Az α 2 -adrenoceptorok és a lizofoszfatidsav receptor 1 vizsgálata molekulamodellezési módszerekkel

Átírás

1 Az α 2 -adrenoceptorok és a lizofoszfatidsav receptor 1 vizsgálata molekulamodellezési módszerekkel Doktori tézisek Dr. Balogh Balázs Semmelweis Egyetem Gyógyszertudományok Doktori Iskola Témavezető: Dr. Mátyus éter egyetemi tanár, D.Sc. Hivatalos bírálók: Dr. Herczegh ál, D.Sc. Dr. Kurtán Tibor, h.d. Szigorlati bizottság elnöke: Szigorlati bizottság tagjai: Dr. Gyires Klára, D.Sc. Dr. Gergely András, h.d. Dr. Lopata Antal, h.d. Budapest 2010

2

3 Az α 2 -adrenoceptorok és a lizofoszfatidsav receptor 1 vizsgálata molekulamodellezési módszerekkel Dr. Balogh Balázs Témavezető: Dr. Mátyus éter, az MTA doktora, egyetemi tanár Semmelweis Egyetem, Szerves Vegytani Intézet Összefoglalás hd munkámat Mátyus éter egyetemi tanár irányításával a Semmelweis Egyetem Szerves Vegytani Intézetében végeztem, ahol az α 2 -adrenoceptor agonistákkal kapcsolatos molekulamodellezési kutatómunkába kapcsolódtam be 2003 szeptemberében, az evvel kapcsolatos gyógyszerkémiai munkák támogatása céljából. A lizofoszfatidsav (LA) receptor 1 agonisták modellezésével 2009 májusától foglalkozom az Intézet egy másik kutatási projektjéhez kapcsolódva. Munkám elsősorban ezen receptorok és ligandumjaik közötti kölcsönhatások vizsgálatára irányult, amelyben alapvetően a homológia modellezés és dokkolás eszköztárát használtam. Új eredményeim az alábbiakban összegezhetők: 1. Homológiai modellezéssel elkészítettem az α 2 -adrenoceptor három altípusának valamint a lizofoszfatidsav receptor 1 atomi léptékű modelljeit. A modelleket statisztikai paraméterei és predikciós képessége szempontjából egyaránt megfelelőnek találtuk. A három α 2 -adrenoceptor altípus feltételezett kötőhelyének szerkezetét is összehasonlítottuk és elemeztük. A lizofoszfatidsav receptor és ligandumának kölcsönhatását molekuladinamikai számításokkal is analizáltuk. 2. Modelljeink kötőhelyeire ismert agonista vegyületeket dokkoltunk. Megvizsgáltuk a ligandumok és receptor kötőhelye közötti kölcsönhatásokat. Eredményeink a publikált mutagenezis adatokkal és a korábbi modellekkel összhangban vannak. 3. Elsőként állapítottuk meg, hogy az AutoDock programmal meghatározott és a biológiai adatok alapján számított kötési szabadenergiák egymással jól korrelálnak; ez alapján új agonisták affinitására jó becslés tehető. 4. Az α 2A -adrenoceptor agonisták háromdimenziós szerkezet-hatás összefüggéseit távolságösszehasonlítás (DISCthech) és összehasonlító molekulatér elemzés (CoMFA) módszerekkel is vizsgáltuk. Az agonisták alapján előbb farmakofór modellt majd egy ezen alapuló kvantitatív modellt hoztunk létre. A CoMFA modell a statisztikai validálás alapján megfelelő pontossággal képes előre jelezni α 2A -adrenoceptor agonisták kötési affinitását. 1

