Új generációs sporttudományi képzés és tartalomfejlesztés, hazai és nemzetközi hálózatfejlesztés és társadalmasítás a Szegedi Tudományegyetemen

Átírás

1 Új generációs sporttudományi képzés és tartalomfejlesztés, hazai Pályázati azonosító: TÁMOP E-15/1/Konv alprojekt Sportélettani képzés és tartalomfejlesztés Pilot 2: Rekreációs tréning kardioprotektív szerepe magas triglicerid diétában ovariektomizált nőstény patkányban:gasotransmitterek szerepe Szakmai beszámoló

2 BEVEZETÉS A szív-és érrendszeri megbetegedések előfordulásának valószínűsége igen ritka a fiatal nők körében, azonban az iparilag fejlett országokban az 50 év körüli nők vezető morbiditási és mortalitási tényezőjévé vált. A posztmenopauzában levő nők haláleseteinek döntő részét a kardiovaszkuláris, valamint az idegrendszeri megbetegedések teszik ki (75-76 %), szemben a melldaganat okozta halálozással (6-8 %). A menopauza utáni szexuálszteroid hiányállapot kedvezőtlen hatással van a kardiovaszkuláris funkciókra valamint a metabolizmusra, így befolyásolva a lipid profilt és szénhidrát háztartást, valamint direkt módon az erek és az endotélium működését. A rizikó növekedése közvetlen összefüggésbe hozható az életmóddal, melyben kiemelt szerepe van a táplálkozási szokásoknak és a testmozgás rendszerességének. Klinikai vizsgálatok során, korai posztmenopauzában levő nők esetén a testzsír-mennyiség növekedés eredményeként 5 kilogrammos testsúlynövekedést figyeltek meg egy 36 hónapos vizsgálati periódus során. Az ösztrogénhiány és a kardiovaszkuláris rizikó összefüggése Számos epidemiológia tanulmány igazolja, hogy fertilis korban a nők kardiovaszkuláris morbiditása és mortalitása mintegy 50 %-kal alacsonyabb, mint a hasonló korú férfiaké (Hu, Grodstein et al. 1999). A protektív hatást a női szexuálszteroid hormon jelenléte biztosítja, mely metabolikus és vazorelaxáns hatásaival befolyásolja a szív-és érrendszeri betegségek előfordulását. Az ösztrogénről igazolták, hogy kedvezően befolyásolja a lipid profilt és szénhidrát háztartást, valamint gyulladáscsökkentő hatással is rendelkezik (Gouva and Tsatsoulis 2004). A vér össz-koleszterin- és az alacsony denzitású lipoprotein (LDL) koleszterin csökkentésével, valamint a magas denzitású lipoprotein (HDL) koleszterin szintjének emelésével protektív hatást fejt ki az ateroszklerotikus folyamatokkal szemben. Az aterogenezis, illetve az ezt követő plakk képződés az érrendszerben lejátszódó gyulladásos folyamatok eredménye. Az ösztrogén szexuálszteroid gyulladáscsökkentő hatása az ösztrogén receptor (ER) működésével magyarázható, mely transzkripciós represszorként gátolja a nukleáris faktor kappa B (NFκB) aktivitását (Ghisletti, Meda et al. 2005). A nemi ciklus során, az ösztrogén jelenléte csökkenti a tumor nekrózis faktor-alfa (TNF-α) és interleukin-6 (IL-6) gyulladásos citokinek szintjét (Straub 2007). Az IL-6 a C- reaktív protein fontos szabályzó tényezőjeként a kardiovaszkuláris megbetegedések etiológiájában is kulcs szerepet játszhat (Ridker, Hennekens et al. 2000).

3 Az ösztrogén érfali hatásaiban továbbá jelentős szerepe van a nitrogén monoxid (NO) által mediált vazodilatációnak, mely a trombocita aggregáció gátlásával, illetve a simaizom sejtek proliferációjának akadályozásával gyulladáscsökkentő és anti-aterotikus szereppel bír. A nitrogénmonoxid- szintáz (NOS) működésének eredményeként megjelenő NO a szolubilis guanilát-cikláz (sgc) és a ciklikus guanozin- monofoszfát (cgmp) útvonalon keresztül szerepet játszik a vérnyomás és a vaszkuláris kontraktilitás szabályozásában. Az ösztrogén endotél működésétől független vazodilatív mechanizmusát a kálcium antagonista szerű hatás jelenti (Han, Karaki et al. 1995). A reproduktív kor hormonális védelme a szervezetet érintő öregedési folyamat során csökken, majd megszűnik, a posztmenopauzában levő nők és az azonos korú férfiak szív és érrendszeri betegségekből adódó halálozása hasonló értéket mutat (Sullivan and Fowlkes 1996). A kor, illetve az ösztrogén hiánya együttesen tehetők felelőssé a posztmenopauzában levő nők fokozott kardiovaszkuláris veszélyeztetettségével. Az ösztrogén hiánya kedvezőtlen hatást gyakorol mind a metabolizmusra, mind pedig a kardiovaszkuláris funkciókra, megváltoztatja a testzsír-eloszlást és a lipid profilt, csökkenti a glükóz toleranciát, emeli a vérnyomást és a szimpatikus tónust, továbbá hozzájárul az érendotél sérüléshez és a gyulladási folyamatok kialakulásához. A magas vérnyomás, illetve a 2-es típusú cukorbetegség a kardiovaszkuláris betegségek ismert kockázati tényezői, különösen posztmenopauzában levő nők esetén (Rosano, Vitale et al. 2007). A szervezet érintő öregedési folyamat, illetve az ösztrogénhiány eredményeként fellépő érfali sérülés során az endotél sejtek elveszítik proliferatív és migrációs képességüket. Az endoteliális gát porózussá válik, megindul a simaizom sejtek bevándorlása a szubendoteliális térbe, mely az intima réteg vastagságát okozza. (Brandes, Fleming et al. 2005). A morfológiai változásokon túl, csökken az endoteliális NOS (enos) enzim aktivitása, valamint a NO biológiai hasznosulása (North and Sinclair 2012). A NO vazodilatátor funkciójának sérülésével hemodinamikai változások következnek be, valamint gyulladásos folyamatok jelennek meg (Heffernan, Fahs et al. 2010).

