PhD értekezés tézisei

Átírás

1 PhD értekezés tézisei A fotoszintetikus pigment-protein komplexek szerveződésének akklimatizációs változásai Cd-stressz alatt: A transzkripciós szabályozás szerepe az antenna stresszválaszában. Basa Brigitta Témavezetők: Dr. Sárvári Éva és Dr. Tamás László ELTE Biológia Doktori Iskola (Prof. Dr. Erdei Anna) Kísérletes Növénybiológia Doktori Program (Prof. Dr. Szigeti Zoltán) ELTE Növényélettani és Molekuláris Növénybiológiai Tanszék Budapest 2012

2 Bevezetés A nehézfémek és az általuk okozott károk az emberi tevékenység által váltak környezetvédelmi problémává. Természetes előfordulásuk csekély, vulkanikus, esetenként üledékes kőzetek ritka komponensei. A Cd is ilyen nem-esszenciális átmeneti nehézfém, az élőlényekre, így a növények számára is mérgező. Számos metabolikus folyamatot, köztük a produkció szempontjából nagy jelentőségű fotoszintézist is gátolja. Szerteágazó hatásai közül a fehérjék SH-csoportjaihoz való kötődése és ezáltal funkcionális gátlása, valamint a fémcentrumok esszenciális fémeinek kiszorítása a Cd közvetlen toxicitását jelenti. Ugyanakkor számos közvetett hatása közül az oxidatív stressz és az ionháztartásban okozott zavarai elsődleges jelentőségűek a fotoszintézis szempontjából. A fotoszintetikus apparátus képes bizonyos mértékben alkalmazkodni a stresszorok jelenlétéhez. Az ún. akklimatizáció során megváltozik a fotoszintetikus működés, ami együtt jár a komplexek szerveződésének, ill. az antenna szerkezetének átalakulásával. E folyamatok hátterében transzkripciós, transzlációs és poszt-transzlációs szintű szabályozások egyaránt állhatnak. A Cd gátolja a Fe felvételét és hajtásba történő transzlokációját is, ezért a Cd-stressz egyik jellegzetes tünete a vashiány-okozta klorózis, amiért a vasat igénylő klorofill- (Chl-) szintézis zavara a felelős. A levelek vastartalmának 80%-a a kloroplasztiszokban található, amiből 60% a tilakoid membránokban kötött. A Chl-bioszintézis számos lépéséről tudjuk, hogy vas-igényes folyamat így a klorotikus levelek sárgulása tulajdonképpen a lecsökkent Chl/karotinoid aránynak köszönhető A karotinoidok közül különösen a xantofillok játszanak fontos szerepet a vashiány következtében fellépő fényfelesleg elleni védelemben. A vas csökkent elérhetősége a tilakoidok szerkezetében, polipeptid-összetételében jelentős átalakulásokat indukál. Arra voltunk tehát kíváncsiak, hogy a Fe-hiány milyen mértékben járul hozzá a Cd-stressz pigment-protein komplexeket érintő tüneteihez. Vizsgálatainkhoz a Cd-stresszre és vashiányra egyaránt érzékenyen reagáló cukorrépát választottuk, gyors növekedése és nagy produktivitása miatt. Korábbi kísérleteinkben megfigyeltük, hogy a Cd-stressznek jobban ellenálló nyárfa növények hosszabb idejű Cd-kezelés hatására számos élettani paraméterük helyreállást mutattak. Az újonnan fejlődő levelek nem voltak klorotikusak, a Chl a/b arányuk, és fotoszintetikus aktivitásuk is a kontrollhoz hasonló volt. E változások a pigment-protein komplexek szerveződésének módosulását is jelezték. Azt kívántuk feltárni, hogy milyen folyamatok állhatnak a nyárfa növényeknél megfigyelt, hosszú Cd-kezeléskor 2