4 Studies on α 2 -adrenoceptors and the lysophosphatidic acid receptor 1 with molecular modelling methods Dr. Balázs Balogh Under the supervision of rofessor éter Mátyus, DSc Semmelweis University, Department of rganic Chemistry Summary The hd work, led by rof. éter Mátyus, was carried out at the Department of rganic Chemistry, Semmelweis University with the aims to provide support for ongoing medicinal chemical projects of the Department relating to α 2 -adrenoceptor subtypes and lysophosphatidic acid (LA) receptor 1. In both cases, the modeling work was focused on the study of the intermolecular interactions between those receptors and their ligands. As modeling tools homology modeling and docking were applied. The most important new results are summarized as follows. 1. Models at atomic level of three subtypes of the α 2 -adrenoceptors as well as that of lysophosphatidic acid (LA) receptor 1, which were constructed via homology modeling procedure. Each model was validated by using statistical parameters and through its predictivity performance. Structural differences in the binding sites were identified for the three α 2 -adrenoceptor models. n the other hand, molecular dynamic calculations were also carried out for the complex of lysophosphatidic acid receptor 1 with its ligand to analyze their interaction. 2. Docking of known to binding sites of these models was investigated and features of the interactions between ligands and receptors were in agreement with mutagenesis data. 3. A good correlation was found between free energy of binding values calculated by AutoDock program and those derived from experimental data, by which affinity of new agonists can also be estimated. 4. Three-dimensional structure activity relationship studies of α 2A -adrenoceptor agonists were carried out by Distance Comparison (DISCthech) and Comparative Molecular Field Analysis (CoMFA) methods to define the pharmacophore and a quantitative model, respectively, of this class of compounds. The statistical validation of the CoMFA model indicates its high predictive performance for designing new α 2A -drenoceptor agonists.. 2

5 BEVEZETÉS, CÉLKITŰZÉS Már több mint harminc év telt el az α 2 -adrenoceptor (α 2 AR) altípusok felfedezése óta, de a mai napig nem sikerült α 2 -receptor altípus szelektív ligandumokat kifejleszteni. Bár a humán- és állatgyógyászatban régóta használnak α 2 -agonistákat, főként antihipertenzív szerkezet a jelenleg rendelkezésünkre álló hatóanyagok közül sok még ráadásul α 1 - és β-adrenoceptor affinitással is rendelkezik. em ritkák továbbá más, nem adrenerg G-fehérje-kapcsolt receptorokkal a kereszthatások, így például az imidazolin receptorokkal. Mindez a hatóanyagok mellékhatás profilját kedvezőtlenül befolyásolhatja. A másik általunk vizsgált receptor a humán lizofoszfatidsav (LA) receptor 1, amelyet 1997-ben publikáltak, szintén a G-fehérje-kapcsolt receptorok (GCR) családjába tartozik. A lizofoszfatidsav receptor 1 számos, a sejtosztódással, sejtvándorlással és differenciálódással kapcsolatos folyamat szabályozásában, így például az obezitásban is szerepet játszanak. Az elmúlt tíz évben számos olyan tanulmány született, amelyben az lizofoszfatidsav receptorok lehetséges gyógyászati szerepét vizsgálják. Sem az α 2 -, sem a lizofoszfatidsav receptorok szerkezetéről nem áll rendelkezésre közvetlen, experimentális adat. Jelen dolgozatban azt tűztük ki célul, hogy homológia modellezéssel a már experimentálisan meghatározott néhány GCR szerkezetből kiindulva elkészítsük a három α 2 -adrenoceptor altípus valamint a lizofoszfatidsav receptor 1 szerkezeti modelljét és aktív ligandumok dokkolásával molekuláris szinten tanulmányozzuk a receptor-ligandum kölcsönhatásokat. Azt reméltük, hogy a vizsgálatok során ismereteket szerezhetünk a kötőhelyekről, a ligandumkötés módjáról és az így megszerzett ismeretek felhasználhatóak lesznek új, nagy affinitású ligandumok tervezéséhez, valamint adatbázisok in silico szűrésére. Célul tűztük ki továbbá az α 2A -adrenoceptor farmakofór modell létrehozását az ismert agonisták alapján, továbbá ennek alapján olyan kvantitatív szerkezet-hatás összefüggés (QSAR) modell létrehozását, amely alkalmas lehet új vegyületek α 2A -altípus kötési affinitásának becslésére. 3

