ALP. foszfát + p-nitrofenol. Mg 2+ Dietanol-amin puffer ph 9,8 1,0 mol/l. detergens és stabilizátor 0,1% 2. Reagens 2

Átírás

1 ALKALIKUS FOSZFATÁZ (ALP) Ortofoszforsav monoészter foszfohidroláz EC in vitro DIAGNOSZTIKAI REAGENS KÉSZLET Optimalizált DGKC módszer Liquid 2 reagens (5+1) Cikkszám: Kiszerelés: 6 x 100 ml 5 x 100 ml Reagens 1 1 x 100 ml Reagens 2 Cikkszám: Kiszerelés: 2 x 120 ml 2 x 100 ml Reagens 1 2 x 20 ml Reagens 2 A felhasználás célja In vitro diagnosztikai reagens készlet az alkalikus foszfatáz (ALP) enzim aktivitásának mennyiségi meghatározására humán szérumból és plazmából. Alkalmazási terület Az ALP működéséhez az optimális ph érték 10 körül van in vitro. Az enzim gyakorlatilag mindenféle szövetben előfordul, különösen nagy mennyiségben található a májban, a csontokban, a placentában, a bélhámsejtekben és a vesetubulusokban. A normál humán szérumban főként a máj és a csont eredetű ALP található. A kettő közötti relatív megoszlást jelentősen befolyásolja a vizsgált személy életkora és neme. A szérum ALP meghatározásnak különleges haszna van a hepatobiliaris betegségek és egyes, fokozott osteoblast aktivitással járó csontbetegségek vizsgálatában. Extrahepatikus elzáródás esetén az enzim aktivitása nagyobb mértékben emelkedik, mint intrahepatikus elzáródásban, és kifejezettebb teljes elzáródás esetén. A csontbetegségek közül a legnagyobb ALP aktivitás növekedést találjuk Paget kórban. Csak mérsékelten emelkedik meg az enzim aktivitása osteomalaciában, és általában normális oteoporosisban. Rachitis esetén 2-4- szeres aktivitás fokozódást látunk, ami csak lassan normalizálódik a D vitamin kezelés kapcsán. Enyhe vagy mérsékelt emelkedést láthatunk Fanconi szindrómában, valamint primer és szekunder hyperparathyroidismus eseteiben. A normál két háromszorosa fordulhat elő a terhesség utolsó harmadában. Egyes rosszindulatú daganatos betegek szérumában a placenta eredetű izoenzim jelenhet meg. A daganatok ugyanakkor képesek más izoenzimek módosult formáit is előállítani. Módszer Kolorimetriás, standardizált kinetikus módszer. Magnézium és cink ionok jelenlétében a p-nitrofenil foszfát hidrolizálódik, alkalikus foszfatáz enzim segítségével p-nitrofenol és foszfát keletkezik. A p- nitrofenol képződés egyenesen arányos az ALP aktivitással, ami fotometriásan mérhető. p-nitrofenil foszfát + H2O Reagensek Reagensek leírása foszfát + p-nitrofenol A reagensek koncentrációi az inkubációs elegyben 1. Reagens 1 Dietanol-amin puffer ph 9,8 1,0 mol/l magnézium-szulfát 0,6 mmol/l detergens és stabilizátor 0,1% 2. Reagens 2 p-nitrofenil foszfát stabilizátor Munkaoldat készítése Szubsztrát start 2,0 mmol/l A Reagens 1 és Reagens 2 használatra kész. Felnyitás nélkül a reagensek 2 8 C-on tárolva felhasználhatók a dobozon ill. címkén feltüntetett időpontig. Stabilitás a reagenstérben: Reagens 1 14 nap Reagens 2 14 nap ALP Mg 2+ Keverjünk össze 5 térfogat Reagens 1-et és 1 térfogat Reagens 2-t. (Pl.: 5 ml Reagens 1 és 1 ml Reagens 2) Felhasználható: Szérum, Heparin-plazma. Felhasználható: Mérés Hullámhossz: Hg 405 nm ( nm) Fényút: 1 cm Hőmérséklet: 37 C Eljárás Szubsztrát start C-on tárolva 4 napig 2 8 C-on tárolva 60 napig C-on tárolva 2 napig 2 8 C-on tárolva 7 napig -20 C-on tárolva 4 hétig Küvettába pipettázunk Reagens 1 1,00 ml 0,02 ml Reagens 2 0,20 ml Jól összekeverjük, majd 1 perc múlva leolvassuk az abszorbanciát (A). A leolvasást pontosan 1, 2 és 3 perc után megismételjük. Küvettába pipettázunk Munkaoldat (37 C) 1,00 ml 0,02 ml Jól összekeverjük, majd 1 perc múlva leolvassuk az abszorbanciát (A). A leolvasást pontosan 1, 2 és 3 perc után megismételjük.

