A vírusellenálló transzgénikus növények. Az RNS silencing antivirális rendszer működése. (A silencing-független vírusellenállóság genetikai alapjai)

Átírás

1 A vírusellenálló transzgénikus növények. Az RNS silencing antivirális rendszer működése. (A silencing-független vírusellenállóság genetikai alapjai) Leadva:1-51-ig. (52-56 már nem) Silhavy Dániel MBK Növényi RNS Biológia csoport Gödöllő

2 A növényi vírusok és a terjedő, veszélyes növénykórokozók (emerging infectious diseases) A növényi vírusok obligát paraziták, amelyek a gazda génexpressziós rendszerét használják a replikációjukhoz Vírus okozta mezőgazdasági kár viszonylag kicsi, de egyes területeken, egyes fajokon nagyon súlyos lehet Pl. Manióka, szub-szahara térség A haszonnövények esetén az Emerging infectious diseases 46%vírus, 30%gomba, 16% baktérium Konklúzió: a haszonnövényeket védeni kell a vírusoktól

3 Vírus fertőzési ciklus Virus vektorok rovar, nematoda, gomba, mechanikus fertőzés (replikáció a primary infected sejtben) Magátvitel az új generációba Vírus vektorok Lokális és szisztemikus terjedés Új gazdanövény Fertőzött levél Szisztemikus levél Szisztemikus terjedés replikáció a primary infected sejtben Sejtről-sejtre mozgás

4 Hogyan védhetjük meg a haszonnövényeket a vírusoktól? - Vírus vektorok kiirtása (inszekticidek stb.) -Vírusellenálló növények termesztése. Olcsó, környezetbarát alternatíva. A vírusellenálló növény legalább egy lépését gátolja a vírus fertőzési ciklusnak, -vírus vektor fertőzést -replikáció a primary infected sejtekben -sejtről-sejtre mozgást -szisztemikus mozgást A fertőzés megakadályozásához a növénynek a vírust terjesztő vektorral szemben rezisztensnek kell lenni (levélszőrök, viaszos kutikula, vastag sejtfal stb.). A nemesítők ezt is vírusrezisztenciának tartják. Virológusok: Vírusrezisztens a növény, -ha a vírus nem képes replikálódni az elsődleges fertőzött sejtekben, -vagy ha nem tud sejtről-sejtre, illetve szisztemikusan mozogni.

5 Természetes rezisztencia A rezisztencia gének hagyományos úton bevihetőek Kell: genetikai változatosság, szelekciós rendszer Vírusrezisztencia típusok Genetikai módosításon alapuló rezisztencia A rezisztencia gének transzformációval építhetőek csak be Természetes vírus rezisztencia rendszerek Vírus specifikus (genetikai variabilitás,hagyományos nemesítés) Poligénes Monogénes Általános antivirális rendszer (RNS silencing, RNAi) (genetikai variáció nincs hagyományos nemesítéshez rossz biotechnológiai nemesítés) Ált. quantitatív rez. ritkán használt, de pl. MSV mastrevírus jó Recesszív!! 1/3 Domináns 2/3 R-gén!!! Inhibitor!

6 Növényi transzformáció: Idegen gének növényi sejtekben történő kifejeztetése Expresszió Tranziens (időszakos) génexpresszió Az idegen DNS kópiaszáma magas de a DNS nem integrálódik,nem öröklődik Stabil (termesztésre csak ez) Az idegen DNS a növény genomjába integrálódik, öröklődik -DNS direkt bejuttatása növényi sejtekbe -Agrobaktérium mediált génbejuttatás -Víruskapcsolt génkifejezés Gyors, magas szintű expresszió könnyen állítható Transzgénikus növények!!!! Térbeli, időbeli vizsgálatokra is jó Egyed szintű vizsgálatokat tesz lehetővé Jobban hasonlít endogén génexpresszióhoz