3 jelentkező regeneráció hátterében. Ezért a nyárfa növényekben összehasonlítottuk a rövid kezelés során kialakult, akut Cd-stressz által előidézett tilakoid-szerveződés és -összetétel változásokat a hosszú kezelés alatt megfigyelt változásokkal. A Cd-stressznek a fotoszintetikus elektrontranszportra gyakorolt gátló hatása miatt normális megvilágítás mellett is megbomlik az egyensúly az abszorbeált fény és a hasznosítható energia között, vagyis fényfelesleg alakul ki. A fénygyűjtés szabályozására és a fényfelesleg eltávolítására a növényekben többféle mechanizmus alakult ki, amelyekben az Lhc fehérjéknek elsődleges szerep jut. Az Lhc fehérjékből szerveződő Chlprotein komplexek biztosítják a megfelelő mennyiségű foton abszorpcióját a reakciócentrumok maximális hatékonysággal történő működéséhez. Ugyanakkor a növények szárazföldi evolúciója sokféle izoformájukat egyedi fényvédő funkcióval is felruházta, ezáltal is biztosítva a szupramolekuláris fotoszintetikus alkalmazkodó képességét a folytonosan változó környezeti feltételekhez. Arra kerestük a választ, hogy az Lhc izoformáknak milyen szerepe van a Cd-stressz által előidézett akklimatizációban, és ez milyen szintű regulációnak köszönhető. Ennek érdekében vizsgáltuk az antennák izoforma összetételében bekövetkező változásokat a fehérjék szintjén. Ugyanakkor a nyárfa, mint fás szárú genetikai modellnövény alkalmas volt az Lhc géncsalád tagjainak transzkripciós szintű vizsgálatára is. Anyagok és módszerek Kísérleti növényeink közül a cukorrépa (Beta vulgaris L. cv. Orbis) növényeket ½- es töménységű Hoagland tápoldaton neveltük 45 M Fe(III)-EDTA vasforrás mellett klimatizált kamrában neveltük. A növények egy részétől később megvontuk a vasat (-Fe), egy másik növénycsoport tápoldatába pedig 10 µm CdCl 2 -ot adagoltunk (+Cd). A kezelés10. napján vettük a mintákat, a kezelés alatt fejlődött levelekből. A kezelt növények élettani paramétereit kezeletlen (Ko) növények adataival vetettük össze. A nyárfákat (Populus jacquemontiana var. glauca (Haines) Kimura, 1982, cv. Kopeczkii ) szintén klimatizált kamrában, vízkultúrában neveltük. Az ¼-es Hoagland tápoldat 10 M Fe(III)-citrátot tartalmazott. A növények egy részénél 10 M Cd(NO3)2 kezelést alkalmaztunk tíz napon (Cd10), illetve három héten keresztül (Cd21). A mérésekhez mintát vettünk a kezelések előtt már kifejlett, fotoszintetikusan kompetens (-2) 3

4 levelekből, és a kezelések alatt fejlődött (+2) levelekből is. A kezelt növények élettani paramétereit kezeletlen (Ko) növények adataival vetettük össze. Az iontartalom-meghatározást a minták koncentrált salétromsavas feltárását követően Tóth Brigitta és Dr. Lévai László (Debreceni Egyetem) végezték ICP-MS (Perkin-Elmer, USA) műszerrel. A pigment-meghatározás során a minták Chl-tartalmát 80%-os (v/v) acetonos kivonatból Porra és mtsai (1989) módszerével határoztuk meg. A karotinoidok koncentrációját 100%-os (v/v) acetonnal történt kivonás után oldatok Rivas és mtsai (1989) által felállított HPLC oszlopkromatográfiás berendezéssel határoztuk meg. A Chl a fluoreszcencia indukció mérése PAM Chlorophyll Fluorometerrel (Walz, Effeltrich, Germany), intakt leveleken történt. A gerjesztési energia allokációjának vizsgálatához a Hendrickson és mtsai (2005) kioltási paramétereit módosított formában használtuk. A tilakoid-membránok izolálása során Jansson és mtsai (1997) leírását követtük. A Chl-proteineket a nem-ionos detergenst tartalmazó pufferben történ9 szolubilizálását követően