INR Kalibrátor készlet in vitro diagnosztikai célra. REAGENSEK A reagens leírása FELHASZNÁLÁS CÉLJA. Reagens oldat készítése A MEGHATÁROZÁS ELVE

Átírás

1 Kalibrátor készlet in vitro diagnosztikai célra Cikkszám: FELHASZNÁLÁS CÉLJA Kiszerelés: 4 x 1 ml A kumarinnal vagy a kumarin-származékokkal végzett orális antikoaguláns terápiát általában a Protrombin idő (PI) meghatározásával ellenőrzik. Az Egészségügyi Világszervezet (WHO) ajánlása, hogy a PI vizsgálat mérési eredményeit másodpercek helyett -ben (Nemzetközi Normalizált Arányszám) adják meg. 1 A PI eredmények megadhatók protrombin aktivitás %-ban is, azonban ez a módszer az értékek bevezetésével egyre inkább túlhaladottá válik. Nem ajánlott. Az Kalibrátor készlet alkalmas: 1. a beteg értékének meghatározására közvetlenül az kalibrációs görbe segítségével, 2. a beteg PI eredményének megadására protrombin aktivitás %-ban, grafikus módszerrel, 3. a laboratórium saját, helyi ISI értékének (Nemzetközi Szenzitivitási Index) meghatározására, figyelembe véve a PI teszt méréséhez felhasznált reagenseket és mérőberendezéseket. A MEGHATÁROZÁS ELVE Az orálisan alkalmazott kumarin vagy kumarin származékok csökkentik a K-vitamin függő véralvadási faktorok - a Faktor II, VII, IX, X, a Protein C, a Ptotein S és a Protein Z - aktivitását. Az FII, FVII, és FX kumarinnal indukált aktivitás csökkenése meghosszabbítja a Protrombin időt. A tromboplasztin reagensek különbségei valamint az eltérő végpont meghatározási módszerek miatt a PI teszt eredményei változhatnak. A WHO támogatásával kidolgozták az ISI/-meghatározási rendszert, amely egy módszer a PI vizsgálati eredmények normalizálására. 1 Az -t (International Normalised Ratio), amely egy arányszám, úgy számítják ki, hogy a beteg protrombin idő (PI) értékét elosztják a laboratóriumban mért normál PI átlagával (MNPI), majd az így kapott hányadost a teszt mérése során használt, a kereskedelemben kapható tromboplasztin reagens rendszerspecifikus ISI-jének hatványára emelik. 2 ( = R ISI R= PI / MNPI) Az ISI (International Sensivity Index) vagy Nemzetközi Érzékenységi Index a tromboplasztinok/mérőműszerek érzékenységének mértéke az extrinzik alvadási út kumarin indukálta alvadáscsökkenésével szemben és kalibrációja a nemzetközi referencia tromboplasztinhoz való hasonlítással/viszonyítással állapítható meg. A legújabb vizsgálatok eredményei azt mutatják, hogy a kalibrációs plazmák alkalmazásával növelhető a helyi ISI értékek meghatározási pontossága, ezáltal javítani lehet az értékek valódiságát és le lehet egyszerűsíteni annak meghatározását. 3,4 A PI normalizálásának egy másik széles körben elterjedt módszere a vizsgálati eredmények megadása a normál érték %-ában. A kalibrációs görbe elkészítéséhez kevert, gyűjtött normál plazma fiziológiás sóoldattal vagy Imidazol pufferrel elkészített különböző higítású oldatait használják. Minden egyes higított plazma alvadási idejét mérik (sec), majd a kapott protrombin időket ábrázolják a plazma koncentráció százalék reciprokának függvényében. A beteg mintájának százalékos aktivitás értéke közvetlenül leolvasható a görbéből. REAGENSEK A reagens leírása Az Kalibrátor készlet tartalma 4 x 1 ml liofilizátum. Minden egyes üveg citráttal gátolt, humán eredetű normál ill. kumarinos plazmákból készült, puffer oldatok és stabilizátorok felhasználásával. Az üvegek 4 különböző szintet tartalmaznak, az 1. számú szint megfelel egy normál vagy közel normál protrombin időnek, míg a számú szintek a növekvő kumarinos antikoaguláció növekvő protrombin idő értékeinek felelnek meg. Minden egyes szintet manuális vizsgálati módszerrel, nemzetközi referens tromboplasztin minták segítségével határozták meg. A reagensek specifikus százalékos aktivitás értékeit szintén kereskedelmi forgalomban lévő tromboplasztin reagensekkel határozták meg. Az értékek valamint a százalékos aktivitás értékek specifikusak, az adott gyártási számra