A TB Quick Stain Kit a hideg festési módszer gyorsabb változata A TB Fluorescent Stain Kit M az auramin-o saválló fluoreszcens festés módszere alapján

Átírás

1 B TB Stain Kits and Reagents A jelmagyarázat a használati utasítás végén található U /05 Magyar TB Stain Kit K 1 Kat sz TB Carbolfuchsin KF Mycobacteriumok Kinyoun-féle (hideg) TB Decolorizer saválló festéséhez TB Brilliant Green K TB Stain Kit ZN TB Carbolfuchsin ZN Mycobacteriumok Ziehl Neelsen-féle (meleg) TB Decolorizer saválló festéséhez TB Methylene Blue TB Quick Stain Kit TB Quick Stain Carbolfuchsin A mycobacteriumok hideg saválló TB Quick Stain Methylene Blue festésének gyors módszere TB Fluorescent Stain Kit M TB Auramine M Mycobacteriumok Morse-, Blair-, Weiser- és TB Decolorizer TM Sproat-féle fluoreszcens festéséhez TB Fluorescent Stain Kit T TB Auramine-Rhodamine T Mycobacteriumok Truant-, Brett- és TB Decolorizer TM Thomas-féle fluoreszcens festéséhez TB Auramine M Mycobacteriumok Morse-, Blair-, Weiser- és 4 x 250 ml Sproat-féle fluoreszcens festéséhez TB Auramine-Rhodamine T Mycobacteriumok Truant, Brett és 4 x 250 ml Thomas-féle fluoreszcens festéséhez TB Brilliant Green K Mycobacteriumok Kinyoun-féle (hideg) és 4 x 250 ml Ziehl Neelsen-féle (meleg) saválló festéséhez TB Carbolfuchsin KF Mycobacteriumok Kinyoun-féle (hideg) 4 x 250 ml saválló festéséhez TB Carbolfuchsin ZN Mycobacteriumok Ziehl Neelsen-féle (meleg) 4 x 250 ml saválló festéséhez TB Decolorizer Mycobacteriumok Kinyoun-féle (hideg) és 4 x 250 ml Ziehl Neelsen-féle (meleg) saválló festéséhez TB Decolorizer TM Mycobacteriumok Truant-, Brett- és 4 x 250 ml Thomas-féle, valamint Morse-, Blair-, Weiser- és Sproat-féle fluoreszcens festéséhez TB Methylene Blue Mycobacteriumok Kinyoun-féle (hideg) és 4 x 250 ml Ziehl Neelsen-féle (meleg) saválló festéséhez Mycobacteriumok Truant-, Brett- és 4 x 250 ml Thomas-féle, valamint Morse-, Blair-, Weiser- és Sproat-féle fluoreszcens festéséhez TB Quick Stain Carbolfuchsin A mycobacteriumok hideg saválló festésének 3 x 250 ml gyors módszere TB Quick Stain Methylene Blue A mycobacteriumok hideg saválló festésének 3 x 250 ml gyors módszere HASZNÁLATI JAVASLAT A TB Stain Kit festékkészlet mycobacteriális fertõzés korai feltételes diagnózisának felállításához és a baktériumizolátumok jellemzéséhez használható, olyan mintákból és tenyészetekbõl készült kenetek festésére, amelyek feltételezhetõen tartalmaznak mycobacteriumokat ÖSSZEGZÉS ÉS MAGYARÁZAT A festés a tuberkulózisbaktériumok mikroszkópos kimutatásának egyik legrégebbi, és mind a mai napig alapvetõ módszere 1 A mycobacterium egyedülálló savállósága teszi a festést megbízható módszerré a korai feltételes diagnózis felállításában és a jelenlévõ saválló pálcák számának meghatározásában A fluoreszcens mikroszkópos vizsgálatnak számos elõnye van a mycobacteriumok klasszikus kimutatási módszereihez képest, mivel gyorsabb és egyszerûbb, a lemezek könnyebben vizsgálhatók meg, és a módszer igen megbízható és kiváló 2 A TB Stain Kit K a Kinyoun-féle (hideg) saválló festés módszere alapján mûködik 3 A TB Stain Kit Z a Ziehl Neelsen-féle (meleg) saválló festés módszere alapján mûködik 4

