BACTEC NAP TB Differentiation Test Kit

Átírás

1 BACTEC NAP TB Differentiation Test Kit HASZNÁLATI JAVASLAT PP119JAA 2007/06 Magyar A BACTEC NAP TB Differenciáló Teszt a Mycobacterium tubreculosis komplex többi mikobaktériumtól való elkülönítésére szolgáló teszt. Elsõsorban a BACTEC 460TB System készülékkel használandó. A BACTEC NAP (ρ-nitro-α-acetilamino-β-hidroxi-propiofenon) differenciáló tesztet a TB komplex (M. tuberculosis, M. bovis, M. africanum és M. microti) más, nem M. tuberculosis mikobaktériumtól (MOTT) való gyors differenciálásához BACTEC 12B Medium tápközeggel kell használni. A tesztet bakteriális kenet morfológiájának és a BACTEC 12B Medium tápközegen való szaporodás jellemzõinek együttes vizsgálata mellett kell használni. ÖSSZEGZÉS ÉS MAGYARÁZAT A BACTEC 12B Medium tápközeg nem teszi lehetõvé a telepmorfológia megfigyelését, ennek ellenére a SzI (Szaporodási Index) alakulása néhány mikobaktérium faj esetében jellegzetes lehet. A M. tuberculosis és a M. bovis lassan szaporodik, a SzI naponta kétháromszorosára emelkedik, míg más mikobaktériumok (MOTT bacilusok) SzI növekedése a 10-szerest is meghaladhatja. Szemre, a M. tuberculosis szaporodása a BACTEC 12B Medium tápközegben apró szemcsék, csomók megjelenésével jár, miközben a tápközeg tiszta marad. A többi mikobaktérium szaporodását igen apró részecskék és a tápközeg enyhe bezavarodása jellemzi. A pozitív palackból (SzI = 100 vagy magasabb) készített kenet támpontot adhat arra vonatkozóan, milyen mikobaktérium szaporodik a tápközegben. A kacskaringós láncok, csomók jellenléte a M. tuberculosis-ra jellemzõ (a M. bovis és a M. kansasii szintén képezhetnek láncokat). A többi mikobaktérium morfológiai jellemzõi eltérõek, pl. a M. avium/m. intracellulare hosszú pálcákból álló láncai elágazóak. A BACTEC NAP teszt segítséget jelent a M. tuberculosis, a legfontosabb mikobaktérium faj gyors kimutatásában. A teszt független a Niacin teszttõl. Az aktívan szaporodó tenyészet egy mintájával kell a NAP palackot, mely egy 5 µg-os NAP korongot tartalmaz, inokulálni. Ezt a palackot, a kontrollal együtt inkubálni kell a BACTEC 460TB System készülékben, és a NAP jelenlétében történõ szaporodást figyelni kell. A SzI naponkénti leolvasása és az eredmények elemzése a következõ 3 5 napban segít differenciálni a TB komplexet a többi mikobaktériumtól. AZ ELJÁRÁS MÛKÖDÉSI ELVE A NAP (ρ-nitro-α-acetilamino-β-hidroxi-propiofenon), mely egy köztes terméke a kloramfenikol szintézisnek, szinte teljes mértékben gátolja a TB komplexbe (M. tuberculosis, M. bovis, M. africanum és M. microti) tartozó mikobaktériumokat, míg a többi mikobaktériumot egyáltalán nem, vagy csak alig gátolja. Ha a NAP gátolja a mikobakteriális szaporodást, a 14 CO 2 -képzõdés szintén gátolt, amit a SzI stagnálása vagy csökkenése is jelez. Ez, az SzI-re kifejtett hatás használható fel az azonosításhoz. REAGENSEK A BACTEC NAP készlet palackjaiban egy papírkorong található, melynek aktív hatóanyag tartalma: ρ-nitro-α-acetilamino-β-hidroxi-propiofenon 5 µg Figyelmeztetés In vitro diagnosztizáláshoz. A termék száraz természetes gumit tartalmaz. A klinikai mintákban patogén mikroorganizmusok, pl. Hepatitis és HIV vírusok lehetnek jelen. Minden vérrel, ill. más testnedvvel fertõzött egységet a Standard Precautions 1-4 elõírásai szerint, ill. az intézet irányelvei szerint kell kezelni. NA HASZNÁLJA FEL a NAP differenciáló teszt palackjait, ha azok nyilvánvalóan befertõzõdtek, elszínezõdtek, vagy nem tartalmazzák a korongot. A nedvesség, különösen ha magas hõmérséklet is társul hozzá, a NAP gyors lebomlását okozza. A mikrobiológiai veszélyek miatt mindig aszeptikusan és a felállított biztonsági rendszabályoknak megfelelõen dolgozzon. 