A Taraxacum officinale és Morus nigra bioaktív anyagainak vizsgálata. Kristó Tita Szidónia

Átírás

1 SEMMELWEIS EGYETEM GYÓGYSZERTUDOMÁNYOK DOKTORI ISKOLA A Taraxacum officinale és Morus nigra bioaktív anyagainak vizsgálata Doktori (Ph. D.) értekezés Kristó Tita Szidónia Témavezeto: Dr. Kéry Ágnes, Ph. D. Készült: Semmelweis Egyetem, Gyógyszerésztudományi Kar, Farmakognózia Intézet Budapest,

2 Ph. D. doktori értekezés A Taraxacum officinale és Morus nigra bioaktív anyagainak vizsgálata Kristó Tita Szidónia Témavezeto: Dr. Kéry Ágnes c. egyetemi tanár Semmelweis Egyetem, Gyógyszerésztudományi Kar, Farmakognózia Intézet, 2002 Összefoglaló A növényi eredetu, biológiailag aktív anyagok egyre szélesebb köru és aprólékosabb farmakológiai vizsgálata az új, gyors, pontos és hatékony extrakciós és fitoanalitikai módszerek alkalmazását sürgeti. A jól összehangolt kémiai-farmakológiai kutatások egyúttal adatokat szolgáltathatnak a szerkezet-hatás összefüggésekkel kapcsolatban is. Számos kísérleti adat támasztja alá, hogy az eddig nem hatóanyagnak tekintett növényi összetevok jelentosen befolyásolhatják a gyógynövények és kivonataik aktivitását, illetve biztonságos felhasználásuk is módosulhat. A Taraxacum officinale és Morus nigra bioaktív anyagai közül a gyulladáscsökkento, immunmoduláns, daganatellenes tulajdonságokkal rendelkezo triterpének és fitoszterolok tanulmányozásához az ezidáig foleg illó komponensek eloállítására alkalmazott hatékony, környezetkímélo szuperkritikus extrakciót alkalmaztuk. Optimalizáltuk a kísérleti paramétereket (nyomás, homérséklet) és megvalósítottuk a hatóanyagok jelentos és szelektív dúsítását. Az elonyök és hátrányok mérlegelése céljából a kivonás hatékonyságát összehasonlítottuk a hagyományos módszerekkel. Az extraktumok kvantitatív értékeléséhez VRK-denzitometriás módszert dolgoztunk ki és megállapítottuk, hogy a szuperkritikus extraktumokban a hatóanyagok esetenként 10%-ig is feldúsultak. A Taraxacum officinale és a Morus nigra liofilizált kivonatai antioxidáns, szabadgyökfogó aktivitással rendelkeznek, amit in vitro vizsgálatokkal bizonyítottunk. A hatásért felelos vegyületek feltárásához kapillárelektroforézist alkalmaztunk, melynek hatékonyságát nagynyomású folyadék-kromatográfiás módszerrel is összehasonlítottuk. Azonosítottuk a drogok fenoloid komponenseit (Taraxacum officinale: apigenin-7-o-?-glükozid, luteolin-7-o-?-glükozid, klorogénsav; Morus nigra: kvercetin-3-o-ramnoglükozid; kvercetin-3-o-glükozid, klorogénsav) és eltéro hatásmechanizmusuk (kelátképzo, szuperoxid ion scavanger) alapján valószínusítettük különbözo betegségekben való alkalmazhatóságukat.

3 Ph. D. Thesis Investigation of bioactive compounds from Taraxacum officinale and Morus nigra Kristó Tita Szidónia Supervisor: Prof. Dr. Ágnes Kéry Department of Pharmachognosy, Faculty of Pharmacy, Semmelweis University, 2002 Summary The results of the continously expanding and detailated pharmacological researches on bioactive plant components call for new, accurate and efficient extraction and phytoanalitical methods to invent and identify the pharmacologically active components. The syncronized biologicalchemical studies can give new answers to questions of structure-activity relationships too. It can be concluded from lots of experimental and clinical data that some so far not bio-active considerated components may influence the efficacy and safety of medical plant extracts through pharmacodynamic or pharmacokinetic way. The antiinflammatory, immunomodulator triterpenes and phytosterols in Taraxacum officinale and Morus nigra were studied in order to find optimal extraction technology. The environmentaly acceptable supercritical fluid extraction have been choosen, which received reduced interest for the extraction of medicinal plant metabolites except volatile and fixed oils. The optimal extraction parameters (pressure, temperature) were determined, which resulted successfull enrichment of active components in supercritical CO 2 extracts. To consider the advantages and disadvantages of the supercritical fluid extraction, the results were compared with the traditional extraction methods. For the quantive evaluation of the extracts a thin layer chromatographic densitometric method was developed and it was demonstrated that some supercritical extracts contained up to 10% (g/ 100 g) of active components. It was proved that the liofilized aqueous and methanolic extracts of Taraxacum officinale and Morus nigra exhibit significant antioxidant activity in in vitro models. To search for possible active components responsible for scavanging activity, capillary electrophoresis was used providing good separation in a relatively short time. Results were compared with high pressure liquid chromatography. Identifing the fenoloid components (Taraxacum officinale: apigenin-7- O-?-glucosid, luteolin-7-o-?-glucosid, chlorogenic acid; Morus nigra: quercetin-3-o rhamnoglucosyl, quercetin-3-o-glucosid, chlorogenic acid) we postulated the possible traditional use, based on the antioxidant (chelating and superoxid scavanging) activity due to their influence on pathological free radical reactions.

4 TARTALOMJEGYZÉK ÖSSZEFOGLALÓ 2 SUMMARY 3 TARTALOMJEGYZÉK 4 1 BEVEZETÉS 7 2 CÉLKITUZÉSEK 9 3 IRODALMI ÁTTEKINTÉS SZUPERKRITIKUS EXTRAKCIÓ Muveletek szupekritikus oldószerekkel A szuperkritikus extrakció alapjai Fizikai-kémiai alapfogalmak Oldószerválasztás Az extrakció folyamata A szuperkritikus extrakció alkalmazása növényi hatóanyagok kivonásánál KAPILLÁRIS ELEKTROFORÉZIS Általános jellemzés alapfogalmak Szeparációs lehetoségek A kapilláris elektroforézis összehasonlítása más analitikai technikákkal Flavonoidok CE analízise Flavonoid aglikonok Flavonoid glikozidok Elméleti számítások TRITERPÉNEK ÉS FITOSZTEROLOK Általános szerkezeti jellemzés Triterpének és szteroidok bioszintézise A triterpének és szteroidok alkalmazása Triterpének Fitoszterolok FLAVONOIDOK Általános jellemzés 40 4