Blue-native PAGE-sel választottuk szét (Schägger és von Jagow, 1991), az apoprotein összetételt denaturáló SDS-PAGE-sel (Laemmli, 1970) vizsgáltuk. A BN sávokból izolált komplexek fehérje-összetételét IEF/SDS-PAGE módszerrel analizáltuk. A második dimenziós szeparálást. A géleket Coomassie Briliant Blue G-250-nel festettük meg. A gélek kiértékeléséhez Phoretix (Newcastle, Egyesült Királyság) programot használtunk. A fehérjefoltok tripszines emésztését követően kapott peptideket nanohplc berendezésben (Agilent Technologies, Waldbronn, Germany) választottuk szét. Tömegspektrometriás analízist követően (model HCTPlus, Bruker Daltonik) a fehérjéket a Mascot program segítségével azonosítottuk. Az Lhc géncsalád transzkripciós szintjének qpcr alapú méréséhez oligonukleotidokat terveztünk felhasználva a nyárfa (Populus trichocarpa) publikus genetikai szekvenciáit. A levélmintákból az mrns-ek kinyerését Oligo d(t)25-t tartalmazó mágnesgyöngyökkel végeztük. A cdns-re történt átírás után RiboGreen festékkel határoztuk meg a minták koncentrációját (Libus és Štorchová, 2006). A cdns mintákat templátként használtuk a valós idejű, kvantitatív PCR reakciók kivitelezéséhez, amit az Applied Biosystems SBS 7000 készülékkel végeztük (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). A Real-Time PCR adatok kiértékeléséhez a LinReg (Ramakers és mtsai, 4

5 2003) programot használtuk a relatív mrns szint meghatározás a RiboGreen mérés adataiból származtatott ún. normalizációs faktoron alapult. A méréseket, vizsgálattól függően, 2 2, illetve 3 3 ismétlésben végeztük. A statisztikai analízisben párosítatlan t-próbát használtunk. Eredmények és következtetések A Cd-kezelt cukorrépa növények jelentős mennyiségű nehézfémet halmoztak fel leveikben, azonban a várttól eltérően, a vas levélbeli koncentrációja korántsem csökkent le olyan mértékben, mint a vashiányos tápoldaton nevelt növények esetében. A Chlkoncentráció hasonló mértékű csökkenést mutatott és a Chl a/b arány emelkedését is mindkét stressz alatt megfigyeltük. Mindkét kezelés esetén kimutatható volt a PSII kvantumhatékonyságának csökkenése. A nem-fotokémiai kioltás (NPQ) azonban Cdstressz hatására lecsökkent a vashiányos levelekben viszont lényegesen felerősödött. A tilakoid-membrán komplexei közül a Cd-stressz és a vashiány is leginkább az I. fotokémiai rendszer (PSI) monomer, a II. fotokémiai rendszer (PSII) szuperkomplex és a II. fotokémiai rendszer antenna (LHCII) trimer komplexei akkumulációját gátolta. A Cdstressz hatására és az extrém mértékben vashiányos növényekben tapasztalt változások rendkívül hasonlóak voltak. A szuperorganizáció és az antennák méretének csökkenése redukálta a fényabszorpciót, ami a stressz hatására kialakult fotoinhibíció kivédésére szolgáló túlélési stratégiát lehet a cukorrépában. Ugyanakkor megfigyeltük a PSII lebomlásának felerősödését is, ami azt jelenti, hogy növény már nem volt képes helyreállítani a fényfelesleg okozta károsodásokat. Eredményeink alapján arra következtetünk, hogy a Cd-stressz fotoszintetikus aktivitásváltozással kapcsolatos tüneteinek előidézésében egyrészt a Cd közvetlen hatásainak, másrészt az általa előidézett vashiánynak is szerepe volt. A tilakoidszerveződésben tapasztalt változások alapján azonban azt is feltételezzük, hogy e változások nagy része a nehézfém által indukált, a kloroplasztiszban fellépő lokális vashiánnyal függhet össze. A nyárfa növények stressz folyamán fejlődő leveleiben (+2) az akut Cd stressz hatására a Chl-koncentráció és a Chl a/b arány egyidejű csökkenését tapasztaltuk. Az NPQ és a PSII fotokémiai hatékonysága is jelentősen alacsonyabb volt, mint a kontrollban. 5

