PhD értekezés tézisei A fotoszintetikus pigment-protein komplexek szerveződésének akklimatizációs változásai Cd-stressz alatt: A transzkripciós szabályozás szerepe az antenna stresszválaszában. Basa Brigitta Témavezetők: Dr. Sárvári Éva és Dr. Tamás László ELTE Biológia Doktori Iskola (Prof. Dr. Erdei Anna) Kísérletes Növénybiológia Doktori Program (Prof. Dr. Szigeti Zoltán) ELTE Növényélettani és Molekuláris Növénybiológiai Tanszék Budapest 2012
Bevezetés A nehézfémek és az általuk okozott károk az emberi tevékenység által váltak környezetvédelmi problémává. Természetes előfordulásuk csekély, vulkanikus, esetenként üledékes kőzetek ritka komponensei. A Cd is ilyen nem-esszenciális átmeneti nehézfém, az élőlényekre, így a növények számára is mérgező. Számos metabolikus folyamatot, köztük a produkció szempontjából nagy jelentőségű fotoszintézist is gátolja. Szerteágazó hatásai közül a fehérjék SH-csoportjaihoz való kötődése és ezáltal funkcionális gátlása, valamint a fémcentrumok esszenciális fémeinek kiszorítása a Cd közvetlen toxicitását jelenti. Ugyanakkor számos közvetett hatása közül az oxidatív stressz és az ionháztartásban okozott zavarai elsődleges jelentőségűek a fotoszintézis szempontjából. A fotoszintetikus apparátus képes bizonyos mértékben alkalmazkodni a stresszorok jelenlétéhez. Az ún. akklimatizáció során megváltozik a fotoszintetikus működés, ami együtt jár a komplexek szerveződésének, ill. az antenna szerkezetének átalakulásával. E folyamatok hátterében transzkripciós, transzlációs és poszt-transzlációs szintű szabályozások egyaránt állhatnak. A Cd gátolja a Fe felvételét és hajtásba történő transzlokációját is, ezért a Cd-stressz egyik jellegzetes tünete a vashiány-okozta klorózis, amiért a vasat igénylő klorofill- (Chl-) szintézis zavara a felelős. A levelek vastartalmának 80%-a a kloroplasztiszokban található, amiből 60% a tilakoid membránokban kötött. A Chl-bioszintézis számos lépéséről tudjuk, hogy vas-igényes folyamat így a klorotikus levelek sárgulása tulajdonképpen a lecsökkent Chl/karotinoid aránynak köszönhető A karotinoidok közül különösen a xantofillok játszanak fontos szerepet a vashiány következtében fellépő fényfelesleg elleni védelemben. A vas csökkent elérhetősége a tilakoidok szerkezetében, polipeptid-összetételében jelentős átalakulásokat indukál. Arra voltunk tehát kíváncsiak, hogy a Fe-hiány milyen mértékben járul hozzá a Cd-stressz pigment-protein komplexeket érintő tüneteihez. Vizsgálatainkhoz a Cd-stresszre és vashiányra egyaránt érzékenyen reagáló cukorrépát választottuk, gyors növekedése és nagy produktivitása miatt. Korábbi kísérleteinkben megfigyeltük, hogy a Cd-stressznek jobban ellenálló nyárfa növények hosszabb idejű Cd-kezelés hatására számos élettani paraméterük helyreállást mutattak. Az újonnan fejlődő levelek nem voltak klorotikusak, a Chl a/b arányuk, és fotoszintetikus aktivitásuk is a kontrollhoz hasonló volt. E változások a pigment-protein komplexek szerveződésének módosulását is jelezték. Azt kívántuk feltárni, hogy milyen folyamatok állhatnak a nyárfa növényeknél megfigyelt, hosszú Cd-kezeléskor 2