4 Kardiovaszkuláris prevenció posztmenopauzális korban A posztreproduktív időszak ösztrogénszint esésével járó krónikus elváltozások hozzájárulhatnak a metabolikus zavarok és 2-es típusú cukorbetegség megjelenéséhez, valamint az agyi és kardiovaszkuláris megbetegedések kialakulásához. E tényekből adódik, hogy a posztmenopauzális panaszok kezelésére irányuló megoldások az elmúlt évtizedek óta intenzív kutatás alatt áll. A posztmenopauzális korban levő nők egy helyes életvitel kialakításával, melyben kellően figyelnek a hipertónia, diszlipidémia és a szénhidrát háztartás egyensúlyára, csökkenthetik és megelőzhetik a kardiovaszkuláris és metabolikus rendellenességek kialakulását. A kalória megvonás (CR) és testmozgás kombinált hatása jelentősen hozzájárul az öregedési folyamat illetve a kardiovaszkuláris megbetegedések késleltetéséhez ben McCay és munkatársai patkány modellen vizsgálva igazolták, hogy %-os CR drámaian növeli az élettartamot (McCay, Crowell et al. 1935). Emlősökön végzett kísérletek bizonyították, hogy a CR számos életkorhoz köthető betegség kialakulását csökkenti, így a daganatos betegségeket, veseelégtelenséget és kardiovaszkuláris megbetegedéseket egyaránt (Weiss and Fontana 2011). A CR az oxidatív stressz csökkentésével hozzájárul a mitokondriális funkció javításához, illetve csökkenti a gyulladásos citokinek szintjét rágcsálókban (Zou, Jung et al. 2004) és emberben (Weiss, Racette et al. 2006) egyaránt. A CR mellett a testzsír csökkentése is kiemelt fontosságú, mivel ösztrogénhiányos állapotban növekszik az adiponektinek forrásául szolgáló zsigeri zsírszövet akkumulációja, mely pozitív korrelációt mutat az inzulin- érzékenység csökkenésével, illetve a szív- és érrendszeri megbetegedések kialakulásával (Okura, Koda et al. 2003, Sumino, Takahashi et al. 2004). A rendszeres testmozgás amellett, hogy segít fenntartani az ideális testsúlyt, fokozza a szív és a tüdő teljesítőképességét, csökkenti a vércukorszintet, így kifejezetten előnyös hatású posztmenopauzában levő nőknek és cukorbetegségben szenvedőknek, akik fokozottan veszélyeztetettek a szív és érrendszeri betegségek tekintetében (Gielen, Schuler et al. 2010). CÉLKITŰZÉSEK A reproduktív korú nők kardiovaszkuláris védettséget élveznek az azonos korú férfiakkal szemben, azonban a kor előrehaladtával a védettség megszűnik, a metabolizmust és kardiovaszkuláris rendszert érintő kóros folyamatok jelennek meg. A rizikó növekedése közvetlen összefüggésbe hozható az életmóddal, melyben kiemelt szerepe van a táplálkozási szokásoknak, illetve a testmozgás rendszerességének.

5 Kísérletesen menopauzában (OVX), 40 % zsírt tartalmazó diétával hipertrigliceridémiát hozunk létre nőstény Wistar patkányokban. 6 hét futást követően vizsgáljuk: 1. az infarktusos terület nagyságát izolált szíveken ex vivo 2. Az alap vérnyomásértékek heti változását 3. A vér klinikai kémiai paramétereinek változását 4. a gasotransmitterek (NO,H 2 S,CO) szintézisében és szerepet játszó enzimek expresszióját és/vagy aktivitását. ANYAGOK ÉS MÓDSZEREK (Állatkísérletes modell megtervezése, koordinálási feladatok, szakmai értékelés : Dr. Varga Csaba,,Dr. Pálfy György, Dr. Pósa Anikó) Vizsgálatainkhoz hetes (fertilis korú) Wistar patkányokat használtunk. Csoportok: 12 hetes, kontroll (áloperált), fertilis nőstények 12 hetes, farmakológiai ovariektómián (POVX) átesett nőstények 12 hetes, sebészi ovariektómián (OVX) átesett nőstények A POVX csoportba tartozó nőstényeket, az ösztrogénhiányos állapot elérése céljából 4 hetente 750 µg/ttkg dózisú gonadotropin felszabadító hormon (GnRH) analóg- triptorelin (Decapeptyl Depot, Ferring) injekciót kaptak intramuszkulárisan. A triptorelin egy GnRH agonista, mely csökkenti a follikulus stimuláló hormon (FSH) és luteinizáló hormon (LH) felszabadulását, a sebészi ovariektómiával hasonló szexuálszteroid szérumszintet eredményezve gátolja az ováriumok működését (Acs, Szekacs et al. 2000). Az OVX csoportba tartozó nőstényeken bilaterális ovariektómiával, sebészi úton távolítottuk el mindkét oldali petefészket. A sebészi ovariektómia után, 6 hetes pihenő fázist követően az adott állatcsoportokon ELISA módszerrel (Quantikine patkány ösztrogén ELISA kit, R&D Systems Inc.) ellenőriztük az ösztrogénhiányos állapot kialakulását. A kísérleteket a által elfogadott Állatkísérletes Etikai Kódex előírásai szerint végeztük.

