A búza (Triticum aestivum L.) táplálkozástani értékének javítása géntechnológiai módszerrel

Átírás

1 A búza (Triticum aestivum L.) táplálkozástani értékének javítása géntechnológiai módszerrel c. Doktori (Ph.D.) értekezés tézisei Tamásné Nyitrai Erzsébet Cecília Eötvös Loránd Tudományegyetem, Természettudományi Kar Biológia Doktori Iskola Dr.Erdei Anna Kísérletes növénybiológia PhD program Dr. Szigeti Zoltán Témavezetı Dr. Bedı Zoltán, akadémikus Igazgató MTA Mezıgazdasági Kutatóintézete, Martonvásár

2 BEVEZETÉS A Föld népességének folyamatos növekedése olyan fenntartható, új mezıgazdasági technológiai fejlesztéseket igényel, melyek lehetıvé teszik az élelmiszer-elıállítás közel 50%- os növekedését a következı évben (OECD, 2000). A gabonafélék az emberi és állati táplálkozásban ısidıktıl fogva nagy szerepet játszanak. Ma is az emberiség mintegy 50%-ának kalória igényét, 45%-ának pedig fı fehérje forrását biztosítják. A gabonafélék szemtermésének úgynevezett tartalékfehérjéi az összes fehérjének több mint felét teszik ki és az endospermiumban raktározódnak. Táplálkozástani értéküket korlátozza a bennük lévı esszenciális aminosavak nem megfelelı mennyisége és aránya. Az esszenciális aminosavak az emberi és állati szervezetben de novo nem szintetizálódnak, így a táplálékkal kell bevinni azokat. Ha egy ilyen aminosav limitáló mennyiségben van jelen, a többi is csak ennek arányában szívódik fel, a többi lebomlik és kiürül a szervezetbıl. Emiatt az állati takarmányok táplálkozástani értékét olyan fehérjék hozzáadásával javítják, melyek esszenciális aminosavakat (fıként lizin) a szokásosnál nagyobb arányban tartalmaznak. Ez a fehérje azonban vagy nagyon drága, vagy nem áll megfelelı mennyiségben rendelkezésre. A gabonafélék táplálkozástani értékének javítását több módon érik el ma is a világban: hagyományos nemesítéssel (szelekció), molekuláris nemesítéssel (mutagenézis és/vagy molekuláris markerezés segítette nemesítés) és géntechnológiai úton. A kívánatos tulajdonság illetve tulajdonság csoport megjelenítésére a gabonafélék szemtermésében ma az egyik lehetséges megközelítés a transzgénikus módszert is alkalmazó nemesítés. A búzanövény (Triticum aestivum L.) minıségét meghatározó tulajdonságok célzott módon történı megváltoztatásáról elıször Vasil és mtsai. számoltak be (1992). A genetikai transzformáció elınye, hogy a kiválasztott gén/gének bejuttatása az egyedek sejtmagjába a gének által hordozott információ hozzáadódását jelenti az ott már meglévı genetikai információ halmazhoz. Ez a megközelítés lehetıvé teszi a szülı kiváló tulajdonságainak megtartása mellett egy specifikus gén által kódolt új, egy adott felhasználási szempontból jobb tulajdonság beépítését. Munkánkban a búza táplálkozástani értékének javításához az amarantusz (A. hypochondriacus) egyik tartalékfehérje génjét (megfelelı szabályozó genetikai elemekkel kiegészítve) biolisztikus módszerrel jutattuk be a búza genetikai állományába, melyrıl fehérje csak az endospermium szövetben expresszálódott. 2