jelentkező regeneráció hátterében. Ezért a nyárfa növényekben összehasonlítottuk a rövid kezelés során kialakult, akut Cd-stressz által előidézett tilakoid-szerveződés és -összetétel változásokat a hosszú kezelés alatt megfigyelt változásokkal. A Cd-stressznek a fotoszintetikus elektrontranszportra gyakorolt gátló hatása miatt normális megvilágítás mellett is megbomlik az egyensúly az abszorbeált fény és a hasznosítható energia között, vagyis fényfelesleg alakul ki. A fénygyűjtés szabályozására és a fényfelesleg eltávolítására a növényekben többféle mechanizmus alakult ki, amelyekben az Lhc fehérjéknek elsődleges szerep jut. Az Lhc fehérjékből szerveződő Chlprotein komplexek biztosítják a megfelelő mennyiségű foton abszorpcióját a reakciócentrumok maximális hatékonysággal történő működéséhez. Ugyanakkor a növények szárazföldi evolúciója sokféle izoformájukat egyedi fényvédő funkcióval is felruházta, ezáltal is biztosítva a szupramolekuláris fotoszintetikus alkalmazkodó képességét a folytonosan változó környezeti feltételekhez. Arra kerestük a választ, hogy az Lhc izoformáknak milyen szerepe van a Cd-stressz által előidézett akklimatizációban, és ez milyen szintű regulációnak köszönhető. Ennek érdekében vizsgáltuk az antennák izoforma összetételében bekövetkező változásokat a fehérjék szintjén. Ugyanakkor a nyárfa, mint fás szárú genetikai modellnövény alkalmas volt az Lhc géncsalád tagjainak transzkripciós szintű vizsgálatára is. Anyagok és módszerek Kísérleti növényeink közül a cukorrépa (Beta vulgaris L. cv. Orbis) növényeket ½- es töménységű Hoagland tápoldaton neveltük 45 M Fe(III)-EDTA vasforrás mellett klimatizált kamrában neveltük. A növények egy részétől később megvontuk a vasat (-Fe), egy másik növénycsoport tápoldatába pedig 10 µm CdCl 2 -ot adagoltunk (+Cd). A kezelés10. napján vettük a mintákat, a kezelés alatt fejlődött levelekből. A kezelt növények élettani paramétereit kezeletlen (Ko) növények adataival vetettük össze. A nyárfákat (Populus jacquemontiana var. glauca (Haines) Kimura, 1982, cv. Kopeczkii ) szintén klimatizált kamrában, vízkultúrában neveltük. Az ¼-es Hoagland tápoldat 10 M Fe(III)-citrátot tartalmazott. A növények egy részénél 10 M Cd(NO3)2 kezelést alkalmaztunk tíz napon (Cd10), illetve három héten keresztül (Cd21). A mérésekhez mintát vettünk a kezelések előtt már kifejlett, fotoszintetikusan kompetens (-2) 3
levelekből, és a kezelések alatt fejlődött (+2) levelekből is. A kezelt növények élettani paramétereit kezeletlen (Ko) növények adataival vetettük össze. Az iontartalom-meghatározást a minták koncentrált salétromsavas feltárását követően Tóth Brigitta és Dr. Lévai László (Debreceni Egyetem) végezték ICP-MS (Perkin-Elmer, USA) műszerrel. A pigment-meghatározás során a minták Chl-tartalmát 80%-os (v/v) acetonos kivonatból Porra és mtsai (1989) módszerével határoztuk meg. A karotinoidok koncentrációját 100%-os (v/v) acetonnal történt kivonás után oldatok Rivas és mtsai (1989) által felállított HPLC oszlopkromatográfiás berendezéssel határoztuk meg. A Chl a fluoreszcencia indukció mérése PAM 101-102-103 Chlorophyll Fluorometerrel (Walz, Effeltrich, Germany), intakt leveleken történt. A gerjesztési energia allokációjának vizsgálatához a Hendrickson és mtsai (2005) kioltási paramétereit módosított formában használtuk. A tilakoid-membránok izolálása során Jansson és mtsai (1997) leírását követtük. A Chl-proteineket a nem-ionos detergenst tartalmazó pufferben történ9 szolubilizálását követően Blue-native PAGE-sel választottuk szét (Schägger és von Jagow, 1991), az