2 Számolás Az enzimaktivitást a A/perc értékből számítjuk. Szubsztrát start: ALP aktivitás (U/l) 3298 x A/ perc ALP aktivitás (U/l) 2757 x A/ perc Linearitás A módszer U/l tartományban lineáris, magasabb aktivitás értékeknél a mintát 1:4 arányban fiziológiás sóoldattal hígítjuk és a mérést megismételjük. Az eredményt 5-tel szorozzuk. Referencia értékek Férfi (37 C-on) Nő (37 C-on) 270 U/l 240 U/l Minden laboratóriumnak ellenőriznie kell a normál értékek alkalmazhatóságát a saját betegpopulációjára és ha szükséges, saját referencia tartományt is meg kell határoznia. Az ALP teszt eredményét mindig a beteg kórelőzményével, a klinikai képpel és a beteg egyéb laboratóriumi eredményeivel összevetve kell értékelni. Analitikai érzékenység Detektálási limit: Precizitás 5 U/l A reprodukálhatóság napok közötti (between day) mérési eredményeit humán szérumokkal és kontoll szérumokkal mérve, az alábbi táblázat foglalja össze (n=20): Between day Átlag U/l SD U/l CV % 1 143,1 2,3 1, ,4 6,6 1, ,2 5,9 1,32 Összehasonlító mérések Az ALP tesztet (y) összehasonlítva más, a kereskedelemben kapható, ugyanezen a meghatározási elven működő teszttel (x), az alábbi egyezés figyelhető meg (n=80): y = 0,992x + 2,64 r = 0,991 Minőségi ellenőrzés Minden kontroll szérummal, amely ezt a módszert alkalmazza. Ajánlott: Reanorm U (cikksz.: ) Reapath U (cikksz.: ) REA-kon I. (cikksz.: ) REA-kon II. (cikksz.: ) A teszt korlátai, interferenciák A teszt mérési eredményeit a bilirubin 60 mg/dl (1020 mol/l), a hemoglobin 1000 mg/dl (0.625 mmol/l) valamint a trigliceridek 2000 mg/dl (22,8 mmol/l) koncentrációig nem befolyásolja. A turbiditás és a trigliceridek közötti korreláció minimális. Tárolás, stabilitás Felnyitás nélkül a reagensek 2 8 C-on tárolva felhasználhatók a dobozon ill. a címkén feltüntetett időpontig. Fagyasztani tilos! A reagens flakonokat használat után azonnal zárjuk le! Irodalom 1. Bablok W et al.: General Regression Procedure for Method Transformation. J Clin Chem Clin Biochem 1988;26: Bessey OAH et al.: J.Biol.Chem. 1946;164: Empfehlungen der Deutschen Gessellschaft für Klinische Chemie. Standard-Methode zur Bestimmung der Aktivitat der alkalischen Phosphatase. Z.klin.Chem u klin.biochem. 1972;10: Glick MR, Ryder KW, Jackson SA. Graphical Comparisons of Interferences on Clinical Chemistry Instrumentation. Clin Chem 1986; 32: Greiling H,Gressner AM (Hrsg.). Lehrbuch der Klinischen Chemie und Pathobiochemie, 3 rd. Stuttgart/New York: Schattauer Verlag, Guder WG, Narayanan S, Wisser H, Zawta B. List of Analytes Preanalytical Variabled. Brochure in: s From the Patient to the Laboratory. Darmstadt: GIT-Verlag, Hausamen TU et al. Clin.Chim.Acta 1967;15: Passing H, Bablock W. A New Biometrical Procedure for Testing the Equality of Measurements from Two Different Analytical Methods. J Clin Chem Clin Biochem 1983; 21: Rosalki SB, Foo AZ, Burlina A et al..: Multicenter Evaluation of Iso ALP Test Kit for Measurement of Bone Alkaline Phosphatase Activity in Serum and Plasma. Clin.Chem. 1993;39: Reg.sz.: HU/CA01/2332/05 Reg.sz.: HU/CA01/4612/05 REANAL FINOMVEGYSZERGYÁR RÉSZVÉNYTÁRSASÁG 1147 Budapest, Telepes u. 53. Tel.: , Telefax: májuss