5 Biológiai tulajdonságaik a legújabb szakirodalmi adatok alapján A VIZSGÁLT GYÓGYNÖVÉNYEK FARMAKOLÓGIAI BEMUTATÁSA Gyermekláncfu (Taraxacum officinale Wiggers et Weber, Asteraceae) Farmakobotanikai jellemzés A gyermekláncfu gyökér (Taraxaci radix) növénykémiája A gyermekláncfu levél (Taraxaci folium) növénykémiája A Taraxacum officinale alkalmazásának javallatai Fekete eperfa (Morus nigra L., Moraceae) Farmakobotanikai jellemzése A fekete eperfa levél (Morus nigrae folium) növénykémiája és felasználása ANYAGOK ÉS MÓDSZEREK VIZSGÁLATI ANYAGOK Vizsgálati növények Vegyszerek Muszerek VIZSGÁLATI MÓDSZEREK Minták eloállítása Liofilizátumok eloállítása antioxidáns vizsgálatokhoz Szerves oldószeres extrakciók Soxhlet készülékben a triterpének és fitoszterolok eloállítására Soxhlet extrakció ipari méretu kísérletekben a triterpének és fitoszterolok eloállítására Szuperkritikus extrakció a triterpének és fitoszterolok eloállítására és meghatározásához Oszlopkromatográfiás vizsgálatok a triterpének és fitoszterolok azonosítására Minoségi és mennyiségi vizsgálatok A flavonoid tartalom meghatározása Összpolifenol tartalom meghatározása Kapillár elektroforetikus vizsgálatok a fenoloidok kvalitatív jellemzésére HPLC vizsgálatok a fenoloid komponensek kvantitatív meghatározására Vékonyréteg-kromatográfiás és VRK-denzitometriás vizsgálatok 70 5

6 Oszlopkromatográfiásan tisztított frakciók HPLC vizsgálata Az antioxidáns hatás igazolására végzett vizsgálatok EREDMÉNYEK ÉS MEGBESZÉLÉS TRITERPÉNEK ÉS FITOSZTEROLOK VIZSGÁLATA Vékonyréteg-kromatográfiás és VRK-denzitometriás módszer kidolgozása ? -amirin és? -szitoszterol azonosítása HPLC módszerrel Kvantitatív vizsgálatok Morus nigra Taraxacum officinale Triterpének és fitoszterolok szuperkritikus extrakciója Mori nigri folium Taraxaci radix Taraxaci folium FLAVONOIDOK VIZSGÁLATA Kvantitatív vizsgálatok eredményei Az antioxidáns hatás igazolására végzett vizsgálatok Kapilláris elektroforézis és HPLC vizsgálatok a fenoloidok minoségi és mennyiségi meghatározására Kapillár-elektroforézis vizsgálatok HPLC vizsgálatok EREDMÉNYEK ÖSSZEFOGLALÁSA IRODALOMJEGYZÉK KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS 149 Melléklet: SAJÁT KÖZLEMÉNYEK BIBLIOGRÁFIAI ADATAI SAJÁT KÖZLEMÉNYEK KÜLÖNLENYOMATAI 6

7 1. BEVEZETÉS A növényi hatóanyagok egyre inkább a tudományos kutatás érdeklodési terébe kerülnek. Néhány közismert gyógynövény újraértékelése, részletesebb farmakológiai tanulmányozása során kiderült, hogy az eddig a hatásért felelosnek tartott vegyületek csak szinergista módon más vegyületek jelenlétében aktívak vagy esetleg más újonnan felfedezett hatóanyagcsoport felelos élettani hatásukért. Például a Calendula officinalis gyulladáscsökkento hatásáért korábban foleg a flavonglikozidokat, esetleg szaponinokat tették felelossé; újabban a körömvirág kivonatokat a triterpén alkohol faradiol származékokra standardizálják, mert egyértelmuen bebizonyosodott e hatóanyagok kiemelkedo szerepe a gyulladásos folyamatok gátlásában?78-83?. Számos további eredmény igazolja, hogy az eddig nem hatóanyagnak tekintett növényi összetevok jelentosen befolyásolhatják a gyógynövények vagy kivonataik hatékonyságát, illetve terápiás felhasználhatóságuk is módosulhat ezek jelenlétében. A gyulladáscsökkento szerek között a gyógyszerpiacon két fo hatástani csoport van forgalomban: az egyik csoport gátolja a ciklooxigenázt, aminek következtében csökken a prosztanoidok képzodése (nem szteroid gyulladásgátlók, pl. aszpirin származékok); a másik csoport a glukokortikoidok, amelyek, mind a ciklooxigenáz mind a lipoxigenáz utat gátolják, a foszfolipáz A 2 -reakcióval interferálva. A mellékhatások ismertek. A gyógyszerpiacnak eddig ismerteknél szelektívebb (COX-1, illetve COX-2 gátlók) gyulladásgátló szerek iránti igénye miatt újra és újra elotérbe kerülnek a természetes anyagok. Német kutatók hatás és szerkezet in vitro tanulmányozásán túlmenoen, amelyek a hatásmechanizmusra is választ kínálnak, olyan pentaciklikus triterpéneket kerestek, amelyek in vivo modellekben, ésszeru koncentrációban fejtenek ki gyulladáscsökkento hatást. Így terápiás alkalmazhatóságuk esélye megno, tekintetbe véve azt a tényt, hogy eleve kis akut toxicitással jellemezhetok ezek a természetes eredetu vegyületek?84?. Egyes triterpének (pl. ß-amirin) gyulladáscsökkento aktivitása valószínu a proteinkináz C enzim gátlásától függ, a neurogenetikus gyulladásos folyamatok teljes mellozésével?93?. Különbözo csoporthoz tartozó triterpének és számos szterol rendelkezik tumor- és HIV ellenes aktivitással?85, 86, 87, 90, 92, 109, 111, 112?. Egy átlag nyugati táplákozás mg koleszterolt és mg nem-koleszterol szterolt tartalmaz, 7

8 amelynek fo alkotói a növényi szterolok. A vérben, legnagyobb mennyiségben jelen lévo? -szitoszterol és kampeszterol elsosorban?124?, de a fitoszterolok általában is jelentosek a rákmegelozésben. A? -szitoszterol/? -szitoszterol glikozid keverékek nemcsak gyulladáscsökkento, lázcsökkento, daganatellenes, hanem immunmoduláns hatást is kifejtenek, serkentve a T-limfociták és killer sejtek aktivitását, csökkentve a túlzott ellenanyag termelést és normalizálva a DHEAH/ kortizon arányt?138,139,140?. A másik nagy hatóanyagcsoport, amelyre fokozott figyelem irányul a flavonoidok. Számos farmakológiai hatást tulajdonítanak nekik; így antiishaemiás, thrombózisgátló, daganatellenes, gyulladáscsökkento, allergia ellenes, lipidperoxidáció gátló, gasztroprotektív funkciót. Ezen túlmenoen potenciális antioxidánsok, szabad gyökfogók, fémkelátképzok és gátolják a lipidperoxidációt is?141?. A jelenkori tudomány a hatás-szerkezet összefüggéseket biomolekuláris szinten tanulmányozza? ?. A köztudatba azonban az a téves felfogás is befészkelte magát, hogy az antioxidánsok boséges fogyasztása az egészségmegorzés kulcsa. Ugyanakkor az arányokban történo durva eltolódások károsodásokat okozhatnak az életminoséget rontó, hosszan tartó betegségekben, mint például az alkoholos májbetegség, diabetes mellitus, colitis ulcerosa, a Crohn-betegség?142?. A triterpének mint citotoxikus ágensek excesszív alkalmazása egyes betegségek kiújulásához is vezethet?94-95?. Szitoszterolémiában, amely egy ritka autoszomális rendellenesség, az érintett egyének szervezete hiperabszorbeálja és visszatartja nem csak a koleszterolt, hanem más szterolokat is. Így a betegnek igen magas a növényi szterol plazmaszintje. Íny és gumós xanthóma, gyorsított arteroszklerózis és korai szívér betegségek jelentkezhetnek?125?. A különbözo etimológiájú betegségek megelozésében és kezelésében indikált szerek helyes használatához a készítmények standardizálása szükséges kiválasztott aktív anyagokra. Mindezek figyelembevételével a növényi, természetes eredetu hatóanyagok felkutatásával foglalkozó szakemberek egyre inkább hangsúlyozzák megfelelo módszerek kidolgozásának fontosságát, amelyek az aktív komponensek gyors azonosítását, másrészt kivonatokban való szelektív dúsításukat valósítják meg, ezáltal lehetové téve standardizált készítmények eloállítását és célzott alkalmazhatóságát különbözo betegségekben. 8