5 Kizárólag biztonsági elszívó fülke alatt dolgozzon. Lehetõség szerint, a koronghoz ne érjen hozzá. Használat után a mintavételi edényeket, illetve a fertõzött anyagokat autoklávozással fertõtleníteni kell. Használat elõtt, minden palackot meg kell vizsgálni, hogy nem található-e rajta sérülésre utaló nyom. A nyilvánvalóan károsodott palackokat még inokulálás elõtt dobja ki. Bizonyos esetekben elõfordulhat, hogy az üvegpalack megreped, illetve a nyaka a kupak megbontása vagy munka közben letörik. Ezenkívül igen ritkán elõfordulhat, hogy az ampullák nem lettek kellõen lezárva. Mindkét esetben a palackok tartalma kifröccsenhet, illetve szivároghat, különösen akkor, ha a palackokat felfordítják. Ha a palackokat már inokulálta, a kicsepegett és kiszivárgott anyaggal bánjon óvatosan, mivel azok fertõzõ organizmusokat vagy anyagokat tartalmazhatnak. Kidobás elõtt minden inokulált palackot autoklávozással sterilizáljon.

2 Továbboltáshoz vagy festéshez való pozitív tenyészapalackok: A mintavétel elõtt ki kell engedni a gázt, ami a mikrobiális metabolizmus során keletkezett. A mikrobiológiai veszélyek miatt mindig dolgozzon aszeptikusan és a felállított biztonsági rendszabályoknak megfelelõen. A tesztet a CDC elõírásainak megfelelõen megfelelõ biológiai biztonsági elszívó fülke alatt, megfelelõ szellõztetéssel rendelkezõ helyiségben kell elvégezni. 5 A potenciálisan fertõzõ mintákkal és tenyészetekkel végzett munka idõtartamára vegyen fel a célnak megfelelõ köpenyt, maszkot és kesztyût. Kövesse a CDC és az OSHA elõírásait. Hogy az inokulálás alatt minimálisra csökkentse a szivárgás lehetõségét, használjon rögzített tûjû fecskendõket, illetve biztonságosan rögzített Luer-Lok hegyeket. Ennek az összetevõnek a toxicitását nem vizsgálták. Használata során, a fertõzés elkerülésére, megfelelõ elõvigyázatosságra van szükség. Tárolási feltételek A BACTEC NAP palackokat hûtve, 2 8 C-on, közvetlen napfénytõl védve, kell tárolni. Mivel a NAP hõérzékeny, óvja a felmelegedéstõl, illetve a magas hõmérséketektõl. A szavatossági idõ az elõírásoknak megfelelõen tárolt, bontatlan palackokra vonatkozik. MINTÁK GYÛJTÉSE A NAP teszt elvégzéséhez BACTEC 12B Medium tápközegben aktívan szaporodó tenyészet használható. A teszt kultúrának tisztának és nem-mikobakteriális szennyezõdésektõl mentesnek kell lennie. ELJÁRÁSOK Szállított anyagok: Tíz palack, mindegyikben egy NAP koronggal. Szükséges, de nem szállított anyagok: BACTEC 460TB készülék, BACTEC 12B Medium, tuberculin fecskendõ rögzített tûvel, BACTEC Diluting Fluid, fertõtlenítõ folyadék, alkoholos törlõ. A részletekért lásd a BACTEC 460TB System termék használati útmutatóját (MA-0029). Amennyiben a BACTEC 12B Medium palack 10-es vagy annél nagyobb SzI értéket mutat, addig tesztelje a palackot, míg a SzI el nem éri az értéket. Gram-festéssel vagy továbbtenyésztéssel