apoprotein összetételt denaturáló SDS-PAGE-sel (Laemmli, 1970) vizsgáltuk. A BN sávokból izolált komplexek fehérje-összetételét IEF/SDS-PAGE módszerrel analizáltuk. A második dimenziós szeparálást. A géleket Coomassie Briliant Blue G-250-nel festettük meg. A gélek kiértékeléséhez Phoretix (Newcastle, Egyesült Királyság) programot használtunk. A fehérjefoltok tripszines emésztését követően kapott peptideket nanohplc berendezésben (Agilent Technologies, Waldbronn, Germany) választottuk szét. Tömegspektrometriás analízist követően (model HCTPlus, Bruker Daltonik) a fehérjéket a Mascot program segítségével azonosítottuk. Az Lhc géncsalád transzkripciós szintjének qpcr alapú méréséhez oligonukleotidokat terveztünk felhasználva a nyárfa (Populus trichocarpa) publikus genetikai szekvenciáit. A levélmintákból az mrns-ek kinyerését Oligo d(t)25-t tartalmazó mágnesgyöngyökkel végeztük. A cdns-re történt átírás után RiboGreen festékkel határoztuk meg a minták koncentrációját (Libus és Štorchová, 2006). A cdns mintákat templátként használtuk a valós idejű, kvantitatív PCR reakciók kivitelezéséhez, amit az Applied Biosystems SBS 7000 készülékkel végeztük (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). A Real-Time PCR adatok kiértékeléséhez a LinReg (Ramakers és mtsai, 4
2003) programot használtuk a relatív mrns szint meghatározás a RiboGreen mérés adataiból származtatott ún. normalizációs faktoron alapult. A méréseket, vizsgálattól függően, 2 2, illetve 3 3 ismétlésben végeztük. A statisztikai analízisben párosítatlan t-próbát használtunk. Eredmények és következtetések A Cd-kezelt cukorrépa növények jelentős mennyiségű nehézfémet halmoztak fel leveikben, azonban a várttól eltérően, a vas levélbeli koncentrációja korántsem csökkent le olyan mértékben, mint a vashiányos tápoldaton nevelt növények esetében. A Chlkoncentráció hasonló mértékű csökkenést mutatott és a Chl a/b arány emelkedését is mindkét stressz alatt megfigyeltük. Mindkét kezelés esetén kimutatható volt a PSII kvantumhatékonyságának csökkenése. A nem-fotokémiai kioltás (NPQ) azonban Cdstressz hatására lecsökkent a vashiányos levelekben viszont lényegesen felerősödött. A tilakoid-membrán komplexei közül a Cd-stressz és a vashiány is leginkább az I. fotokémiai rendszer (PSI) monomer, a II. fotokémiai rendszer (PSII) szuperkomplex és a II. fotokémiai rendszer antenna (LHCII) trimer komplexei akkumulációját gátolta. A Cdstressz hatására és az extrém mértékben vashiányos növényekben tapasztalt változások rendkívül hasonlóak voltak. A szuperorganizáció és az antennák méretének csökkenése redukálta a fényabszorpciót, ami a stressz hatására kialakult fotoinhibíció kivédésére szolgáló túlélési stratégiát lehet a cukorrépában. Ugyanakkor megfigyeltük a PSII lebomlásának felerősödését is, ami azt jelenti, hogy növény már nem volt képes helyreállítani a fényfelesleg okozta károsodásokat. Eredményeink alapján arra következtetünk, hogy a Cd-stressz fotoszintetikus aktivitásváltozással kapcsolatos tüneteinek előidézésében egyrészt a Cd közvetlen hatásainak, másrészt az általa előidézett vashiánynak is szerepe volt. A tilakoidszerveződésben tapasztalt változások alapján azonban azt is feltételezzük, hogy e változások nagy része a nehézfém által indukált, a kloroplasztiszban fellépő lokális vashiánnyal függhet össze. A nyárfa növények stressz folyamán fejlődő leveleiben (+2) az akut Cd stressz hatására a Chl-koncentráció és a Chl a/b arány egyidejű csökkenését tapasztaltuk. Az NPQ és a PSII fotokémiai hatékonysága is jelentősen alacsonyabb volt, mint a kontrollban. 5