9 2. CÉLKITUZÉSEK Kísérletes munkánkkal két, az Asteraceae és Moraceae családba tartozó gyógynövény vizsgálatával a bevezetésben vázolt kérdéskör megismeréséhez kívántunk kísérletes adatokat szolgáltatni. A gyermekláncfüvet már az ókorban kínai orvosok is alkalmazták megfázás, hörghurut, tüdogyulladás, májgyulladás, furunkulus, fekélyek, elhízás, viszketés és belso sérülések kezelésére. A mai kor herbalistái vizelethajtásra, epehajtásra, emésztés serkentésére, menstruációt megelozo kellemetlen tünetek enyhítésére, lábduzzadásra, magas vérnyomásra és pangásos szívelégtelenségre ajánlják?166,170,173,174,175?. Változatos tartalmi anyagai az alábbi fontosabb csoportokba sorolhatók: triterpének, szterolok, szeszkviterpén laktonok, fenoloidok, nyálka, inulin, ásványi anyagok és vitaminok? ?. A fekete eperfa kevésbé elterjedt, mint a fehér eperfa, kellemes ízu gyümölcse miatt inkább kertekbe, udvarokba ültetik. Az eperfa leveleket más drogokhoz elegyítve diétás teakeverékek készítésére használják, foleg cukorbajosoknak ajánlják. Vércukorszint csökkento hatása azonban gyenge, megbízhatatlan; a kínai gyógyászat több indikációval alkalmazza? ?. A levelei glukózt, karotint, C-vitamint, folsavat,? -amirint, fitoszterolokat és flavonoidokat tartalmaz?193?. Gyökérkérgében antinoniceptív, potenciális rákellenes prenilflavonidokat mutattak ki?193, 194, 195, 197?. Célul tuztük ki a minkét növény tartalmi anyagai között jelentos triterpének, fitoszterolok kivonására hatékony, környezetkímélo extrakciós módszer kidolgozását. Ennek megvalósítására a szuperkritikus kivonást választottuk. Ezt a módszert ezidáig foleg illó komponenseket tartalmazó kivonatok eloállítására alkalmazták. A gyermekláncfu és fekete eperfa nem illó komponenseinek extrahálására az optimális körülmények kidolgozása is hangsúlyt kapott. A folyamat szélesebb köru alkalmazásához a kituzött célt az elméleti fiziko-kémiai folyamatokkal is értelmeznünk szükséges. Fontos ugyanakkor a hagyományos kivonási módszerekkel történo összehasonlítás is és így az elonyök és hátrányok mérlegelése. Ezt a költséges, de elsosorban lipofil anyagok kivonására kiváló módszert egyre kiterjedtebben alkalmazza az élelmiszer és gyógyszeripar. Éppen költséges volta miatt azonban akkor lehetséges létjogosultsága 9

10 növényi gyógyszeralapanyagok eloállításában, ha alkalmazásával a kívánt hatóanyag jelentos és lehetoleg szelektív dúsítása érheto el. Másrészt viszont égeto igény jelentkezik a módszer alkalmazásával kapcsolatos tapasztalatokra, ahogy ezt egy közelmúltban rendezett fitokémiai konferencia is megfogalmazta. Ez indokolta egy gyors, egyszeru és kielégíto pontosságú módszer kidolgozását a szuperkritikus extrakcióval nyert nagyszámú minta étékeléséhez. Erre a célra vékonyréteg kromatográfiával kombinált denzitometriát választottunk. Elemezni kívántuk a kifejleszto rendszer befolyását a szétválasztásra, az elohívó reagens, homérséklet és ido befolyását a mérés pontosságára és megbízhatóságára. Célunk volt a megfelelo muszeres analízis kidolgozása után a kivonatok hatóanyagban való feldúsulásának pontos adatokkal történo jellemzése. Tekintettel a Taraxacum és Morus fajok gyulladásgátló hatásának terápiás felhasználására, valamint a flavonoidoknak, mint potenciális hatóanyagoknak jelenlétére részletesebben kívántuk tanulmányozni a Taraxaci folium és Mori nigri folium vizes kivonatainak antioxidáns hatásának jellemzoit, in vitro modelekben. Jellemezni kívántuk: hidrogén-donor aktivitásukat, redukáló képességüket, összscavanger kapacitásukat stb. A hatás és szerkezet összefüggések feltárásához meg kívántuk határozni az antioxidáns, szabadgyökfogó aktivitással rendelkezo drog extraktumok flavonoid és összpolifenol tartalmát. A flavonoidkémiában legkiterjedtebben alkalmazott HPLC vizsgálatok mellett célul tuztük ki egy kevésbé ismert, de összetett fitoterápiás készítmények minoségvizsgálatában a jövoben egyszerusége miatt feltehetoen jelentosebb szerepet játszó kapillárelektroforézis technika alkalmazását. Adatokat kívántunk szolgáltatni alkalmazhatóságukhoz, illetve a HPLC-vel való összehasonlítását is célul tuztük ki. A kapillárelektroforetikus tapasztalatokkal hozzá szeretnénk járulni a fito-gyógyszerek eloállítási és standardizálási kérdéseinek eredményes eloviteléhez is, különös tekintettel az európai harmónizációs törekvésekre. 10

11 3 IRODALMI HÁTTÉR 3.1 SZUPERKRITIKUS EXTRAKCIÓ Muveletek szuperkritikus oldószerekkel A szuperkritikus állapotú (fluid) anyagok különleges viselkedését már a múlt században megfigyelték. A fluid állapotú oldószerek oldóképessége és szelektivitása a nyomással és homérséklettel változik. Ez a tulajdonság szélesköru alkalmazási lehetoséget eredményez. A szuperkritikus eljárások a vegyi-, gyógyszer-, élelmiszer-, kozmetikai ipar számos területén megjelentek. Népszeruségük méltán no, mert kiküszöbölik a klasszikus kivonási eljárások legfobb hátrányait, és jelentosen hozzájárulnak az emberi fogyasztásra szánt termékek (élelmiszerek, gyógyszerek) biztonságos alkalmazásához (megoldják az oldószer-maradványok kérdését), az aktív komponensek természetes összetételének megorzéséhez (segítségükkel sok olyan tartalmi anyag kivonható, ami a hagyományos eljárásokkal bomlást szenved), és a környezet megóvásához is (a kivonószer nem toxikus és újrahasznosítható). Nagynyomású oldószereket egyaránt alkalmaznak kémiai reakciók megvalósításánál, szilárd anyagok kristályosításánál, szilárd komponensek extrakciójánál és több komponensu rendszerek kromatográfiás elválasztásánál. Kémiai reakciókban a fluid oldószer lehet reaktáns is [1, 2]. A reakciósebességet a homérséklet mellett a nyomás és az oldószer is befolyásolja. A folyadék halmazállapotú oldószerekhez viszonyítva nagyobb a reakciósebesség, jobb hozam és szelektivitás érheto el és a termék az oldószertol egyszeruen (pl. nyomáscsökkentéssel) elválasztható [3]. Közel kritikus vagy szuperkritikus vízben megvalósíthatók egyes szintézisreakciók, makromolekulák lebontása és mérgezo, környezetszennyezo anyagok, így alifás és 11

