A hármas kromoszóma sokpontos interfázis FISH vizsgálata gyermekkori leukémiákban

Átírás

1 A hármas kromoszóma sokpontos interfázis FISH vizsgálata gyermekkori leukémiákban Ph. D. értekezés tézisei Készítette: Haltrich Irén Témavezető: Dr. Fekete György egyetemi tanár Semmelweis Egyetem Doktori Iskola Tudományági Doktori Iskola: Molekuláris Orvostudományok Vezető: Dr. Mandl József egyetemi tanár Program: A humán molekuláris genetika és géndiagnosztika alapjai Programvezető: Dr. Falus András egyetemi tanár Semmelweis Egyetem Általános Orvostudományi Kar II. Sz. Gyermekgyógyászati Klinika Budapest, 2005

2 BEVEZETÉS A leukémiára jellemző a hematopoietikus rendszer zavara, a normális fejlődési program megszakadása. Ennek gyakori oka a vérképzésben, a sejtek differenciálódásában szerepet játszó gének szerzett hibája, sérülése. A malignitás irányába történő progresszió olyan másodlagos elváltozásoktól is függ, melyek a fejlődésükben megakadályozott, fenntartott sejtek életbenmaradását, túlélését elősegítik. Alfred Knudson zseniális felfedezése (1971) óta tudjuk, hogy a sejtciklus szabályozásában, az apoptózisban szerepet játszó tumor szuppresszorgének (TSG) védik a szervezetet a kóros sejtek szaporodásától, a tumorok kialakulásától. Az utóbbi két évtizedben számos TSG-t azonosítottak és egyre több génről feltételezik, hogy tumor szuppresszor szerepe van. A TSG leggyakoribb hibája a deléció és pontmutáció. Knudson két találat elmélete, mindkét allél funkcióvesztése (a heterozigótaság elvesztése -loss of heterozigosity- LOH) a TSG-k nagy részére máig érvényes, bár néhány TSG védő funkciója már az egyik allél elvesztésével (haploinszufficiencia) vagy hibájával is károsodhat. A TSG-k azonosításában jelentős szerepet játszott a szomatikus sejthibridizációs- és kromoszóma transzfer technikák bevezetése. A mikrosejt transzfer lehetővé tette, hogy egyetlen ép kromoszómát vigyenek be különféle tumorsejtekbe és azok malignus fenotípusra gyakorolt hatását kövessék. Imreh István kutatócsoportja a humán 3-as kromoszómát vitte át egér és emberi daganatsejtekbe. Az így keletkezett mikrosejthibrideket egymás után többször inokulálták immundeficiens (SCID) egerekbe és a bevitt kromoszómát tumor szuppresszor tesztként tanulmányozták különféle daganat sejtvonalakban. A hármas kromoszóma rövid karján két mindig kilökődő szakaszt azonosítottak a 3p21 régióban, melyet az angol kezdőbetűk alapján (Common Eliminated Region) CER1 és CER2 régiónak neveztek el. Egy harmadik gyakran elvesző 3-as kromoszóma rövid kar régió (Frequently Eliminated Region) a 3p14.3-3p21.2 között a FER elnevezést kapta. A 3p deléciókkal párhuzamosan a hosszú karon egy ~ 40 cm terjedelmű mindig megmaradó régiót (Common Retained Region) azonosítottak az összes daganatban, mely a CRR rövidítést nyerte el. A kísérleti modell eliminációs teszt (Et) néven lett ismert a szakirodalomban. Az Et arra engedett következtetni, hogy a 3p karon a tumor fejlődését gátló gének találhatók, ezek elvesztése szelektív növekedési előnyt biztosít a daganat számára. Ezzel szemben a hármas hosszú karon, a CRR régióban a tumor növekedését pozitív irányban befolyásoló gének fordulnak elő. Az Et eredménye megegyezik számos malignus betegség citogenetikai, komparatív genomiális hibridizáció (CGH) és LOH módszerekkel történő vizsgálataival. A 3p21 kart érintő intersticiális deléciót 23 különféle tumorban írtak le. A hármas rövid kar CER és FER régióinak intersticiális deléciója és a hosszú kar CRR régió többletének szimultán előfordulása több daganattípusban, mint pl. vese-, húgyhólyag-, tüdő-, petefészek-, emlő- és prosztata karcinómában azt a lehetőséget veti fel, hogy a 3p karon található TSG-k, illetve a hármas hosszú kar onkogénjei hematológiai malignitásokban is érintettek lehetnek. A gyermekkori daganatos betegségek közel 30%-át kitevő leukémiák túlnyomó része akut formában jelentkezik. Az akut leukémiák 80-82%-a limfoid (ALL), 15-20%-a mieloid leukémia (AML). A krónikus mieloid leukémia (CML) a gyermekkori leukémiás esetek ~ 1%-át teszi ki. 1