7 A PDR koncepció Cél: Idegen gén beépítésével vírusellenállóvá tenni a növényt. Elvben nagyon sokféle gén alkalmas lehet rá, pl dsrns vírusok ellen dsrns kötő fehérjék termeltetése. Gyakorlatban egy domináns típus: Pathogen derived resistance (PDR) Korai megfigyelés: keresztvédettség, cross-protection. Egy gyenge tüneteket okozó vírus fertőzés véd az azonos vagy nagyon hasonló, de erős tüneteket okozó vírusok ellen (immunizál). Ok: nem volt ismert, de használták a vírusok elleni védekezésben. Sanford és Johnston : PDR általános mesterséges védekezés lehet bármely patogén ellen (vírus, gomba, baktérium). Elv: fertőzéshez patogén fehérjék (és RNS-ek) megfelelő mennyisége és minősége kell. Minden patogén termel olyan fehérjéket, amelyek a patogénnek kellenek, a gazdának nem. Ha ezeket vad vagy inkább mutáns formában a gazdában túltermeltetjük, felborul a patogenezishez szükséges fehérje egyensúly, a gazda védett lesz. Teszt: E. coli ban termeltettek a Qβ fágból eltérő fehérjéket, a transzgénikus E. coli-k védettek lettek Qβ-ra!!!

8 A fehérje-alapú PDR, mint mesterséges növényi vírusrezisztencia rendszer A PDR első növényi tesztje Powell Beachy Transzgénikus dohány, ami a TMV köpenyfehérje (CP) génjét expresszálja Tobacco mosaic virus (TMV, + ssrns vírus) Transzgénikus vonalak fertőzése TMV-vel, illetve kontroll vírussal Eredmény: -TMV CP expresszáló vonalak védettek a TMV-vel szemben, de fogékonyak a kontroll vírusokkal szemben (kivéve ha azok a TMV közeli rokonai) -Minél magasabb a CP transzgén eredetű fehérje szint, annál erősebb védettség Fehérje-alapú PDR (Protein-based PDR vagy CP-mediated resistance) A PDR koncepció növényekben vírusok ellen hatékony, ígéretes, mert bármely vírus ellen könnyen védettség érhető el!!!!

9 Az RNS-alapú PDR, mint mesterséges növényi vírusrezisztencia rendszer Lindbo, Dougherty Cél: TEV (Tobacco etch virus, potyvírus) rezisztens dohány növények előállítása Beépíteni CP, CPmut.(áns) és kontrollként nem-transzlálható cprns Sok száz vonal, kiválasztva magas és alacsony CP, illetve CPmut. expresszáló egyedek és egy darab cprns expresszáló negatív kontroll. Eredmény: TEV fertőzés A TEV CP termelők mind fertőződnek, némelyik idővel kigyógyult, Mások teljesen fogékonyak. Hasonló eredmény CPmut.-okkal is. A cprns vonal teljesen rezisztensnek bizonyult!!!!!! -A cprns vonalban a cprns transzkripció erős, a sejtmagban a cprns szint magas, a citoplazmában a cprns szint drámaian alacsony. -A cprns expresszáló vonal rezisztenciája specifikus, csak TEV ellen hat. -Itt fehérje nincs, PDR mégis van: RNS-alapú PDR (RNA-based PDR, ma már tudjuk RNS silencing alapú rezisztencia) A növényekben PDR-alapú transzgénikus vírusrezisztencia kétféle módon is elérhető, virális fehérje, illetve RNS termeltetésével!!!! Az RNS-alapú hatékonyabb!!!!

10 Vírusellenálló transzgénikus növények 1, Gyorsan, számos gazdanövénybe beépítették egy, illetve több vírus CP-jét vagy cprns-ét. Sok változatos vírusellenálló vonal, mindenféle növényi vírus ellen (+ssrns, -ssrns, dsrns, ssdns, dsdns). Nagyon sikeres programok, szinte mindenhol hatékony rezisztencia. Piacra jutás nagyon nehéz, kevés vírusellenálló fajta - a transzgénikus vonal hozama, minősége nem romolhat - versenyképes fajtákba kell bevinni - a víruskártételnek komolynak kell lenni - a transzgénikus növény bevezetéséhez a szükséges tesztek rettenetesen drágák - vásárlók elfogadják -Ma alig néhány vírusellenálló fajta a piacon -USA: vírusellenálló papaya, illetve tökfélék, tök, (zucchini, sárgadinnye), -Kína: vírusellenálló paradicsom, paprika, illetve papaya