vonatkozó mért értékek, amelyeket a Meghatározott Értékek részben, táblázatban adunk meg. Reagens oldat készítése Minden egyes üveg tartalmát 1,0 ml ionmentes vagy desztillált vízben oldjuk. Óvatosan keverjük össze és a teljes oldódás eléréséig 30 percen át tartsuk szobahőmérsékleten. Nem szabad erőteljesen rázni, kerülni kell a habképződést! Közvetlenül a felhasználás előtt a reagenst még egyszer óvatosan keverjük fel. Felhasználható: 15 25ºC-on (lezárt állapotban) 4 óráig Onboard (nyitott állapotban) 4 óráig 20ºC-on tárolva 2 hétig A rekonstituált plazma lefagyasztható, de a fagyasztott minták csak egyszer engedhetők fel közvetlenül a felhasználás előtt. A fagyasztást ill. a felolvasztást jól zárt edényben és gyorsan végezzük a minőségromlás elkerülése miatt! A fagyasztott, rekonstituált plazma felengedését a lehető leggyorsabban, 37ºC-os vízfürdőben kevesebb, mint 10 perc alatt végezzük el, majd hagyjuk a mintát szobahőmérsékleten állni legalább 15 percig. ELJÁRÁS Az kalibrációs készlettel ugyanazokat a meghatározásokat kell elvégezni, mint a beteg friss citrátplazmájával, azonos módszert, ugyanazt a mérő műszert és reagenseket alkalmazva. A rendszert minden új tromboplasztin sarzs esetében kalibrálni kell, valamint el kell végezni a kalibrációt abban az esetben is ha a kontrollminta mért értékei kiesnek a referencia tartományból vagy a mérőműszeren nagyobb javítási, karbantartási munkák folytak. Ajánlatos több párhuzamos kalibrációt elvégezni, és a mérések során kapott eredményeket átlagolni, majd a protrombin idők átlagát felhasználva elkészíteni a kalibrációs görbét.

2 A beteg értékének meghatározása kalibrációs görbe felhasználásával Az kalibrációs görbét log-log diagramban készítjük el, minden egyes kalibrációs plazma esetén ábrázoljuk a mért átlag protrombin időket (sec) a hozzájuk tartozó értékekkel szemben. A kalibrációs pontokra lineáris regresszióval illesztett egyenes meredekségéből és tengelymetszetéből számítható a beteg értéke. A fenti módon elkészített kalibrációs görbéből grafikusan is meghatározható a beteg ismeretlen értéke, a beteg mintájából mért protrombin időt (sec) ismerve, a görbéről leolvasható a hozzátartozó megfelelő érték. (Példa: 1.ábra Interpolációra nem alkalmas!) 1.ábra kalibrációs görbe A helyi, laboratóriumi ISI értéke grafikusan is meghatározható, egy kétszeresen logaritmikus skálájú görbéből. A kalibrációs pontokat ábrázoljuk egy olyan diagramban, ahol az értékek a vízszintes tengelyen, a protrombin idők (PI) a baloldali függőleges tengelyen találhatók. Az egyenest a négy kalibrációs adatpontra illesztjük és kiterjesztjük mindkét irányban; balra a függőleges vonalig 1,0-hez, míg jobbra egészen az Y- tengelyig. Azt a távolságot, amely függőleges irányban az =1,0-nél az illesztett egyenest metszi (a PI 10 sec-nál és 1,0-nél), OFFSET értéknek nevezik és megmérik. Az ISI értékek a jobb oldali Y-tengelyen találhatóak. A helyi, laboratóriumi ISI érték meghatározása úgy történik, hogy megkeresik azt a pontot az ISI skálán, ahol az illesztett egyenes meghosszabbítása metszi azt, majd a metszésponttól lefelé függőleges irányban rámérik az OFFSET távolságot (=1,0-nél mért táv), leolvassák az ISI értéket (Példa: 2. ábra, ISI=1,25. Interpolációra nem alkalmas!). PI (sec) PI (sec) ISI 2.ábra Helyi, laboratóriumi ISI meghatározása grafikus módszerrel PI (sec) ISI A helyi, laboratóriumi ISI meghatározása A tromboplasztin reagensek laboratóriumi, helyi ISI értéke matematikai úton kiszámítható. Átalakítjuk az meghatározási képletet, majd megoldjuk az ISI-re. A számításokhoz felhasználjuk minden kalibrációs plazma esetében a mért átlag protrombin időket a hozzájuk tartozó értékekkel valamint a laboratórium saját mért átlag protrombin idejét (MNPI). (Példa: 1. táblázat) 1. táblázat Példa a helyi, laboratóriumi ISI számítására (Csak összehasonlítás céljára használható, számítások végzésére nem alkalmas!) Üveg PI (sec) ISI (spec) ISI (beszúrt) 1, ,01 12,5 MNPI 12,45 sec 2. 