12 aromás szénhidrogének (hexán, bifenil) [4], halogénezett szénhidrogének (1,2- diklóretén, DDT, PCB) [5,6], nitrogéntartalmú vegyületek (2,4-dinitro-toluol) [7], növényvédoszerek (?-HCH, HCB), muanyagok (PVC adalékok) [8], vegyi fegyverek [9], ipari szennyvíz (gyógyszer, papír, textil) [10], szennyvíz iszapok (kommunális, ipari) [10-12], szennyezett talaj (ásványolajok) [13], nukleáris hulladékok (oldószerek, ioncserélo gyanták) [14,15] megsemmisítése. A szuperkritikus széndioxid jó közeg a kémiai- és biokémiai reakciók megvalósítására [16]: zsírok, olajok, szabad zsírsavak, zsírsav monoészterek [17], ciklohexén, acetofenon, növényi olajok [18], benzaldehid, acetofenon, ciklohexanon [19], telítetlen keton [20], ciklopropén és származékai [21], izoprén [22]. A kristályosítás egyik módja a RESS (Rapid Expansion of Supercritical Solution) eljárás [23,24,25]. A nem illó anyagot szuperkritikus állapotú oldószerben feloldják, majd nyomáscsökkentéssel túltelített oldatot hoznak létre, amibol kis méretu és kedvezo méreteloszlású kristályokat kapnak. Másik módszer a GAS (Gas Anti-Solvent Crystallisation) kikristályosítás [26]. Ebben az eljárásban a szuperkritikus állapotú oldószert oldékonyságot csökkento hatása miatt használják. A szilárd anyagot valamilyen folyadékban feloldják és a szuperkritikus állapotú oldószert (amely nem oldja a szilárd komponenst) hozzáadják ehhez az oldathoz. Ennek hatására a szilárd anyag kicsapódik. Az extrakcióban szilárd vagy folyékony halmazállapotú anyagokból szuperkritikus állapotú oldószerekkel vonják ki a kioldható komponenseket [1,2,26,27,28]. Az oldott anyagot nyomáscsökkentéssel vagy valamilyen másik muvelettel (abszorbció, adszorbció) választják el az oldószertol. A szuperkritikus extrakció (SFE) ma már nagyon sok területen alkalmazott elválasztó muvelet. A kávé és tea koffein-mentesítése [29, 30], a komló extrakciója, a dohány nikotin tartalmának csökkentése, fuszerkivonatok [31], gyógynövény hatóanyagok és kozmetikum alapanyagok 12

13 eloállítása a legfontosabb ipari példák. A koolaj feldolgozásánál a desztillációs maradék extrakciója nagyipari méretekben is megvalósult. A szuperkritikus fluid kromatográfia (SFC) jól kiegészíti a már hagyományosnak számító GC és HPLC analitikai módszereket. Elsosorban a hore érzékeny, nem illékony vagy reakcióra hajlamos komponensek szétválasztására alkalmas. Sokkomponensu rendszerek (élelmiszer, gyógyszer, kozmetikum illetve talajminták) analízisére használják A szuperkritikus extrakció alapjai Fizikai-kémiai alapfogalmak A szuperkritikus oldószereket eloször extrakciós elválasztásnál használták. Az extrakció elve az alábbiakban foglalható össze [1, 2]. Ha az anyag nyomása és homérséklete meghaladja az anyagra jellemzo kritikus értéket, akkor speciális, a gáz és a folyadék állapot keverékeként jellemezheto fluid állapotba kerül. A szuperkritikus tartományban kizárólag egy fázis létezik, ami viszont a folyadékokra jellemzo oldási tulajdonságokkal és a gázokra jellemzo transzport képességgel rendelkezik. Ez a diffúzió-kontrolállt mátrixok (mint például a növényi szövetek) esetén ugrásszeruen növeli a kivonás hatékonyságát. A szuperkritikus fluid oldóképessége egy adott vegyületre nézve a fluid suruségének komplex függvénye. A folyadék- és gázállapottal összehasonlítva a szuperkritikus fluidumoknak olyan fizikaikémiai sajátságaik vannak, amelyek egyedülállóak (1. táblázat). Az 1. táblázatból látható, hogy a szuperkritikus fluidumok surusége a folyadék suruségéhez, viszkozitása 13

14 a gáz viszkozitásához hasonlítható, míg a diffúziós képessége a folyadék és gáz diffúziós képessége között helyezkedik el. 1. táblázat: Fizikai-kémiai jellemzok összehasonlítása Fizikai-kémiai Gáz Fluid Folyadék jellemzok Suruség (kg/m 3 ) Diffúziós állandó (cm 2 /s) Viszkozitás (Pás) A p-t állapotdiagramon az egyes halmazállapotoknak (szilárd, folyadék, gáz) megfelelo területeket szublimációs görbe választja el (1. ábra). 1. ábra: CO 2 P-T állapotdiagramja Simándi és mtsai. 1999, Olaj, Szappan, kozmetika, 45, 3-11 C jelöli a kritikus pontot. A kritikus homérséklet és kritikus nyomás vonalai (szaggatott egyenesek) határolják a fluid állapotnak megfelelo területet. A szaggatott vonalakon átlépve nem történik fázisállapot változás, tehát nincs éles, ugrásszeru változás a fizikai tulajdonságokban. Jól megfigyelheto ez a suruség vonalaknál (?), ahol a fluid 14

15 állapotban a gáz suruségétol folytonos a változás. A szuperkritikus extrakció területe a redukált állapotdiagramon is behatárolható (2. ábra). 2. ábra: CO 2 redukált suruség és redukált nyomás állapotdiagramja Simándi és mtsai 1999, Olaj, Szappan, kozmetika, 45, 3-11 A fluid állapotnak megfelelo területet a T r? 1 görbe és a? r? 1 egyenes határolja. Az extrakcióhoz nem mindig szükséges kritikus homérséklet feletti fluidum. Ilyenkor nyomás alatti folyadékkal, közel kritikus állapotban (az ábrán NCE-vel jelölt terület) történik az extrakció. A 2. ábrán az is jól látható, hogy nem célszeru T r értékét túl nagyra választani, mert akkor nagyon nagy nyomással tudunk folyadékokhoz hasonló oldószert eloállítani. Az oldékonyság pedig nagyon nagymértékben függ a fluid állapotú oldószer suruségétol. A goz-folyadék átmenetnél a suruség változása ugrásszeru, a fluid fázisban a suruség folyamatosan no a nyomás növelésével. A suruségnek ez a folyamatos változása ad lehetoséget a szelektív extrakció illetve szeparáció megvalósítására Oldószerválasztás A szuperkritikus extrakció céljára leginkább a szuperkritikus széndioxid használata vált be és terjedt el, melynek fobb elonyei és esetleges hátrányai a következokben foglalhatók össze: 15