11 Vírusellenálló Papaya 1, Vírusellenálló Papaya-USA USA- Fő papaya termelő vidék Hawaii. PRSV- Papaya ringspot virus (potyvirus). Úgy tűnt teljesen elpusztítja a papaya termesztést. CP-transzgénikus növények Elfogadottság: % transzgénikus, % Papaya infected with the papaya ringspot virus Virus resistance gene introduced

12 Vírusellenálló Papaya 2, 2 fajta -SunUP- homozigóta a CP-re -Rainbow- heterozigótacp-re- SunUp X nem transzgénikus Kapoho RNS-alapú PDR, mert CP fehérje nem mutatható ki, beépített cprns RNS silencing célpont (kevés mrns, sok sirns). Rainbow körülvéve nem-transzgénikussal Rainbow

13 Vírusellenálló Papaya 2, Mennyire ellenálló más törzsekre? A Rainbow-ba és a SunUp-ba a Hawaii PRSV egy darabját építették. Fertőzés: Hawaii PRSV, illetve Taiwan-i PRSV-vel. Hawaii PRSV Taiwan PRSV Rainbow SunUp Taiwan PRSV A homozigóta vonal ellenálló Taiwan-i törzsre, a heterozigóta fogékony. A fogékonyság tehát függ a vírus különbözőségétől, illetve a transzgénikus vonal hatékonyságától. Rezisztensek PRSV-re ha legalább 90 % szekvencia hasonlóság a CP régióban RNS szinten.

14 Vírusellenálló Tök 1, nyári tök ZYMV (Zucchini yellow mosaic virus) és WMV (Watermelon mosaic virus), illetve CMV (Cucumber mosaic virus) CP beépítés egyenként. Keresztezéssel 2 vagy mindhárom összeépíthető. Hagyományos nemesítéssel beépítés több tökfélébe pl. öt zucchini fajtába. Azokban is működik, tehát a rezisztencia faktor nem fajta, faj specifikus. A rez. molekuláris alapja nem ismert (fehérje vagy RNS-alapú PDR). Elfogadottság: %, de New Jersey-ben 70% The Freedom II squash has a modified coat protein that confer resistance to zucchini yellows mosaic virus and watermelon mosaic virus II. Scientists are now trying to develop crops with as many as five virus resistance genes

15 Vírusellenálló Tök 2, Non-TR. TR. TR. Non-TR. ZYMV és WMV fertőzés A fertőzés a hozamot és a minőséget is rontja

16 Vírusellenálló burgonya, két transzgénikus vírusellenálló burgonya vonal -Potato leafroll virus PLRV rezisztens itt a CP beépítés nem működött, de a replikáz beépítés igen. (ezt a vonalat keresztezték a a burgonyabogár rezisztens Bt transzgénikussal is) -PVY Potato virus Y rezisztens- CP beépítés 2001-ben kivonták, sok kritika, viszonylag kis piaci érték.

17 Vírusellenálló tesztvonalak 983 field teszt transzgénikus vírusrezisztens vonalakkal,

18 Vírusellenálló transzgénikus vonalak Miért sikeresek a vírusrez. transzgénikus vonalak a többi patogén rez. képest? Könnyű, biztosan működő PDR rendszer. Miért kevés a piacon? drága (lásd korábban) Vírusellenálló transzgénikus vonalak veszélyei 1, A vonal rossz, nem védi a növényt -félrevezeti a farmert, pl. nem öli a vektort. Ezek nagyon megbízható vonalak, a rezisztencia erős!!! 2, A rezisztencia nem tartós. Rezisztencia törést eddig csak üvegházban tapasztaltak!!! 3, A transzgénikus CP rekombinálódhat más vírussal. Ez elvben igaz, eddig ilyet nem láttak. De természetben az együttfertőzés gyakori, ott sokszor valószínűbb a rekombináció!!! 4, A transzg. CP más vírus RNS-eit is becsomagolhatja, veszélyes új vírus jöhet. Elvben ez is lehet, de lásd 3. pontot. Az RNS-alapú PDR-nél elvben sem lehet!!! 5, A transzgén pollennel kijut, vírusellenállóvá teszi a vad rokon növényt. Igaz, ha van rokon,amelynek a fékentartásában a vírus komoly szerepet játszik, nem szabad használni!!! 6, Kimerítheti a gazda védelmi rendszerét, más patogénekkel szemben fogékonyabb lesz.. Ezt sem tapasztalták eddig.!!! Fajtadiverzitás!!!!????

