Agyi hálózatok kutatási lehetőségei: kombinált elektrofiziológiai, viselkedési és molekuláris módszerek

Átírás

1 Agyi hálózatok kutatási lehetőségei: kombinált elektrofiziológiai, viselkedési és molekuláris módszerek Arszovszki Antónia MTA-ELTE NA B Molekuláris és Rendszer Neurobiológiai Kutatócsoport

2 Mi alkotja az agyat? ~ 2.6 x x 10 9 a becsült neuron mennyiség eltérő denzitás a különböző agyterületeken: (agranuláris kéreg: neuron/0,001 mm 3, látókéreg : neuron/0,001 mm 3 ) ~10% neuron ~90% ~10% ~90% glia astroglia mikroglia oligodendrocyta serkentősejt (glutamáterg) vetítő piramissejt gátlósejt (GABAerg) lokális interneuron vetítő interneuron

3 etilla terminológia avagy mi alapján kategorizáljuk az idegsejteket? Morfológiai jellemzők Szóma alak méret; orientáció Dendritek arborizáció polaritás elágazások finom struktúra posztszinaptikus elemek Axon iniciális szegmentum arborizáció terminalis alakja elágazások butonok szinaptikus célterületek The etilla Interneuron Nomenclature Group (ING, 2008) A64- Kapcsolatok kémiai és/vagy elektromos szinapszisok forrás elhelyezkedés és eloszlás Lasztóczi & Klausberger, 2014)

4 etilla terminológia avagy mi alapján kategorizáljuk az idegsejteket? calbindin Molekuláris jellemzők transzkripciós faktorok (c-fos) neurotranszmitterek vagy szintetizáló enzimeik (TH) neuropeptidek kálcium-kötő fehérjék (calbindin, parvalbumin, calretinin.) receptorok: ionotrop; metabotrop szerkezeti fehérjék sejtfelszíni markerek ion-csatornák konnexinok transzporterek neurobiotin

5 Típus: piramissejt (70%) kortex, hippokampusz, amygdala szaglógumó, striatum, középagy, köztiagy, gerincvelő Serkentősejtek iramissejtek Morfológiai jellemzők: jellegzetes piramis alakú szóma 2 különböző (apikális, bazális ) tüskés dendritfa tüske: legtöbb serkentő bemenet ide érkezik szinaptikus integráció!!! Neurotranszmitter: glutamát - NMDA, AMA receptorok Molekuláris jellemzők: kálcium-kötő fehérje (CB+ ;CB-) rojekció: számos távoli agyterületre Egyéb serkentő sejttípusok: szemcsesejt (hipp.), tüskés csillagsejt (kortex) Egyéb serkentő neurotranszmitter: acetilkolin, katekolaminok, szerotonin, hisztamin (Arszovszki et al., 2014) a/ Wooley et al., 1996 b/ Matus, 2000

6 Típusok: lokális interneuron (struktúrán belül marad, serkentősejteket gátol) interneuron-specifikus interneuron (struktúrán belül marad, interneuronokat gátol) Gátlósejtek Interneuronok -/+ kapcsolat -/- kapcsolat vetítő interneuron (kilép a struktúrából és távolabbi területeken lévő sejteket gátol) -/+;-/-; kapcsolat Morfológiai jellemzők: szóma alakja heterogén (fusiform, poligonális, kerek ) dendrit leggyakrabban sima, ritkán tüskés Molekuláris jellemzők: rendkívül heterogén Neurotranszmitter: GABA GABAA, GABAB Feed-back gátlás + - Feed-forward gátlás + -

7 Hippocampus (dca1) 1. Szomatikus interneuronok: (lokális) (1-4) 2. Dendritikus interneuronok: (lokális/projekciós) (5-18) 3. Interneuron-specifikus interneuronok: (19-21) CB+ piramissejt CB- piramissejt

