Új eredmények a Fehér biotechnológia területén New Results on the field of White biotechnology Németh Áron, Nagy Gábor és Sevella Béla Budapesti Műszaki és Gazdaságtudományi Egyetem, Alkalmazott Biotechnológia és Élelmiszertudományi Tanszék H-1111 Budapest Műegyetem rkp.3. Summary White biotechnology term is used to describe the production of chemical compouds by enzymatic or microbial (biotechnological) methods. Our research group focuses on the field of glycerol utilization and lactic acid production, and in this work we present a new kinetic model based on our laboratory experiments, and used for planning continuos fermentaion with high productivity. Bevezetés A Fehér biotechnológiát Karl-Erich Jaeger [1] úgy definiálta, hogy ez a szóösszetétel fejezi ki a kemikáliák biotechnológiai előállítását enzimek illetve mikroorganizmusok segítségével. Kutató csoportunk munkája is évtizedek óta erre a területre fókuszál, amelyen belül az utóbbi időben a glicerin és a tejsav platformok kutatása kapott nagyobb hangsúlyt. Ebben a közleményünkben a tejsav előállítás fermentációs technológia fejlesztésének újabb eredményeit mutatjuk be. A tejsav több mint 1 éve ismert és évtizedek óta elsősorban élelmiszeripari célra felhasznált királis karbonsav. Az utóbbi évtizedekben jelentősen bővült a felhasználási területe (gyógyszeripar, műanyagipar) és volumene, ezért a kutatások középpontjába került. Bár kémiai és biológiai úton egyaránt előállítható, az előbbi esetben racém elegy az utóbbiban termelő mikroorganizmustól függően- optikailag tiszta L- vagy D-tejsav vagy akár racém elegy is előállítható. Nagyrészt ennek köszönhető, hogy túlnyomórészt fermentációs úton állítják elő. A tejsav fermentációs előállítását a mikroorganizmusok tejsavas erjesztő képessége teszi lehetővé, amelynek eredményeként glükózon egyes mikroorganizmusok tiszta tejsavat állítanak elő (homofermentatívak, Embden-Meyerhof-Parnas útvonalon), mások pedig egyéb fermentációs termékekkel (ecetsav, széndioxid, etanol) együtt termelik a tejsavat (heterofermentatívak, pentózfoszfát útvonalon). Léteznek olyan homofermentatív törzsek is, amelyek C 5 cukorból is képesek tejsavat erjeszteni melléktermékek keletkezése közben, ezeket gyakran fakultatív homofermentatív mikobáknak nevezik. Míg a fehér biotechnológia szempontjából természetesen a homofermentatív törzsek fontosak, az élelmiszeripar számára a heterofermentítv törzsek értékesek. Előbbi esetben a nyersanyag minél nagyobb arányú termékké alakítása a fontos, az utóbbinál pedig a különböző arányú melléktermékek által szolgáltattott íz és aroma. A tejsav fermentációk hatékonyságát a fermentáció produktivitásával szokás megadni (g tejsav/ L fermentlé / óra). E tekintetben igen tág tartományban mozognak az irodalmi adatok (1,5-35 g/(l h), [2]). Mindezek ellenére az ipari eljárás a klasszikus szakaszos fermentációs technikán alapszik, és 2,5-3 g*l -1 *h -1 produktivitással üzemel. Több ízben bemutattuk már, hogy versenyképes tejsav előállítást tesz lehetővé [3, 4] egy homofermentatív mezofil Lactobacillus nemzetségbe tartozó mikroorganizmusunkra építő eljárásunk.. Ebben a közleményünkben azt mutatjuk be, hogy az elvégzett számos szakaszos tejsav fermentációból kinyert adatokra milyen kinetikai modellt tuunk felállítani, majd ennek felhasználásával hogyan tuunk magasabb produktivitású folytonos fermentációs rendszert megtervezni.
