépés: Előkezelés Az előkezelő oldat (1. üveg, 1:20 hígítás) hígításának/lejáratának dátuma Az előkezelő oldat mért hőmérséklete (95 99 C), ha a vízfürdős módszert használják a melegítéshez Előkezelés (10 perc) és hűtés (15 perc) Mosás a mosópufferben (6. üveg, 1:20 hígítás) (2 x 3 perc) 2. lépés: Pepszin A pepszinkezelés (2. üveg) időtartama 37 C-on vagy A pepszinkezelés (2. üveg) időtartama szobahőmérsékleten vagy A pepszinimmerzió időtartama 37 (±2) C-on Mosás a mosópufferben (6. üveg, 1:20 hígítás) (2 x 3 perc) A tárgylemezek dehidrálása (3 x 2 perc) sorozathígított etanolban és szárítás levegőn 3. lépés: HER2/CEN-17 IQISH próbakeverék Adja hozzá a próbakeveréket (3. üveg), helyezze fel a fedőlemezt, és zárja le a fedőlemez-tömítéssel / C perc perc perc Mért denaturálási hőmérséklet (66 (±1) C) C Denaturálás 10 percen át Mért hibridizálási hőmérséklet (45 (±2) C) C Hibridizálási idő (60 120 perc) 4. lépés: Magas stringenciájú mosás A magas stringenciájú mosópuffer (4. üveg, 1:20 hígítás) hígításának/lejáratának dátuma A magas stringenciájú mosópuffer mért hőmérséklete (63 (±2) C) Magas stringenciájú mosás (10 perc) a fedőlemezek eltávolítása után perc C Mosás a mosópufferben (6. üveg, 1:20 hígítás) (2 x 3 perc) C A tárgylemezek dehidrálása (3 x 2 perc) sorozathígított etanolban és szárítás levegőn perc 5. lépés: Rögzítés Vigyen fel 15 μl fluoreszcens rögzítőszert (5. üveg) és helyezze fel a fedőlemezt Megjegyzések: P04090HU_02/K573111-2 65/57. o.

Gyomorrák Dátum és aláírás, labortechnikus: P04090HU_02/K573111-2 65/58. o.

Gyomorrák 5. függelék gyomor HER2 IQFISH pharmdx, kód: K5731 Számlálási vázlat HER2 IQFISH pharmdx, K5731, Tétel: A festési munkamenet naplóazonosítója: A munkamenet dátuma: Minta azonosító száma: A szöveti jeleloszlás jellemzése: Homogén: Heterogén Fokális: vagy Heterogén Mozaik: Számlálja meg a jeleket 20 sejtmagban Sejtmag Piros Zöld Piros Sejtmag száma száma (HER2) (CEN-17) (HER2) 1 11 2 12 3 13 4 14 5 15 6 16 7 17 8 18 9 19 10 20 Összes (1 10) Összes (11 20) Zöld (CEN-17) A HER2/CEN-17 arány meghatározásához számlálja meg a HER2 jeleket és a CEN-17 jeleket ugyanazon 20 sejtmagban, és a HER2 jelek számának összegét ossza el a CEN- 17 jelek számának összegével. Ha a HER2/CEN-17 arány a határérték közelébe (1,8 2,2) esik, akkor számláljon meg még 40 sejtmagot és ismét számítsa ki az arányt (lásd a számlálási vázlatot). A határértékre vagy a kritikus cut-off érték közelébe (1,8 2,2) eső arányt eredményező minták kiértékelését különös gonddal kell végezni (lásd a számlálási útmutatót). P04090HU_02/K573111-2 65/59. o.

Gyomorrák HER2 FISH HER2 CEN-17 HER2/CEN-17 arány VÉGEREDMÉNY (1 20) Arány < 2: Nem figyelhető meg HER2 génamplifikáció Arány 2: HER2 génamplifikációt figyeltek meg Dátum és aláírás, labortechnikus: Dátum és aláírás, patológus: Számlálási útmutatások tekintetében lásd A festődés értékelése című szakaszt. P04090HU_02/K573111-2 65/60. o.