6 Ugyanakkor az inaktív PSII reakciócentrumok általi kioltás (Φ NF ) aránya jelentősen megemelkedett a PSII aktuális fotokémiai hatékonyságának (Φ PSII ) terhére ami azt jelzi, hogy a sérült PSII egy része nem vett részt a regenerációs ciklusban, hanem inaktív kioltó centrumként működött. Az akut Cd-stressz leginkább a PSI monomerek mennyiségét csökkentette, ugyanakkor az LHCII antennát tartalmazó komplexek akkumulációját ennél kevésbé gátolta. A PSI szuperkomplexek mennyiségében tapasztalt jelentős emelkedés a ciklikus elektron áramlás előtérbe kerülésére utalhat. Míg a PSII szuperkomplexek arányának megemelkedése azt jelzi a PSII az antennák egy jelentős részével együtt energiadisszipáló szuperkomplexekbe szerveződött. Az LHCII monomerizációjának következtében a fénygyűjtő antenna is kisebb hatékonysággal működött, ezáltal csökkentve az e - -transzportlánc fényterhelését, megelőzve a káros reaktív oxigén-formák képződését. A mérsékelt Cd-stressz jellegzetes tünetei 7-10 napos Cd kezelés után voltak a legkifejezettebbek. Ezt az időszakot a Cd kezelés fenntartása mellett is lassú helyreállás követte. A Chl a/b arány visszaállt a kontrollra jellemző értékre, a fotoszintetikus aktivitás is helyreállt. Ugyanakkor vaskoncentráció szinte alig változott a levélben, ellenben megváltozhatott a vas sejten belüli megoszlása, feltételezhetően a kloroplasztiszok vastartalma emelkedett meg. Az akut Cd stressz hatására nyárfában olyan védekező válasz alakul ki, amelynek köszönhetően a növény képes megőrizni a PS-k intaktságát és olyan mértékben fenntartani a funkciót, hogy a stressz későbbi szakaszában a kontrollhoz hasonló tilakoid-szerveződés helyreállhasson. A helyreállás valószínűleg a kloroplasztisz vastartalmának emelkedésével van összefüggésben. A Cd-stressz hatására bekövetkező transzkripciós szintű változások követéséhez a nagy érzékenységű és specifikus qrt-pcr módszert választottuk. Ahhoz, hogy a mérés során kapott adatok biológiai értelmet nyerjenek megfelelő ún. normalizációs stratégiát kellett választanunk. Az irodalomban leginkább elterjedt, relatív mérésen alapuló módszer a belső kontroll gén(ek) használata. A mérés megbízhatóságához szükséges, hogy a kiválasztott belső kontroll gén(ek) expressziója változatlan szintű legyen, függetlenül a fejlődési állapottól és a külső körülményektől. Az irodalmi adatok alapján kiválasztottunk 4 gyakran használt belső kontroll gént (cyclophilin (cyc), elongation factor-1 α (ef-1 α), polyubiquitin (ubq), tubulin β-chain (tub)) és két kevésbé ismert jelöltet (serine/threonineprotein phosphatase 2A (pp2a), ubiquitin-conjugating enzyme (ubc10), amelyek 6