2 A TB Quick Stain Kit a hideg festési módszer gyorsabb változata A TB Fluorescent Stain Kit M az auramin-o saválló fluoreszcens festés módszere alapján mûködik 5 A TB Fluorescent Stain Kit T az auramin-rodamin saválló fluoreszcens festés Truant, Brett és Thomas által leírt módszere alapján mûködik 6 AZ ELJÁRÁS ELVE A mycobacteriumok egyik jellemzõ tulajdonsága, hogy savállóak, vagyis ha azokat megfestik az anilinfestékkel, a bázikus fukszinnal, nehezen színteleníthetõk el, és még akkor is megtartják a színüket, ha savas etanol keverékével kezelik õket A Ziehl Neelsen-féle festékben a metilénkék a kontrasztfesték A Kinyoun-féle festékben a szükséges kontrasztot a brillantzöld biztosítja A TB Quick Stain metilénkéket használ kontrasztfestéknek, de az elszíntelenítés nem külön lépésben történik, mivel a Reagent B színtelenítõ/kontrasztfesték egy lépésben színteleníti el és festi meg a kontrasztfestékkel a kenetet A fluoreszcensz festék egyik tulajdonsága, hogy az ultraibolya fénynél rövidebb hullámohosszú fénnyel, például higanygõzlámpa fényével, vagy megfelõen szûrt erõs kék fénnyel megvilágítva látható kék sugárzást bocsát ki 7 Az auramin-o és a rodamin-b a mycobacteriális sejtek sejtfalának fajlagos zsírsavaihoz kötõdik 8 A szabad festéket a savas etanol színtelenítõoldat mossa ki A kálium-permanganát kontrasztfestékként szolgál, hogy elnyomja a nem specifikus háttér-fluoreszcenciát REAGENSEK Hozzávetõleges érték, 1 literenként* TB Stain Kit K (TB K festékkészlet) TB Carbolfuchsin KF (TB karbolos fukszin KF) Lúgos fukszin 15,0 g Fenol, USP 45,0 g Izopropanol 200,0 ml Etanol 50,0 ml Desztillált víz 750,0 ml TB Decolorizer (TB színtelenítõ folyadék) Sósav 30,0 ml Etanol/Metanol 970,0 ml TB Brilliant Green K (TB brillantzöld K) Brillantzöld 2,0 g Nátrium-hidroxid 0,02 g Desztillált víz 1000,0 ml TB Stain Kit ZN (TB festékkészlet ZN) TB Carbolfuchsin ZN (TB karbolos fukszin ZN) Lúgos fukszin 1,7 g Fenol, USP 50,0 g Izopropanol 95,0 ml Desztillált víz 905,0 ml TB Decolorizer (TB színtelenítõ folyadék) Sósav 30,0 ml Etanol/Metanol 970,0 ml TB Methylene Blue (TB metilénkék) Metilénkék, USP 2,4 g Etanol/Metanol 300,0 ml Desztillált víz 700,0 ml TB Quick Stain Reagents (TB gyorsfesték) reagensek Carbolfuchsin Reagent A (Karbolos fukszin A reagens) Lúgos fukszin (alkoholos) 17,0 g Fenol vizes oldata 1000,0 ml TB Fluorescent Stain Kit M TB Auramine M (TB auramin M) Auramin-O 2,0 g Fenol, USP 4,0 g Glicerin, USP 100,0 ml Izopropanol 250,0 ml Desztillált víz 650,0 ml TB Decolorizer TM (TB színtelenítõ folyadék TM) Sósav 5,0 ml Izopropanol 700,0 ml Desztillált víz 300,0 ml (TB kálium-permanganát) Kálium-permanganát 5,0 g Desztillált víz 1000,0 ml TB Fluorescent Stain Kit T (TB fluoreszcens festékkészlet T) TB Auramine-Rhodamine T (TB auramin rodamin T) Auramin O 12,0 g Rodamin B 6,0 g Fenol, USP 80,0 g Glicerin, USP 600,0 ml Izopropanol 140,0 ml Desztillált víz 260,0 ml TB Decolorizer TM (TB színtelenítõ folyadék TM) Sósav 5,0 ml Izopropanol 700,0 ml Desztillált víz 300,0 ml (TB kálium-permanganát) Kálium-permanganát 5,0 g Desztillált víz 1000,0 ml Methylene Blue Reagent B (Metilénkék B reagens) Metilénkék (alkoholos) 