1,75 19,8 1, ,9 30,9 1, ,4 43,8 1,20 Átlag 1,19 Kalibrációs görbe A beteg eredményeinek megadása protrombin aktivitás %-ban A PI aktivitását százalékban, a kalibrátorok PI értékének és a hozzá tartozó normál érték % reciprokának lineáris regressziójából számítjuk ki. A kalibrációs görbe grafikus megadásakor a függőleges (y) tengelyen az egyes kalibrátorok PI idejét (sec) adjuk meg, míg a vízszintes (x) tengelyen a megfelelő százalékos aktivitás értékek reciproka van feltüntetve (1/%PNP). Ezután minden egyes kalibrátor értékét ábrázoljuk a grafikonban és egyenest illesztünk a négy adatponthoz. Ezt követően a beteg PI eredménye %-ban leolvasható a görbéről (Példa: 3. ábra Interpolációra nem alkalmas!). 3.ábra Kalibrációs görbe a beteg PI eredményének megadására PI aktivitás %-ban Log ISI = Log PI Log MNPI PI (sec) % PI (sec) Helyi, laboratóriumi ISI: a rendszer számított ISI átlagértéke, a 2., 3., és 4. kalibrációs szintek felhasználásával. Megjegyzés: a számított helyi ISI érték nem tartalmazza a 1. kalibrációs szintet. 1 / % PNP

3 MEGHATÁROZOTT ÉRTÉKEK Az Kalibrátor készlet négy különböző kalibrátorának értékeit és százalékos aktivitás értékeit az alábbi táblázat tartalmazza (a táblázat értékei gyártási tételenként változnak, az adott gyártási számú készletre vonatkoznak): Gyártási szám: KTB Lejárati idő: Kalibrátor szintek érték 1 % % % érték 2 aktivitás 3 aktivitás 4 aktivitás 5 1. szint 1,09 1, szint 1,54 1, szint 2,55 2, szint 3,51 3, az ERM/149 Nyúlagy IRP Tromboplasztin értéke, amely nyúlagy eredetű nemzetközi referens tromboplasztin készítmény és nyúlagy tromboplasztinokhoz használható az RTF/95 Human IRP tromboplasztin értéke, amely humán rekombináns eredetű nemzetközi referens tromboplasztin készítmény és humán rekombináns tromboplasztinokhoz használható TromboMAX százalékos aktivitás értéke Reaplasztin százalékos aktivitás értéke TromboMAX -HS százalékos aktivitás értéke A százalékos aktivitás értékeket AMAX 190/200 Plus TM készülékkel, mechanikusan határozták meg. A TESZT KORLÁTAI, INTERFERENCIÁK Minden mérési eredmény a vizsgáló rendszer korlátainak a függvénye. Mindig figyelembe kell venni az összes alkalmazási utasítást, a mérőműszerek-, valamint a reagens gyártók/szállítók utasításait, valamint a karbantartás, a kalibráció, az eltarthatóság és az üzemelés előírásait. A preanalitikai valamint az analitikai változók befolyásolhatják a mérési eredményeket, ezért ezeket a külső tényezőket minimalizálni kell. A pontos értékek meghatározásához fontos hogy a méréshez felhasznált laborspecifikus MNPI-t (a laboratórium által meghatározott/mért érték), a módszerspecifikus ISI-t (gyártó által megadott érték) valamint a beteg minta PI-jét, a lehető legnagyobb pontossággal és alapossággal határozzuk meg. A laboratóriumra jellemző átlag normál PI-t (MNPI) minimum 20 normál, egészséges donor mintájából kell meghatározni, ugyanazzal a módszerrel és mérőműszerekkel, reagensekkel elvégezve mint a beteg minták esetében. Gyűjtött normál plazma PI-jének vagy a normál kontroll plazma PI-jének az alkalmazása valós MNPI helyett nem megengedett, nem használható, hibás eredményekhez vezethet az eredményekben. A kalibrációs görbék érvényessége, valódisága csakis a megfelelő kontrollanyagok alkalmazásával érhető el. A felhasználónak azonban minden esetben magának kell eldöntenie, hogy a termékek alkalmazása és alkalmassága megfelel-e az ő sajátos felhasználási igényeinek. TÁROLÁS ÉS STABILITÁS 2 8ºC-on tárolva felhasználható a dobozon ill. a címkén feltüntetett időpontig. MEGJEGYZÉS A készítményben kiszerelésre került plazmákat FDA által elfogadott módszerrel tesztelték HIV I és HIV II vírusra, Hepatitis B felületi antigénre (HBsAg), Hepatitis C (HCV) vírusra és negatívnak találták. A donorokat szűrték Creutzfedt-Jacob kórra (CJD) és a Creutzfedt-Jacob kór új variánsára (nvcjd) is, a két