gyõzõdjön meg arról, hogy a tenyészet nem fertõzödött be. Homogenizálja a tenyészetet egy (rögzített tûjû) tuberkulin fecskendõ segítségével, majd ugyanazzal a fecskendõvel, aszeptikus módon tegyen 1 ml tenyészetet a NAP palackba. A megfelõ fertõtlenítõszerrel, majd alkoholos törlõvel törölje le a NAP palack és a kontroll (eredeti tenyészet) palack tetejét. Mindkét palackot, hogy 5 10% CO 2 -vel átmossa, azonnal tesztelje a BACTEC készülékkel. A leolvasott eredményeket ne vegye figyelembe. Inkubálja a palackokat 37 ± 1 C-on, vagy optimális hõmérsékleten, és a következõ 2 6 napon, naponta végezze el a tesztet. Jegyezze fel naponta a NAP palack és a kontrollként szolgáló eredeti palack SzI értékeit. Amennyiben a SzI meghaladja a 100-as értéket, a tenyészetet, a NAP palack inokulálása elõtt, az alábbiak szerint kell hígítani. SzI hígítás nem szükséges SzI ,8 ml egy friss BACTEC 12B Medium palackba SzI ,6 ml egy friss BACTEC 12B Medium palackba SzI ,4 ml egy friss BACTEC 12B Medium palackba SzI ,3 ml egy friss BACTEC 12B Medium palackba SzI ,2 ml egy friss BACTEC 12B Medium palackba SzI egy napnál 0.1 ml egy friss BACTEC 12B Medium palackba hosszabb ideig 999 Ne hagyja, hogy a tenyészet túlszaporodjon a csúcs SzI-értéken (999). Ha a tenyészet túlszaporodott, oltsa át egy BACTEC 12B Medium palackba, inkubálja és tesztelje naponta, míg el nem érte a kívánt SzI értéket. Ha szilárd táptalajon nõtt telepeket kell tesztelni, emeljen le néhány reprezentatív telepet, emulgálja azokat steril desztillált vízben vagy BACTEC hígító folyadékban, és készítsen belõlük szuszpenziót. Állítsa be e szuszpenzió turbiditását 1 McFarland standardra. Ennek a szuszpenziónak 0.1 ml-ével inokuláljon egy BACTEC 12B Medium palackot. Inkubálja a palackot, és naponta tesztelje a BACTEC 460TB System készülékkel. Ha SzI értéke , kövesse a fentiekben leirtakat. MINÕSÉGELLENÕRZÉS Minden egyes tétel esetében, a teszt eljárás megfelelõ mûködésének tesztelésére, a következõ negatív és pozitív kontroll elvégzése szükséges. M. tuberculosis, H37Rv ATCC No M. kansasii ATCC No M. intracellulare ATCC No M. avium ATCC No *A részletekért lásd a BACTEC 460TB System termék használati útmutatóját (MA-0029). A lejárati idõ után NE HASZNÁLJA FEL a palackokat. NE HASZNÁLJA FEL azokat a palackokat, melyeken sérülés bármilyen nyoma látszik. Az ilyen palackokat a megfelelõ módon dobja ki. A Quality Control Certificate (Minõségellenõrzési tanúsítvány) minden NAP Kit mellett megtalálható. A Quality Control Certificate ismerteti az ilyen típusú termékkel használható teszt mikroorganizmusokat. A napi karbantartási ütemterv részeként a BACTEC gépen Performance Test Vials (BACTEC Performance Test Kit) palackokat kell tesztelni. Amennyiben a leolvasott értékek alacsonyak, pedig a Performance Test Vials palackokat megfelelõen tesztelte, akkor zavar állhatott be a gép mûködésében (lásd BACTEC PTK használati útmutató, PP-046JAA). A minõségellenõrzési követelményeknek a helyi, állami és/vagy szövetségi szabályozásoknak és akkreditációs követelményeknek megfelelõen, illetve a laboratórium standard minõségellenõrzési módszereivel összhangban kell eleget tenni. A megfelelõ minõségellenõrzési gyakorlat kialakításánál tanácsos figyelembe venni a vonatkozó NCCLS-elõírásokat és a CLIA szabályzatot. 2