Ugyanakkor az inaktív PSII reakciócentrumok általi kioltás (Φ NF ) aránya jelentősen megemelkedett a PSII aktuális fotokémiai hatékonyságának (Φ PSII ) terhére ami azt jelzi, hogy a sérült PSII egy része nem vett részt a regenerációs ciklusban, hanem inaktív kioltó centrumként működött. Az akut Cd-stressz leginkább a PSI monomerek mennyiségét csökkentette, ugyanakkor az LHCII antennát tartalmazó komplexek akkumulációját ennél kevésbé gátolta. A PSI szuperkomplexek mennyiségében tapasztalt jelentős emelkedés a ciklikus elektron áramlás előtérbe kerülésére utalhat. Míg a PSII szuperkomplexek arányának megemelkedése azt jelzi a PSII az antennák egy jelentős részével együtt energiadisszipáló szuperkomplexekbe szerveződött. Az LHCII monomerizációjának következtében a fénygyűjtő antenna is kisebb hatékonysággal működött, ezáltal csökkentve az e - -transzportlánc fényterhelését, megelőzve a káros reaktív oxigén-formák képződését. A mérsékelt Cd-stressz jellegzetes tünetei 7-10 napos Cd kezelés után voltak a legkifejezettebbek. Ezt az időszakot a Cd kezelés fenntartása mellett is lassú helyreállás követte. A Chl a/b arány visszaállt a kontrollra jellemző értékre, a fotoszintetikus aktivitás is helyreállt. Ugyanakkor vaskoncentráció szinte alig változott a levélben, ellenben megváltozhatott a vas sejten belüli megoszlása, feltételezhetően a kloroplasztiszok vastartalma emelkedett meg. Az akut Cd stressz hatására nyárfában olyan védekező válasz alakul ki, amelynek köszönhetően a növény képes megőrizni a PS-k intaktságát és olyan mértékben fenntartani a funkciót, hogy a stressz későbbi szakaszában a kontrollhoz hasonló tilakoid-szerveződés helyreállhasson. A helyreállás valószínűleg a kloroplasztisz vastartalmának emelkedésével van összefüggésben. A Cd-stressz hatására bekövetkező transzkripciós szintű változások követéséhez a nagy érzékenységű és specifikus qrt-pcr módszert választottuk. Ahhoz, hogy a mérés során kapott adatok biológiai értelmet nyerjenek megfelelő ún. normalizációs stratégiát kellett választanunk. Az irodalomban leginkább elterjedt, relatív mérésen alapuló módszer a belső kontroll gén(ek) használata. A mérés megbízhatóságához szükséges, hogy a kiválasztott belső kontroll gén(ek) expressziója változatlan szintű legyen, függetlenül a fejlődési állapottól és a külső körülményektől. Az irodalmi adatok alapján kiválasztottunk 4 gyakran használt belső kontroll gént (cyclophilin (cyc), elongation factor-1 α (ef-1 α), polyubiquitin (ubq), tubulin β-chain (tub)) és két kevésbé ismert jelöltet (serine/threonineprotein phosphatase 2A (pp2a), ubiquitin-conjugating enzyme (ubc10), amelyek 6