6 GAZOTRANSZMITTEREK SZEREPÉNEK TISZTÁZÁSA A TNF-α és IL-6 koncentráció meghatározása (Török Szilvia mérések kivitelezése) A gyulladáskeltő citokinek meghatározása ELISA (Quantikine patkány TNF-α és IL-6 ELISA kit, R&D Systems Inc.) módszerrel történt bal szívkamrából. A TNF-α és IL-6 értékeket pg/mg fehérjeként fejeztük ki. A mieloperoxidáz (MPO) aktivitásának meghatározása (Dr. Hegyköziné Veszelka Médea) Az MPO mennyisége a neutrofil granulociták infiltrációjakor megemelkedik, mennyisége a gyulladás mértékével korrelál. A minták homogenizálását 0,5 % hexadeciltrimetilammónium bromidot tartalmazó foszfát pufferben (50 mm, ph 6,0) végeztük. A szív balkamrát hideg pufferben, Ultra Thurrax homogenizáló segítségével (2 x 30 másodpercig; rpm) homogenizáltuk. A mintákat folyékony nitrogénben lefagyasztottuk, majd 37 o C-os vízfürdőben felolvasztottuk. A fenti folyamatot még kétszer megismételtük. Ezt követően a mintáinkat g-vel 15 percig 4 o C-on lecentrifugáltuk és a felülúszót használtuk a mérésekhez. Az MPO méréseinkhez peroxidázt használtunk standardként (0; 0,0125, 0,025, 0,05, 01, 02, 03, 04, 05, U/ml). A mérés során ELISA plate-be tettünk 280 μl O-dianisidindiHCl-t (0,167 mg/1 ml foszfát puffer). Ehhez adtunk a felülúszónkból vagy a standardunkból 12 μl-t és a reakciót 10 μl 0,03 %-os hidrogén-peroxiddal indítottuk. 90 másodperces rázatás után 490 nm-n ELISA reader (Benchmark, BIO-RAD) segítségével mértük a kialakult színváltozásokat. Eredményeinket mu/mg fehérjére vonatkoztattuk. A hem-oxigenáz (HO) aktivitás meghatározása (Dr. Szűcs Gergő mérések kivitelezése, mérési protokoll beállítása) Az állatokon cervikális diszlokációt végeztünk, majd az eltávolított bal kamra szöveteket jégen tartott ph 7.4 -es, 10,0 mm N-2-hidroxietilpiperazin-N -2-etánszulfonát (HEPES), 32,0 mm szacharóz, 1,0 mm dithiotreitol, 0,10 mm etilén-diamin-tetraecetsav (EDTA), 10,0 µg/ml tripszin inhibítor, 10,0 µg/ml leupeptin és 2,0 µg/ml aprotonin tartalmú elegyben homogenizáltuk (Ultra Turrax T25; min-1; 2x30 s). Az 1,5 ml végtérfogatú, 2,0 mm glükóz-6-foszfátot, 0,14 U/ml glükóz-6-foszfát-dehidrogenázt, 15,0 µm hemint, biliverdinreduktáz forrásként 120,0 µg/ml patkánymáj-citoszolt, 2,0 mm MgCl2x6H2O ot és 100,0 mm KH2PO4 ot tartalmazó reakcióelegyhez 150,0 µl-nyi, centrifugálással (20 perc, g, 4 C) nyert felülúszót adtunk.

7 A reakció elindításához 100,0 µl ß-nikotinamid-adenin-dinukleotid-foszfátot (β-nadph) 150,0 µm adtunk a mintákhoz, majd sötétben, 37 C-on inkubáltuk őket 60 percen keresztül. A reakció leállítása érdekében a mintákat jégre tettük. Standardként bilirubin oldatot (58,47 µg/ml; 10,0 µm) alkalmaztunk, és a képződött bilirubin mennyiségét a 464 és 530 nm-en mért optikai denzitások különbsége alapján számítottuk ki. A fehérjetartalmat spektrofotometriásan határoztuk meg (Bio-Rad Protein Assay). A HO aktivitás egységét a következőképpen adtuk meg: képződött bilirubin (nmol/óra/mg fehérje). A HO-1 és HO-2 expresszió meghatározása (Dr. Bereczki Zsolt, Dr. Gallé Ágnes) Az állatokon cervikális diszlokációt hajtottunk végre, majd a HO-1 és HO-2 enzimek expresszióját Western blot módszerrel vizsgáltuk (Chomczynski and Sacchi 1987, Essig, Borger et al. 1997). Az eltávolított bal kamra szöveteket jégen tartott Tris-mannitol puffer (2,0 mm Tris 7-9, 50,0 mm mannitol, 100,0 µm fenil-metil-szulfonil-fluorid, 2,0 µm leupeptin, 0,50 mu/ml aprotinin, 0,50 % Triton X-100 tartalmú elegyben homogenizáltuk (Ultra Turrax T25; min-1; 2 x 30 s), majd a kapott homogenizátumokat lecentrifugáltuk (20 perc, g, 4 C). A fehérjetartalmat spektrofotometriásan mértük (Bio-Rad Protein Assay). A felülúszót 1:1 arányban hígítottuk (20 mm Tris 7-9; 3 mm EDTA; 2 % (nátrium dodecyl szulfát) SDS; 10 % ß-merkaptoetanol; 20 % glicerol), majd denaturáltunk (100 o C-os vízfürdő, 3 perc). A 25 μg fehérjéket tartalmazó mintákat ezt követően 10 %-os SDSpoliakrilamid gélen megfutattuk (100V/50 ma), és nitrocellulóz memránra (Hybond ECL Nitrocellulose membrán, Amersham, Pharmacia Biotech., Buckinghamshire, UK) transzferáltuk át (100 V, 100 ma, 2 óra; Cleaver SD10 Semi dry). A fél órás blokkolást (PBS ph 7,4; 0,25 %-os Tween 20, 5 %-os sovány tejpor) követően egér anti-ho-1 (1/10000) vagy egér anti-ho-2 monoklonális antitestet alkalmaztunk. Az inkubáció után PBS-tween 20-as oldattal mostuk a membránt (3x15 perc). Ezt követően torma-peroxidázzal kapcsolt egér antitesttel (1/2000; 1 óra; 25 o C Santa Cruz Biotechnology Inc., Santa Cruz, Ca, USA) végeztünk inkubációt. Ismételt mosás után a membránokat egy kemilumineszcens rendszer (ECL+Plus, Amersham Pharmacia Biotech., Buckinghamshire, UK) segítségével láthatóvá tettük, Uvisoft Uviprochemi (Iconix, Toronto, Kanada) rendszerrel exponáltuk, ezt követően Quantity One program segítségével értékeltük. Az elektroforézis Triple wide mini-vertical electroforeesis system segítségével zajlott.