3 A KONTROLL EREDMÉNYEK ÉRTELMEZÉSE A kontroll palack (eredeti tenyészet palackja) SzI értéke naponta emelkedik. A NAP teszt palackban, a SzI csökkenése, illetve növekedése a jelenlévõ mikobaktérium fajok függvénye. A csökkenõ vagy változatlan SzI TB komplexre utal, míg a SzI növekedése MOTT bacilusok jelenlétét jelzi. A következõ kritériumok a NAP palackban lévõ majdnem minden mikobaktériumra vonatkoznak: TB Komplex (M. tuberculosis, M. bovis, M. microti, M. africanum) inokuláció után a SzI egymás után két alkalommal szignifikánsan csökken az elsõ két napban a SzI enyhe, de nem szignifikáns növekedése, majd annak csökkenése, illetve stagnálása MOTT bacilusok a SzI naponta emelkedik, négy nap eléri a 400-at az inokulálás után elsõ 1 3 napon az SzI enyhén csökken, vagy nem változik, majd egymást követõ két napon szignifikánsan megemelkedik a 2. nap után A szignifikáns növekedés vagy csökkenés legkevesebb 20%-os változást jelent egyik napról a másikra. AZ ELJÁRÁS KORLÁTAI A TB Komplex MOTT bacilusoktól való elkülönítése a BACTEC NAP TB Differenciáló teszttel csak izolált, tiszta tenyészetekbõl kindulva lehetséges. A TB Komplex és a MOTT bacilusok vegyes tenyészete a SzI növekedését eredményezné, ami azonban csak a MOTT bacilusok jelenlétét jelezné. A más, nem mikobaktériumokkal való szenyezettség, amennyiben a befertõzõ mikroorganizmusok felhasználják a szubsztrátot, is a SzI fals növekedéséhez vezethet. A NAP palackokat szemmel meg kell vizsgálni nyilvánvaló befertõzõdésre és/vagy turbiditásra. Emelkedõ SzI esetében a NAP palackokból készített AFB kenet segíthet kimutatni a MOTT bacilusokat, a TB-t, vagy más szennyezõ baktériumokat. Némely esetben a NAP a M. kansasii törzseit oly mértékben gátolhatja, hogy az így kapott eredmények tévesek. A további meghatározást más módszerekkel kell elvégezni. A biológiai alapanyagok természete, valamint a mikroorganizmusok változékonysága miatt, a felhasználónak tudatában kell lennie, hogy egyes mikroorganizmusok kimutatásakor az eredmények változóak lehetnek. VÁRT ÉRTÉKEK A mikobaktérium fajoktól függõen az eredmények 2 6 nap múlva várhatók. Az eredményeket csak akkor szabad jelenteni, ha világos tendenciát tapasztalunk. Ha a SzI változatlan, a TB komplexként való azonosítást legkevesebb 4 nap elteltével lehet értelmezni. A NAP teszt elvégzésének átlagos idõtartama 4 nap. 6,7-11 A NAP teszt eredményeit a szaporodás jellemzõivel, és egy saválló festéssel megfestett kenet AFB morfológiájával is meg kell erõsíteni. A kenet kimutathatja a kevert tenyészeteket, illetve a befertõzõdést is. TELJESÍTMÉNY JELLEMZÕK Bár a fertõzött NAP tesztet könnyû értelmezni, némely esetben a világos tendencia kimutatásához, szükség lehet az inkubációs idõ meghosszabbítására. Ez azon mikobaktériumok esetében a legfontosabb, melyeket a NAP csak részlegesen gátolt, vagy a SzI lassan vagy megkésve növekedett, vagy ha NAP jelenlétében a lag (lappangási) fázis hosszú volt (pl. a M. kansasii, a M. gastri, a M. szulgai, a M. terrae vagy a M. triviale néhány törzse esetében). Minden, a NAP teljesítmény vizsgálatban szereplõ MOTT bacilus 5 6 nap alatt mutatott SzI növekedést. 