3 ALKALINE PHOSPHATASE (ALP) EC For in vitro DIAGNOSTIC REAGENT KIT Optimized DGKC method Liquid 2 reagent (5+1) Cat. No.: Package: 6 x 100 ml 5 x 100 ml Reagent 1 1 x 100 ml Reagent 2 Cat. No.: Package: 2 x 120 ml 2 x 100 ml Reagent 1 2 x 20 ml Reagent 2 Intended use In vitro diagnostic reagent kit for the quantitative determination of alkaline phosphatase (ALP) activity in human serum and plasma. Summary ALP has a ph optimum of about 10 in vitro. The enzyme is present in practically all tissues of the body, and it occurs at particularly high levels in liver, bone, placenta, intestinal epithelium and kidney tubules. The predominant forms present in normal human serum can be chartacterized as the liver and bone variants. The respective contributions of these two forms to the total activity are markedly influenced by age and gender. Serum ALP measurements are of particular interest in the investigation of hepatobiliary diseases and bone disease associated with increased osteoblastic activity. The elevation in enzyme activity is higher in extrahepatic obstruction, than in intrahepatic obstruction, and is greater when the obstruction is more complete. Among bone diseases, the highest levels of serum ALP activity are encountered in Paget s disease. Only moderately increased values are observed in osteomalacia and levels are generally normal in osteoporosis. In rickets, levels two to four times normal can be observed, and these fall slowly to normal on treatment with vitamin D. Slight to moderate elevations are associated with Fanconi s syndrome, primary and secondary hyperparathyoidism. An increase of up to two to three times normal may be observed in the third trimester of pregnancy. Placental isoenzymes may appear in the sera of some cancer patients. Tumors may also produce modified forms of nonplacental isoenzymes. Method Colorimetric kinetic assay in accordance with a standardized method. In the presence of magnesium and zinc ions, p- nitrophenyl phosphate is hydrolyzed by alkaline phosphatase to form phosphate and p-nitrophenol. The p-nitrophenol released is proportional to the ALP activity and can be measured photometrically. p-nitrophenilphosphate + H 2 O Reagents Reagents description Phosphate + p-nitrophenol Reagent concentration in the incubation mixture 1. Reagent 1 Diethanolamine buffer ph mol/l Magnesiumsulfate 0.6 mmol/l Detergents and stabilizers 0.1% 2. Reagent 2 p-nitrophenylphosphate Stabilizer Preparation and stability of reagent solution Substrate start 2.0 mmol/l Reagents (Reagent 1 and Reagent 2) are ready for use. The unopened reagents are stable up to the expiry date on the label when stored at 2 8 C. Onboard stability: Reagent 1 14 days Reagent 2 14 days ALP Mg 2+ start Prepare working reagent, mix 5 volumes of Reagent 1 with 1 volume of Reagent 2. (e.g.: 5 ml Reagent 1 and 1 ml Reagent 2) The working solution is stable up to: 60 days at 2 8 C 4 day at C Serum, Heparinized plasma Stability: 2 days at C 7 days at 2 8 C 4 weeks at 20 C Assay Wavelength: Hg 405 nm ( nm) Light path : 1 cm Temperature: +37 C Procedure Substrate start Pipette into cuvette Reagent ml 0.02 ml Reagent ml Mix, read the initial absorbance and start stopwatch simultaneously. Read again after exactly 1, 2 and 3 minutes and calculate A. start Pipette into cuvette Working solution 1.00 ml 0.02 ml Mix, read the initial absorbance and start stopwatch simultaneously. Read again after exactly 1, 2 and 3 minutes and calculate A.