2,0 g Savas etanol 1000,0 ml *Úgy beállítva és/vagy kiegészítve, hogy megfeleljen a végrehajtási követelményeknek Figyelmeztetés: In vitro diagnosztikai felhasználásra A klinikai mintákban patogén mikroorganizmusok, pl Hepatitis és HIV-vírusok lehetnek jelen Minden vérrel, illetve más testnedvvel fertõzött tételt a Szokványos óvintézkedéseket 9-12 elõírásai szerint, illetve az intézet irányelvei szerint kell kezelni Az aeroszolt nem termelõ klinikai minta feldolgozási folyamatoknál, mint amilyen a saválló kenet készítése, Biosafety Level 2 gyakorlat és felszerelés szükséges Minden aeroszol képzõdéssel járó mûvelethez 1 vagy 2 osztályú biztonsági elszívófülke alatt kell elvégezni Biosafety Level 3 színtû gyakorlat, elszigetelt felszerelés és berendezés szükséges az M tuberculosis és az M bovis tenyészetekkel való munkához Az állatokkal végzett vizsgálatokhoz is speciális eljárás szükséges 13 2

3 A reagensek szemirritációt vagy vakságot okozhatnak, és lenyelésük sérüléshez vagy halálhoz vezethet Ha a reagens a szembe kerül, legalább 15 percig öblögesse szemöblítõvel vagy csapvízzel, majd forduljon orvoshoz A festék- és színtelenítõoldatok fokozottan tûzveszélyesek, gõzeik veszélyesek lehetnek; ne használja õket nyílt láng közelében Ügyeljen arra, hogy ne kerüljenek bõrre, szembe vagy nyálkahártyára A reagenseket jól szellõzõ helyen használja, és vigyázzon, hogy ne kerüljenek a bõrére, ne nyelje le õket és gõzeiket ne lélegezze be tartósan TB Carbolfuchsin ZN: Bõrre kerülve és lenyelés esetén mérgezõ! Égést okozhat Tartsa az edényeket gondosan lezárva Ügyeljen arra, hogy a folyadék ne kerüljön a szembe vagy a bõrre Használjon megfelelõ védõruhát és kesztyût TB Decolorizer TM: Égést okozhat Tartsa az edényeket gondosan lezárva és jól szellõzõ helyen Ha a szer a szembe kerül, azonnal öblítse ki bõ vízzel, majd forduljon orvoshoz Használjon megfelelõ védõruházatot, kesztyût, valamint szem- és arcvédõt Baleset vagy rosszullét esetén azonnal kérjen orvosi segítséget : Szem-, légúti- és bõrirritációt okozhat Tartsa az edényeket gondosan lezárva Ügyeljen arra, hogy a folyadék ne kerüljön a szembe vagy a bõrre Használjon megfelelõ védõruhát és kesztyût TB Auramine M: Gyúlékony Szem-, légúti- és bõrirritációt okozhat Ha a szer a bõrre kerül, az érintett bõrfelületet azonnal le kell öblíteni bõ vízzel Tartsa az edényeket gondosan lezárva Tartsa távol a tûzforrásoktól A vegyszer közelében tilos a dohányzás Használjon megfelelõ védõruhát és kesztyût TB Auramine-Rhodamine T: Gyúlékony Bõrre kerülve és lenyelés esetén mérgezõ! Égést okozhat Hatására visszafordíthatatlan károsodások léphetnek fel Tartsa az edényeket gondosan lezárva Ha a szer a szembe kerül, azonnal öblítse ki bõ vízzel, majd forduljon orvoshoz Használjon megfelelõ védõruházatot, kesztyût, valamint szem- és arcvédõt Baleset vagy rosszullét esetén azonnal kérjen orvosi segítséget TB Decolorizer: Belélegzése és lenyelése veszélyes! Tartsa az edényeket gondosan lezárva és jól szellõzõ helyen Tartsa távol a tûzforrásoktól Tilos a dohányzás Használjon megfelelõ védõruhát és kesztyût TB Methylene Blue: Belélegzése és lenyelése veszélyes! Szem-, légúti- és