8 etilla terminológia avagy mi alapján kategorizáljuk az idegsejteket? Elektrofiziológiai jellemzők A (unit) asszív vagy küszöb alatti paraméterek: nyugalmi membrán potenciál membrán idő állandó bemeneti ellenállás oszcilláció és rezonancia rektifikáció Akciós potenciál (A) jellemzők: amplitúdó küszöb fél-szélesség (half-width); hiperpolarizáció utáni szakasz depolarizáció utáni szakasz A hullámforma változások dendritikus visszaterjedés depolarizációs plató Tüzelési mintázat: oszcillatórikus és rezonáns viselkedés stimulációkra adott válaszok extracellulárisan elvezetett tüzelés (unit/spike) oszcillációhoz viszonyuló fáziskapcsoltság funkcionális válasz specifitás autokorreláció / keresztkorreláció lokális mezőpotenciál (LF) változásai osztszinaptikus válaszok: spontán és kiváltott S receptor alegységek aránya térbeli és időbeli összegződés rövid- és hosszú távú plaszticitás réskapcsolatok (gap junctions)

9 EEG rágcsálókban 500ms 1mV 100ms 1mV lassú hullám Hz lassú hullámú alvás delta 1-4 Hz lassú hullámú alvás theta 4-8 Hz exploráció, szenzoros feldolgozás, REM alvás (paradoxical sleep) (alpha 9-13 Hz éber inaktív állapot) béta Hz szenzoros feldolgozás gamma Hz exploráció, szenzoros feldolgozás, REM alvás éleshullám (sharp-wave ripple) Hz mozdulatlan állapot, táplálkozási magatartás, lassú hullámú alvás

10 Hálózatkutatás matematikai hálózat kommunikációs hálózat (facebook ) számítógépes hálózat (internet ) vállalati hálózat közlekedési hálózat. mesterséges neuronhálózat F C B A D E

11 Valódi neuronhálózat IR becsült szinapszisok száma : több száz/több ezer szinapszis érkezik egy sejttestre és dendritjeire sok sejt felől egyszerre a dendritekre érkező jelek összeadódnak, ha elérik a küszöböt A keletkezik és az ingerület az axonon elindul a célsejtek felé (axonelágazások) nem digitális rendszer A kivételével a szinapszisok nem állandóak, dinamikusan változnak időben hosszú projekciók esetén vagy direkt a célterületre vetít a sejt vagy átkapcsol valahol (direkt kapcsolat vs. sorba kapcsolt) egyes agyterületen ritmusgenerátor sejtek (oszcillációk) távoli agyterületek közti fáziskapcsoltság

12 szóma tüskés dendrit iramissejt + axonelágazás serkentő bouton axon (mielinizált főaxon) Interneuron axon - l gátló bouton sima dendrit vetítő lokális interneuron-specifikus vetítő

13 Neuronhálózatok:huzalozás - 1.agyterület + l 2.agyterület l + 1.agyterület 2.agyterület + - l + + l

14 Neuronhálózatok:huzalozás 1.agyterület 2.agyterület - l l + 1.agyterület 2.agyterület l l l + l +

15 Neuronhálózatok: precíz időzítés 1.agyterület 2.agyterület + - l l agyterület l

16 Neuronhálózatok: precíz időzítés 1.agyterület 2.agyterület - l l + Időleges csatoltság kialakulása: először helyben, majd távoli területek között Az oszcillációk szinkronitásának térbeli eloszlása konnektom változik-e egy bizonyos folyamat során. l 1:1 fázis szinkron 1:4 fázis szinkron fázis-amplitúdó szinkron alva és alva, 2012 alapján

17 Neuronhálózatok: fáziskapcsoltság theta oszcilláció (4-8 Hz) unit LF l theta viselkedő patkányban (6-9Hz) exploráló magatartásnál REM alvásban uretán altatásban (3-6Hz) +

18 Hagmann et al., 2008, alapján Konnektom: hálózati térkép Konnektom: az idegrendszeri strukturális kapcsolatok teljes leírása (huzalozás) Konnektomika: sejtcsoportok, hálózatok feltérképezése, adatelemzés funkcionális képalkotó módszerek, diffúziós eljárások (fmri, ET )