7 megbízhatóságát vizsgáltuk. A gének transzkripcióját megmértük különböző fejlettségű kontroll és Cd-kezelt nyárfalevelekben és a genorm programmal ellenőriztük változékonyságuk mértékét. A fiatal Cd-kezelt levelekben nagy eltéréseket tapasztaltunk transzkripciójuk szintjében (Basa és mtsai, 2009). Ezért egy alternatív normalizációs módszert választottunk az Lhc gének transzkripciójának méréséhez. A mintában található összes mrns mennyiségének mérésén alapuló, ún. RiboGreen módszer olyan relatív meghatározást tett lehetővé, amelynek segítségével az egyes vizsgált gének egymáshoz képesti kifejeződési szintjét is mérni tudtuk. A Cd-kezelt nyárfák antenna-összetétel 2D IEF/SDS módszerrel vizsgálva, az Lhcb1 és Lhcb2 egyes izoformáinak mennyiségében emelkedést tapasztaltunk, ezzel párhuzamosan az Lhcb3 bizonyos izoformáinak mennyisége jelentősen lecsökkent. A transzkripciós szintű változások is azt mutatták, hogy a nagy mennyiségben expresszálódó Lhcb1 és Lhcb2 gének kevésbé érzékenyek a Cd kezelésre, mint az Lhcb3. A nyárfában tapasztalt akklimatizációs folyamatokban fontos szerepet játszhatnak az Lhcb1 és Lhcb2 fehérjék ugyanis a PSII-ről leváló mobilis LHCII komponenseiként más komplexekhez is kapcsolódhatnak. Így például megnövelhetik a PSI+NDH (NDH: NADPH dehidrogenáz komplex) szuperkomplexek fénygyűjtési hatékonyágát is. Ugyanakkor tudjuk, hogy a PSII-ről leváló mobil LHCII nem tartalmaz Lhcb3-at. Elképzelhető, hogy a fény-disszipáló centrumként működő PSII szuperkomplexekben sem szükséges az Lhcb3 jelenléte. Nyárfa növényekben a legnagyobb mértékben kifejeződő Lhcb1.1 és Lhcb1.2 gének az akut Cdstressz alatt is megőrizték magas arányukat, a jóval kisebb mennyiségben jelen lévő Lhcb1.4 mrns-ei a stressz akut fázisában szinte teljesen eltűntek. Az Lhcb1 izoformák eltérő transzkripciós szabályozása, stressz körülmények között, vélhetően az energiadisszipáló antenna szerveződésének egyik kulcsfontosságú lépése. Az Lhca5 és Lhca6 gének kifejeződését vizsgálva, a kezelés kezdetén magasabb transzkripciót mértünk a Cdkezelt mintákban, mint a kontrollban. Mindkét fehérje a ciklikus elektrontranszportban részt vevő NDH komplexnek a PSI-hez való asszociációjában játszik fontos szerepet, ezért a tapasztalt serkentés a ciklikus elektron áramlás felerősödésével hozható összefüggésbe. Az Lhcb7 mrns szintje Cd-stressz hatására kísérletünk minden mintájában megemelkedett. Az Lhcb7 mrns-ek jelenlétét csak a fénynek leginkább kitett, oszlopos parenchima sejtekben mutatták ki. Ezért feltételezhetően szerepe lehet a többlet fénnyel szembeni védelemben, bár jelenlétét a PSII-ben még nem bizonyították. Cd-stressz hatására két eltérő fejlettségű levélmintában emelkedett meg az Lhcb8 transzkripciója, ami 7

8 alapján arra következtetünk, hogy a levél fejlődési állapota a többi Lhc-től eltérően szabályozza transzkripcióját és a stresszre is tőlük eltérően reagál. A tilakoid komplexek Lhc fehérje-összetételének vizsgálata és a génexpressziós eredmények alapján valószínűsítjük, hogy az Lhc fehérjék mennyiségének szabályozása legfőképp a transzkripción keresztül valósul meg. Az akklimatizáció során megvalósuló kooperációjuk vélhetően a közös transzkripciós szabályozásnak köszönhető. Az eltérő szabályozás alá eső Lhc fehérjékről pedig feltételezzük, hogy kivételezett funkciót tölthetnek be a fotoszintetikus apparátus alkalmazkodásában. Hivatkozások: de las Rivas J, Abadía A, Abadía J, 1989, Plant Physiol. 91: Hendrickson L, Förster B, et al., 2005, Photosynth. Res. 84: Jansson S, Stefánsson H, et al., 1997, Biochm. Biophys. Acta 1320: Laemmli UK, 1970, Nature 227: Libus J, Štorchová H, 2006 Biotechniques 41: Porra RJ, Thompson WA, et al., 1989, Biochim. Biophys. Acta 975: Ramakers C, Ruijter JM, et al., 2003, Neurosci. Lett. 339: Sárvári É, Nyitrai P, 1994, Electrophoresis 15: Schägger H, von Jagow G, 1991, Anal. Biochem. 