bõrirritációt okozhat Hatására visszafordíthatatlan károsodások léphetnek fel Tartsa az edényeket gondosan lezárva Tartsa távol a tûzforrásoktól A vegyszer közelében tilos a dohányzás Használjon megfelelõ védõruhát és kesztyût TB Carbolfuchsin KF: Bõrre kerülve és lenyelés esetén veszélyes! Szem- és bõrirritációt okozhat Hatására visszafordíthatatlan károsodások léphetnek fel Tartsa az edényeket gondosan lezárva Tartsa távol a tûzforrásoktól A vegyszer közelében tilos a dohányzás Ha a szer a szembe kerül, azonnal öblítse ki bõ vízzel, majd forduljon orvoshoz Használjon megfelelõ védõruhát és kesztyût Tárolás: A TB Stain Kits and Reagents C közötti hõmérsékleten tárolandó A kartondobozukból kivett reagenseket sötétben kell tárolni A szavatossági idõ az elõírásoknak megfelelõen tárolt, bontatlan csomagolású termékre vonatkozik MINTÁK GYÛJTÉSE ÉS ELÕKÉSZÍTÉSE Készítsen a mintából egy vékony kenetet közvetlenül egy tiszta tárgylemezre A kenetkészítésre alkalmas a köpet (közvetlen minta vagy koncentrált köpet), a gerincfolyadék vagy más testnedv (katéter-vizelet), a homogenizált szövet és a lenyomati készítmények 1 Hagyja a kenetet a szabad levegõn megszáradni Rögzítsék a kenetet a tárgylemezre úgy, hogy a tárgylemezt átviszik alacsony lángon 2-3x, kerülve a túlzott hõt vagy használjanak elektromos tárgylemez melegítõt C hõmérsékleten legalább 2 órán keresztül 14 ELJÁRÁS Szállított anyagok*: TB Stain Kit K, TB Stain Kit ZN, TB Quick Stain Kit, TB Fluorescent Stain Kit M, TB Fluorescent Stain Kit T *Külön megrendelhetõ reagensekkel Szükséges, de nem szállított anyagok: Tárgylemezek újak vagy dikrómsav-oldattal tisztítottak, festõtálca, valamint olajimmerziós objektívvel ellátott mikroszkóp vagy fluoreszcens mikroszkóp A teszt kivitelezése KINYOUN-FÉLE FESTÉS TB Stain Kit K 1 Helyezze a lemezeket a festõtálcára és 4 percre fedje be azokat TB Carbolfuchsin KF oldattal Ne melegítse a tárgylemezeket 3 Színtelenítse el a lemezeket 3 5 másodpercig a TB Decolorizer oldattal 4 Folyó víz alatt óvatosan öblítse le a lemezeket 5 Végezzen kontrasztfestést 30 másodpercig TB Brilliant Green K vagy TB Methylene Blue (külön megrendelhetõ) festékkel 6 Folyó víz alatt óvatosan öblítse le a lemezeket 7 A lemezeket hagyja a levegõn megszáradni TB Methylene Blue használata esetén gyenge hõforrás felett szárítsa meg a lemezeket ZIEHL NEELSEN-FÉLE FESTÉS TB Stain Kit ZN 1 Helyezze a lemezeket a festõtálcára és fedje be azokat TB Carbolfuchsin ZN oldattal Óvatosan hevítse a lemezeket, amíg gõzölni nem kezdenek, majd 5 percig tartsa fenn ezt az állapotot 3 A TB Decolorizer színtelenítõoldattal 1 2 percig színtelenítse a lemezeket közben kétszer cserélje le a színtelenítõoldatot, mindaddig, amíg a mosófolyadékban már nem látható piros szín 3