19 Az agy kapcsolatainak szintjei Strukturális kapcsoltság (anatómiai kapcsolatok) Funkcionális kapcsoltság (koherencia, korrelációk) Effektív kapcsoltság (információáramlás) fmri EEG TMS MEG

20 Inger feldolgozás viselkedés MÉM: 10%? LUCY tévhit

21 Elektrofiziológia Anatómia Funkcionális képalkotó módszerek Neuronhálózat Optogenetika Molekuláris biológia OMICS Matematikai modellek, AI

22 Hálózatkutatásban alkalmazott kombinálható technikák Anatómiai kapcsolatok: (időben rögzített) retrográd/anterográd tracerek (vírusok) immunhisztokémia (IHC) in situ hibridizáció (ISH) fluorescens, fény- és elektronmikroszkópia 3D rekonstrukció átlátszó agy/patkány projekt Funkcionális kapcsolatok: (valós idejű) elektrofiziológia funkcionális képalkotó módszerek (fmri, ET, NIRS, SECT, MEG ) 2-foton mikroszkópia fluorescens molekulával jelölt partikulumok (fehérje, mrns stb ) nyomonkövetése optogenetika, optofarmakológia (Chudakov és mtsai, 2010)

23 Elektrofiziológia egy/többelektródás rendszerek Egyelektródás elvezetések: (üveg, fém) elektród/neuron pozíciója alapján: extracell, juxtacell, intracell Előnyök: elektrolit oldat összetétele választható (KCl, NaCl stb ) elvezetés után sejtjelölés, részletes morfológia, sejtprofil meghatározás, 3D rekonstrukció drót: egyszerű, olcsó, adott területről EEG-t és multi-unitot elvezetni Többelektródás rendszerek: (üveg-, fém-, szénelektródok) sejthálózatok populációs aktivitásának vizsgálata horizontális, vertikális, (tetród, optród, 16, 32, 64, 128, fólia) Előnyök: csatornaszámtól függően akár többszáz sejt tüzelési mintázatának egyidejű értékelése

24 Elektrofiziológia egyelektródás rendszerek Juxtacell Intracell Extracell Extracelluláris (üveg) Juxtacelluláris (üveg) Intracelluláris (üveg) atch-clamp (üveg) Egyszerű drót (fém) Előny: egyedi sejt tulajdonságai mérhetőek Hátrány: kis elemszám Na + Cl - Na + Cl - Ca 2+ K + K + K + Ca 2+ K + Ca 2+ K + K + Ca2+ Ca 2+ K + K+ Cl - Na + Na + Na + Cl - Cl - Cl - Na + Na +

25 Intracelluláris elvezetés (sharp electrode) : Elektrofiziológia üvegelektródák Mit mérünk? membrán jellemzők, membránpotenciál Hol mérjük? In vitro: szeletben In vivo: altatott állatban Előnyök: nagyon részletes intracell jel sejtjelölés, post-hoc azonosítás Technikai jellemzők: hegyméret: <1µm ellenállás: >40mΩ pipetta: 3M KCl + Lucifer yellow (leggyakrabban) konfiguráció: current-clamp

26 Juxtacelluláris elvezetés/jelölés Elektrofiziológia üvegelektródák Mit mérünk? neuron részletes tüzelési mintázata (unit) környezet mezőpotenciálja (LF) Hol mérjük? In vivo: altatott In vivo: szabadon mozgó Előnyök: sejtjelölés, post-hoc azonosítás részletes morfológia, neurokémiai profil, 3D rekonstrukció Technikai jellemzők: hegyméret: ~1µm ellenállás: 10-30mΩ pipetta: NaCl + jelölőanyag (neurobiotin) konfiguráció: current-clamp

27 Juxta: Elvezetés és jelölés üvegelektróddal spontán tüzelési mintázat (NaCl + neurobiotin) stimulálható a sejt (ingerlés, eltérő elektrolit összetétel) sejt/dendritek feltöltése részleges vagy teljes axonhálózat a túlélési idő függvényében