3 CÉLKITŐZÉSEK Munkánk célja a búza táplálkozástani minıségének javítása, melynek meghatározó paramétere az endospermiumból ırölt lisztben található tartalékfehérjék aminosav összetétele. Irodalmi adatok alapján régóta ismert, hogy a búza tartalékfehérjéinek aminosav összetétele jelentısen eltér az állati fehérjék aminosav összetételétıl. Esszenciális aminosav tartalmuk nagyon alacsony, ezért e fehérjék táplálkozástani értéke nem kielégítı, nem teljes. A búzalisztben jellemzıen alacsony az arginin, hisztidin és treonin aminosavak aránya, míg a lizin tartalom nagyon alacsony. Ez annak tulajdonítható, hogy az ırlés során a magasabb esszenciális aminosav összetételő embrió részt (8,3% lizin) és aleuronréteget (4,8% lizin) eltávolítják. Így a liszt fehérje összetételének, azon belül aminosav összetételének megváltoztatása jelentıs táplálkozástani érték változást eredményezhet. Munkánkban in vitro funkcionális vizsgálatok segítségével, illetve in vivo molekuláris biológiai módszereket felhasználva egyrészt arra szeretnénk választ kapni, hogy a búza endospermium fehérje mátrixában expresszálódott magas esszenciális aminosav tartalmú (lizin 7,7%, tirozin 7,0%, treonin 5,4%) amarantusz tartalékfehérje (AmA1) hogyan befolyásolja a búza endospermiumból ırölt liszt fehérje- és aminosav összetételét. Vizsgálni kívánjuk továbbá, hogy a búzalisztbıl készült tészta dagasztási tulajdonságai változnak-e az albumin típusú, öt cisztein aminosavat tartalmazó amarantusz fehérje génjének a búza örökítı anyagába való beépítése és a fehérje termelıdése után. A célkitőzés megvalósításához az alábbi konkrét célokat fogalmaztuk meg: 1A. Hatékony növényregenerációs rendszer kidolgozása különbözı búza genotípusokhoz. 1B. A kidolgozott szövettenyésztési módszer körülményeinek optimalizálása búza transzformációhoz. 2. Amarantusz tartalékfehérje gén in vivo expresszáltatása transzgénikus búzavonalakban. 3. A transzgénikus búzanövények nukleinsav és fehérje szintő vizsgálatai. 4. Utódgenerációk felnevelése és a transzgén öröklıdés kapcsoltsági szintjének megállapítása. 5. Összefüggések keresése a megváltozott fehérje-összetétel és a funkcionális tulajdonságok között. 3

4 ANYAG ÉS MÓDSZER Növényregenerációs kísérleteinkben magyar ıszi búza genotípusok (Mv Emese, Mv Magvas, Mv Martina, Mv Pálma, Mv Emma, Bánkúti 1201/B2, /B8, /B70) éretlen embrióiból nyert kalluszok szövettenyésztéséhez különbözı összetételő, MS típusú táptalajokat használtunk (Tamás és mtsai., 1999). Több kísérleti beállításban a hajtásregeneráció körülményeit az alábbiak szerint módosítottuk: hımérséklet változtatása (26 C helyett 23 C), hajtásregeneráló táptalaj MS makroelem tartalmának felére csökkentése, fényviszonyok változtatása. A módszer búza transzformációhoz történı optimalizálásakor az Mv Emese, Bobwhite és Cadenza búzafajták éretlen embrióiból preparált szkutellumokat embriógenézist indukáló táptalajokon tenyésztettük (Sparks és Jones, 2004; Tamás és mtsai., 2004). A biolisztikus transzformációban a szelekciós markergént (bar) és riportergént (uida) is tartalmazó pahc25 jelő plazmidot (Christensen és Quail, 1996) ko-transzformáltuk a transzgént (ama1, Raina és Datta, 1992) hordozó ptlz transzformációs kazettával (AmA1- ptlz). A transzgén mőködését nagy hatékonyságú, búza endospermium specifikus promóter, az 1Bx17 HMW-GS tartalékfehérje promótere szabályozza. A plazmidokat ekvimoláris mennyiségben aranyszemcsék felületére rácsapatva PDS-1000/He génágyúval (Bio-Rad) juttattuk a kétnapos kalluszosodó szkutellumokba. A zöldülı kalluszokat és növénykéket 4 mg/l foszfinotricin (PPT) tartalmú hajtásregeneráló és gyökereztetı táptalajon szelektáltuk. Az Mv Emese ıszi búzafajta szelektált, kb. 10 cm nagyságú transzgénikus jelölt növényeit szelekciós nyomás nélkül 6 hétig vernalizáltuk. A cserépbe ültetett transzgénikus jelölt növények (és utódaik) zászlósleveleibıl AquaGenomic (Fermentas) oldattal izolált DNS-t specifikus primerek segítségével, PCR módszerrel vizsgáltuk a marker/riporter gén és a transzgén jelenlétére. A transzgén stabil integrálódását a búzagenomba CTAB módszerrel kinyert genomi DNS-en Southern-blot analízissel bizonyítottuk. A transzgén transzkripcióját az endospermiumból kinyert mrns-en végzett RT-PCR reakcióval igazoltuk. A promóter korrekt mőködését az ama1 gén transzkripció idıbeli változásának nyomonkövetésével is igazoltuk. A T 3 szemtermés éretlen endospermiumából (10, 17, 24 és 31 DPA) izolált RNS mintákban az átírt mrns mennyiségét Terzi és mtsai. (2005) módszerét követve qrt-pcr reakcióval határoztuk meg. Fehérje szintő vizsgálatainkban a marker/riporter gén aktivitását a T 1 és T 2 generációkban PAT teszttel és hisztokémiai GUS festéssel igazoltuk. Az AmA1 fehérje expresszióját a 4