199: A tézisek alapjául szolgáló közlemények listája A. Referált tudományos folyóiratokban megjelent dolgozatok Solti Á, Szűcs J, Basa B, Sárvári É (2009) Functional and organisational change of photosystem II in poplar thylakoids under Cd stress (Dissipative PSII centres in Cd treated poplar thylakoids). Cer. Res. Commun., 37S, IF: 0 Basa B, Solti Á, Sárvári É, Tamás L (2009) Housekeeping gene selection in poplar plants under Cd-stress: comparative study for real-time PCR normalization. Funct. Plant. Biol., 36, IF: Sárvári É, Solti Á, Basa B, Mészáros I, Lévai L, Fodor F (2011) Impact of moderate Fe excess under Cd stress on the photosynthetic performance of poplar (Populus jaquemontiana var. glauca cv. Kopeczkii). Plant Physiol. Biochem., 49, IF: 2,485 8

9 B. Cikkek konferenciakiadványokban Szegi P, Basa B, Solti Á, Gáspár L, Lévai L, Láng F, Tamás L, Mészáros I, Sárvári É (2007) Time course of the appearance of Cd effects on photosynthetically competent poplar leaves. In: Allen JF, Gantt E, Golbeck JH, Osmond B, eds., Photosynthesis. Energy from the Sun: 14 th International Congress on Photosynthesis, Glasgow, pp C. Összefoglalók referált folyóiratokban Basa B, Gárdonyi M, Sárvári É, Tamás L (2007) Cd-induced changes in the expression of chlorophyll-protein-complexes in Populus glauca. (Abstracts of 2 nd World Conference of Stress, August 2007 Budapest, Hungary) published online in: Budapest Meeting Abstracts Cell Stress Chaperones online 12: 4G-03-P. IF: D. Összefoglalók konferenciakiadványokban Sárvári É, Gáspár L, Szegi P, Basa B, Solti Á, Nyitrai P, Mészáros I (2006): Photosynthetic acclimation under Cd stress in poplar. In: Book of Abstracts of XV. FESPB Congress, Lyon, France, RAS Sárvári É, Solti Á, Basa B, Abadía J, Fodor F (2010) Effect of Cd and Zn treatment and Fe deficiency on chloroplast Fe uptake. In: Program and abstracts of the 15 th International Symposion on Iron nutrition and Interactions in Plants p. Budapest, 107. S3P24. Basa B, Sárvári É, Tamás L (2009) Validation of reference genes in poplar under Cd stress. In: Abstracts of Int. Conf. on Plant Abiotic Stress Tolerance. Vienna, Austria, p Basa B, Solti Á, Sagardoy R, Abadía J, Sárvári É (2010) Compositional changes in the thylakoid complexes under Cd toxicity and iron deficiency studied by 3D electrophoresis and high pressure liquid chromatography techniques In: Program and abstracts of the 15 th International Symposion on Iron nutrition and Interactions in Plants p. Budapest, 135. S5P11. Basa B, Solti Á, Sárvári É, Tamás L (2010): Changes in the transciptional profile of the genes coding for the light harvesting complex proteins under Cd stress in poplar. In: Book of Abstracts of the FESPB XVII. Congress of the Federation of European Societies of Plant Biology P Basa B, Ross K, Solti Á, Szabó K, Sárvári É (2010) Cd induced changes in the organization of chlorophyll-protein complexes in thylakoids and thylakoid domains of poplar. In: Photosynthesis Research for Food, Fuel and the Future, Abstract Book of the 15 th International Congress of Photosynthesis, p. 263 (PS18.41). 9