6 MÓDSZEREK, EREDMÉYEK Az α 2 -adrenoceptor három típusának (α 2A, α 2B és α 2C ) és a lizofoszfatidsav receptor 1 modellezésével kapcsolatos legfontosabb eredményeim az alábbiakban összegezhetők. 1. Homológia modellezés Felépítettük az α 2 -adrenoceptor három altípusának modelljét. Az aminosav szekvenciákat az UIRT adatbázisból töltöttük le. A szekvencia illesztést a BioEdit program és a ustal W algoritmus segítségével végeztük, amelyet szükség esetén a konzervatív aminosavak figyelembevételével manuálisan korrigáltunk. A receptor modellezésekhez az kada és munkatársai által 2004-ben publikált, 2,2 Å felbontású marha rodopszin (DB ID: 1U19) szerkezetet használtuk templátumként, amelyet az RCSB fehérje adatbázisból töltöttünk le. A modellépítéshez a MDELLER program 9v4-es verzióját használtuk. Az alapértelmezett beállításokat használva modellt generáltunk, ezeket a program által számított Modeller bjective Function értékek alapján választottuk ki, a modelleket statisztikai paraméterek alapján validáltuk és a modelleket megfelelőnek találtuk. A három α 2 -adrenoceptor altípus esetében összehasonlítottuk a kötőhelyeket. A α 2A altípus esetében mutagenezis vizsgálatokkal experimentálisan meghatároztak bizonyos, a ligandum kötésben résztvevő kulcs aminosavakat, míg a másik két altípus (α 2B és α 2C ) esetében ismertek ezek analógjai. A kötőhelyeket a ocket Finder program segítségével is azonosítottuk, a modellek teljes összhangban vannak a mutagenezis adatokkal. A kötőzsebek nagyjából tölcsér alakúak, melyek felső, kiszélesedő részben találhatóak a kötésben részt vevő aminosavak, és a lefelé, az intracelluláris tér felé irányuló részek keskenyednek. A modellek alapján a ocket Finder program az α 2C altípushoz tartozó kötőzseb méretét becsülte a legkisebbnek (482 Å 3 ), az α 2A altípusé valamivel nagyobb (584 Å 3 ) és a α 2B altípus esetében (619 Å 3 ) a legnagyobb a kötőzseb. A lizofoszatidsav receptor 1 esetében a szekvencia illesztés és homológia modellezés az α 2 -adrenoceptornál leírt szoftverekkel és módszerekkel történt. Templátumként a Cherezov és munkatársai által 2007-ben publikált, 2,4 Å felbontású humán β 2 -adrenoceptor (DB ID: 2RH1) szerkezetet használtuk. 4

7 A receptor és a ligandum kölcsönhatás vizsgálatára, valamint a kötőhely meghatározása céljából molekuladinamikai (MD) számításokat végeztünk a lizofoszatidsav receptor 1 LA ligandummal képzett komplexén. A preekvilibrációs fázist (1600 lépéses) minimalizációját egy és egy lépésből álló MD szimuláció követte, végül egy 4 ns-ig tartó (2x10 6 lépés) relaxációt végeztünk. A receptor és a környezet közötti kölcsönhatási energia változása, valamit a receptor kulcs aminosavak és a ligandum megfelelő atomjainak távolság változásai alapján úgy ítéltük, hogy a 4 ns elteltével a rendszer egyensúlyba került. Az így kapott receptorból eltávolítottuk az LA ligandumot és a kapott kötőzsebbe dokkoltuk az agonistákat. 2. Dokkolás A három α 2 -adrenoceptor altípus modellhez tizennyolc, az irodalomban leírt agonista vegyületet dokkoltunk. A H H H dexmedetomidin + levlofexidin H ST-91 H H H H adrenalin H H 3 + H alfa-metilnoradrenalin + H 3 S BHT H 2 H 2 C guanabenz guanfacin F ICI H H H 2 H 2 H 2 + H 2 + H 3 C C H 3 nafazolin H H H noradrenalin H oximetazolin H 3 + H tramazolin H H rilmenidin H S xilazin H Br brimonidin H H H H klonidin H 2 H H p-aminoklonidin H 3 C H 3 C H xilometazolin 5