19 Természetes rezisztencia Vírusrezisztencia típusok Genetikai módosításon alapuló rezisztencia Természetes vírus rezisztencia rendszerek Vírus specifikus (genetikai variabilitás, hagyományos nemesítés) Általános antivirális rendszer (RNS silencing, RNA interferencia-rnai) Poligénes Monogénes Ált. quantitatív rez. ritkán használt, de pl. MSV mastrevírus jó Recesszív!! 1/3 Domináns 2/3 R-gén!!! Inhibitor! Természetes genetikai variabilitás van, hagyományos nemesítésben használható! Hagyományos nemesítésben általánosan használt Genetikai variabilitás nincs, hagy. nemesítéshez rossz. De, transzgénikus nemesítésre kiváló!!!

20 A transzgénikus vírusellenállóság alapja, az RNS silencing rendszer

21 The Nobel Prize in Physiology or Medicine 2006 "az RNS interferencia rendszer felismeréséért" "for their discovery of RNA interference - gene silencing by double-stranded RNA" Andrew Z. Fire Craig C. Mello Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature Feb 19; RNAi = RNS interferencia = RNS silencing

22 Géninaktiválás antisense RNS technológiával Baktétiumokban van antisense gátlás, hátha eukariótákban is hatékony lehet Target mrns Antisense RNS Target mrns degradáció

23 Működhet-e az antisense gátlás növényekben? Hexokináz1 Endogén gén vad típus anti-athexokináz1 anti-athexokináz1 transzgén Vad növény anti- AtHexokináz1 Hexokináz mrns 6% cukor Az antisense RNS-ek növényekben gyakran a cél mrns degradációját, ezáltal géninaktivációt, silencing-et okoznak!

24 Mi történik a sense mrns túltermelésénél? Chalcone synthase (CHS) gén Erős promoter pigment képzésért felelős Chalcone synthase gén Chalcone synthase transzgénikus petúnia Nem transzformált transzformánsok Napoli et al Chs mrns Co-szupresszió (ritka) Ritkán, de a sense mrns túltermelési eltünteti a célgén mrns-ét, Az antisense gátlás modellel nem összeegyeztethető!!!

25 Mi okozhatja a co-szupressziót? Fire A, Xu S, Montgomery MK, Kostas SA, Driver SE, Mello CC. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature Feb 19; RNAi - RNS silencing szúrni sense, antisense, illetve sense+antisense (dsrns) RNS-sel Unc22 sense Unc22 antisense Unc22 dsrns UNC-22 kell normál mozgáshoz A dsrns hatékony és specifikus géninaktivációt eredményez, sokkal jobb, mint a sense vagy antisense túltermelés!

26 Sejt-autonóm RNA silencing dsrns induktor D I C E R Specifitási faktor Amplifikáció, + visszacsatolás sirns nt cap cap cap Második szál szintézis RDR RISC (AGO) AAA RDR (exonukleáz) AAA A homológ mrns hasítása (vagy transzlációs gátlása) AAA Végrehajtó komplex

27 Az RNAi (silencing) rendszer A silencing rendszer egy ősi eukarióta génszabályozási mechanizmus, amely kétszálú (double-stranded, ds)rns-ek hatására indukálódik és a dsrns-sel homológ nukleinsavak inaktiválása, elsősorban a homológ mrns-ek specifikus lebontása révén a hasonló gének specifikus és nagyon hatékony inaktivációját, silencing-jét eredményezi. A rendszer specifitását rövid nt RNS-ek adják!!!! Az RNAi (silencing) rendszer jelentősége Az RNAi rendszer felismerése alapvetően változtatta meg az eukarióta génszabályozásról, az RNS-ek szerepéről alkotott képet Páratlanul hatékony eszköz a gén-funkció kapcsolat megállapítására Óriási gyakorlati jelentőség Az RNS-alapú transzgénikus vírusrezisztencia (RNS-alapú PDR) pl. ezen alapszik.