5,7 Ennek ellenére, némely esetben a NAP a M. kansasii törzseit az átlagosnál jobban gátolja, ezért azok a teszt során tévesen kerülnek azonosításra. Pontos eredmények eléréséhez szükséges az optimális inkubációs hõmérsékleteket betartani. Azok a mikobaktériumok, melyek 37 C alatti, pl. a M. chelonae és a M. marinum, illetve magasabb hõmérsékleten szaporodnak, pl. M. xenopi, pontatlan eredményt adhatnak, ha 37 C-on tesztelik õket. Amennyiben a pontos optimális hõmérséklet nem ismeretes, úgy tanácsos a tesztet több hõmérsékleten is elvégezni. Korábbi tanulmányok során, a teszt általános érzékenysége és specifitása 98 99% volt. 7,10 ELÉRHETÕSÉG Kat. sz. Leírás BACTEC NAP Differenciáló Készlet, 5 µg NAP / palack, 10 palack dobozonként BACTEC 12B Medium, 4 ml, dobozonként 100 darab. IRODALOMJEGYZÉK 1. National Committee for Clinical Laboratory Standards Approved Guideline M29-A2. Protection of laboratory workers from occupationally acquired infections, 2nd ed. NCCLS, Wayne, Pa. 2. Garner, J.S Hospital Infection Control Practices Advisory Committee, U.S. Department of Health and Human Services, Centers for Disease Control and Prevention. Guideline for isolation precautions in hospitals. Infect. Control Hospital Epidemiol. 17: U.S. Department of Health and Human Services Biosafety in microbiological and biomedical laboratories, HHS Publication (CDC), 4th ed. U.S. Government Printing Office, Washington, D.C. 4. Directive 2000/54/EC of the European Parliament and of the Council of 18 September 2000 on the protection of workers from risks related to exposure to biological agents at work (seventh individual directive within the meaning of Article 16(1) of Directive 89/391/EEC). Official Journal L262, 17/10/2000, p Kent, P.T. et al. Public health mycobacteriology, a guide for the level III laboratory. Centers for Disease Control, Division of Laboratory Training and Consultation. Atlanta, GA,

4 6. Gross, W.M. et al. Radiometric selective inhibition tests for differentiation of Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium bovis, and other mycobacteria. J. Clin. Microbiol., 21: , Laszlo, A. et al. Evaluation of a rapid radiometric differentiation test for the Mycobacterium tuberculosis complex by selective inhibition with ρ-nitro- α-acetylamino-β-hydroxy-propiophenone. J. Clin. Microbiol., 19: , Libonati, J.P. et al. Identification and direct drug susceptibility testing of mycobacteria by the radiometric method. Abstract C300, A.S.M. Meeting, St. Louis, MO Morgan, M.A. et al. Evaluation of the ρ-nitro-α-acetylamino-β-hydroxy-propiophenone differential test for identification of Mycobacterium tuberculosis complex. J. Clin. Microbiol., 21: , Siddiqi, S.H. et al. Rapid radiometric methods to detect and differentiate Mycobacterium tuberculosis / M. bovis from other mycobacterial species. Amer. Rev. Respir. Dis., 130: , Stager, C.E. et al. Identification of Mycobacterium tuberculosis from acid-fast smear-positive specimens by direct inoculation of the BACTEC NAP Test. Abstract C267, A.S.M. Annual Meeting, Las Vegas, NV,

5 5

6 Becton, Dickinson and Company BENEX Limited 7 Loveton Circle Bay K 1a/d, Shannon Industrial Estate Sparks, Maryland USA Shannon, County Clare, Ireland Tel: Fax: ATCC is a trademark of the American Type Culture Collection. BD, BD Logo, BACTEC and Luer-Lok are trademarks of Becton, Dickinson and Company BD.