8 Az agonistáknak a kötési affinitását (K i ) ligandum leszorításos mérés útján határozták meg mindhárom altípusra vonatkozóan, a mérésekhez [ 3 H]-MK912 radioligandumot használtak. Bár a vegyületkészlet viszonylag változatos kémiai szerkezeteket tartalmaz, az egyes vegyületek altípus affinitásában jelentősebb eltérés nincs, így ezek az agonisták nem altípus szelektívek. Az arilamino-imidazolin vegyületek esetében az irodalom szerinti szimmetrikus protonálást használtunk. éhány vegyület esetben nem volt egyértelmű, melyik tautomert illetve protonált állapotot használjuk, ilyenkor az összes lehetséges formát dokkoltuk. A dokkolást az AutoDock 4.0 programmal végeztük, a paraméter készletet kissé módosítottuk. A dokkolásnál során a ligandumokban előforduló valamennyi egyszeres kötést szabadon rotálhatónak vettünk az összes vegyület esetében. A minél tökéletesebb receptor-ligandum kölcsönhatások elérése érdekében a kötésben résztvevő kulcs aminosavak oldalláncait szabadon rotálhatóvá tettük ( flexibilis dokkolás). A dokkolás után a legalacsonyabb kötési szabadenergiával rendelkező konformert választottuk ki valamennyi ligandium esetében. A dokkolt szerkezetek kötési szabadenergiáját ( G (calc) b ) az AutoDock program scoring függvényével határoztuk meg (AD score). Az experimentális kötési energia értékek (ΔG (exp) b ) kiszámítása publikált K i adatok alapján történt. A receptor-ligandum kölcsönhatások vizsgálatához a könnyebb összehasonlíthatóság érdekében a receptorok aminosavait a Ballesteros-Weinstein által kidolgozott rendszer alapján számozzuk. A receptor-ligandum kölcsönhatás szempontjából kitüntetett fontosságú a harmadik transzmembrán régió (TM3) egyik aszparaginsavja (D3.32) és a ligandumok kationos nitrogénje közötti sóhíd. A megfelelő atomok távolsága alapján ez a kölcsönhatás valamennyi agonista esetében létrejött. A katekolamin típusú vegyületek esetében a benzolgyűrűn található hidroxilcsoportok és az ötödik transzmembrán régió (TM5) két szerinjénk (S5.42 és S5.46) hidroxilcsoportja közötti hidrogénhíd kötések kialakulása szintén valószínűsíthető. Az irodalomban leírtak egy hidrofób üreget amelyet az ötödik és hatodik transzmembrán régió (TM5 és TM6) hidrofób oldalláncai alkotnak (F5.47, W6.48, F6.51, F6.52, Y6.55). Az oldalláncok erre utaló elrendeződése a általunk bedokkolt ligandumok esetében szintén megfigyelhető volt. 6

9 A három altípus esetében a kötőhely környezetét összehasonlítva az alábbi különbségeket találtuk: az 5.31-es helyzetben található aminosav mindhárom altípus esetében eltért (E5.31/K5.31/G5.31), ráadásul ezek eltérő karakterűek (semleges/bázikus/savas) az 5.43-as helyzetű az A és C típusok esetében megegyezett, de a B típus esetében eltért (C5.43/S5.43/C5.43) A többi, a kötőhely kialakításában résztvevő aminosav megegyezett, ezek mindhárom altípus esetében azonosak. Kevés lizofoszfatidsav receptor agonista vegyületet publikáltak, az általunk dokkolt vegyületkészlet három különböző irodalomból származik. Az első vegyületkörbe a tíz VC analóg, a másodikba az MT analógok és harmadikba a AEA analógok tartoznak, utóbbiak mindössze 5-5 vegyületet jelentenek. Ligandum log[ec 50 ] Szerkezet VC ,9 VC ,27 C H 3 VC ,08 C H 3 VC ,69 H 2 H H H H VC ,53 VC ,46 H H VC ,55 VC ,2 VC ,87 VC ,58 H H 3 C H H 3 C H H 3 C H 7

10 Ligandum log[ec 50 ] Szerkezet MT-1 1,90 S H 3 C MT-2 2,09 S H 3 C MT-3 1,87 S H 3 C MT-4 2,06 S H 3 C MT-5 1,87 S H 3 C LA 1,23 H Ligandum log[ec 50 ] Szerkezet AEA 2,29 H AEA-5 3,29 H H AEA-9 3,09 H AEA-11 2,34 H AEA-19 2,50 S H LA 1,23 H A természetes LA ligandum és az ismert szintetikus analógok szerkezete is magukon viselik a membránt felépítő foszfolipidek sajátosságait. Így a poláris negatív töltésű, általában foszforsavakat tartalmazó feji rész és a hosszú szénláncú, flexibilis, telítetlen kötéseket is tartalmazó farok rész különböztethető meg. A lizofoszfatidsav agonisták körében nem találtunk publikált kötési affinitását (K i ) adatokat, a maximális hatásos dózis felének logaritmusával (log[ec 50 ]) végeztünk összehasonlítást. 8