Anyagok és Módszerek A Lactobacillus sp. MKT878 törzset korábbi vizsgálataink során választottuk ki [3]. A szakaszos tejsav fermentációkat az alábbi, erre a mikrobára optimált tápközegen végeztük: 12g/l glükóz, 3 g/l kukorica lekvár (Hungrana, Roquette), élesztő kivonat 6 g/l, KH 2 PO 4,5 g/l, MgSO 4 *7H 2 O,3 g/l, FeSO 4 *7H 2 O,1 g/l, MnSO 4,1 g/l. A fermentációt Biostat Q fermentorban végeztük (BBraun), ph=5,8-on (szabályozás 2% NaOH illetve 25% H 2 SO 4 segítségével), 37 C-on 7rpm keverés mellett. Az oltóanyag 3 db 24h-ás ferdeagar tenyészetről sterilvízes lemosással készült. A folyamatot mintavételezéssel követtük nyomon, amely mintákból 6nm-en 2x higítás után abszorbanciát mértünk a sejtkoncentráció meghatározására (szárazanyag tartalom (g/l)=,5xod 6 ). A szűrt mintából szintén 2x higítás után tejsav és glükóz tartalmat határoztunk meg Waters Breeze HPLC-vel (,5ml/perc 5mM H 2 SO 4, BioRad Aminex HPX87H oszlop 65 C-on, RI detektálás 4 C-on). A mintavételezésből nem állt kinetikai kiértékeléshez elegendő adat rendelkezésre, ezért a folyamatosan mért és a sejt valamint termékkoncentrációval egyenesen arányos lúgfogyasztás alapján számított OD, glükóz és tejsav értékeket számoltunk ki, és ezekhez illesztettük a kinetikai egyenleteket Berkeley Madonna 8 szoftverrel. Mindhárom változóra a mérési időpontokban leolvasott változó értékekből és lúgfogyási értékekből átváltási faktort számoltunk, majd ezeket változónként átlagolva átlagos átváltási faktort határoztunk meg. Ezek: OD számított =1,26xLúgfogyás, Sza szám.=,5xod szám. Tejsav szám.=,52xlúgfogyás, Glükóz szám. =Glükóz-(Sza szám +Tejsav szám )*1,2. Eredmények Modell-építés Az 1. ábrán egy szakaszos fermentációt mutatunk be, amelynél minden rendelkezésre állt a kinetikai modell felállításához. [g/l] 12 1 8 6 4 2 9219 Tejsav mért Glükóz mért OD mért Lúgfogyás Tejsav számított Glükóz számított Sza.számított 2 4 6 1. ábra: Szakaszos tejsav fermentáció A kinetikai leíráshoz a Monod-féle fermentációs modellt (1. egyenlet) vettük alapul kiegészítve a Luedeking-Piret féle termékképzési modellel (2. egyenlet). Míg előbbi a biomassza változását írja le, utóbbi a termékkoncentráció növekedését adja meg. A szubsztrát fogyasztást az eredő hozam segítségével a biomassza változásból számoljuk (3. egyenlet. dx S = μ x, μ = μ max K S + S 1.egyenlet dp = a μ x + b x 2.egyenlet ds 1 dx = Y 3.egyenlet x / s A modellezés során a kezdeti feltételek az alábbiak voltak: S = 15,3 g/l, x =,67g/l, és P =3,3 g/l. Az 1.ábrán látható, hogy a fermentáció során a biomassza előbb éri el a maximális koncentrációját (hanyatló fázis, plató), mint a termék görbe. Ezt a jelenséget a fenti egyenletrendszer nem tudja leírni, mert az eredő biomassza hozamon keresztül a szubsztrát koncentráció össze van kapcsolva tenyészet növekedésével, így amikor a tenyészet eléri a platót, a szubsztrát koncentráció is már zérusra csökken, pedig a mérések szerint még