kórkép nem volt kimutatható. Mindezek mellett egy esetleges fertőzés lehetősége természetesen nem zárható ki. Mint minden humán eredetű anyag, ez a termék is potenciálisan fertőző anyagnak tekintendő. Minden biológiai anyagot tartalmazó hulladékot megfelelően jelölve, és egyéb hulladékoktól elkülönítve kell tárolni. A hulladék-kezelésre ezen túlmenően a nemzetközi, országos illetve helyi szabályok vonatkoznak. Irodalom 1. WHO Expert Committee on Biological Standardization. Thirty-third Report. Technical Report Series 687, page 83-85, Loeliger EA, ISTH/ICTH Recommendations for Reporting Prothrombin Time in Oral Anticoagulant Control, Thrombosis and Haemostasis 53:155, Craig S, Stevenson KJ, Dufty JMK, and Taberner DA, Local correction: justification for a simplified approach, J. Clin. Pathol. 50:783, Houbouyan, LL, and Goguel AF, Long-term French experience in Standardization by a procedure using plasma calibrants, Am. J. Clin. Path. 108:83, 1997 Reg.sz.: HU/CA01/5091/05 REANAL.FINOMVEGYSZERGYÁR RÉSZVÉNYTÁRSASÁG 1147 Budapest, Telepes u. 53. Tel.: , Telefax: január

4 MELLÉKLET SEGÉDGRAFIKON A HELYI, LABORATÓRIUMI ISI MEGHATÁROZÁSÁHOZ

5 Cat. No.: INTENDED USE CALIBRATOR SET in vitro diagnostic use Package: 4 x 1 ml Monitoring of coumarin or coumarin-like oral anticoagulant therapy is generally performed with the Prothrombin Time (PT) test. The World Health Organization (WHO) recommends normalizing and reporting the results of the PT test as an rather than seconds. 1 The PT may also be reported in a normalized format as a Percent Activity. Calibrator Set may be used to: 1. Determine the patient s directly by establishing an calibration curve. Determine the patient s Percent Activity directly by establishing a Percent Activity curve. 2. Determine a local ISI value of the measurement reagent/instrument system used in the PT test. PRINCIPLE OF THE METHOD Coumarin or coumarin_like oral anticoagulant drugs reduce the activity of the vitamin K-dependent clotting factors II, VII, IX, X, Protein C, Protein S, and Protein Z. Coumarin induced reductions in factors II, VII, and X prolong the PT test. PT test results can vary due to differences in the thromboplastin reagent and end-point detection method. The ISI/ reporting system was developed under the auspices of the WHO as a method to normalize PT results. 1 The is calculated as the ratio of the patient PT compared to the Mean Normal Prothrombin Time (MNPT) established in each laboratory, then raised to the power of the system specific ISI of the commercial thromboplastin/instrument used in the assay. 2 The ISI is a measure of the sensivity of the thromboplastin/instrument system to coumarin-induced deficiencies in the extrinsic pathway of coagulation, and is established by calibration to a recognized International Reference Preparation thromboplastin. Recent publications indicate the use of calibrant plasmas may improve accuracy of the local ISI, and thus improve and simplify the determination of s. 3,4 A second widely used method of normalizing the PT is the Percent Activity system. In this system dilutions of pooled normal plasma (PNP) in saline or buffer are prepared, the PT clotting time of each dilution is measured, and a standard curve relating the reciprocal concentration of PNP to the clotting time is determined (1/%PNP versus PT). The patient Percent Activity is then read directly from this curve. Activity values are assigned for selected commercial thromboplastins. The value assignments for this lot of Calibrators are listed in the Assigned Values section of this product data sheet. Reagent Preparation Reconstitute each vial with 1.0 ml deionized or distilled water. Mix gently and allow to stand at room temperature for 30 minutes for complete dissolution. Do not mix vigorously. Do not cause the reagent to foam. Mix gently prior to use. After reconstitution store: at room temperature (capped) up to 4 hours onboard (uncapped) up to 4 hours at 20ºC (capped) up to 2 weeks Reconstituted plasmas can be frozen and thawed only once prior to use. Rapid freezing and thawing in a tighthly sealed container is essential to ensure the quality of the product. Once frozen, reconstituted plasmas should be thawed rapidly in a +37ºC water bath for less than 10 minutes, then allow to stand at room temperature for at least 15 minutes PROCEDURE Calibrator set should be used in the same manner as freshly drawn citrated patient plasma using the same test procedures, instruments, and reagents. Calibration of the system is recommended with each new lot of thromboplastin, if the controls are out of range, or after each major service intervention. It is recommended that a composite curve be prepared using the average of the PT times obtained from multiple runs. Detemination of patient using an Calibration Curve An calibration curve is established from the relationship between the log of the mean PT of each calibrator versus the log of it s assigned. Patient s may be calculated from the slope and intercept obtained from a linear regression of log PT versus log of the calibrators. Alternativly a graphical curve is determined by fitting a stright line on a log/log plot of calibrator PT versus calibrator. Patient s may then be read off this curve by locating the corresponding PT result and determining the associated. (See figure 1 for an example) Figure 1 Reference curve REAGENTS Reagent Description Calibrator set consists 4 vials of 1ml. Each vial contains 1 ml of freeze-dried human plasma which has been prepared from citrated human normal and coumarin plasmas to which are added buffer and stabilizers. The lyophilized set consists of one vial each of four different levels. Level 1 corresponds to a normal or near-normal PT response, and levels 2 through 4 correspond to increasing levels of coumarin anticoagulation. Each level s is assigned using International Reference Preparation thromboplastins with the manual detection technique. Reagent-specific Percent

6 Determination of local ISI The local ISI of the thromboplastin may calculated by mathematically rearraging the formula for and solving for ISI, using the mean PT of each calibrator, its assigned, and the laboratory s MNTP (see Table 1 for an example). Table 1 Example calculation for local ISI determination Vial PT (sec) ISI (spec) ISI (insert) MNPT sec Mean 1.19 Determination of patient results in Percent Activity Percent Activity calibration curve may be determined grafically. The vertical axis is a linear scale of PT times (sec), and the horizontal axis is a linear scale of the reciprocal of the Percent Activity assignments (1/%PNP). Each calibrator is located on the graph, and a straight line is fitted to the four data points. Patient results in % PT are then read off this curve (see figure 3 for an example). PT (sec) Figure 3 % of Standard curve % PT(sec) Log ISI = Log PT Log MNPT Local ISI: mean of the calculated ISI of the system using calibrator Levels 2, 3, and 4. Note: do not include calibrator Level 1 in calculating the local ISI. Alternativly the local ISI may be determinated grafically using the scaled log/log graph included in this insert. The position of each calibrator is plotted using the scale on the horizontal axis and the PT scale on the left vertical axis. A straight line is fitted to the four data points and extended in both directions to the vertical line corresponding to an of 1.0 and to the right vertical axis. The distance, OFFSET, is measured vertically from cross (PT 10.0 seconds, 1.0) to the intersection of the fitted line with the vertical line at =1.0. A scaled plot of ISI is located on the right vertical axis. The local system ISI is determined by locating the point on the ISI scale asd measured down from the intersection of the fitted line with the