11 A LA agonisták dokkolása flexibilis ligandumokkal történt merev receptorhoz, szintén az AutoDock 4.2 szoftverrel. A dokkolással kapott konformerekhez tartozó kötési szabadenergiák ( G (calc) b ) kiszámításához három módszert alkalmaztunk. Az első esetben az AutoDock program saját scoring függvényét használtuk (AD módszer). A második esetben az AutoDock program által dokkolt konformereket az XSCRE program segítségével újra scoroltuk (XS módszer). A harmadik esetben a számítás szintén az XSCRE függvénnyel történt, de egy rövid molekulamechanika (MM) optimálás után (MMXS módszer). Az endogén ligandum LA esetében az MD számítás eredményeként és a dokkolással kapott konformáció lényegében megegyezett. A többi vegyület esetében a dokkolással kapott konformerek szintén nagyon hasonlítottak az LA-ra. A dokkolások eredményeként kapott szerkezetekben a poláros fej és receptor között egy hidrogénhíd kötés hálózatot figyeltünk meg, amely a rövid MM futás után sem változott. A bedokkolt konformerekben a farok helyzete ahogyan az várható is volt nem változott számottevően az MD konformerhez képest. A publikációk szerint a negatív töltésű fej kölcsönhatása kiemelt fontosságú a kötödés szempontjából. Modellünkben a ligandumok a harmadik transzmembrán régióban (TM3) található, pozitív karakterű oldalláncokkal (R3.28-Q3.29) létesítenek sóhidat, az irodalomban leírtakkal összhangban. Modellünk alapján egy további, pozitív oldalláncú TM3 aminosav, a R3.19 közreműködése is valószínűsíthető bár erre vonatkozóan az irodalomban utalást nem találtunk. Szintén nem említettek egy, az ötödik transzmembrán régióban (TM5) található szerint (S5.37), bár mivel ez egy neutrális oldalláncú csoport, ennek szerepe valószínűleg jóval kisebb. Megállapítható továbbá, hogy egy, a TM5-ben található aszparaginsav (D5.38), bár szintén a kötőhely közelében található, nem vesz részt a kötésben. A többi altípussal ellentétben ugyani az 1-es altípus esetében a pozitív karakterű lizin helyett itt egy negatív töltésű aszparaginsav található. Esetünkben ez kifelé, a ligandumtól elfordul, összhangban az irodalomban leírtakkal. Szintén vizsgálták a TM5 egyik triptofánjának (W5.44) szerepét, azonban ezt sem találták különösebben fontosnak; modellünkben ez az oldallánc is hidrogénhíd kötés távolságba került. 9

12 3. Lineális regresszió Az α 2 -adrenoceptorok esetében lineáris regresszió analízissel összefüggést találtunk az experimentális G b (exp) egyúttal a modelleket szintén validálja. és a számított G b (calc) értékek között, ez G ( A,exp) b (2,207 0,196) t 11,25 G ( A, calc) b (8,914 1,623) t 5,49 G ( B,exp) b (1,011 0,009) t 109,6 G ( B, calc) b r 2 0,888 F 126,6 18 r 2 0,887 F 105,1 18 r G 2 ( C,exp) b (1,084 0,129) G ( C, calc) b t 84,4 0,790 F 49,4 18 Az experimentális és a számított értékeket összehasonlítva jó egyezést tapasztalunk, ami a legtöbb ligandum esetében fél nagyságrenden belüli eltérést jelent. A becslés pontossága a statisztikai paraméterek alapján a biológiai mérések pontosságának tartományába esik. 10