5 transzgénikus búzanövények éretlen illetve érett szemtermésének endospermiumából kinyert fehérjeminta Western-blot analízisével bizonyítottuk. A transzgénikus búzanövények T 2, T 3 és T 4 szemtermése keménységét és fizikai paramétereit Perten SKCS 4100 készülékkel határoztuk meg. A kapott töretbıl (és szemtermésekbıl) laboratóriumi Mini-malmon (METEFÉM Kft.) lisztet ıröltünk, amit mikro-szitán megszitáltunk a liszt tulajdonságainak további vizsgálata elıtt. A lisztminták teljes fehérjetartalmát Kjeldahl módszerrel, a transzgénikus búzából kapott lisztben az AmA1 fehérje relatív mennyiségét (a teljes fehérje százalékában) indirekt ELISA módszerrel határoztuk meg (Kang és mtsai., 2003). A lisztminták esszenciális aminosav összetételének méréséhez Adebowale és mtsai. (2007) módszerét alkalmaztuk. A lisztminták polimer/monomer (glutenin/gliadin, Glu/Gli) arányát SE-HPLC kromatográfiás módszerrel a Batey és mtsai. (1991) által leírt módon, az oldhatatlan polimer frakció (UPP%) mennyiségét Gupta és McRitchie (1994) módszerét alkalmazva határoztuk meg. A fenti paramétereket a kromatogrammok polimer és monomer fehérjéire jellemzı csúcsok számszerősített görbe alatti területeibıl számoltuk (Larroque és Békés, 2000). A HMW- és LMW gluteninek egymáshoz viszonyított mennyiségét Marchylo és mtsai. (1989) módosított módszerét követve RP-HPLC kromatográfiával határoztuk meg. A HPLC mérési eredmények értékelése statisztikai módszerekkel (korrelációs számítások, variancia analízis), a STATISTICA version 7.0 software (Statsoft Inc., USA) segítségével történt. A lisztminták szedimentációs vizsgálatát, ami a lisztek poliszacharidjainak és fehérjéinek duzzadási tulajdonságaival kapcsolatba hozható információt ad, a Sedicom System automata készülékkel (Lab-Intern Kft., Magyarország) végeztük Tömösközi és mtsai. (2005) által leírt módon. A funkcionális kísérletekben (dagasztási paraméterek meghatározása) a transzgénikus búzanövények T 3 szemtermésébıl ırölt lisztet mikro-valorigráf (mikro z-arm mixer) prototípusán vizsgáltuk a szerzık leírását követve (Tömösközi és mtsai. 2000; Haraszi és mtsai. 2004). 5