Gyomorrák 6. függelék gyomor HER2 IQFISH pharmdx, kód: K5731 Újraszámlálási vázlat HER2 IQFISH pharmdx, K5731, Tétel: A festési munkamenet naplóazonosítója: A munkamenet dátuma: Minta azonosító száma: Jelek további 40 sejtmagban (1-40) Sejtmag száma Piros HER2 Zöld CEN-17 Sejtmag száma Piros HER2 Zöld CEN-17 Sejtmag száma Piros HER2 Zöld CEN-17 Sejtmag száma 1 11 21 31 2 12 22 32 3 13 23 33 4 14 24 34 5 15 25 35 6 16 26 36 7 17 27 37 8 18 28 38 9 19 29 39 10 20 30 40 Összesen Összesen Összesen Összesen 1 10 11 20 21-30 31 40 Piros HER2 Zöld CEN-17 A HER2/CEN-17 arány meghatározásához számlálja meg a HER2 jeleket és a CEN-17 jeleket ugyanazon 40 sejtmagban, és a HER2 jelek számának összegét ossza el a CEN-17 jelek számának összegével. Írja be az alábbi táblázatba az 1-40 sejtmagokból származó végeredményt. HER2 FISH HER2 CEN-17 HER2/CEN-17 arány VÉGEREDMÉNY (1-40) Arány < 2: Nem figyelhető meg HER2 génamplifikáció Arány 2: HER2 génamplifikációt figyeltek meg Dátum és aláírás, labortechnikus: Dátum és aláírás, patológus: Számlálási útmutatások tekintetében lásd A festődés értékelése című szakaszt. P04090HU_02/K573111-2 65/61. o.

Gyomorrák 7. függelék gyomor HER2 IQFISH pharmdx, kód: K5731 A fluoreszcencia mikroszkóp műszaki leírása A Dako a következő eszközök használatát ajánlja a HER2 IQFISH pharmdx, K5731 készlettel: 1. Mikroszkóp típusa Epifluoreszcencia mikroszkóp 2. Lámpa 100 wattos higanylámpa (vezessen nyilvántartást a használati időről). 3. Objektívek A szövetek szűrővizsgálatához 10-szeres nagyítású száraz fluoreszcenciás vagy 16-szoros nagyítású olajimmerziós fluoreszcenciás objektívek használhatók. A nagy erejű nagyításhoz és a jelek számlálásához kizárólag az olajimmerziós (pl. 100-szoros nagyítású) fluoreszcencia objektívek használata ajánlott. 4. Szűrők A szűrőket egyénileg alakították ki a különböző fluorokrómokhoz, így ezeket ennek megfelelően kell kiválasztani. A Dako speciális DAPI szűrő használatát ajánlja, magas minőségű Texas Red/FITC kettős szűrővel kombinációban. DAPI szűrő Texas Red/FITC kettős szűrő A Texas Red és FITC monoszűrőket az eredmények megerősítéséhez lehet használni. Fluorokróm Gerjesztő hullámhossz Kibocsátási hullámhossz FITC 495 nm 520 nm Texas Red 596 nm 615 nm Az egyes mikroszkóptípusokhoz különböző szűrők tartoznak, és a megfelelő szűrők használata kulcsfontosságú az értékelés szempontjából. Részletes információkért vegye fel a kapcsolatot a mikroszkóp szállítójával vagy a Dako képviselőjével. 5. Olaj Nem fluoreszkáló olaj Óvintézkedések Az 50 wattos higanylámpa használata nem ajánlott. Rodamin szűrőket nem lehet használni. Tripla szűrők használata nem ajánlott. Problémákat okozhat a fluoreszcens jelek értékelésekor, ha a mikroszkóp kialakítása nem optimális. Fontos, hogy a fényforrás ne legyen lejárva, valamint hogy az igazítása és fókuszálása megfelelő legyen. A vevőknek ellenőrizniük kell a higanylámpát, és követniük kell a gyártó lámpára vonatkozó utasításait. Az eredmények értékelése előtt el kell végezni a mikroszkóp karbantartását és ellenőrizni kell, hogy a higanylámpa megfelelően van-e a helyére illesztve. Törekedni kell arra, hogy a mintát a lehető legkisebb mértékben tegyék ki a gerjesztő hullámhossz hatásának, hogy a fluoreszcencia elhalványulása minimális legyen. Javasoljuk, hogy a fluoreszcencia in situ hibridizálás megkezdése előtt beszélje meg az adott mikroszkóp beállítását a gyártóval, vagy tanulmányozza a szakirodalmat. P04090HU_02/K573111-2 65/62. o.