28 A növényi RNS silencing alapmechanizmusa (az amplifkációs ciklus nélkül) Sejt-autonóm RNA silencing dsrns Rövid távú szisztemikus RNS silencing D I C E R cap RISC (AGO) A homológ mrns hasítása (vagy transzlációs gátlása) AAA sirns Plasmodezma RISC AAA Phloem Rövid távú szisztemikus RNA silencing Felső levelek

29 A vírusok elvben- a növényi RNS silencing ideális célpontjai Transzláció Virus + RNS Viral RdRP + viral dsrns Replikáció - RNA Viral RdRP viral dsrns + + _ Viral RdRP + ++ D I C E R sirns RISC Vírus RNS degradáció Plasmodezma RISC Szisztemikus RNS silencing

30 Az RNS silencing valóban antivirális rendszer növényekben? Control wt wt CMV fertőzés RNS silencing mutáns A növényi RNS silencing egy hatékony antivirális rendszer! Vaucheret et. al., Cell 2000

31 Mennyire hatékony antivirális rendszer az RNS silencing? A legtöbb vírus egyáltalán nem fertőzi a legtöbb növényt - non-host Szerepet játszhat-e ebben az RNS silencing? PVX-Arabidopsis non-host kapcsolat Teszt: PVX képes-e fertőzni a silencing (DICER) mutáns Arabidosist? Jaubert M et al. Plant Physiol. 2011; Az RNS silencing egy rendkívül hatékony antivirális rendszer, amely (teljes) non-host védettséget biztosíthat!

32 Transzláció Vírus + RNS Vírus RdRP + vírus dsrns Replikáció - RNA Vírus RdRP vírus dsrns + + _ Vírus RdRP + ++ D I C E R sirns RISC Vírus RNS degradáció Plasmodezma RISC Szisztemikus RNS silencing növényi RNS silencing - vírus silencing szupresszió: A vírus előnyben, mert a silencing akkor aktiválódik, amikor a vírus már fertőz!!!

33 Transzgénikus vírus rezisztens növények Virális szekvenciák transzgénről expresszáltatva (intron szeparált fordított ismétlődés) CP intron PC AAA vírusszekvencia sirns dsrns DICER AA %-os védettség!!! RISC RISC Fertőzés Vírus + RNS RISC Vírus RNS degradáció Amikor a vírus fertőz, már van vírus ellen aktív sirns-risc komplex!!!

34 Transzgénikus multivírus rezisztencia Tosposviruses gazd- fontos negatív szálú vírusok. A transzgén egy-egy darabot ford. ismétlődésként hordoz 4 eltérő Tospovírusból. Tr16 Cont. Tr16 Cont. Számos vírus ellen egyidejű védettség érhető el!!! Bucher et. al., J. Gen Virol 2006

35 Miért okoztak a CP és nccp transzgén beültetések RNS silencing-et? dsrns induktor Amplifikáció, + visszacsatolás cap Második szál szintézis RDR AAA RDR cap D I C E R sirns cap AAA AAA Specifitási faktor RISC (AGO) Végrehajtó komplex A homológ mrns hasítása A transzgén expresszió erős és kevésbé kontrollált, mint az endogén, ezért sok aberráns cap vagy AAA nélküli mrns, ezek beindítják az RDR-silencing ciklust. Az aberráns RNS-ek által indukált silencing ált. gyengébb, mint a inverted-repeat, azaz a direkt dsrns termelésen alapuló. Minél több vírus szekvenciájú sirns-risc fertőzéskor, annál hatékonyabb védettség.