6 ÚJ TUDOMÁNYOS EREDMÉNYEK Olyan új növényregenerációs rendszert dolgoztunk ki ıszi búza genotípusok éretlen embrióiból létrehozott kalluszkultúrákra szomatikus embriogenézissel, mely megteremtette a sikeres transzformáció feltételeit. A növényregenerációs rendszer kidolgozása során alkalmazott általános érvényő változtatások lehetıvé teszik más genotípusok növényregenerációs képességének tesztelését is. Elsıként transzformáltunk búzát olyan idegen fajú génnel (A. hypochondriacus, ama1 gén), mely javítja annak táplálkozástani minıségét. Kimutattuk, hogy a transzgénikus búzavonalak endospermiumában expresszálódó AmA1 fehérje mennyisége arányos mennyiségő esszenciális aminosav tartalom változást eredményezett. Elsıként transzformáltunk búzát olyan idegen fajú génnel (ama1), mely javítja a transzgénikus búza lisztjébıl készült tészta reológiai paramétereit így annak funkcionális tulajdonságait. Kimutattuk, hogy a transzgénikus búzavonalak endospermiumában expresszálódó AmA1 fehérje pozitív hatással van a liszt funkcionális tulajdonságaira, a belıle dagasztott tészta reológiai tulajdonságai javultak. Megnıtt a polimer fehérjék mennyisége a monomer fehérjékhez képest a lisztben, valamint a tésztában a polimer fehérjék méreteloszlása is megváltozott (magasabb UPP%). Igazoltuk több transzgénikus vonalból kinyert liszt esetében is, hogy a belıle dagasztott tészta dagasztási paraméterei javultak, a tészta erısebbé és stabilabbá vált az idegen fehérje megjelenésével. Azt feltételezzük, hogy a rekombináns fehérje szabad szulfhidril csoportjain keresztül beépült a tészta fehérje térhálójába, s ez eredményezte az erısebb és stabilabb tésztát. 6

7 KÖVETKEZTETÉSEK A vizsgált ıszi búzafajták éretlen embrió eredető kalluszainak szövettenyésztése alacsonyabb hımérsékleten (26 C helyett 23 C), a táptalajokban alkalmazott makroelemek alacsonyabb koncentrációja mellett szignifikánsan javítja a kalluszok regenerációs képességét. A hımérséklet és a fényintenzitás fokozatos, együttes növelése a hajtásregenerációban tovább növeli a növényregeneráció hatékonyságát. A kidolgozott szövettenyésztési módszer a fajták közötti regenerációs képességbeli különbségeket nem tüntette el, így a módszer más búzafajták tesztelésére is alkalmas. Az éretlen embriók kallusz kultúráinak embriogenézisen keresztül történı növényregenerációja megteremtette a sikeres transzformálás feltételeit. Ehhez megfelelı korú szkutellumok preparálása, rövid szövettenyésztési fázisok, valamint a kallusz indukcióban és a hajtásregeneráció korai szakaszában alkalmazott táptalaj összetétel módosítására volt szükség. Több generáción keresztül vizsgálva a transzformáns vonalakat igazoltuk a bevitt gén stabil jelenlétét a búza genetikai állományában és szövetspecifikus expresszióját az endospermiumban. Az in vivo expresszáltatott rekombináns fehérje mennyiségével arányos mennyiségő esszenciális aminosav tartalom növekedést mutattunk ki a lisztmintákban miközben azok teljes fehérjetartalma számottevıen nem változott. A géntechnológiai úton történı nemesítés, ezen belül a biolisztikus transzformálási módszer alkalmas olyan búzafajták létrehozására, melyekben magas esszenciális aminosav tartalmú fehérjék (pl. az A. hypochondriacus albumin, vagy globulin típusú fehérjéi) jelennek meg kizárólag az endospermiumban, s ezáltal javul a liszt és a belıle készült termékek táplálkozástani értéke. Megfelelı tulajdonságú fehérjét kódoló gén használatával a géntechnológiai úton történı nemesítés során lehetıség van a búza táplálkozástani értékének és a liszt funkcionális tulajdonságának együttes javítására. 7