3 Az LOH vizsgálatokkal hematológiai malignitásokban a TSG-k széles spektrumát feltérképezték. A hármas kromoszómán található TSG-k és az akut leukémiák közti összefüggéssel kapcsolatos irodalmi adatot nem találtam, részletes modern citogenetikai tanulmányok célzottan a hármas kromoszómáról, legjobb ismereteim szerint nem készültek. Az eliminációs teszttel összefüggő régiókon kívül a hármas kromoszómához kapcsolódó aberrációkat is tanulmányoztam. Az ALL-hez viszonyítva, AML-ben és CML-ben a hármas kromoszóma számbeli és szerkezeti rendellenességei gyakoribbak. Annak ellenére, hogy a citogenetikai vizsgálatok klinikai jelentősége a molekuláris genetikai érában is fokozódott, bizonyos hematológiai malignitások jellegzetes kromoszóma elváltozásai WHO osztályozási szemponttá váltak, az eddigi AML-lel kapcsolatos információk elsősorban felnőttkori tanulmányokra támaszkodnak. Másrészt a szakirodalom nagy része a FISH korszak előtti évtizedek eredményeit dolgozza fel. Az I-FISH technikával végzett saját vizsgálataim lehetővé tették, hogy a hármas kromoszóma hagyományos citogenetikával nem mindig követhető, finomabb elváltozásait is azonosítsam. Az elektronikusan feltérképezhető szakirodalom alapján egyetlen olyan tanulmány sem született, mely gyermekkori leukémiában a hármas kromoszómát részletesen, megabázisról-megabázisra vizsgálja. 2

4 CÉLKITŰZÉSEK Az előbbi megfontolások alapján az alábbi kérdéseket, feladatokat tűztem ki: 1. A hármas rövid kar CER régióiban feltételezett TSG-k elveszhetnek-e gyermekkori ALL-ben, ezzel egyidőben vagy ettől függetlenül a hármas hosszú kar CRR régiója duplikálódik-e? 2. A hármas kromoszómához kapcsolódó rendellenességek azonosítása I-FISH technikával gyermekkori ALL-ben. 3. Et-ből ismert CER (3p21.2), FER (3p14.3) és más, az AML-hez kapcsolódó szakirodalomban leírt 3p deléciós forró pontok, valamint gyakoribb deléciós régiók (3p25-26, 3p13-14) elvesztődnek-e gyermekkori AML-ben? 4. Az Et-ben mindig megmaradó CRR régió vagy más 3q többlet azonosítása gyermekkori AML-ben. 5. A vizsgált gyermekkori AML esetek hármas kromoszómához kapcsolódó valamennyi rendellenességének azonosítása GTG-sáv alapú- és I-FISH technika kombinálásával és az eltérések prognosztikai-klinikai összefüggéseinek értékelése és összehasonlítása hasonló felnőttkori esetekkel. 6. Egy akcelerált fázisban diagnosztizált gyermekkori CML komplex variáns transzlokációjának és hármas kromoszómát érintő átrendeződésének analízise multiplex-fish (M-FISH) és I-FISH technikával; az eltérés klinikai jelentőségének értékelése. 7. A hármas kromoszómához kapcsolódó szerkezeti rendellenességek töréspontjainak meghatározása sokpontos I-FISH vizsgálattal, specifikus génhibák azonosítása. BETEGEK ÉS MÓDSZEREK Betegek A hármas kromoszómát összesen 61 gyermekleukémiás esetben vizsgáltam. Az eliminációs teszt hipotézisét akut leukémiában ellenőriztem 32 új vagy recidivált ALL (25 B-sejtes és 7 T-sejtes) és 28 AML esetben. Vizsgálataimat kiegészítettem egy CML-es beteg hármas kromoszómát érintő szokatlan szerkezeti rendellenességének feltárásával. Hagyományos citogenetikai vizsgálatok A diagnózis idején rövid idejű spontán tenyésztést végeztem a csontvelői sejtekből és perifériás vérből standard technikával. Négy eset kivételével sikeres G-sávos kariotípust nyertem. A kariotípust a nemzetközileg elfogadott ISCN 1995-ös nomenklatúra alapján írtam le, általában metafázis alapján. 3