Hivatkozások 1. Muleris M, Almeida A, Malfoy B, Dutrillaux B. Assignment of v-erb-b2 avian erythroblastic leukemia viral oncogene homolog 2 (ERBB2) to human chromosome band 17q21.1 by in situ hybridization. Cytogenet Cell Genet 1997;76(1-2):34-5. 2. Coussens L, Yang-Feng TL, Liao YC, Chen E, Gray A, McGrath J, et al. Tyrosine kinase receptor with extensive homology to EGF receptor shares chromosomal location with neu oncogene. Science 1985;230(4730):1132-9. 3. King CR, Kraus MH, Aaronson SA. Amplification of a novel v-erbb-related gene in a human mammary carcinoma. Science 1985;229(4717):974-6. 4. Schwab M. Oncogene amplification in solid tumors. Semin Cancer Biol 1999;9(4):319-25. 5. Kallioniemi OP, Kallioniemi A, Kurisu W, Thor A, Chen LC, Smith HS, et al. ERBB2 amplification in breast cancer analyzed by fluorescence in situ hybridization. Proc Natl Acad Sci U S A 1992;89(12):5321-5. 6. Persons DL, Bui MM, Lowery MC, Mark HF, Yung JF, Birkmeier JM, et al. Fluorescence in situ hybridization (FISH) for detection of HER-2/neu amplification in breast cancer: a multicenter portability study. Ann Clin Lab Sci 2000;30(1):41-8. 7. Slamon DJ, Clark GM, Wong SG, Levin WJ, Ullrich A, McGuire WL. Human breast cancer: correlation of relapse and survival with amplification of the HER-2/neu oncogene. Science 1987;235(4785):177-82. 8. Rennstam K, Baldetorp B, Kytola S, Tanner M, Isola J. Chromosomal rearrangements and oncogene amplification precede aneuploidization in the genetic evolution of breast cancer. Cancer Res 2001;61(3):1214-9. 9. Borg A, Tandon AK, Sigurdsson H, Clark GM, Ferno M, Fuqua SA, et al. HER-2/neu amplification predicts poor survival in node-positive breast cancer. Cancer Res 1990;50(14):4332-7. 10. Nichols DW, Wolff DJ, Self S, Metcalf JS, Jacobs D, Kneuper-Hall R, et al. A testing algorithm for determination of HER2 status in patients with breast cancer. Ann Clin Lab Sci 2002;32(1):3-11. 11. Bilous M, Dowsett M, Hanna W, Isola J, Lebeau A, Moreno A, et al. Current perspectives on HER2 testing: a review of national testing guidelines. Mod Pathol 2003;16(2):173-82. 12. Nielsen PE, Egholm M, editors. Peptide Nucleic Acids: Protocols and Applications. Norfolk NR18 0EH, England: Horizon Scientific Press 1999. 13. Clinical and Laboratory Standards Institute (formerly NCCLS). Protection of laboratory workers from instrument biohazards and infectious disease transmitted by blood, body fluids, and tissue; Approved guideline. NCCLS document M29-A. 940 West Valley Road, Suite 1400, Wayne, Pennsylvania 19087-1898 USA: NCCLS. 1997. 14. Clinical Laboratory Improvement Amendments of 1988: Final Rule, FR 7163, February 28. 1992. 15. Sheehan DC, Hrapchak BB. Theory and practice of histotechnology. St. Louis: CV Mosby Company. 1980. 16. Kiernan JA. Histological and histochemical methods: theory and practice. New York: Pergamon Press 1981. 17. Tsuda H, Akiyama F, Terasaki H, Hasegawa T, Kurosumi M, Shimadzu M, et al. Detection of HER- 2/neu (c-erb B-2) DNA amplification in primary breast carcinoma. Interobserver reproducibility and correlation with immunohistochemical HER-2 overexpression. Cancer 2001;92(12):2965-74. 18. Ellis IO, Dowsett M, Bartlett J, Walker R, Cooke T, Gullick W, et al. Recommendations for HER2 testing in the UK. J Clin Pathol 2000;53(12):890-2. 19. Hanna W. Testing for HER2 status. Oncology 2001;61 Suppl 2:22-30. 20. Jorgensen JT. Targeted HER2 Treatment in Advanced Gastric Cancer. Oncology 2010;78(1):26-33. 21. Fujimoto-Ouchi K, Sekiguchi F, Yasuno H, Moriya Y, Mori K, Tanaka Y. Antitumor activity of trastuzumab in combination with chemotherapy in human gastric cancer xenograft models. Cancer Chemother Pharmacol 2007;59(6):795-805. 22. Kim SY, Kim HP, Kim YJ, Oh do Y, Im SA, Lee D, et al. Trastuzumab inhibits the growth of human gastric cancer cell lines with HER2 amplification synergistically with cisplatin. Int J Oncol 2008;32(1):89-95. P04090HU_02/K573111-2 65/63. o.