további termékképződésnek kell lennie a szubsztrát rovására. Ennek megoldására olyan módon kellett a modellt átalakítani, hogy a növekedéshez nem kapcsolt termékképzést egy fenntartási taggá kellett konvertálni, amely fenntartási tag a szubsztrát egyenletében is megjelent (5. egyenlet) dp = a μ x + m x ds 1 dx = m x Y x / s 4.egyenlet 5.egyenlet A fajlagos fenntartási koefficiens ( m ) értékét a biomassza növekedésének leállása utáni szubsztrátfogyasztás meredekségéből számolhatjuk és az 1.ábrán bemutatott fermentáció esetében ez,222 1/h. Végül tehát 3 változót kellett a mért értékekhez illeszteni és eközben 3 paramétert (eredő hozam, K s, μ max ) meghatározni. A modell flexibilis felhasználása érdekében szükséges kísérletesen vagy szimulációs úton meghatározni a lag fázis időtartamát és a biomassza növekedés leállásának időpontját (utóbbit a növekedéshez kapcsolt termékképzés, és a fenntartás céljából mellékesen végzett termékképzés közötti váltás - nak nevezzük). Az 1. ábrán bemutatott fermentáció mért és szimulált eredményei láthatóak a 2. ábrán. Számított és modellezett értékek 813 14 s:1 Glü. Számított 12 p:1 LA. számított x:1 Sz.a. szám 1 8 6 R 2 átl=,89 4 2 2 4 6 8 1 3. ábra: A modell adekvátságát igazoló fermentáció, t lag =26,5 h, t váltás =46 h Mivel az illeszkedés ez esetben is kielégítő volt a megfelelő egyedi változók (lagfázis, váltás) beállítása után, a modellel folytonos fermentációt terveztünk. A kitűzött cél az volt, hogy nagy térfogati produktivitást érjünk el magas (iparilag kinyerhető, gazdaságos) termékkoncentráció mellett. A modell szerint (4. ábra) D=,1 1/h-ás higítási sebesség mellett 51,6 g/l tejsavat lehet az elvételben mérni, ami J P =5,2 g/(l h) volumetrikus produktivitást jelent, ami mintegy 2x-ese a szakaszos technikával elértnek. Szimulált Kemosztát 12 1 8 6 4 2 Számított és modellezett értékek 9219 s:1 Glü. Számított p:1 LA. számított x:1 Sz.a. szám 1 2 3 4 5 6 2. ábra: A modell illeszkedése R 2 átl=,998 Az illesztés eredményeként egy adekvát modellt kaptunk a következő paraméterekkel: μ max =,134 1/h, K S =,268 g/l, Y X/S =,143 g/g, t lag =,132 h, t váltás =2,22 h, a=y P /Y X/S =4,18. Bár az illeszkedés kiemelkedően jó volt, további fermentációval is validáltuk a modellt (3. ábra). 9 8 7 6 5 4 3 2 1 5 1 15 2 (1)(2) s:1 p:1 x:1 m 4.ábra: Folytonos technika modellezése (1) a biomassza növekedésének vége ( váltás ) (2):Sf=8 g/l betáplálás indítása.14.12.1.8.6.4.2 Mivel az itt bemutatott termékkoncentráció meglehetősen magas érték, mielőtt további szimulációkat végeznénk még magasabb termékkoncentrációkkal, kísérletileg kívánjuk igazolni a bemutatott folytonos üzemű, kemosztát elvű fermentációt. [1/h]
Összefoglalás Az egyre perspektivikusabb, platform alkotó tejsav fermentációs előállításának fejlesztése során létrehoztunk egy kinetikai modellt, amely képes leírni a kétlépcsős fermentációs folyamatot: 1. biomassza képződés, 2. termékképzés a fenntartásra fordított energiatermelés melléktermékeként. Ez a modell kiemelkedően illeszkedik az elvégzett szakaszos fermentációk mért értékeihez, ezért folytonos fermentáció tervezésére is felhasználtuk. Irodalomjegyzék [1] Jaeger, K.E., Current Opinion in Biotechnology, 15:269-271, (24) [2] Rojan P. John & K. Madhavan Nampoothiri & Ashok Pandey, Applied Microbioogy andl Biotechnoogyl, 74, 524-534 (27), mini review [3] Hetényi, K., Németh, Á. and Sevella, B, Fifth Croatian Professional and Scientific Conference on Biotechnology with International Participation 27, Stubicke Toplice. [4] Hetényi, K.; Németh, Á.; and Sevella, B., 35. Mûszaki Kémiai Napok 27, Veszprém, 164-167.