megbízhatóságát vizsgáltuk. A gének transzkripcióját megmértük különböző fejlettségű kontroll és Cd-kezelt nyárfalevelekben és a genorm programmal ellenőriztük változékonyságuk mértékét. A fiatal Cd-kezelt levelekben nagy eltéréseket tapasztaltunk transzkripciójuk szintjében (Basa és mtsai, 2009). Ezért egy alternatív normalizációs módszert választottunk az Lhc gének transzkripciójának méréséhez. A mintában található összes mrns mennyiségének mérésén alapuló, ún. RiboGreen módszer olyan relatív meghatározást tett lehetővé, amelynek segítségével az egyes vizsgált gének egymáshoz képesti kifejeződési szintjét is mérni tudtuk. A Cd-kezelt nyárfák antenna-összetétel 2D IEF/SDS módszerrel vizsgálva, az Lhcb1 és Lhcb2 egyes izoformáinak mennyiségében emelkedést tapasztaltunk, ezzel párhuzamosan az Lhcb3 bizonyos izoformáinak mennyisége jelentősen lecsökkent. A transzkripciós szintű változások is azt mutatták, hogy a nagy mennyiségben expresszálódó Lhcb1 és Lhcb2 gének kevésbé érzékenyek a Cd kezelésre, mint az Lhcb3. A nyárfában tapasztalt akklimatizációs folyamatokban fontos szerepet játszhatnak az Lhcb1 és Lhcb2 fehérjék ugyanis a PSII-ről leváló mobilis LHCII komponenseiként más komplexekhez is kapcsolódhatnak. Így például megnövelhetik a PSI+NDH (NDH: NADPH dehidrogenáz komplex) szuperkomplexek fénygyűjtési hatékonyágát is. Ugyanakkor tudjuk, hogy a PSII-ről leváló mobil LHCII nem tartalmaz Lhcb3-at. Elképzelhető, hogy a fény-disszipáló centrumként működő PSII szuperkomplexekben sem szükséges az Lhcb3 jelenléte. Nyárfa növényekben a legnagyobb mértékben kifejeződő Lhcb1.1 és Lhcb1.2 gének az akut Cdstressz alatt is megőrizték magas arányukat, a jóval kisebb mennyiségben jelen lévő Lhcb1.4 mrns-ei a stressz akut fázisában szinte teljesen eltűntek. Az Lhcb1 izoformák eltérő transzkripciós szabályozása, stressz körülmények között, vélhetően az energiadisszipáló antenna szerveződésének egyik kulcsfontosságú lépése. Az Lhca5 és Lhca6 gének kifejeződését vizsgálva, a kezelés kezdetén magasabb transzkripciót mértünk a Cdkezelt mintákban, mint a kontrollban. Mindkét fehérje a ciklikus elektrontranszportban részt vevő NDH komplexnek a PSI-hez való asszociációjában játszik fontos szerepet, ezért a tapasztalt serkentés a ciklikus elektron áramlás felerősödésével hozható összefüggésbe. Az Lhcb7 mrns szintje Cd-stressz hatására kísérletünk minden mintájában megemelkedett. Az Lhcb7 mrns-ek jelenlétét csak a fénynek leginkább kitett, oszlopos parenchima sejtekben mutatták ki. Ezért feltételezhetően szerepe lehet a többlet fénnyel szembeni védelemben, bár jelenlétét a PSII-ben még nem bizonyították. Cd-stressz hatására két eltérő fejlettségű levélmintában emelkedett meg az Lhcb8 transzkripciója, ami 7
alapján arra következtetünk, hogy a levél fejlődési állapota a többi Lhc-től eltérően szabályozza transzkripcióját és a stresszre is tőlük eltérően reagál. A tilakoid komplexek Lhc fehérje-összetételének vizsgálata és a génexpressziós eredmények alapján valószínűsítjük, hogy az Lhc fehérjék mennyiségének szabályozása legfőképp a transzkripción keresztül valósul meg. Az akklimatizáció során megvalósuló kooperációjuk vélhetően a közös transzkripciós szabályozásnak köszönhető. Az eltérő szabályozás alá eső Lhc fehérjékről pedig feltételezzük, hogy kivételezett funkciót tölthetnek be a fotoszintetikus apparátus alkalmazkodásában. Hivatkozások: de las Rivas J, Abadía A, Abadía J, 1989, Plant Physiol. 91: 190 192. Hendrickson L, Förster B, et al., 2005, Photosynth. Res. 84: 43 49. Jansson S, Stefánsson H, et al., 1997, Biochm. Biophys. Acta 1320: 297-309. Laemmli UK, 1970, Nature 227: 680-685. Libus J, Štorchová H, 2006 Biotechniques 41: 156-164. Porra RJ, Thompson WA, et al., 1989, Biochim. Biophys. Acta 975: 384-394. Ramakers C, Ruijter JM, et al., 2003, Neurosci. Lett. 339: 62-66. Sárvári É, Nyitrai P, 1994, Electrophoresis 15: 384-394. Schägger H, von Jagow G, 1991, Anal. Biochem. 