28 Juxta: Analízis Tüzelési mintázat: Regular spiking Fázis-korreláció: Theta melyik fázisán tüzel a sejt? unit Bursty LF Cluster-firing Éleshullám esetén aktiválódik vagy gátlódik a sejt? Autocorrelogram / Cross-correlogram Van-e korreláció egy idősor (EEG) alatt bekövetkező saját események (unit) vagy két sejt tüzelése között? Borhegyi Zs. ábrája

29 Juxta: Morfológia, IHC, projekció, térképezés + 3D rekonstrukció Morfológia: Hol a sejt? Hogy néz ki? Molekuláris profil: Milyen markerfehérjét tartalmaz? rojekció: 3D rekonstrukció összevetve az agy atlaszokkal Rosral Z Caudal

30 Juxta: vca1 vetítő piramissejt A64- (Arszovszki et al., 2014)

31 - l Juxta: Minden egyben Lokális interneuron a basolaterális amygdalában, amely kapcsolódik a hippokampális theta oszcillációhoz (Bienvenu et al. 2012)

32 Juxta kombinációk: Szabadon mozgó állatban viselkedési paradigmában + Előny: Mit csinál 1 neuron adott viselkedés közben? ost-hoc azonosítás lehetősége, 3D rekonstrukció Hátrány: komplikált technika stabilitási problémák viselkedési paradigma esetén előtte hosszú habituáció, tréning

33 Magasrendű kortikális funkciók vizsgálata: szabálykövetés-döntés Wisconsin card sorting test 3 szabály random változik: szín szám forma

34 Hogyan modellezzük a humán teszteket a patkányokban? (Borhegyi és Klausberger, nem publikált kísérlet) atkány a D kiinduló pontból indul, ahol mindig kap egy kis cukros folyadék jutalmat Választ egy cél-kart, ahol ha a válasz megfelel az aktuális szabálynak szintén jutalmat kap A következő kört a kiindulópontra való visszatéréssel indítja róba-szerencse alapján kell tanulnia Teszthelyzetben a már megtanult szabály megváltozik olyanra amit még nem ismer Karim Benchenane et al., Neuron 66, , June 24, 2010

35 Szabadon mozgó juxta: morfológia molekuláris profil (Borhegyi és Klausberger, nem publikált ábra)

36 Juxta kombinációk: rögzített fejű, de mozgó állatban mesterséges vizuális környezetben változatos viselkedési paradigmák lehetősége multiszenzoros funkciók vizsgálata kombinálható egyéb technikákkal (elektrofiziológia, optogenetika, calciumimaging ) aying-quake-with-a-real-mouse/ (Aharoni, 2013 disszertáció )

37 atch-clamp: Elektrofiziológia üvegelektródák Mit mérünk? szinaptikus események, csatorna tulajdonságok membránpotenciál Hol mérjük? In vitro: szeletben Előnyök: sokrétű, nagyfelbontású jel citoplazma kinyerése, részleges vagy teljes mrns profil (szekvenálás, CR) monoszinaptikus kapcsolatban lévő sejtpárok feltérképezése Technikai jellemzők: hegyméret: 1-2µm ellenállás: 3-8mΩ pipetta: KCl / citoplazma kinyerése konfiguráció: voltage-clamp vagy current-clamp

38 Egyszerű drótelektród (single wire): Elektrofiziológia fémelektródák Mit mérünk? LF Hol mérjük? In vivo: altatott állatban In vivo: szabadon mozgó állatban Előnyök: részletes LF és multi-unit elvezetés, akár viselkedés közben is egyszerű, olcsó Hátrány: nincs sejtazonosításra lehetőség

39 Elektrofiziológia többelektródás rendszerek multi-barell elektród tetród (8, 16, 32, 64, 128.) silicon probe fésűelektród fóliaelektród Előny: Csatornaszámtól függően akár többszáz sejt tüzelési mintázatának egyidejű értékelése viselkedés közben!!! Hátrány: sejtek ismeretlenek klaszteranalízis átlagol Buzsaki 2004, Nat Rev Neurosci