8 VÉRNYOMÁS ÉRTÉKEK MONITOROZÁSA, ISZKÉMIA VIZSGÁLAT Adrenalin (A) és fentolamin (P) által kiváltott experimentális angina modell + vérnyomásértékek monitorozása (Dr. Hegyköziné Veszelka Médea mérés kivitelezés, módszertan kidolgozása) Az kísérleti állatokat uretánnal (30 %, 0,50 ml/100g, i.p.) altattuk, testhőmérsékletüket 37 o C- on tartottuk. Kanült helyeztünk a patkányok farokvénájába, amelyen keresztül adtuk a gyógyszereket, a tracheába, hogy biztosítsuk a spontán légzést, és az arteria carotisba, amelyen keresztül mértük az artériás vérnyomást. 15 perc stabilizáció után a HEMOSYS számítógépes mérő és analizáló rendszer segítségével regisztráltuk az artériás középvérnyomást és a testfelszíni II. EKG-t. A szíviszkémia meghatározásához az ST változását használtuk fel. ST szegmens értékként az S hullám csúcsa után 13 ms-mal mért átlagos ECG feszültséget definiáltuk. Kiszámoltuk az anginát kiváltó ágensek alkalmazása előtti és utáni, ST szegmens amplitúdókban tapasztalt különbségeket, és mv-ban fejeztük ki az ST szegmens depresziójaként. Az adrenalin-fentolamin modellben egyetlen dózisnyi adrenalin (10,0 μg/kg) majd 30 s elteltével α-adrenoceptor antagonista fentolamint (15,0 mg/kg) adtunk az állatok farki vénájába. Az egyes ágenseket 0,20 ml fiziológiás sóoldatban oldottuk fel. Az ECG és vérnyomás változásait párhuzamosan követtük. A HO enzimek aktivitását ón- protoporfirin IX-cel gátoltuk le (SnPP: 30 µmol/kg s.c., ph 7,4, 24 és 1 órás előkezelés). A mérés kivitelezése kisállat farokvérnyomás mérő segítségével történt Statisztikai analízis (Juhász Katalin, Dr. Pfeiffer Ilona) Az adatok átlag ±S.E.M.-ként fejeztük ki. A statisztikai szignifikanciát ANOVA teszttel állapítottuk meg és az eltéréseket p< 0,05 esetén tekintettük szignifikánsnak. A Western blot kísérlet eredményeit reprezentatív képeken mutatjuk be.

9 6.2. A kalória megvonás, magas triglicerid tartalmú diéta és a rekreatív testmozgás hatásának vizsgálata reproduktív korú, illetve ösztrogénhiányos nőstényekben (Protokoll megtervezése, munkafolyamatok koordinálása Dr. Varga Csaba, Dr. László Ferenc) Vizsgált állatcsoportok Kísérleteinkhez azonos korú (10 hetes) nőstény Wistar patkányokat használtunk. Az állatok egy csoportján áloperálást (SO) hajtottunk végre, az ösztrogénhiányos állapotot pedig bilaterális, sebészeti ovariektómiával (OVX) idéztük elő. Négyhetes pihenő fázist követően az ösztrogén szérumszintjének csökkenését ELISA (Quantikine patkány ösztrogén ELISA kit, R&D Systems Inc.) módszerrel ellenőriztük, majd a diéta (CTRL, normál táp; HT, magas triglicerid tartalmú diéta 40%- os zsírtartalommal; CR, 50%- os kalória megvonás) és vagy/tréning alapján tovább csoportosítottuk az állatokat (1. ábra). A testmozgást végző állatokat futókerékkel felszerelt (Acéllabor Ltd., Budapest) ketrecekben helyeztük el, ezzel szabad hozzáférést biztosítva a kerékhez a nap 24 órájában, 12 héten keresztül. A tréning protokollt szabadidős testmozgásmodellként definiáltuk, csökkentve a lehetséges stresszhatásokat, ezzel megkülönböztetve az erőnléti, intenzív fizikai metodikai eljárásoktól (Ghosh, Golbidi et al. 2010). Tizenkéthetes periódust követően meghatároztuk a metabolikus és gyulladásos paramétereket. A kísérleteket a által elfogadott Állatkísérletes Etikai Kódex előírásai szerint végeztük. Csoportok: Normál táp (CTRL) Futó Magas triglicerid tartalmú (HT) Kalóriamegvonásos (CR) SO/ OVX Normál táp (CTRL) Nem futó Magas triglicerid tartalmú (HT) Kalóriamegvonásos (CR) 1. ábra: A SO és OVX nőstények csoportosítása a diéta és tréning alapján Orális glükóz tolerancia teszt (OGTT) (Dr. Molnár Erika, Mainé Dr. Csiszár Jolán)