36 -RNS silencing természetes antivirális rendszer -A transzgénikus vírusellenálló növények az RNS silencing rendszert használják ki, virális szekvencia beépítés, amiről sirns-ek képződnek, ezek beépülnek RISC-be, fertőzéskor azonnal támadják a vírust. Erős, specifikus és tartós rezisztenciát okoznak. -inverted repeat beépítés-direkt dsrns szintézis, vagy virális szekvencia erős expressziója, RDR-silencing ciklus aktiválása. Inv. Rep. Több sirns, jobb védettség. -transzgénikus vírusellenálóság specifikus, csak azok ellen a vírusok ellen hatásos, amelyeket a virális beépített szekvenciáról képződött sirns-ek Felismernek. Tartós, mert a vírusnak nagy szekvencia részt kéne lecserélni, hogy elkerülje.

37 Gazda-parazita ko-evolúció (fegyverkezési verseny) Gazda Silencing antivirális rendszer vírus evolúció, hatékonyan fertőző vírusok?

38 Az RNS silencing szupressziója, a vírusok lépése az evolúciós fegyverkezési versenyben

39 Ha az RNS silencing ilyen hatékony antivirális mechanizmus, hogyan fertőznek a növényi vírusok? 2 lehetőség: azokban a vírus-gazda kapcsolatokban, ahol a vírus fertőz, a patogén elkerüli vagy legyőzi (szupresszálja) az RNS silencing-et? N. benthamiana- Cymbidium ringspot virus (Cym) model rendszer Cym N. Benthamiana -hatékony RNS silencing rendszer működik p19 ORF 1 ORF 2 ORF 3 ORF 4 Cym - kontroll G-RNS Sziszt. levél minta 21 nt sirns Cym a szisztem. levélben A vírus nem tudja elkerülni a silencing-et, valószínű szupresszálja!

40 Hogyan győzhetik le a vírusok az RNS silencing-et? N. benthamiana- Cymbidium ringspot virus (Cym) model rendszer Cym p19 19stop p19 ORF 1 ORF 2 ORF 3 ORF 4 ORF 1 ORF 2 ORF 3 ORF Cym a szisztem. Levélben Recovery 19stop a szisztem. Levélben A p19 kell a hatékony szisztemikus fertőzéshez! 1 2

41 Hogyan szupresszálja a silencing-et a p19, 1? in vitro sirns kötés vizsgálata 19 GST-p19 fúziós synthetic 21mer ds sirns G GST ds sirnskompetítor 19G 19G 100X 1000X ss sirns P19 G ds sirns P19 G P19 Jelölt p19-kötött ds sirns Jelölt szabad ss vagy ds sirns Long ss RNS Long ds RNS A p19 in vitro méretszelektíven köti a ds sirns-eket, a silencing kulcsmolekuláit! Az első méretszelektív dsrns-kötő fehérje!

42 Mi a p19 méretspecifikus ds sirns-kötésének az alapja? p19 dimerként köti a ds sirns-t C N C N Vargason, et al.,2003 N C Reading head Dimerization, dsrna binding α1 α2 β1 β2 α3 α4 β3 β4 α5 P19 A p19 dimer köti a dsrns-t, az N-terminális vég köti a ds sirns végét, de csak a megfelelő méret esetén, azaz a p19 sokkal jobban köti sirns-méretű dsrns-eket, mint a nagyobbakat vagy kisebbeket.

43 Hogyan szupresszál a P19? Vírus fertőzés iránya RISC RISC P19 Viral RNA CymRSV RISC RISC RISC Vírus RNS P19 dimer Vírus sirns-ek Cym19stop RISC RISC RISC RISC RISC RISC Viral RNAs p19 dimers Virus sirnas Havelda et al. 2005