4 Folyó víz alatt óvatosan öblítse le a lemezeket Végezzen kontrasztfestést 30 másodpercig TB Methylene Blue vagy TB Brilliant Green K festékkel Folyó víz alatt óvatosan öblítse le a lemezeket Gyenge hõ fölött szárítsa meg a lemezeket TB QUICK STAIN TB Quick Stain Kit 1 Helyezze a lemezeket a festõtálcára és fedje be õket TB Quick Stain Carbolfuchsin A reagenssel Hagyja 5 percig állni 2 Vízsugár alatt addig mossa óvatosan a lemezeket, amíg már nem látható festék az öblítõvízben 3 Végezze el a kontrasztfestést nagy mennyiségû Methylene Blue B reagenssel, majd a lemezeket hagyja állni 2,5 3 percig 4 Vízsugár alatt óvatosan öblítse le a lemezeket és hagyja azokat a levegõn megszárítani MORSE-FÉLE FESTÉS TB Fluorescent Stain Kit M 1 Helyezze a lemezeket a festõtálcára, és fedje be azokat 15 percre TB Auramine M oldattal 3 Színtelenítse el a lemezeket másodpercig a TB Decolorizer TM oldattal 4 Folyó víz alatt óvatosan öblítse le a lemezeket 5 Végezzen kontrasztfestést 2 percig a oldattal 6 Folyó víz alatt óvatosan öblítse le a lemezeket 7 A lemezeket hagyja a levegõn megszáradni 8 A lemezeket a Chapin és Murray által leírt szûrõkkel felszerelt mikroszkóppal vizsgálja meg 15 TRUANT-FÉLE FESTÉS TB Fluorescent Stain Kit T 1 Helyezze a lemezeket a festõtálcára és fedje be azokat 15 percre TB Auramine-Rhodamine T oldattal, amelyet elõtte gondosan felrázott Szobahõmérsékleten hagyja állni percig 3 Színtelenítse el a lemezeket 2 3 percig a TB Decolorizer TM oldattal 4 Folyó víz alatt óvatosan öblítse le a lemezeket 5 Végezzen kontrasztfestést 4 5 percig a oldattal 6 Folyó víz alatt óvatosan öblítse le a lemezeket 7 Óvatosan itassa fel a tárgylemezekrõl a nedvességet Hagyja a lemezeket a szabad levegõn megszáradni vagy nagyon óvatosan láng fölött szárítsa meg azokat 8 A lemezeket a Truant et al 6, illetve a Chapin és Murray által leírt szûrõkkel felszerelt mikroszkóppal vizsgálja meg 15 Felhasználói minõség-ellenõrzés: Tanácsos naponta kontrollt készíteni a BBL AFB Slide (Kat sz ) tárgylemezzel vagy ismert saválló és nem saválló mikroorganizmusok alkalmazásával A minõségellenõrzési követelmények betartásának összhangban kell lennie a vonatkozó helyi, állami és/vagy szövetségi szabályozásokkal vagy követelményekkel és a végzõ laboratórium irányadó minõségellenõrzési eljárásaival A megfelelõ minõség-ellenõrzési gyakorlat kialakításánál tanácsos figyelembe venni az érvényes CLSI (eredetileg NCCLS) elõírásokat és a CLIA szabályzatot Mikroorganizmus Várt eredmények Mycobacterium tuberculosis H37Ra ATCC Pozitív Bacillus subtilis ATCC 6633 Negatív AZ ELJÁRÁS KORLÁTAI A pozitív festési eredmény elõzetesen megerõsíti a mycobacteriumok jelenlétét a mintában A negatív színezési reakció nem jelenti okvetlenül, hogy a minta tenyészete negatív a mycobacteriumok jelenlétére A mycobacteriumok pozitív azonosítására, egyéb módszereket kell alkalmazni (tenyészet, molekuláris, stb ) VÁRT EREDMÉNYEK ÉS TELJESÍTMÉNYJELLEMZÕK 1-8,15 Saválló pálca Nem saválló pálca alakú baktériumok alakú baktériumok TB Stain Kit K élénk piros, rózsaszín zöld TB Stain Kit ZN élénk rózsaszín, piros kék TB Quick Stain Kit élénk piros, rózsaszín kék, zöldeskék Mycobacteriumok TB Fluorescent Stain Kit M élénk sárgán-zölden fluoreszkáló TB Fluorescent Stain Kit T pirosas narancsszínben fluoreszkáló 4