10 A patkányok glükóz-terhelésre adott válaszát OGTT segítségével határoztuk meg a 12 hetes kísérleti periódus befejeztével. A vizsgálat előtti napon az állatoktól 12 órára megvontuk a táplálékot, majd meghatároztuk az éhhomi, illetve a 30., 60. és 120 percben 0,1 g/ttkg dózisú cukorterhelésre adott vércukor értékeket (Accu-Chek Active). Az adott időpillanatban a laterális farokvénából vért vettünk az inzulin szint meghatározásához. Az inzulin, leptin, triglicerid, TNF-α, aszpartát aminotranszferáz (AST) és alanin aminotranszferáz (ALT) enzimek meghatázozása (Magyariné Berkó Anikó, Dr. Bereczki Zsolt) A 12 hetes periódus végén ELISA módszerrel (SunRed Biological Technology Co., Shanghai) meghatároztuk a szérum inzulin, plazma leptin, triglicerid, TNF-α, AST és ALT enzimek koncentrációját. AST /ALT mérés BioLis 24i Premium műszer segítségével történt A MPO enzim aktivitásának meghatározása (Dr. Hegyköziné Veszelka Médea, Dr. Lőrinczi Gábor) A szívben mért MPO enzim aktivitását a 12 hetes periódus végén a korábban leírt módszer segítségével határoztuk meg. Regionális iszkémia/reperfúzió protokoll és coronary flow mintagyűjtés (Szabó Renáta, Dr. Gellért Levente) Cervikális diszlokációt követően a szívet Langendorff perfúziós oszlopra helyeztük. A szíveket az aortán keresztül perfundáltuk a Langendorff-módszer alapján, 70 Hgmm állandó nyomáson, 37 C hőmérsékleten. Perfúziós elegyként Krebs-Henseleit puffert használtunk (95 % O 2 / 5 % CO 2 ; ph 7.4). 10 perc aerob perfúziót követően elkötjük a bal leszálló koronária artériát (LAD), így 15 percig iszkémiát hoztunk létre. A 120 perces reperfúzió elindításához megszüntetjük az elkötést. A reperfúzió első 5 percében coronary flow (CF) mintákat gyűjtünk, melyeket ultrafiltrációs Amicon csövekben koncentráltunk.

11 Az infarktusos terület meghatározása (Dr. Szűcs Gergő) Az infarktusos terület meghatározásához a patkányszíveket, minden egyes kísérlet végén Evans blue oldattal perfundáltuk az aortakanül egyik oldalsó ágán keresztül, majd a mintákat -20 C-on tároltuk a további analízisig. A fagyasztott szíveket az apico-bazális axisra merőlegesen 2 mm-es szeletekre vágtuk, majd 2,3,5- trifeniltetrazolium-klorid (TTC) oldatban 10 percig 37 C-on inkubáltuk. A TTC festést követően a szeleteket formalin majd foszfát pufferbe (ph 7.4) helyeztük 10 percre. A metszeteket két üveglemez közé helyezve digitálisan szkenneltük és Image J programmal értékeltük. Az infarktusos terület nagyságát, a veszélyeztetett területekre (rizikózóna) vonatkozó %-os arányban fejeztük ki. Statisztikai analízis (Dr. Pfeiffer Ilona, Dr. Boldog Eszter, Dr. Ördög Attila) Az adatok átlag ±S.E.M.-ként fejeztük ki. A statisztikai szignifikanciát ANOVA teszttel állapítottuk meg és az eltéréseket p< 0,05 esetén tekintettük szignifikánsnak. EREDMÉNYEK A természetes és mesterséges menopauza hatása a gyulladásos és keringési paraméterekre A TNF-α és IL-6 koncentrációja bal szívkamrában A bal szívkamrában mért TNF-αés IL-6 gyulladáskeltő citokinek tekintetében szignifikáns növekedést tapasztaltunk természetes (A) és mesterséges menopauzát (POVX és OVX) követően. Az IL-6 koncentrációja idős patkányok esetén szignifikánsan magasabb értéket mutatott az ovariektomizált állatokhoz képest. MPO aktivitás bal szívkamrában A MPO enzim aktivitását spektrofotometriásan, az oxidált o-dianizidin mennyiségéből határoztuk meg. Az ösztrogénhiány következtében az MPO aktivitás szignifikánsan emelkedett POVX, OVX és idős nőstények bal szívkamrájában. HO aktivitás és expresszió bal szívkamrában A HO aktivitásra a képződött bilirubin mennyiségből következtettünk. Természetes és mesterséges menopauzát (POVX,OVX) követően szignifikáns csökkenést tapasztaltunk a HO enzim aktivitásában kontroll nőstényekhez képest.