13 A altípus B altípus C altípus G b (exp) G b (calc) G b (exp) G b (calc) G b (exp) G b (calc) A ,01-7,85-8,23-8,15-8,32-7,31 -metil-noradrenalin -7,41-7,53-7,60-7,25-7,55-6,80 BHT-920-8,72-8,3-8,57-9,04-8,20-8,05 brimonidin -9,09-8,3-8,20-7,94-7,78-6,91 klonidin -9,82-8,48-9,76-9,52-9,36-8,52 dexmedetomidin -10,74-8,66-10,18-9,84-9,59-8,64 adrenalin -7,94-7,73-7,09-6,54-7,86-6,52 guanabenz -10,44-8,61-8,92-8,58-8,65-8,25 guanfacin -9,58-8,14-7,98-8,48-7,37-7,25 ICI ,04-9,2-9,77-10,02-8,92-8,47 nafazolin -10,46-8,50-8,71-8,51-8,71-8,15 noradrenalin -7,77-7,54-7,58-7,10-8,00-7,57 oximetazolin -11,09-9,07-7,83-8,04-9,02-8,74 rilmenidin -7,9-7,62-7,85-7,53-7,26-6,41 ST-91-8,50-7,68-8,31-7,89-8,46-7,45 tramazolin -10,22-8,88-9,35-9,29-8,94-8,72 xilazin -7,14-7,63-7,44-7,70-6,55-6,21 xilometazolin -10,65-8,89-8,15-8,11-9,39-7,97 A lizofoszfatidsav receptor 1 esetében szintén elvégeztük a lineáris regressziót a három, különböző scoring módszerekkel számított ( G b (AD), G b (XS), G b (MMXS) ) kötési szabadenergiák alapján. Ligandum csoport Ligandum szám AD R 2 XS R 2 MMXS R 2 VC vegyületek 10 0,689 0,626 0,632 AEA vegyületek 6 0,33 0,773 0,797 MT vegyületek 6 0,676 0,612 0,43 Az AD score alapján számított korreláció a AEA vegyületek esetében gyengébb volt, az MT vegyületek esetében az MMXS módszerrel számított korreláció a gyengébb. A VC vegyületek esetében azonban mindhárom módszerrel elfogadható eredményt kaptunk (az AD score alapján és az XS alapján számított korrelációt lásd alább). 11

14 4. Farmakofór és QSAR modell Az α 2A -adrenoceptor esetében farmakofór modellezést is végeztünk, továbbá az agonisták affinitásának becslésére kvantitatív szerkezet-hatás összefüggés (QSAR) modellt is létrehoztunk. Ehhez a dokkolásnál felhasznált vegyületkészletet használtuk (két további vegyülettel kiegészítve). Ez az előzőektől elvileg és módszerében eltérő modellezési technika lehetővé teszi, hogy a receptorok figyelembevétele nélkül, hogy az ismert agonisták szerkezete és biológiai aktivitása alapján alkossunk modellt, új ligandumok tervezéséhez. A modellezés első lépéseként farmakofór modellt hoztunk létre a SYBYL programcsalád DISCtech moduljának segítségével, mely a farmakofór csoportok távolságának összehasonlításán (DIstance Cmparison) alapszik. A modellezés első lépéseként létrehoztuk a ligandumok alacsony energiájú konformereit. A modellképzés fázisban a kapott konformerekben azonos farmakofór csoportokat egy automatizált algoritmus segítségével hoztuk egymással fedésbe így hozva létre azokat a modell hipotéziseket, amelyekhez valamennyi vegyület esetében legalább egy konformer hozzárendelhető. Az általunk kiválasztott modell hipotézisben a két farmakofór csoport szerepel: egy hidrogéndonor atom (ami a protonált, kationos nitrogénnek felel meg), és egy aromás centrum. Ezen csoportok távolsága és egymáshoz viszonyított helyzete megfelelt az irodalomban korábban leírtaknak. A farmakofór modell szerinti konformer illesztésből kiindulva QSAR modellt hoztunk létre a SYBYL programcsalád CoMFA moduljának segítségével. Ez egy összehasonlító molekula-tér analízisen (Comarative Molecular Field Analysis) alapuló módszer, amely a ligandum körüli doboz rácspontjaiban elhelyezett próbatestre ható sztérikus és elektrosztatikus erők kiszámításával hoz létre leírókat. Mi a módszer egy Cho és munkatársai által továbbfejlesztett változatát, az úgynevezett q 2 -irányított régió szelekciós (q 2 -GRS) módszert alkalmaztuk, amely a hagyományos CoMFA modellből (A modell) kiindulva 0,1; 0,2; 0,3; 0,4 és 0,5 q 2 levágási értékekkel hoz létre új modelleket (B-F modellek). A modellek statisztikai szignifikanciáját és a komponensek optimális számát LS (arcial Least Squares, parciális legkisebb négyzetek) módszerrel, L (Leave-ne-ut) keresztvalidálást alkalmazva határoztuk meg. A q 2 -GRS módszerrel kapott modellek paraméterei a hagyományos CoMFA modellhez képest szignifikánsan javultak. 12