right vertical axis by the OFFSET distance (see figure 2 for an example ISI=1.25) ASSIGNED VALUES The assigned values of and Percent Activity for 4 Calibrator Levels of Calibrator Set are listed in the next table (the values are lot-specific): Lot. No.: KTB Exp. Date: Calibrator Levels value 1 1 / % PNP value 2 % activity 3 % activity 4 % activity 5 Level 1 1,09 1, Level 2 1,54 1, Level 3 2,55 2, Level 4 3,51 3, PT (sec) Figure 2 Determination of the system specific ISI by a grafical method ISI value of ERM/149 Rabbit IRP Thromboplastin, which is made from a rabbit brain international reference preparation thromboplastin, and should be used with rabbit brain thromboplastins. value of RTF/95 Human IRP Thromboplastin, which is made from human recombinant international reference preparation thromboplastin, and should be used with human recombinant and placental thromboplastins. Percent Activity value of ThromboMAX Percent Activity value of Thromboplastin-S Percent Activity value of ThromboMAX -HS Calibration curve Percent Activity values assignments were determined with AMAX 190/200 Plus TM in mechanical mode.

7 LIMITATIONS AND INTERFERENCES All test results are subject to the limitations of the test system. Follow all instrument and reagent manufacturer s applications and guidelines for installation, maintenance, calibration, stability and operation. Pre-analytic and analytic variables may influence the results of the test system and should be minimized. Determination of a valid by calculation using the MNPT, the sample PT, and the system ISI requires an accurately calibrated ISI and the laboratory s determination of a valid system specific MNPT. The MNPT should be determined from the geometric mean of a minimum of twenty (20) normal donors collected and tested using the same methods and reagent/instrument system as patient samples. The use of a pooled normal plasma PT or a normal control plasma PT in place of the true MNPT is not acceptable and may cause incorrect results in the. The validity of the calibration curves should be assessed by the use of appropriate controls. STORAGE AND STABILITY All unreconstituted reagents are stable until the expiration date shown on the box and vial labels when stored at 2-8 C. WARNINGS AND PRECAUTIONS Each unit of source plasma used in the preparation of this product has been tested by an FDA approved method for the presence of antibody to Human Immunodeficiency Virus (HIV) Type I and Type II, Hepatitis B surface antigen (HBSAg) as well as for Hepatitis C (HCV) and found negative (not repeatedly reactive). Donors have been screened for Creutzfeldt-Jakob Disease (CJD) and new variant Creutzfeldt-Jakob Disease (nvcjd) and found acceptable. However, since no test method can offer complete assurance that products derived from human blood will not transmit infectious diseases. As with all materials of human origin, this product should be handled as a potentially infectious material. All wastes containing biological material should be properly labelled and stored separately from other wastes. Dispose of all waste materials according to prescribed international, national and local regulations. REFERENCES 1. WHO Expert Committee on Biological Standardization. Thirty-third Report. Technical Report Series 687, page 83-85, Loeliger EA, ISTH/ICTH Recommendations for Reporting Prothrombin Time in Oral Anticoagulant Control, Thrombosis and Haemostasis 53:155, Craig S, Stevenson KJ, Dufty JMK, and Taberner DA, Local correction: justification for a simplified approach, J. Clin. Pathol. 50:783, Houbouyan, LL, and Goguel AF, Long-term French experience in Standardization by a procedure using plasma calibrants, Am. J. Clin. Path. 108:83, 1997 Reg. No.: HU/CA01/5091/05 REANAL FINECHEMICAL Co 1147 Budapest, Telepes u. 53. Tel.: , Telefax: January 2006

8 SUPPLEMENT GRAPHICAL EVALUATION TO DETERMINE SYSTEM SPECIFIC ISI