8 IRODALOMJEGYZÉK Adebowale YA, Adeyemi IA, Oshodi AA, Niranjan K (2007) Isolation, fractionation and characterization of proteins from Mucuna bean. Food Chem 104: Batey IL, Gupta RB, MacRitchie F (1991) Use of SE-HPLC in the study of wheat flour proteins: An improved chromatographic procedure. Cereal Chem 68: Christensen AH. and Quail PH. (1996) Ubiquitin promoter-based vectors for high-level expression of selectable and/or screenable marker genes in monocotyledonous plants. Transgenic Res 5: Gupta RB. and McRitchie F. (1994) Allelic variation at glutenin subunit and gliadin loci, Glu- 1, Glu-3 and Gli-1 of common wheats. II. Biochemical basis of the allelic effects on dough properties. J Cereal Sci 19: Haraszi R., Gras PW., Tömösközi S., Salgo A., Békés F. (2004) The application of a micro Z- arm mixer to characterize mixing properties and water absorption of wheat flour. Cereal Chem. 81: Kang TJ, Loc NH, Jang MO, Jang YS, Kim YS, Seo JE, Yang MS (2003) Expression of the B subunit of E. coli heat-labile enterotoxin in the chloroplasts of plants and its characterization. Transgenic Res 12: Larroque OR. and Bekes F. (2000) Rapid size-exclusion chromatography analysis of molecular size distribution for wheat endosperm protein. Cereal Chemistry 77: Marchylo BA, Kruger JE, Hatcher DW (1989) Quantitative RP-HPLC analysis of wheat storage proteins as a potential quality prediction tool. J Cereal Sci 9: Raina A. and Datta A. (1992) Molecular cloning of a gene encoding a seed-specific protein with nutritionally balanced amino acid composition from Amaranthus. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, Sparks CA. and Jones HD. (2004) Transformation of wheat by biolistics. In: (Curtis I, ed) Transgenic Crops of the World. Kluwer Academic Publ., pp Tamás C., Tamás L., Morell KM., Appels R. (1999) The use of GFP gene as a reporter gene in wheat transformation. 4 th Congress of the Hungarian Genetical Society, p 166. Tamás C., Szucs P., Rakszegi M., Tamás L., Bedo Z. (2004) Effect of combined changes in culture medium and incubation conditions on the regeneration from immature embryos of elite varieties of winter wheat. Plant Cell Tissue and Organ Culture 79,

9 Terzi V., Pastori G., Shewry PR., Di Fonzo N., Stanca AM., Faccioli P. (2005) Real-time PCR-assisted selection of wheat plants transformed with HMW glutenin subunit genes. Journal of Cereal Science 41, Tömösközi S., Varga J., Gras PW., Rath C., Salgó A., Nánási J., Fogor D., Békés F. (2000) Scale down possibilities in development of dough testing methods. in Proc. 7th International Workshop Gluten 2000, ISBN , Univ. of Bristol, UK. Tömösközi S., Nádosi M., Ercsey K., Nánási J., Varga J. (2005) Development of small-scale methods for measuring wheat quality - A new instrument for determination of sedimentation value. 50 YEARS ICC JUBILEE CONFERENCE Cereals - The future challange Vienna, Austria July 3-6. Vasil V., Castillo AM., Fromm ME., Vasil IK. (1992) Herbicide resistant fertile transgenic wheat plants obtained by microprojectile bombardment of regenerable embryogenic callus. BioTechnology 10,