15 q 2 levágás d.sz. p.sz. q 2 SDE n A modell ,635 0,625 2 B modell 0, ,734 0,568 4 C modell 0, ,734 0,590 4 D modell 0, ,768 0,531 4 E modell 0, ,768 0,532 4 F modell 0, ,845 0,434 4 d.sz. dobozok száma; p.sz. pontok száma; SDE a predikció standard hibája; n a LS komponensek száma Amikor 0,5-ös levágást használtunk (F modell) az eredeti 125-ös doboz szám 10-re csökkent. Az ezen dobozok által reprezentált rácspontok száma (7920) elégségesnek bizonyult az agonisták alak-tulajdonságainak megfelelő leírására. A modellek statisztikai validálása az LM (Leave-Multiple-ut) módszer alapján történt. Az adatkészletet a program automatikusan és véletlenszerűen osztotta fel betanító és ellenőrző részekre. A beállítások alapján 2, illetve 5 csoportot hoztunk létre. Az LM keresztvalidálás a B modell a q 2 alapján szignifikánsan jobban teljesített a hagyományos CoMFA modellnél (A modell). Az LM keresztvalidálásokat a B modell esetében 50-szer megismételve, majd átlagot számolva az alábbi értékeket kaptuk: 2 csoportos felosztás 5 csoportos felosztás araméterek: q 2 n SDE c q 2 n SDE c Átlagok: 0,441 2,24 0,772 0,587 2,66 0,672 sd 0,161 0,65 0,111 0,1038 0,74 0,074 SDE a predikció standard hibája; n a LS komponensek száma A két csoportos felosztásnál az LM keresztvalidáláskor kapott q 2 átlag (0,441) bár kissé alacsony, de figyelembe véve, hogy a modell mindössze 10 vegyület alapján készült, mindenképpen elfogadható. A végső, nem keresztellenőrzött modellt (a B keresztellenőrzött modell alapján) 4 komponens felhasználásával építettük fel és 34 alrégiót tartalmaz. A modell statisztikai paraméterei az alábbiak r 2 =0,984, s=0,141 és F(4,15)=226,

16 A modellben a sztérikus (0,481) és elektrosztatikus (0,519) mező hozzájárulása nagyjából kiegyenlített volt. Ez arra engedett következtetni bennünket, hogy az α 2A -ARok ligandumok esetében mindkét kölcsönhatás típus egyaránt fontos szerepet játszik a kötődésben. Ez a megállapítás összhangban van a korábbi modellekkel. Az eredmények grafikus ábrázolására kontúr-térképeket generáltunk, az ezek alapján levonható következtetések összhangban állnak az irodalomban korábban leírt szerkezet-hatás összefüggés ismeretekkel. 14

17 KÖVETKEZTETÉSEK Az α 2 -adrenoceptorral kapcsolatos modellezések: Elkészítettük α 2 -adrenoceptor három altípusának homológia modelljét; a kapott szerkezetek az ismert modellekkel és a mutagenezis adatokkal összhangban vannak. A statisztikai paraméterek alapján is megfelelő prediktív képességgel rendelkeznek. Elvégeztük a három altípus kötőhelyének összehasonlítását: a három kötőzseb alakja hasonló, méretük azonban különböző, s a három altípus-kötőhely esetén mindössze néhány aminosav eltérést találtunk. Ismert agonistákat dokkoltunk a modellekhez, a dokkolással kapott és biológiai adatok alapján számított kötési szabadenergiák egymással jól korreláltak, és a receptor-ligandum kölcsönhatás típusok megfelelnek a korábban ismert modellek esetén felismertekkel. Lineáris regresszió analízissel összefüggést találtunk az experimentális és a számított kötési szabadenergia értékek között mindhárom altípus esetében, a statisztikai paramétereik alapján elfogadható prediktív képességgel rendelkeznek.. Elkészítettük α 2A -adrenoceptor altípus validált farmakológiai és QSAR modelljét is. A lizofoszfatidsav receptor 1 modellezések: Elkészítettük a humán lizofoszfatidsav receptor 1 homológia modelljét, a receptor-ligandum kölcsönhatások vizsgálatára molekuladinamikai szimulációt is végeztünk. Ismert agonistákat dokkoltunk a modellekhez, a dokkolással kapott és biológiai adatok alapján számított kötési szabadenergiák egymással korrelálnak, a receptor-ligandum kölcsönhatások típusa megfelel a publikáltaknak, valamint új kölcsönhatásokat is valószínűsítettünk. 15