12 HO- gátlás hatása a szívizom iszkémiára A+P modellben (ST depresszió) Intravénásan adrenalin (A; 10,0 µg/kg), majd 30 s elteltével fentolamin (P; 15,0 mg/kg)- kezelést követően az ST szegmens változásait standard felszíni ECG II-vel vizsgáltuk. A beavatkozás következtében a POVX, OVX és idős nőstények esetén markáns ST szegmens depresszió jelentkezett. SnPP-vel történő előkezelés (30 µmol/kg, 24 illetve 1 órával a mérés előtt) súlyosbította az ST depresszió mértékét. A kalória megvonás (CR), magas triglicerid tartalmú diéta (HT) és a rekreatív testmozgás hatásának vizsgálata reproduktív korú, illetve ösztrogénhiányos nőstényekben A vércukorszint változása 12 hetes kísérleti periódust követően SO és OVX nőstényekben A magas vércukorszinttel járó szénhidrát anyagcserezavar, a csökkent glükóz tolerancia diagnózisa orális glükóz tolerancia teszttel (OGTT) állítható fel, melyet 12 órás táplálékmegvonást követő éhgyomri vércukorszint meghatározását követően vizsgáltunk. Tizenkéthetes kísérleti periódust követően meghatároztuk az éhhomi (0. perc), illetve 30., 60. és 120. percben mért vércukor értékeket. Az áloperált (SO) és ovariektomizált (OVX) nőstények esetén a 60. percben történő OGTT kezelést követően tapasztaltuk a legjelentősebb vércukorszint változást. A 12 hetes CR diéta illetve a rekreatív testmozgás kombinált hatása szignifikáns csökkenést eredményezett a vércukor értékekben. A szérum inzulin szint változása 12 hetes kísérleti periódust követően SO és OVX nőstényekben A szérum inzulin szintet a 12 hetes diétát és/ vagy tréning periódust követően, a vércukor értékek meghatározásnál is figyelembe vett időpillanatokban (0., 30., 60. és 120. perc) határoztuk meg. A HT diéta és ösztrogénhiány következtében emelkedett inzulin értékeket a CR diéta és a 12 hetes rekreatív testmozgás kombinált hatása jelentősen csökkentette. A plazma leptin szint változása 12 hetes kísérleti periódust követően SO és OVX nőstényekben A 11. ábrán jól látható, hogy az ösztrogénhiányos, illetve a HT diétán tartott állatok plazma leptin értékei mutatják a legmagasabb értékeket, azonban ezt a megnövekedett leptin koncentrációt 12 hetes tréning protokollunk szignifikánsan csökkentette.

13 A plazma triglicerid szint változása 12 hetes kísérleti periódust követően SO és OVX nőstényekben A plazma triglicerid értékek a HT diéta eredményeként jelentősen emelkedtek SO és OVX nőstényekben egyaránt. A CR diéta és a rekreatív testmozgás azonban csökkentette a triglicerid értékeket. A plazma AST és ALT enzimek koncentrációja 12 hetes kísérleti periódust követően SO és OVX nőstényekben A transzaminázok a májat érintő gyulladási folyamatok indikátorai, melyek a májat érintő sérülés során jutnak a keringésbe. Eredményeink egyértelműen mutatják, hogy az ösztrogénhiányos állapot, valamint a HT diéta markánsan megemelte az enzimek szintjét a vérplazmában. A csökkentett kalóriabevitel, illetve a rekreatív testmozgás azonban jelentősen mérsékelte az AST és ALT enzimek szintjét. A TNF-α koncentrációja 12 hetes kísérleti periódust követően SO és OVX nőstényekben A TNF-α gyulladáskeltő citokin koncentrációja jelentősen emelkedett ovariektómia és HT diéta következtében, azonban a 12 hetes testmozgás hatékonynak bizonyult a gyulladásos marker szintjének csökkentésében. A MPO enzim aktivitása 12 hetes kísérleti periódust követően SO és OVX nőstényekben Az ösztrogénhiányos állapot és a HT diéta jelentős MPO aktivitás-emelkedést eredményezett, azonban ezt a csökkentett kalóriabevitel és tréning protokollunk kombinált hatása szignifikánsan csökkentette a gyulladás mértékét. Eredményeink összhangban állnak azokkal a megfigyelésekkel, miszerint szoros összefüggés vonható az ösztrogénhiány, az életkor és a metabolikus- valamint kardiovaszkuláris betegségek incidenciája között. A veszélyeztetettség megállapításakor a rizikófaktorok jelentőségével is számolnunk kell, melyben kiemelt fontosságú az életmód (legfőképpen a táplálkozási szokások, a dohányzás és a testmozgás hiánya).

14 Kísérleteinkkel igazoltuk, hogy az ösztrogénhiány és a magas triglicerid tartalmú diéta következtében kialakuló kardiovaszkuláris rizikó szoros összefüggésbe hozható a gyulladásos folyamatok megjelenésével, valamint az antioxidáns rendszerek csökkent működésével. A rendszeres testmozgás hozzájárul az angina elleni védelemhez, javítja a metabolikus paramétereket és csökkenti a gyulladásos markerek szintjét, mellyel potenciális nem-farmakológiás kezelési módszernek bizonyul fertilis korban és menopauzában egyaránt.