44 Viral family Virus Suppressors Other functions Positive-strand RNA viruses in plants Carmovirus Turnip Crinkle virus P38 Coat protein Cucumovirus Cucumber mosaic virus; 2b Host-specific movement Closterovirus Vírus kódolta RNS szupresszorok tomato aspermy virus Beet yellows virus Citrus tristeza virus P21 P20 P23 CP Replication enhancer Replication enhancer Nucleic-acid binding Coat protein Comovirus Cowpea mosaic virus S protein Small coat protein Hordeivirus Barley yellow mosaic virus b Replication enhancer; movement; seed transmission; phatogenicity determinant Pecluvirus Peanut clump virus P15 Movement Polerovirus Beet western yellows virus; P0 Phatogenicity determinant cucurbit aphid-borne yellows virus Potexvirus Potato virus X P25 Movement Potyvirus Potato virus Y; tobacco etch virus; turnip yellow virus HcPro Movement; polyprotein processing; aphid transmission; phatogenicity determinant Sobemovirus Rice yellow mottle virus P1 Movement; phatogenicity determinant Tombusvirus Tomato bushy stunt virus; cymbidium ringspot virus; carnation Italian ringspot virus P19 Movement; phatogenicity determinant Tobamovirus Tobacco mosaic virus; P30 p122 Replication tomato mosaic virus Tymovirus Turnip yellow mosaic virus P69 Movement; phatogenicity determinant Negative-strand RNA viruses in plants Tospovirus Tomato spotted with virus NSs Phatogenicity determinant Tenuivirus Rice hoja blanca virus NS3 Unknown DNA viruses in plants Geminivirus African cassava mosaic virus Tomato yellow leaf curl virus Mungbean yellow mosaic virus AC2, AC4 C2 C2 Positive-strand RNA viruses in animals Nodavirus Flock house virus; nodamura virus B2 Plaque formation Transcriptional activator protein (TrAP), Phatogenicity determinant Voinnet, 2005

45 A legtöbb növ. vírus expresszál RNS silencing szuppresszort! vírus dsrns P14? P19 D I C E R sirns Plasmodezma P0 RISC Vírus RNS degradáció RISC Szisztemikus RNA silencing A különböző RNS silencing szuppresszorok eltérően hatnak!

46 Gazda Gazda-vírus ko-evolúció (fegyverkezési verseny) Szupreszor nélküli vírus evolúció Silencing antivirális rendszer Komplexebbb, hatékonyabb silencing rendszer (pl. több DICER, AGO, RdRP vagy spec. Védekezési mechanizmusok Pl. N. tabaccum p19-et felismeri hiperszenzitív válasz, Sejthalál, védettség Virális silencing szupreszorok evolúciója vagy meglévő fehérje szerez + funkciót pl. TEV HvPro vagy új, szupresszor fehérje evolválódik pl. p19 A gazda silencing rendszere hatékony egyes vírusok ellen, mások ellen nem. A vírus szupresszora is hatékony lehet egyes gazdák ellen, másoké ellen nem A gazda-vírus kapcsolat eredménye függ genetikai és környezeti tényezőktől is.

47 Ha a silencing szupresszorok gátolják az RNS silencing-et, vajon hogyan véd mégis? A hőmérséklet hatása a gazda-vírus interakcióra Magas hőmérséklet Alacsony vírus szint gyenge tünetek Heat masking Harrison(1955): Vírus replikáció Vírus szint Hőmérséklet-függő vírus degradáció Lehet, hogy az RNS silencing a feltételezett hőmérséklet-függő RNS degradációs rendszer?

48 Befolyásolja-e a hőmérséklet a vírus-indukálta szisztemikus RNS silencing-et? 15 C 21 C 27 C 19stop Cym Cym 19stop Vírus akkumuláció a szisztemikus levelekben A vírus-indukálta szisztemikus RNS silencing hőmérsékletfüggő

49 Alacsony hőmérséklet, gyenge silencing Magas hőmérséklet, hatékony silencing Fertőző vírusok tünetei erősödnek tünetgyengülés, még erős szupresszort termelővírus ellen is véd szupresszor nélküli vírus is fertőz Hőterápia Heat masking

50 Az RNS silencing hiába a növények talán leghatékonyabb antivirális rendszere, nemesítésre nem jó, nincs fajon belül variáció. De a silencing rendszer megértése hozzásegíthet, hogy hatékonyabb vírusellenálló növényeket hozzunk létre!!!!