40 Elektrofiziológia többelektródás rendszerek fémelektródák Tetród, optród és társai Mit mérünk? tüzelési mintázat + LF Hol mérjük? In vivo: szabadon mozgó állatban Előnyök: csatornaszámtól függően akár többszáz sejt tüzelési mintázatának egyidejű értékelése részletes LF és tüzelési mintázat viselkedés közben hosszú időn keresztül mérhető jel Technikai jellemzők: méret: 15µm ellenállás: kΩ konfiguráció: referencia

41 Elektrofiziológia tetród, optród és társai (Anikeeva et al., 2012)

42 Elektrofiziológia analízis Extracelluláris unit válogatás (cluster-analysis) serkentő és gátlósejtek eltérő spike alak, autokorrelogram

43 Elektrofiziológia silicon probe technológia Előnyök: Réteges struktúrában a vertikális rétegek közötti eltérő LF mérhető a csatorna közti távolság függvényében (CSD). Lasztóczi B. kísérlete nyomán

44 Elektrofiziológia többelektródás rendszerek

45 Elektrofiziológia analízis iramis sejt modell: átlagolt akciós potenciálok sejttesten, dendriteken eltérő spike alak (Schomburg et al. 2012)

46 Térbeli lokalizáció helysejtek HD sejtek (fejforgatás) gridsejtek határsejtek (Hartley et al., 2014)

47 Térbeli lokalizáció: helysejtek helysejtek által kódolt helymező kör alakú arénában O Keefe and Nadel, 1978 után piramissejt ami fáziskapcsolt (theta) helyet kódol (J. O Keefe and M. Recce,1993.)

48 Theta fázis kapcsoltság A helysejt időzítése (spike) kapcsolódik a theta oszcillációhoz és helyet kódol a lineáris karon O Keefe & Recce, Hippocampus, 1993 Skaggs et al., Hippocampus, 1996 Klausberger előadása nyomán

49 Helysejtek navigációs térkép 80 sejt térfüggő tüzelési mintázata ugyanabban a környezetben Fekete: a patkány valós útvonala iros: számítógépes útvonal előrejelzés a helysejtek aktivitásból következtetve Wilson, McNaughton, Science 1993

50 Helysejtek emberben taxisofőr játék navigáció random generált városon keresztül minden városban 3 jelölt célbolt (20-ból) 6 nem jelölt nem célbolt (48-ból) 1 út során 7 utas felvétele és célba juttatása random navigáció közben elvezetés 317 sejtből (frontális és temporális lebeny) (Eckstrom et al., Nature 2003)

51 A Jennifer Aniston neuron Quiroga et al., Nature 2005

52 A neuron doktrinától... (Yuste, 2015) Kulcstechnikák: 1873: Golgi módszer felfedezése (Golgi) 1929: Elektromos elvezetés idegrostból (Adrian) EEG (Hans Berger) 1945: Elektronmikroszkópia (orter és mtsai) 1949: Wolfram mikroelektród (Hubel)

53 a hálózatokig Kulcstechnikák: 1977: Szerves feszültség-indikátorok (Salzberg és mtsai) 1983: Multi-elektród elvezetések, stereotród (Buzsaki és mtsai, McNaughton és mtsai) 1986: Digitális fényképezés, CCD kamerák (Connor) 1990: Funkcionális MRI (Ogawa és mtsai) 2-foton mikroszkópia (Denk és mtsai) 1994: Multi-neuron elvezetések (Meister és mtsai) 1997: Genetikailag-kódolt kalcium indikátorok (Miyawaki)

54 Megjegyzendő információk: serkentő, gátlósejt típusok, általános jellemzők konnektom fogalma, szintjei elektrofiziológiai technikák, előnyök, hátrányok sejtazonosítási technikák, molekuláris profil, rekonstrukció, térképezés navigációhoz, pozícióhoz, látványhoz köthető sejtek Köszönöm a figyelmet!