10 AZ ÉRTEKEZÉSHEZ KAPCSOLÓDÓ KÖZLEMÉNYEK JEGYZÉKE Referált tudományos folyóiratokban megjelent dolgozatok Rakszegi M., Tamás C., Szőcs P., Tamás L., Bedı Z. (2001) Current Status of Wheat Transformation-review. J. of Plant Biotech. 3(2): Rakszegi M., Szőcs P., Tamás C., Tamás L. (2003) Búza transzformáció- szemle Növénytermelés 52(1): Tamás C., Szőcs P., Rakszegi M., Tamás L., Bedı Z. (2004) Effect of Combined Changes in Culture Medium and Incubation Conditions on the Regeneration from Immature Embryos of Elite Varieties of Winter Wheat, Plant Cell, Tissue and Organ Culture, 79(1): Oszwald M., Gardonyi M., Tamas C., Takacs I., Jenes B., Tamas L. (2008) Development and Characterization of a chimaeric tissue-specific promoter in wheat and rice endosperm. In Vitro Cell.Dev.Biol.-Plant 44:1-7 Oszvald M., Tamás C., Rakszegi M., Tömösközi S., Békés F., Tamás L. (2009) Effects of incorporated amaranth albumins on the functional properties of wheat dough. Journal of the Science of Food and Agriculture (has been accepted DOI /jsfa.3528) Tamás C., N. Kisgyörgy B., Rakszegi M., Wilkinson MD., Yang MS., Láng L., Tamás L., Bedı Z. (2009) Transgenic approach to improve wheat (Triticum aestivum L.) nutritional quality. Plant Cell Reports (accepted with minor revision) Konferencia kiadványok és összefoglalások - elıadás Tamás C., Rakszegi M., Szőcs P., Tamás L., Bedı Z. (2001) İszi búza éretlen embrió kallusz regenerációjának optimalizálása transzformáláshoz. MTA VII. Növénynemesítési Tudományos Napok, Budapest Tamás C., Rakszegi M., Szőcs P., Tamás L., Bedı Z. (2003) Táptalaj és inkubációs körülmények együttes hatása ıszi búza kalluszok regenerációjára. MTA IX. Növénynemesítési Tudományos Napok, Budapest Tamás C., Némethné Kisgyörgy B., Szőcs P., Rakszegi M., Láng L., Yang MS., Tamás L., Bedı Z. (2007) Amaranthus hypochondriacus tartalékfehérje gén (ama1) beépítése búzába. In: XIII. Növénynemesítési Tudományos Napok, Bp. (Ed: Kiss J és Heszky L.) Összefoglalók pp26 10

11 Tamás C., Némethné Kisgyörgy B., Szőcs P., Rakszegi M., Wilkinson MD., Láng L., Yang MS., Tamás L., Bedı Z. (2008) A búza (Triticum aestivum L.) nemesítése géntechnológiai módszerrel. In: MTA Bizottsági ülés, Szeged Konferencia kiadványok és összefoglalások poszter Tamás C., Tamás L., Morell K.M., Appels R. (1999) Usage of GFP gene as riporter molecule in wheat transformation. IV. Hungarian Genetic Congress, p 166. Siófok Tamás C., Rakszegi M., Szőcs P., Tamás L., Bebı Z. (2000) Temperature, light and medium optimisation for plant regeneration of winter wheat varieties. 6th International Wheat Conference, p Budapest, Hungary Tamás C., Némethné Kisgyörgy B., Mészáros K., Rakszegi M., Tamás L., Sági L., Bedı Z. (2006) Búza biolisztikus transzformáció egyes paramétereinek vizsgálata és szemléltetése. MTA XII. Növénynemesítési Tudományos Napok Budapest Némethné Kisgyörgy, B., Tamás, C., Rakszegi, M., Láng, L., Tamás, L., Bedı, Z. (2007) Herbicid rezisztenciát kódoló gén expressziója búza genotipusokban. In: XIII. Növénynemesítési Tudományos Napok, Bp. (Ed: Kiss J és Heszky L.) Összefoglalók pp62 11