51 Milyen hatással van a hőmérséklet a transzgénikus vírusrezisztenciára? Növényi RNS silencing hőmérsékletfüggő, hidegben gyenge. A transzgénikus vírusrezisztencia alapvetően silencing-en alapszik CymRSV aberráns RNS-t expresszáló rezisztens dohány (A1) 15 C 24 C CymRSV C A1 A1 wt A1 wt wt Alacsony hőmérsékleten az aberráns RNS silencing-en alapuló vírusellenállóság elveszhet! De az inverted repeat-konstrukciók által kiváltott vírusellenállóság hatékonyabb, hidegben is működik!!! Artificial mirns-alapú vírusrezisztencia szintén stabil hidegben.

52 Természetes rezisztencia A rezisztencia gének hagyományos úton bevihetőek Vírusrezisztencia típusok Genetikai módosításon alapuló rezisztencia A rezisztencia gének csak transzformációval építhetőek be Természetes vírus rezisztencia rendszerek Vírus specifikus (genetikai variabilitás,hagyományos nemesítés) Poligénes Monogénes Általános antivirális rendszer (RNS silencing, RNAi) (genetikai variáció nincs hagyományos nemesítéshez rossz biotechnológiai nemesítés) Ált. quantitatív rez. ritkán használt, de pl. MSV mastrevírus jó Recesszív!! 1/3 Domináns 2/3 R-gén!!! Inhibitor!

53 R-gén(ek) közvetítette egygénes, domináns vírusrezisztencia R (resistance) gének domináns gazda faktorok, amelyek megvédik a növényeket az adott R génnek megfelelő Avr (Avirulence) gént hordozó patogénektől (gene-for-gene model). Az R-gén közvetítette védekezés hatékony mindenféle patogén rovar, nematodes, gomba, baktérium és vírus ellen. VirusA1 Avr1 R1 Rezisztencia R1 Fertőzés VirusA2 Avr* Számos R-gént klónoztak----hasonlóság! NB=Nucleotide binding LRR=Leucine rich repeat! Virális Avr faktorok : bármely vírus fehérje, ritkán RNS darab, Egy vírus esetén a különböző gazdákban más és más fehérjék lehetnek az AVR faktorok.

54 Hogyan védik az R-gének a növényt? Két fő aspektus: Hogyan ismeri fel az R gén a megfelelő Avr faktort? Az R-Avr kapcsolat miként vezet rezisztenciához? Hogyan ismeri fel az R gén a megfelelő Avr faktort? Két model: receptor-ligand versus guarding model Receptor-ligand Avr R Def. -néhány száz R több ezer Avr-t tud azonosítani -Kísérletes biz. az R-Avr direkt interakcióra nagyon ritka -azonos co-factorok kellenek a különböző R-Avr rendszerekhez R=TMV N rez. faktor, Avr faktor p50 replikáz domain N-p50 R-Avr a legjobban tanulmányozott növényi R-Avr system Guarding model Avr Co-factor * R Def. Yeast two-hybrid P50 direkt interaktál az NBS-LRR Ueda et. al., Plant Mol. Biol. 1997

55 Hogyan védik az R-gének a növényt? Más tanulmányok: P50 közvetetten interaktál az N fehérje TIR doménjével. Yeast two-hybrid screen. a TIR domén kapcsolódik az NRIP1 kloroplaszt génnel Részt vesz-e az NRIP1 az N közvetítette rezisztenciában? (N+NRIP1) vad dohány N gén knock-out NRIP1 knock-out TMV fertőzés (TMV-GFP) NRIP1-N guard model Caplan et. al., Cell 2008

56 Az R-Avr kapcsolat miként vezet rezisztenciához? R-Avr interakció számos védelmi rendszert is aktivál és gyakran vezet lokális sejthalálhoz, ami korlátozza a patogén terjedését HR (hypersensitive response), CMV+ Mennyire specifikusak a különböző R-Avr kiváltotta védelmi válaszok? PVX-Avr - PVX-avr - CMV- PVX Rx gén protoplast PVX Rx gén PVX Rx gén Rx-PVX Avr kiváltotta védelmi válasz képes más (CMV) vírus replikációját is gátolni Köhm et. al., Plant Cell 1993