15 IRODALMI JEGYZÉK Acs, N., B. Szekacs, G. L. Nadasy, S. Varbiro, Z. Miklos, M. Szentivanyi, Jr. and E. Monos (2000). "Effects of combined sex hormone replacement therapy on small artery biomechanics in pharmacologically ovariectomized rats." Maturitas 34(1): Bradley, R. L., J. Y. Jeon, F. F. Liu and E. Maratos-Flier (2008). "Voluntary exercise improves insulin sensitivity and adipose tissue inflammation in diet-induced obese mice." Am J Physiol Endocrinol Metab 295(3): E Brandes, R. P., I. Fleming and R. Busse (2005). "Endothelial aging." Cardiovasc Res 66(2): Cameron, I., M. A. Alam, J. Wang and L. Brown (2012). "Endurance exercise in a rat model of metabolic syndrome." Can J Physiol Pharmacol 90(11): Chomczynski, P. and N. Sacchi (1987). "Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction." Anal Biochem 162(1): Essig, D. A., D. R. Borger and D. A. Jackson (1997). "Induction of heme oxygenase-1 (HSP32) mrna in skeletal muscle following contractions." Am J Physiol 272(1 Pt 1): C Ghisletti, S., C. Meda, A. Maggi and E. Vegeto (2005). "17beta-estradiol inhibits inflammatory gene expression by controlling NF-kappaB intracellular localization." Mol Cell Biol 25(8): Ghosh, S., S. Golbidi, I. Werner, B. C. Verchere and I. Laher (2010). "Selecting exercise regimens and strains to modify obesity and diabetes in rodents: an overview." Clin Sci (Lond) 119(2): Gielen, S., G. Schuler and V. Adams (2010). "Cardiovascular effects of exercise training: molecular mechanisms." Circulation 122(12): Gouva, L. and A. Tsatsoulis (2004). "The role of estrogens in cardiovascular disease in the aftermath of clinical trials." Hormones (Athens) 3(3): Hajer, G. R., T. W. van Haeften and F. L. Visseren (2008). "Adipose tissue dysfunction in obesity, diabetes, and vascular diseases." Eur Heart J 29(24): Hamilton, K. L., L. Lin, Y. Wang and A. A. Knowlton (2008). "Effect of ovariectomy on cardiac gene expression: inflammation and changes in SOCS gene expression." Physiol Genomics 32(2): Han, S. Z., H. Karaki, Y. Ouchi, M. Akishita and H. Orimo (1995). "17 beta-estradiol inhibits Ca2+ influx and Ca2+ release induced by thromboxane A2 in porcine coronary artery." Circulation 91(10): Heffernan, K. S., C. A. Fahs, S. M. Ranadive and E. A. Patvardhan (2010). "L-arginine as a nutritional prophylaxis against vascular endothelial dysfunction with aging." J Cardiovasc Pharmacol Ther 15(1): Hu, F. B., F. Grodstein, C. H. Hennekens, G. A. Colditz, M. Johnson, J. E. Manson, B. Rosner and M. J. Stampfer (1999). "Age at natural

16 menopause and risk of cardiovascular disease." Arch Intern Med 159(10): Kamada, M., M. Irahara, M. Maegawa, Y. Ohmoto, T. Takeji, T. Yasui and T. Aono (2001). "Postmenopausal changes in serum cytokine levels and hormone replacement therapy." Am J Obstet Gynecol 184(3): Kandasamy, A. D., A. K. Chow, M. A. Ali and R. Schulz (2010). "Matrix metalloproteinase-2 and myocardial oxidative stress injury: beyond the matrix." Cardiovasc Res 85(3): Kang, S., K. B. Kim and K. O. Shin (2013). "Exercise training improves leptin sensitivity in peripheral tissue of obese rats." Biochem Biophys Res Commun 435(3): Kushida, T., G. Li Volti, S. Quan, A. Goodman and N. G. Abraham (2002). "Role of human heme oxygenase-1 in attenuating TNF-alpha-mediated inflammation injury in endothelial cells." J Cell Biochem 87(4): Lucotti, P., L. D. Monti, E. Setola, E. Galluccio, R. Gatti, E. Bosi and P. Piatti (2011). "Aerobic and resistance training effects compared to aerobic training alone in obese type 2 diabetic patients on diet treatment." Diabetes Res Clin Pract 94(3): Maines, M. D. (1997). "The heme oxygenase system: a regulator of second messenger gases." Annu Rev Pharmacol Toxicol 37: Maines, M. D. (2005). "The heme oxygenase system: update 2005." Antioxid Redox Signal 7(11-12): Maines, M. D., G. M. Trakshel and R. K. Kutty (1986). "Characterization of two constitutive forms of rat liver microsomal heme oxygenase. Only one molecular species of the enzyme is inducible." J Biol Chem 261(1): McCay, C., M. Crowell and L. Maynard (1935). "The effect of retarded growth upon the lifespan and upon the ultimate body size." J Nutr 10(63). Motterlini, R., J. E. Clark, R. Foresti, P. Sarathchandra, B. E. Mann and C. J. Green (2002). "Carbon monoxide-releasing molecules: characterization of biochemical and vascular activities." Circ Res 90(2): E Nath, K. A. (2006). "Heme oxygenase-1: a provenance for cytoprotective pathways in the kidney and other tissues." Kidney Int 70(3): Niessner, A., B. Richter, M. Penka, S. Steiner, B. Strasser, S. Ziegler, E. Heeb-Elze, G. Zorn, A. Leitner-Heinschink, C. Niessner, J. Wojta and K. Huber (2006). "Endurance training reduces circulating inflammatory markers in persons at risk of coronary events: impact on plaque stabilization?" Atherosclerosis 186(1): North, B. J. and D. A. Sinclair (2012). "The intersection between aging and cardiovascular disease." Circ Res 110(8): Okura, T., M. Koda, F. Ando, N. Niino, S. Ohta and H. Shimokata (2003). "Association of polymorphisms in the estrogen receptor alpha gene with body fat distribution." Int J Obes Relat Metab Disord 27(9): Posa, A., K. Kupai, R. Menesi, Z. Szalai, R. Szabo, Z. Pinter, G. Palfi, M. Gyongyosi, A. Berko, I. Pavo and C. Varga (2013). "Sexual