5 IRODALOMJEGYZÉK 1 Nolte, F S and B Metchock 1995 Mycobacterium, p In P R Murray, E J Baron, M A Pfaller, F C Tenover and R H Yolken (ed ), Manual of clinical microbiology, 6 th ed American Society for Microbiology, Washington, D C 2 Tenover, F C, J T Crawford, R E Huebner, L J Geiter, C R Horsburgh, Jr, and R C Good 1993 The resurgence of turberculosis: is your laboratory ready? J Clin Microbiol 31: Ebersole, L L 1994 Acid-fast stain procedures, p In H D Isenberg (ed ), Clinical microbiology procedures handbook, vol 1 American Society for Microbiology, Washington, D C 4 Murray, R G E, R N Doetsch and C F Robinow 1994 Determinative and cytological light microscopy, p In P Gerhardt, R G E Murray, W A Wood and N R Krieg (ed ), Methods for general and molecular bacteriology, American Society for Microbiology, Washington, D C 5 Heifets, L B and R C Good 1994 Current laboratory methods for the diagnosis of tuberculosis, p In B R Bloom (ed ), Tuberculosis: pathogenesis, protection, and control, American Society for Microbiologhy, Washington, D C 6 Truant, J P, W A Brett and W Thomas, Jr 1962 Fluorescence microscopy of tubercle bacilli stained with auramine and rhodamine Henry Ford Hosp Med Bull 10: Cernoch, P L, R K Enns, M A Saubolle and R J Wallace, Jr 1994 Cumitech 16A, Laboratory diagnosis of the mycobacterioses Coord ed A S Weissfeld American Society for Microbiology, Washington, D C 8 Baron, E J and S M Finegold 1990 Bailey & Scott s diagnostic microbiology, 8 th ed The C V Mosby Company, Baltimore, MD 9 National Committee for Clinical Laboratory Standards 2001 Approved Guideline M29-A2 Protection of laboratory workers from occupationally acquired infections, 2nd ed NCCLS, Wayne, Pa 10 Garner, J S 1996 Hospital Infection Control Practices Advisory Committee, U S Department of Health and Human Services, Centers for Disease Control and Prevention Guideline for isolation precautions in hospitals Infect Control Hospital Epidemiol 17: U S Department of Health and Human Services 1999 Biosafety in microbiological and biomedical laboratories, HHS Publication (CDC), 4th ed U S Government Printing Office, Washington, D C 12 Directive 2000/54/EC of the European Parliament and of the Council of 18 September 2000 on the protection of workers from risks related to exposure to biological agents at work (seventh individual directive within the meaning of Article 16(1) of Directive 89/391/EEC) Official Journal L262, 17/10/2000, p U S Public Health Service, Centers for Disease Control and Prevention, and National Institutes of Health 1999 Biosafety in microbiological and biomedical laboratories, 4th ed HHS Publication No (CDC) U S Government Printing Office, Washington, D C 14 Kent, P T and G P Kubica, 1985 Public Health Mycobacteriology A guide for the level III laboratory, p 58, U S Dept of Health and Human Services, Centers for Disease Control, Atlanta Ga 15 Chapin, K C and P R Murray 1999 Stains, p In P R Murray, E J Baron, M A Pfaller, F C Tenover and R H Yolken (ed ), Manual of clinical microbiology, 7 th ed American Society for Microbiology, Washington, D C 5

6 m Becton, Dickinson and Company 7 Loveton Circle Sparks, Maryland USA A BENEX Limited Bay K 1a/d, Shannon Industrial Estate Shannon, County Clare, Ireland Tel: Fax: ATCC is a trademark of the American Type Culture Collection BD, BD Logo and BBL are trademarks of Becton, Dickinson and Company 2005 BD