16 - A kivonószer szinte maradéktalanul eltávolítható az anyagból, hiszen a homérséklet és a nyomás csökkentésével a gáz halmazállapotú széndioxid leadja a benne oldott vegyületeket és eltávozik az anyagból, megoldva ezáltal az oldószer-maradványok kérdését. - A kivonószer a folyamat során visszanyerheto és újabb kivonási ciklusban használható, ami környezetvédelmi és gazdaságossági szempontból is kedvezo. - A kivonáshoz használt széndioxid természetes anyag, nem toxikus, színtelen, íztelen, szagtalan, olcsó és nem gyúlékony. - Kémiailag inert, nem lép kölcsönhatásba a tartalmi anyagokkal. - Kritikus állapota nem jelent kezelhetetlenül szélsoséges körülményeket, kritikus homérséklete megfeleloen alacsony, így az extrakciót viszonylag alacsony homérsékleten el lehet végezni (általában o C on), ami a termolabilis komponensek károsodásának kockázatát csökkenti. - Oldóképessége megfelelo és szelektív, mivel permanens dipólusmomentummal nem rendelkezik. Legalkalmasabb kis molekulájú, apoláris, valamint szemipoláris vegyületek extrahálására. - A CO 2 szelektivitása egyes esetekben hátrányos is lehet, foleg olyan mátrix esetén, amely jelentosen visszatartja, vagy megköti a kivonandó komponenseket. Ekkor néhány százalék poláris vagy koszolvens hozzáadásával (például etanollal) javítható a kivonás hatásfoka. Ebben az esetben figyelembe kell venni, hogy a koszolvens jelentékeny mértékben megváltoztatja a kivonószer kritikus állapotának paramétereit és a kivonatból nehezen távolítható el. - A legtöbb illó komponens jelen van a szuperkritikus kivonatban, de a nem illó komponensek is feldúsíthatók a kivonatban a széndioxid apolaritása következtében. - A folyadékokra jellemzo oldóképesség és a gázokra jellemzo transzport tulajdonságoknak köszönhetoen az extrakció mértéke és a fázisok elválasztásának sebessége jelentosen gyorsabb, mint a hagyományos extrakciós eljárásoknál. - Aszeptikus kivonatok keletkeznek, mert a csírákat a szuperkritikus kivonószer nem oldja. 16

17 - A szuperkritikus extraktor közvetlenül kromatográfhoz kötheto, ami azonnali analízist tesz lehetové a kivonás után. - Hátránya, hogy drága és berendezésigénye is jelentos. - Oldószerereje a szerves oldószerekkel összehasonlítva kisebb Az extrakció folyamata Leggyakrabban, így a gyógynövény hatóanyagok kivonására is a szilárd fázisú extrakció használatos. Ennek következtében a szilárd anyagot megfeleloen elo kell készíteni a muvelethez. Szükséges a megfelelo szemcseméret kialakítása, hogy az anyagátadás és áramlás szempontjából kedvezo töltetet kapjunk. A nagyméretu alapanyagot aprítják, orlik, a porokat granulálják. Amikor a kinyerendo anyag nem extrahálható formában van jelen, akkor enzimmel, vagy kémiai úton elozoleg fel kell szabadítani. Az elokészített szilárd anyagot töltik az extraktorba. 3.ábra: A szuperkritikus extrakció folyamatábrája Dean, J., R., (1998) Extraktion methods for enviromental analysis. John Wiley and Sons., UK , A szuperkritikus széndioxidot tároló kompresszor térben a kivonószer nyomása és homérséklete beállítható, majd az így eloállított fluidot az extraktor térben rávezetik a növényi drogra. A fluid nyomása a különbözo szelepeken keresztül, homérséklete, pedig hocserét biztosító elemeken keresztül szabályozható, illetve áramlási sebessége is beállítható. A szuperkritikus fluid oldóképessége egy adott vegyületre nézve a fluid suruségének komplex függvénye. Egy adott anyag oldhatósága gázokban arányos az anyag által kifejtett goznyomás értékével, amit a homérséklet határoz meg, míg a folyadékokban az oldószerrel 17

18 kialakított kölcsönhatás mértéke a dönto, ami többek között a nyomás függvénye. A szolvatációs képesség megnövekedte tehát két tényezo eredoje: - a goznyomás megnövekedése, ami a homérséklet-növekedés következménye, illetve - a suruség megnövekedése, ami a nyomás növekedése miatt alakult ki. Figyelembe kell venni azt is, hogy a homérséklet növelésének a suruséget csökkento, tehát az oldóképesség szempontjából negatív hatása van. A kivonandó vegyületek diffúziós képessége egyenesen arányos a homérséklettel, mert az anyagok viszkozitásának csökkenése viszont fordítottan arányos a nyomással. A folyamat következo lépéseként a kivont anyagban gazdag oldószer a szeparátorokba kerül, ahol nyomását és homérsékletét csökkentve a benne oldott anyagot szelektíven leadja. Több szeparátor esetén a polárisabb anyagok válnak ki az elso szeparátorban, míg az apolárisabbak az azt követokben. A kivonószer a kompresszortérbe visszajutva újra kivonásra alkalmas állapotba hozható a homérséklet és nyomás emelésével. Az extraktor muködése szakaszos, de léteznek már kvázi-folyamatos vagy folyamatos elválasztásra képes készülékek is (frakcionális elválasztás több szeparátorral, ellenáramú kaszkádkivonás stb.). Megállapítható, hogy a szuperkritikus extrakció során a kivonási paraméterek optimalizálása a végbemeno folyamatok összetett jellege miatt (függnek a nyomástól, a homérséklettol, a szilárd anyag elokészítésétol, a részecskemérettol, az oldószer áramlási sebességétol, a kivonás idejétol) általában csak kísérletesen valósítható meg. A szuperkritikus tartomány azon része, amelyet ma extrakciós folyamatokban felhasználnak relatíve korlátozott, és foként a kritikus ponthoz közeli értékeket érinti (2. ábra). Erre a tartományra jellemzo, hogy a kritikus pontra vonatkoztatott, azaz redukált suruség értékei 1 és 1,4, a redukált nyomás értékei pedig 1,3 és 2,1 között mozognak, aminek oka az, hogy a suruség itt változik legnagyobb mértékben a nyomás és a homérséklet változtatásával, tehát az optimális szelektivitás pontosan szabályozható [2] Szuperkritikus extrakció alkalmazása növényi hatóanyagok kivonásánál Gyógynövényekkel kapcsolatos szuperkritikus extrakciós vizsgálatok néhány alkaloidtartalmú növényen (pl. kávé, dohány) kívül idáig kiemelten illó- és zsírosolajtartalmú nyersanyagok feldolgozására terjedtek ki [32, 33, 34]. Kevés 18