17 dimorphism of cardiovascular ischemia susceptibility is mediated by heme oxygenase." Oxid Med Cell Longev 2013: Posa, A., R. Szabo, A. Csonka, M. Veszelka, A. M. Berko, Z. Barath, R. Menesi, I. Pavo, M. Gyongyosi, F. Laszlo, K. Kupai and C. Varga (2015). "Endogenous Estrogen-Mediated Heme Oxygenase Regulation in Experimental Menopause." Oxid Med Cell Longev 2015: Posa, A., R. Szabo, K. Kupai, Z. Barath, Z. Szalai, A. Csonka, M. Veszelka, M. Gyongyosi, Z. Radak, R. Menesi, I. Pavo, A. M. Berko and C. Varga (2015). "Cardioprotective effects of voluntary exercise in a rat model: role of matrix metalloproteinase-2." Oxid Med Cell Longev 2015: Posa, A., R. Szabo, K. Kupai, A. Csonka, Z. Szalai, M. Veszelka, S. Torok, L. Daruka and C. Varga (2015). "Exercise training and calorie restriction influence the metabolic parameters in ovariectomized female rats." Oxid Med Cell Longev 2015: Reeve, J. L., A. M. Duffy, T. O'Brien and A. Samali (2005). "Don't lose heart--therapeutic value of apoptosis prevention in the treatment of cardiovascular disease." J Cell Mol Med 9(3): Ridker, P. M., C. H. Hennekens, J. E. Buring and N. Rifai (2000). "C-reactive protein and other markers of inflammation in the prediction of cardiovascular disease in women." N Engl J Med 342(12): Rosano, G. M., C. Vitale, G. Marazzi and M. Volterrani (2007). "Menopause and cardiovascular disease: the evidence." Climacteric 10 Suppl 1: Ross, J. L. and S. E. Howlett (2012). "Age and ovariectomy abolish beneficial effects of female sex on rat ventricular myocytes exposed to simulated ischemia and reperfusion." PLoS One 7(6): e Ryter, S. W., J. Alam and A. M. Choi (2006). "Heme oxygenase-1/carbon monoxide: from basic science to therapeutic applications." Physiol Rev 86(2): Sato, M., M. K. Rippy and H. U. Bryant (1996). "Raloxifene, tamoxifen, nafoxidine, or estrogen effects on reproductive and nonreproductive tissues in ovariectomized rats." FASEB J 10(8): Schulz, R. (2007). "Intracellular targets of matrix metalloproteinase-2 in cardiac disease: rationale and therapeutic approaches." Annu Rev Pharmacol Toxicol 47: Speretta, G. F., M. C. Rosante, F. O. Duarte, R. D. Leite, A. D. Lino, R. A. Andre, J. G. Silvestre, H. S. Araujo and A. C. Duarte (2012). "The effects of exercise modalities on adiposity in obese rats." Clinics (Sao Paulo) 67(12): Straub, R. H. (2007). "The complex role of estrogens in inflammation." Endocr Rev 28(5): Suganami, T., J. Nishida and Y. Ogawa (2005). "A paracrine loop between adipocytes and macrophages aggravates inflammatory changes: role of free fatty acids and tumor necrosis factor alpha." Arterioscler Thromb Vasc Biol 25(10): Sullivan, J. M. and L. P. Fowlkes (1996). "Estrogens,

18 menopause, and coronary artery disease." Cardiol Clin 14(1): Sumino, H., T. Takahashi, T. Itoh, K. Kusaka, J. Yamakawa, S. Ichikawa, M. Kurabayashi and T. Kanda (2004). "Plasma adiponectin levels in post-menopausal women receiving hormone replacement therapy." J Int Med Res 32(6): Thornton, T. M., G. Pedraza-Alva, B. Deng, C. D. Wood, A. Aronshtam, J. L. Clements, G. Sabio, R. J. Davis, D. E. Matthews, B. Doble and M. Rincon (2008). "Phosphorylation by p38 MAPK as an alternative pathway for GSK3beta inactivation." Science 320(5876): Weiss, E. P. and L. Fontana (2011). "Caloric restriction: powerful protection for the aging heart and vasculature." Am J Physiol Heart Circ Physiol 301(4): H Weiss, E. P., S. B. Racette, D. T. Villareal, L. Fontana, K. Steger-May, K. B. Schechtman, S. Klein, J. O. Holloszy and C. G. Washington University School of Medicine (2006). "Improvements in glucose tolerance and insulin action induced by increasing energy expenditure or decreasing energy intake: a randomized controlled trial." Am J Clin Nutr 84(5): Wellen, K. E. and G. S. Hotamisligil (2003). "Obesity-induced inflammatory changes in adipose tissue." J Clin Invest 112(12): Yasui, T., M. Maegawa, J. Tomita, Y. Miyatani, M. Yamada, H. Uemura, T. Matsuzaki, A. Kuwahara, M. Kamada, N. Tsuchiya, M. Yuzurihara, S. Takeda and M. Irahara (2007). "Changes in serum cytokine concentrations during the menopausal transition." Maturitas 56(4): Zou, Y., K. J. Jung, J. W. Kim, B. P. Yu and H. Y. Chung (2004). "Alteration of soluble adhesion molecules during aging and their modulation by calorie restriction." FASEB J 18(2):