18 SAJÁT UBLIKÁCIÓK JEGYZÉKE Az értekezés témájában megjelent közlemények: 1. Balogh, B., Hetényi, Cs., Keseru, M.G., Mátyus,.: Structure-based calculation of binding affinities of α 2A -adrenoceptor agonists. ChemMedChem 2007, 2, (IF: 2,825) 2. Balogh, B., Jójárt, B., Wágner, Z., Kovács,., Máté, G., Gyires, K., Zádori, Z., Falkay, G., Márki, Á., Viskolcz, B, Mátyus,.: 3D QSAR models for α 2A -adrenoceptor agonists. eurochem. Int. 2007, 51, (IF: 2,975) 3. Balogh, B., Szilágyi, A., Gyires, K., Bylund, D.B., Mátyus,.: Molecular modelling of subtypes (α 2A, α 2B, α 2C ) of α 2 -adrenoceptors: a comparative study. eurochem. Int. 2009, 55, (IF: 3,541) 16

19 Az értekezéshez kapcsolódó előadások és poszterek: 1. Balogh B.: α 2 -Adrenoceptor modeling. European School of Medicinal Chemistry (XXIV Advanced Course of Medicinal Chemistry and E. Duranti ational Seminar for hd Students), Urbino, július 4-8. () 2. Balogh B., Keserű Gy., Hetényi Cs., Mátyus.: Ligand-validated homology model of α 2A -adrenoceptor. Adrenergic transmission: from benchside to bedside, Visegrád, október 6-7. (E) 3. Balogh B., Hetényi Cs., Jójárt B.: α 2A -Adrenoceptor homológia és 3D- QSAR modellezés. auder ttó Emlékverseny, Budapest, április (E) 4. Szilágyi A., Balogh B., Vanyúr R., Mátyus.: Az α 2 -adrenoceptorok molekulamodellezése az altípusok összehasonlítása. KeMoMo - QSAR miniszimpózium 2009, Szeged, április (E) 5. Balogh B., Szilágyi A., Jeszenői., Mátyus.: α 2 -Adrenoceptor altípusok és ligandjaik kölcsönhatásának vizsgálata molekula modellezési módszerekkel. Congressus harmaceuticus Hungaricus XIV., Budapest, november () (E): (): előadás poszter 17

20 KÖSZÖETYILVÁÍTÁS Hálás köszönetemet fejezem ki Mátyus éter intézetigazgató egyetemi tanárnak, hogy doktori munkámat irányította és hasznos szakmai tanácsaival segítette. Továbbá szeretném megköszönni a disszertációm elkészítéséhez nyújtott segítségét. Köszönöm az rszágos Tudományos Kutatási Alapprogram (TKA; K73389), az Egészségügyi Tudományos Tanács (ETT-508/2006) és a Semmelweis Egyetem Doktori Iskolájának munkám elvégzéséhez nyújtott anyagi támogatását. Köszönetet mondok dr. Hetényi Csabának a dokkolási számításokban való közreműködéséért. Köszönetet mondok dr. Jójárt Balázsnak a QSAR és a molekula dinamikai számításokban való közreműködéséért. Köszönetet mondok Szilágyi Andrásnak valamint Jeszenői orbertnek a dokkolásokban való közreműködésükért. Köszönetet mondok dr. Krajsovszky Gábornak a disszertációm átnézéséért. Megköszönöm továbbá a disszertáció témájához kapcsolódó közlemények valamennyi társszerzőjének segítségét. Továbbá szeretném megköszönni valamennyi Kollégámnak, akik segítettek doktori munkám során. 18