19 figyelmet fordítottak az illóolaj mellett jellegzetesen felhalmozódó és biológiailag, illetve terápiás szempontból hatásos, esetleg toxikus vegyületek szuperkritikus extrahálhatóságának lehetoségére [35,36]. A növényi kivonatok hatóanyag tartalom standardizálásának irányelvei (CA, GM) egyre inkább arra ösztönzik a kutatókat, hogy új extrakciós módszereket keressenek. Napjainkban számos eredmény igazolja, hogy az eddig nem hatóanyagnak tekintett növényi összetevok jelentosen befolyásolhatják a kivonatok hatékonyságát, illetve ezek terápiás felhasználhatósága is módosulhat jelenlétükben: pl. a Calendula officinalis gyulladáscsökkento hatásáért korábban foleg a flavonglikozidokat tették felelossé. Szuperkritikus extrakcióval eloállított, flavonoidokat egyáltalán nem tartalmazó kivonataik kiemelkedo hatása alapján sikerült igazolni a triterpéndiolok szerepét (a körömvirág kivonatokat ma faradiol származékokra standardizálják) [78-83]. 3.2 KAPILLÁRIS ELEKTROFORÉZIS A kapilláris elektroforézist (CE), mint analitikai módszert elsoként Hjerten 1967-ben [37] írta le, de az igazi gyakorlati megvalósítás Jorgenson és Lukács (1981) nevéhez fuzodik [38]. Elso alkalmazása biológiai makromolekulák (fehérjék, peptidek, nukleotidok, oligonukleotidok, DNA stb.) analízise volt, majd sikeresen használták fel élelmiszer analitikában és gyógyszerkémiában is. Számos összefoglaló közlemény számol be a fejlesztés állomásairól, majd az utóbbi néhány évben alkalmazása elterjed a fitoanalitikában is [39, 40, 41] Általános jellemzés-alapfogalmak A kapillár-elektroforetikus elválasztás (CE) alapja lényegében azonos más elektroforetikus technikákkal. Töltéssel rendelkezo molekulák elektromos erotér hatására az ellentétes töltetu elektródhoz vándorolnak. A CE egység szíve egy kapilláriscso, amely olcsó és könnyen helyettesítheto. Ez általában szilikagél kapilláris maximum 1 méter hosszúsággal és µm között váltakozó belso átmérovel. 19

20 4. ábra: Kapillár- elektroforetikus berendezés sémája Barberán, T., F., A. 1995, Phytochemical Analysis, 6, A felbontóképesség szempontjából a kisebb belso átméro egy jobb elválasztást biztosít, amely a csökkent pályahosszúsággal és mintamegterhelhetoséggel magyarázható. Az anyagot általában az anódvégen adagolják (több változat lehetséges: vákuum-, nyomás-, hidrosztatikus-, elektrokinetikus injektálás) és a detektálás a katódvégen következik be [41]. A szükséges anyag mennyisége nagyon kicsi (1 ng nagyságrendu), de a koncentráció relatív magas kell legyen (µg/ml), mert az a maximális térfogat, amely anélkül beviheto, hogy megzavarná a rendkívül kicsi szétválást (nl nagyságrendu). A felbontóképesség és az elméleti tányérszám a CE analízisnél csökken, ha no az injektálás mennyisége, ezért az injektálási ido a leheto legrövidebb kell legyen [42]. 5. ábra: Molekulák vándorlása a CE analízis során Barberán, T., F., A. 1995, Phytochemical Analysis, 6, ; EM-effektív-, EP-elektroforetikus vándorlás, EOF- a víz elektroendoozmotikus áramlása 20

21 A legtöbb elválasztó módszerben, amikor felszültséget alkalmazunk, az egész oldat a víz elektrozmotikus áramlása folytán a katódhoz szállítódik, de az arány, hogy melyik molekulák vándorolnak, a töltésük szerint változik. A CE elválasztás során az elektro osmotic flow (a víz elektro-ozmotikus áramlása = EOF) a fobb vezeto ero, és ezt a vízáramlást a kapillárison keresztül a magasero potenciál és a szilikagél kapilláris természete is befolyásolja. Ha feszültséget alkalmazunk (50 kv-ig, habár 30 KV az általában maximálisan alkalmazott feszültség), az ionok az ellenkezo töltéssel rendelkezo elektród felé mozdulnak el. Semleges vagy alkalikus ph alkalmazásánál az összes típus a katódhoz vándorol a víz eros elektro-ozmotikus áramlása következtében, ami a kapilláris falmenti szilanol csoportok poláris jellegébol következik. A fal felülete általában negatívan töltött és bizonyos ionok az oldatból a falhoz tapadnak dupla bevonatot képezve. Az alkalmazott erotér hatására a pozitív töltéssel rendelkezo molekulák a hozzájuk kötodött vízmolekulákkal együtt a katód felé vándorolnak (5. ábra: EOF + EP = EM). Az EOF sebessége számos paramétertol függ, mint például a ph, a dielektrikus konstans, a közeg viszkozitása stb. [43]. Ha az anionok mobilitása kisebb, mint az EOF, akkor az összes típus a katódhoz vándorol (5. ábra: EOF EP = EM). Az elektromosan semleges molekulák az anionok és kationok mobilitása közötti sebességgel vándorolnak és a szétválásuk nem mindig megfelelo (5. ábra: EOF = EM) [44] Szeparációs lehetoségek A CE erossége az elválasztási lehetoségek széles választékában van: kapillár zónaelektroforézis (CZE), szabad oldat elektroforézis (FSCE), micelláris elektrokinetikus kapillár elektroforézis (MECC), stb. Az említett metodikák által nyert szétválás nagyon hatékony, elméleti tányérszám körüli, néha még több is [45].? Kapillár zóna-elektroforézis (CZE) vagy szabad oldat elektroforézis (FSCE) A CZE elválasztási mechanizmusa a tömeg/töltés arány különbözoségén alapul. A molekulák a kapillárisról a csökkeno pozitív töltés arányában eluálódnak. A ph =4 alatt történo elválasztásoknál az EOF biztosítja, hogy a pozitív, semleges és negatívan töltött típusok a fent említett sorrendben jelentkezzenek a katódvégen. Kis tömegu és nagy negatív töltetu fajtákat (nagy töltet/ tömeg arány) taszítja leginkább a katód, így leghosszabb vándorlási idejuek lesznek, míg a kis pozitív töltetu fajták a leghamarabb 21

22 jelentkeznek a detektáláskor. A CZE megvalósítható komplexképzokkel (borát) vagy nélkülük olyan elektromosan semleges molekulák esetében (cukrok), amelyeknél a képzodött komplex negatív töltéssel fog rendelkezni, lehetové téve így a CE elválasztást [42].? Micelláris elektrokinetikus kapillárelektroforézis Ebben az esetben micellákat visznek be és ezek az EOF vándorlással ellentétes irányba vándorolnak. Alkalmazását kationos és anionos analíziseknél, illetve sajátságait (elválasztás és ismételhetoség, stb.) több közlemény is tárgyalja [46,47]. A legelterjedtebb micellák az anionos felületmegkötokkel képzettek (nátrium dodecilszulfát SDS), amelyek negatívan töltöttek a legtöbb ph tartományban és az anódhoz vándorolnak, míg az EOF a katódhoz áramlik. Az EOF nagyobb arányban valósul meg, mint az SDS vándorlás. Így a nettóvándorlás a katód felé történik. A minta molekulák (foleg a semleges és hidrofób molekulák) megoszlása az SDS micellák és a vizes fázis között, szelektivitástöbbletet eredményez és ebben az esetben a különbözo molekulák és a kromatográfia kapacitási tényezojérol (k, ) beszélhetünk. Ha kationos felületmegkötoket használnak (cetil-trimetil-amonium-bromid CTAB), az EOF az anód felé tolódik, a micellák a katód felé mozognak (az EOF-el ellentétesen). Ez esetben a negatívan töltött molekulák sebességét az EOF növeli, míg a CTBA késlelteto hatással rendelkezik. A MECC egyik legfontosabb alkalmazása a töltés nélküli molekulák analízise. A CZE elválasztásnál ezek a típusok azonos sebességgel vándorolnak, mint az EOF. Ha felületmegkötot adunk a futtató pufferhez a kritikus micella koncentráció alatt (CMC), a töltéssel nem rendelkezo hidrofób vegyületek a micellákkal történo kölcsönhatás következtében hosszabb retenciós idovel (MT) mozognak. Ebben az esetben a molekulák ugyanabban a sorrendben vándorolnak, mint ahogy a fordított fázisú HPLCnél eluálódnak, mely elválasztás szintén a hidrofobicitásbeli különbségeken alapul A kapilláris elektroforézis összehasonlítása más analitikai technikákkal A CE egy nagyszeru analitikai módszer változatos szerkezetek elválasztására és mennyiségi meghatározására. Magas feszültségnél nagy hatásfokkal alkalmazható (milliós nagyságrendu tányérszámot biztosítva ez által), gyors elválasztás (1-30 perc), minimális minta igénnyel (nl) és nagyon alacsony reagens fogyasztással (µl/h) [47, 48]. 22