4 Calculation Enzyme activity is calculated from the mean A/min. Substrate start: ALP activity (U/l) 3298 x A/ min start: ALP activity (U/l) 2757 x A/ min Linearity Measuring range: U/l In case of higher activity values, dilute sample 1:4 with NaCl solution and repeat the test. Multiply the result by 5. Reference values Men (37 C) Women (37 C) 270 U/l 240 U/l Each laboratory should investigate the transferability of the expected values to its own patient population and if necessary determine its own reference range. For diagnostic purposes the ALP results should always be assayed in conjunction with the patient s medical history, clinical examinations and other findings. Analytical sensitivity (lower detection limit) Detection limit: Precision 5 U/l Reproducibility was determined using human samples and controls. The following results were obtained (n=20): Between day Mean U/l SD U/l CV % Method comparison A comparison of the Alkaline phosphatase kit (y) with a commercial obtainable assay (x) gave the following result (n=80): y = 0.992x r = Quality control Any control serum is applicable to this method. Recommended: Reanorm U (Cat. No.: ) Reapath U (Cat. No.: ) REA-kon I. (Cat. No.: ) REA-kon II. (Cat. No.: ) Limitations and interferences No significant interference up to an approximate conjugated and unconjugated bilirubin concentration 60 mg/dl (1020 mol/l), approximate hemoglobin concentration 1000 mg/dl (0.625 mmol/l) and approximate triglycerides concentration 2000 mg/dl (22.8 mmol/l). There is poor correlation between turbidity and triglycerides concentration. Storage, stability The reagents are stable up to the expiry date on the box and label when stored at 2-8 C. Do not freeze! The reagent bottles should be closed immediately after use. Reference 1. Bablok W et al.: General Regression Procedure for Method Transformation. J Clin Chem Clin Biochem 1988;26: Bessey OAH et al.: J.Biol.Chem. 1946;164: Empfehlungen der Deutschen Gessellschaft für Klinische Chemie. Standard-Methode zur Bestimmung der Aktivitat der alkalischen Phosphatase. Z.klin.Chem u klin.biochem. 1972;10: Glick MR, Ryder KW, Jackson SA. Graphical Comparisons of Interferences on Clinical Chemistry Instrumentation. Clin Chem 1986; 32: Greiling H,Gressner AM (Hrsg.). Lehrbuch der Klinischen Chemie und Pathobiochemie, 3 rd. Stuttgart/New York: Schattauer Verlag, Guder WG, Narayanan S, Wisser H, Zawta B. List of Analytes Preanalytical Variabled. Brochure in: s From the Patient to the Laboratory. Darmstadt: GIT-Verlag, Hausamen TU et al. Clin.Chim.Acta 1967;15: Passing H, Bablock W. A New Biometrical Procedure for Testing the Equality of Measurements from Two Different Analytical Methods. J Clin Chem Clin Biochem 1983; 21: Rosalki SB, Foo AZ, Burlina A et al..: Multicenter Evaluation of Iso ALP Test Kit for Measurement of Bone Alkaline Phosphatase Activity in Serum and Plasma. Clin.Chem. 1993;39: Reg. No.: HU/CA01/2332/05 Reg. No: HU/CA01/4612/05 REANAL FINECHEMICAL Co Budapest, Telepes u. 53. HUNGARY Phone: , , Fax: May 2006

5