23. Matsui Y, Inomata M, Tojigamori M, Sonoda K, Shiraishi N, Kitano S. Suppression of tumor growth in human gastric cancer with HER2 overexpression by an anti-her2 antibody in a murine model. Int J Oncol 2005;27(3):681-5. 24. Tanner M, Hollmen M, Junttila TT, Kapanen AI, Tommola S, Soini Y, et al. Amplification of HER-2 in gastric carcinoma: association with Topoisomerase IIalpha gene amplification, intestinal type, poor prognosis and sensitivity to trastuzumab. Ann Oncol 2005;16(2):273-8. 25. Bang YJ, Van Cutsem E, Feyereislova A, Chung HC, Shen L, Sawaki A, et al. Trastuzumab in combination with chemotherapy versus chemotherapy alone for treatment of HER2-positive advanced gastric or gastro-oesophageal junction cancer (ToGA): a phase 3, open-label, randomised controlled trial. Lancet 2010; 376(9742):687-97 26. Hofmann M, Stoss O, Shi D, Buttner R, van de Vijver M, Kim W, et al. Assessment of a HER2 scoring system for gastric cancer: results from a validation study. Histopathology 2008;52(7):797-805. P04090HU_02/K573111-2 65/64. o.

Szimbólumok magyarázata Katalógus-/kódszám Hõmérsékleti korlátozások Kötegkód In vitro orvosdiagnosztikai eszköz Nézzen utánaa Használati Utasításban Napfénytől védett helyen tárolja (lásd a Tárolással foglalkozó részt) Tartalma <N> számú teszthez elegendõ Lejárati idõ Gyártó GHS piktogram (lásd az óvintézkedések című részt) GHS piktogram (lásd az óvintézkedések című részt) GHS piktogram (lásd az óvintézkedések című részt) GHS piktogram (lásd az óvintézkedések című részt) GHS piktogram (lásd az óvintézkedések című részt) Gyártó: Dako Denmark A/S Produktionsvej 42 DK-2600 Glostrup Dánia Tel.: +45 44 85 95 00 Fax: +45 44 85 95 95 www.agilent.com P04090HU_02/K573111-2 65/65. o.