23 Habár az érzékenysége kituno, az UV detektáláshoz szükséges koncentráció nagy (mikro mólnál nagyobb), ezáltal beszukül az alkalmazhatósága [49]. Néhány közlemény összehasonlítja a CE-t a HPLC-vel egyes vegyületcsoportok analízisénél [49, 50]. Mind a HPLC mind a CZE, jól ismételheto eredményeket adott. A reprodukálhatóság relatív standard szórása szignifikánsan nagyobb volt a CZE esetében, mint a HPLC-nél, ami valószínu a kapillárisfal kondicionálásának tudható be [49]. Ez támasztja alá a kapilláris helyes kondicionálásainak fontosságát a CE analízisnél. Az elválás hatékonysága ször nagyobb volt CZE esetében, mint a HPLC-nél [50, 51]. Az antrakinonok analízisénél például élesebb csúcs és nagyobb hatékonyság jellemzi a CE-t, mint a HPLC-t [52]. Egy összehasonlító tanulmányban a hatékonyság a CE esetében elméleti tányérszám (N) között mozgott, míg ezek a HPLC esetében közötti értékek voltak [51]. Szerzok javasolják, hogy a HPLC-t foleg kis számú komponens elválasztására alkalmazzák, amikor rövid ido alatt kell ezt megvalósítani, de ha nagy elméleti tányérszám szükséges, akkor a CZE a megfelelobb választás [51]. Mindkét analízist kituno korrelációs együtthatók jellemezték [48, 52]. A CE-vel szembeni kritikák foleg a kis terhelhetoségét és érzékenységét róják fel. Meghatározták, hogy például az antrakinonok esetében a detektálási limit 0,006 µg/ml volt HPLC-nél, míg CZE analízissel ez mindössze 0,7 µg/ml volt [52]. Ezzel szemben a tömeg kimutathatósági határ ezeknél az antrakinonoknál 2,8 pg volt a CZE és 56 pg a HPLC módszerrel. Ki kell hangsúlyozni, hogy az abszorbancián és fluoreszcencián alapuló detektálásnál az érzékenység és nem a minimum kimutatható mennyiség az ami releváns a fitokémiai analízisnél. Következtetésként elmondható, hogy az analízisek többségében az érzékenység szor jobb HPLC-vel, mint CZE-vel [50, 51]. A két módszer összehasonlításából megállapítható, hogy a CE több általános elonnyel jellemezheto a HPLC-vel szemben. A CE kisebb anyagigényu, rövidebb az analízis ido, kevesebb a reagens fogyasztás (µl/min), olcsóbb az oszlop, környezetkímélo (nincs szükség szerves oldószerekre), nagy hatékonyságú és kisebb a tömeg-kimutathatósági határ, mint a HPLC-nél. A HPLC és CE analízis összehasonlítását flavonoidok meghatározásánál több szerzo is elvégezte, mind favonoid glikozidok [53, 54, 55], mind aglikonok esetében [56, 57]. Általában megegyeztek abban, hogy a CE egy megfelelobb választás a HPLC-vel szemben, ha flavonoid analízisrol van szó, különösen diódasoros készülékek esetében. Mindezek ellenére, úgy tunik, a CE nem fogja helyettesíteni a 23

24 HPLC-t a kevésbé poláris vegyületek, mint például a lipofil flavonoid aglikonok esetében Flavonoidok CE analízise Flavonoid aglikonok A természetben szabadon eloforduló és a flavonoid glikozidokból hidrolízissel nyert aglikonokat egyaránt vizsgálták. A flavonol-3-o-glikozidokból hidrolízissel eloállított aglikonokat MECC borát puffer és SDS jelenlétében (ph=8,3) analizálták. A miricetin, kvercetin, kempferol, izoramnetin jól elváltak és ebben a sorrendben vándoroltak [56]. Ilyen körülmények között a flavon aglikonok az SDS micellákhoz való eltéro kötodési tendenciájuk alapján váltak el és növekvo lipofil sajátságuknak megfeleloen vándoroltak: morin, kvercetin, naringenin, heszperidin, krizin [58]. A flavonoid aglikonokat MECC-vel (flavonolok, flavonok és flavanonok), az elválasztást a ph (6,5-8,5), illetve az SDS koncentrációjának változtatásával optimalizálták [58]. A szabad állapotban eloforduló aglikonokat MECC-vel borát puffer (ph=8,5) és SDS segítségével tanulmányozták [57]. ph=8 nál 10% metanolt adtak a pufferhez, hogy növeljék az oldódást, csökkentsék az EOF-t és növeljék a felbontást. A különbözo flavonoid aglikonok diódasoros detektorral felvett UV spektruma világos különbséget mutatott a flavonok és flavanonok között. Ráadásul, azon orto-dihidroxi csoporttal rendelkezo flavonoidok, amelyek komplexet képeznek a jelenlévo borát molekulákkal (kvercetin, luteolin), olyan UV spektrumot mutattak, amely világosan megkülönböztetheto volt azoktól, amelyek ilyen orto-dihidroxi csoporttal nem rendelkeztek (apigenin, krizin, tektokrizin) [57]. Az MECC-nél a flavonoidok két tényezo közrejátszásával válnak el: töltés és hidrofób sajátság. A változások a hidroxil csoport ionizációjával jelentkeznek és a flavonoidok a negatív töltések függvényében, vándorolnak: ha negatívabb a molekula töltése, hosszabb a migrációs ido [MT]. Ezek a flavonoidok tehát borát komplexképzés segítségével, töltéssel elláthatók. A komplexképzés a molekuláknak elektroforetikus mobilitást kölcsönöz, ami negatív töltéssel magyarázható. Az SDS koncentrációt változtatva, különbözo flavonoid párok elkülöníthetok [57]. Metanol hozzáadása a pufferhez a rezolúciót jelentosen megnöveli, mivel ez javítja a flavonoidok oldódását és ebbol kifolyólag a felbontást, és csökkenti az 24