199: 223-231. A tézisek alapjául szolgáló közlemények listája A. Referált tudományos folyóiratokban megjelent dolgozatok Solti Á, Szűcs J, Basa B, Sárvári É (2009) Functional and organisational change of photosystem II in poplar thylakoids under Cd stress (Dissipative PSII centres in Cd treated poplar thylakoids). Cer. Res. Commun., 37S, 525-528. IF: 0 Basa B, Solti Á, Sárvári É, Tamás L (2009) Housekeeping gene selection in poplar plants under Cd-stress: comparative study for real-time PCR normalization. Funct. Plant. Biol., 36, 1079-1087. IF: 1.678 Sárvári É, Solti Á, Basa B, Mészáros I, Lévai L, Fodor F (2011) Impact of moderate Fe excess under Cd stress on the photosynthetic performance of poplar (Populus jaquemontiana var. glauca cv. Kopeczkii). Plant Physiol. Biochem., 49, 499-505. IF: 2,485 8
B. Cikkek konferenciakiadványokban Szegi P, Basa B, Solti Á, Gáspár L, Lévai L, Láng F, Tamás L, Mészáros I, Sárvári É (2007) Time course of the appearance of Cd effects on photosynthetically competent poplar leaves. In: Allen JF, Gantt E, Golbeck JH, Osmond B, eds., Photosynthesis. Energy from the Sun: 14 th International Congress on Photosynthesis, Glasgow, pp. 1511 1514. C. Összefoglalók referált folyóiratokban Basa B, Gárdonyi M, Sárvári É, Tamás L (2007) Cd-induced changes in the expression of chlorophyll-protein-complexes in Populus glauca. (Abstracts of 2 nd World Conference of Stress, 23-26 August 2007 Budapest, Hungary) published online in: Budapest Meeting Abstracts. 2007. Cell Stress Chaperones online 12: 4G-03-P. IF: 3.097 D. Összefoglalók konferenciakiadványokban Sárvári É, Gáspár L, Szegi P, Basa B, Solti Á, Nyitrai P, Mészáros I (2006): Photosynthetic acclimation under Cd stress in poplar. In: Book of Abstracts of XV. FESPB Congress, Lyon, France, RAS02-118.Sárvári É, Solti Á, Basa B, Abadía J, Fodor F (2010) Effect of Cd and Zn treatment and Fe deficiency on chloroplast Fe uptake. In: Program and abstracts of the 15 th International Symposion on Iron nutrition and Interactions in Plants p. Budapest, 107. S3P24. Basa B, Sárvári É, Tamás L (2009) Validation of reference genes in poplar under Cd stress. In: Abstracts of Int. Conf. on Plant Abiotic Stress Tolerance. Vienna, Austria, p. 108. Basa B, Solti Á, Sagardoy R, Abadía J, Sárvári É (2010) Compositional changes in the thylakoid complexes under Cd toxicity and iron deficiency studied by 3D electrophoresis and high pressure liquid chromatography techniques In: Program and abstracts of the 15 th International Symposion on Iron nutrition and Interactions in Plants p. Budapest, 135. S5P11. Basa B, Solti Á, Sárvári É, Tamás L (2010): Changes in the transciptional profile of the genes coding for the light harvesting complex proteins under Cd stress in poplar. In: Book of Abstracts of the FESPB 2010 - XVII. Congress of the Federation of European Societies of Plant Biology P01-121. Basa B, Ross K, Solti Á, Szabó K, Sárvári É (2010) Cd induced changes in the organization of chlorophyll-protein complexes in thylakoids and thylakoid domains of poplar. In: Photosynthesis Research for Food, Fuel and the Future, Abstract Book of the 15 th International Congress of Photosynthesis, p. 263 (PS18.41). 9