25 EOF-et, ezért no a flavonoidok migrációs ideje [59]. Az MECC választása a CZE-vel szemben az aglikonok esetében a polihidroxilált flavonoid aglikonok (miricetin, kvercetin) instabilitásának tudható be alkalikus körülmények között (ph=10-10,5), amely a CZE elválasztásnál szükséges Flavonoid glikozidok A flavonoidok a természetben leggyakrabban, mint O-glikozidok fordulnak elo, de a C- glikozid flavonok szintén jelen vannak több növénycsaládban is. A szeparáció körülményeit a flavonol-3-o-glikozidok [42,53,54,56,60] és 3,7-di-O-glikozidok [55] esetében MECC és CZE segítségével valósították meg. Flavon-7-Oglikozidok CE analízisét is leírták [61,62,63], de a flavanon-o-glikozidok [42, 63] és a kalkon-oglikozidokét is [63]. Másrészrol nem bovelkedünk adatokban a flavon-c-glikozidok elválasztását illetoen [62]. A közölt analízisek többségénél borát puffert alkalmaztak. Kipróbálták a tris-hcl puffert (ph=7,1) [61] és foszfát puffert is (ph=10,5), hogy összehasonlítsák a borát-komplexképzés hatásaival (ph=10,5) [61]. Mindkét analízisénél CZE (ph=9-10,5) és MECC (ph=7-8,5) technikákat is leírtak. MECC alkalmazásánál az anionos SDS micellákat általában mm közötti koncentrációban adják a pufferhez, de a kationos CTBA segédanyagot szintén hasznosnak találták a flavonoid glikozidok elválasztásánál [63]. Hasonlóan az aglikonokhoz, a szerves oldószer adagolása a pufferhez (10-20% metanol vagy 4% izopropanol) javítja a felbontást [62, 64]. Az UV spektrum nagyon hasznos a flavonoidok azonosítására. Habár ezek a spektrumok különbözoek a metanolban vagy savas metanolban felvett spektrumoktól (pl. HPLC) [56, 57], hasznos szerkezeti információt szolgáltatnak. Felhasználhatók a borát komplexképzés által, az ortodihidroxi csoportot tartalmazó vegyületek, mint a luteolin (5,7,3,,4, -tetrahidroxi flavonok) és a megfelelo vegyületek, amelyek egy hidroxi csoporton metilétert tartalmaznak, mint például a krizeolin (5,7,4 -trihidroxi-3, -metoxiflavon) megkülönböztetésére. A cukor molekulák semlegesek, ezért elektroforetikusan nem választhatók el. Vizes oldataikhoz borátot adva átalakíthatók negatív töltésu borát komplexekké [41]. Ez a komplexképzés no a borát-koncentrációval és a ph-val, így a cukrok elektroforetikus mobilitása szintén no ezekkel a paraméterekkel. Csak a cisz konfigurációjú vicinális 25

26 hidroxi csoportok képezhetnek stabil komplexeket, mivel a komplexképzés számára a legkedveltebb konfiguráció a cukor molekulán a C 3 és C 4 -en lévo cisz orientáltságú hidroxicsoport párok jelenléte [65]. A diszacharidok kisebb mobilitásúak, mint a monoszacharidok a kisebb töltéssuruségük következtében (A borát komplexek képzése az azonos aglikont, de különbözo cukorrészt tartalmazó flavonoid-o-glikozzidok leválasztására használható.) [66]. Mint látható, a flavonoidok cukorrészén 1,2 cisz-diol szerkezetet tartalmazók a borát csoportot sokkal erosebben komplexálják, mint az ezeket nem tartalmazó cukrok: így a glukóz nem rendelkezik vicinális cisz-hidroxi csoportokkal, míg a rhamnóz stabil komplexeket képezhet C 2 és C 3 között. A flavonoid glikozid borát-komplexképzés erossége a cukorrész szerkezetek ilyen helyétol, illetve a cukor konfigurációjától függ. A vándorlási sebesség a borát-komplexképzés strukturális preferenciáján múlik, valamint a borát flavonoid komplex relatív tömegétol. Valóban az anion borát-komplexek mobilitása a nettótöltéstol és tömegtol függ. A következo vándorlási sorrendet közölték öt kvercetin-3-o-glikozidra 10,5 ph-nál [60], CZE elválasztással: kvercetin-3-o-arabinoglikozid; kvercetin-3-o-glukopiranozid; kvercetin- 3-O-galaktopiranozid; kvercetin-3-o-rhamnopiranozid; kvercetin-3-oarabinofuranozid. Az a-l-arabinofuranozid egység nem tartalmaz 1,2-cisz-diol rendszert, de valószínuleg a 2-5 hidroxi csoportokkal borátkomplexet képezhet, mivel ezek térbélileg közel állnak egymáshoz [66]. A kvercetin-3-glükozid elválasztása a kvercetin-3-galaktozidtól, mely a HPLC-módszernél nehézségbe ütközik, a CE-vel könnyedén sikerült megvalósítani a komplexáló puffereket használva (borát), mivel a galaktozid stabil komplexeket képez a galaktóz C 3 és C 4 -es hidroxi csoportjaival, míg a glukozid nem képezi ezt a típusú stabil komplexeket és kisebb migrációs idovel vándorolnak [60]. A flavonoidok MECC elválasztása az analitok elektroforetikus mobilitásán (ami csökkentheto 7-es ph-jú értékeket használva), az oldószer EOF-án, a micellák elektroforetikus mobilitásán alapul. A flavonoid-glikozidok MECC elválasztása elérheto anionos (SDS) vagy kationos (CTAB vagy CTAC) micellákat használva, habár az elobbi gyakoribb. Ha CTAB-t használunk az EOF iránya az anód felé tolódik. A CTAB által képzett micellák az anód felé vándorolnak az EOF-el ellentétes irányba. Negatívan töltött flavonoidok injektálásával a kapilláris negatív végén az EOF megnöveli az analitok sebességét, míg a CTAB késlelteto hatást fejt ki. Az MECC által létrejött szelektív retenció a fenolátok megoszlási különbségébol adódik 26

27 a vizes puffer és micelláris fázis között. Az MECC-ben CTAB-vel és ph=7 környezetben flavonoid glikozidok elválasztásánál a polárisabb komponensek vándorolnak eloször, míg a lipofilebb flavonoidok a CTAB micellákkal történo kölcsönhatás következtében késleltetést szenvednek. A triglikozidok hamarabb vándorolnak, mint a diglikozidok és utóbbiak gyorsabban, mint a monoglikozidok. Az acilálás által növekszik a MT, mint várható is, hiszen ez a gyök növeli a flavonoid hidrofobicitását [64] Elméleti számítások Ismeretesek publikációk, amelyek a flavonoidok elválasztásának optimalizálását tuzték ki célul és ezt a jellemzo elméleti paraméterek összefüggéseinek meghatározásával, kísérelték meg leírni. A jó elválasztás követelményei: minden csúcs jól elváljon (R>4) és az elválasztás kevesebb, mint 40 percet vegyen igénybe. Az említett két kritériumot figyelembe véve, két csúcs között a legjobb elválást a következo képlet írja le: R=2 (t 2 - t 1 ) / W 1 + W 2 Ahol t 1 ést 2 a vándorlási ido, W 1 és W 2 az alapvonali csúcs szélesség két elvált csúcspár esetén. Frakcionált elválasztásnál egy adott komponens gyujtésének elkezdéséhez szükséges ido t, R = (L/l) / t R, ahol t R az a migrációs ido, ami a starttól a detektorig szükséges, L a kapilláris hossza, l az hasznos hosszúság (a bemeno végétol a detektorig) [67]. Terabe által bevezetett MECC, az analitok megoszlási képességét a vizes és micelláris fázis között használja, mint eszközt, hogy megváltoztassa az analitok migrációs tulajdonságait, így befolyásolva az elválasztást. Ennek jellemzésére bevezették a kapacitási faktort, amely elso megközelítésben: K = (t m t 0 ) / t 0 (1 t m / t mc ), majd késobb K, = (t m t 0 ) / (t m t 0 ) megfogalmazásban írtak le, ahol t m, t 0 és t mc az analitok ozmotikus áramlási jellemzoje és a micella migrációs ideje. Az utóbbi képlet matematikailag jobban jellemzi a 27