5 FISH tanulmányok A FISH vizsgálatokat standard metodika szerint, gyári próbák esetén a cég ajánlásai alapján végeztem. A T-ALL esetekben 42, az AML-es betegeknél 84, CML-es beteg 3 q kar rendellenességeinek vizsgálatához 16 FISH próbával dolgoztam, sokpontos I-FISH technikát alkalmazva. Ez az új metodika lehetővé tette tíz próba egyetlen lemezen történő detektálását és az egész hármas kromoszóma megabázisonkénti lefedettségét. Másik előnye az olyan kisebb sejtpopulációk azonosításának lehetősége, melyek feltárása a jelenlegi CGH, CGH array vagy LOH vizsgálatokkal nem lehetséges. A hármas kromoszóma esetleges számbeli eltéréseit Spectrum Red CEP3 α-szatellita FISH (Vysis, Abbot GmbH and Company, KG, Germany) próbával ellenőriztem. A CER régió vizsgálatához a P1-bakteriofág alapú (PAC) mesterséges kromoszóma klónjait használtam fel, melyeket a ppac4 könyvtár szűrésével nyertem. A CRR kópia számot a 3q27-ben térképezett BCL6 dual color (Vysis, Abbot GmbH and Company, KG, Germany) gyári próbával ellenőriztem. A többi próbát a BACPAC Resources Center at the Children s Hospital Oakland Research Institute, USA nevű kutató központból szereztem be és a National Center for Biotechnology Information (NCBI) fizikai és genetikai térképezésének megfelelően a számítógépes honlap ( guide/human) felhasználásával választottam ki. A próbákat biotin-dutp (Bionick labeling system, BRL) és digoxigenin dutp (DIG-Nick translation mix, Roche Molecular Biochemicals) gyári kittekkel jelöltem a gyártó által meghatározott metodika alapján. A biotinnal jelölt próbákat Cy3 konjugált sztreptavidinnel (Amersham Biosciences UK Limited, Little Chalfont Buckinghamshire, England) és a digoxigeninnel jelölt próbákat FITC konjugált anti-digoxigenin (Roche Molecular Biochemicals, Mannheim) ellenanyaggal detektáltam. A FISH jeleket 200 interfázis sejtmagban számoltam meg. A hematológiai esetekkel párhuzamosan egészséges donortól származó mintával is elvégeztem a hibridizációt, ennek alapján a normál és kóros esetek közti hiba határt (cut-off level) 6%-nál állapítottam meg. Multicolor-FISH vizsgálatot a CML-es betegnél a komplex variáns transzlokáció és a szekundér rendellenességeinek azonosításához végeztem 20 C-on tárolt, fixált sejtszuszpenzióból, a Spectra Vision Assay (Vysis, Inc., Downers Grove, IL) protokollnak megfelelően. Az eredményeket Genus (Applied Imaging Corporation, Santa Clara, CA) softver segítségével dolgoztam fel. 4

6 EREDMÉNYEK Az eliminációs teszttel kapcsolatos vizsgálati eredmények I-FISH vizsgálataim a 25 B sejtes ALL-ben a CER régió vesztését, illetve a CRR régió kópiaszám növekedését nem mutatták ki. Az analizált 7 T-sejtes ALL-ből kettőben 3p deléciót és 4-ben CRR régiót érintő duplikációt találtam. A T- sejtes ALL 3p deléciói nem érintették az Et következetesen elvesző CER1 és CER2 régióját. A két T sejtes ALL esetben a két egymást átfedő intersticiális deléciót a 3p12-p13-as régióban azonosítottam. A deléció helye megfelel egy ismert, feltételezett tumor szuppresszor gén helyének, melyet Rabbits és mtsai a kissejtes tüdő karcinóma (SCLC) U20U20 nevű sejtvonalban azonosítottak. A deléciók által megszakított, feltételezett tumor szuppresszor gént klónozták és elnevezték Deleted in U-Twenty-Twenty, DUTT1 génnek. A gén homológ az ecetmuslica Roundabout (ROBO1) nevű génjével, delécióját szolid tumorok premalignus fázisában írták le. Két T-sejtes ALL esetben a triszómiás töréspontot a 3q pericentromérikus régiójában térképeztem. A centromérához közeli régió evolucionárisan is gyakori töréspont, genetikai instabilitáshoz vezető szekvencia átrendeződési hely. A harmadik, triszómiás töréspontot a 3p21.2 régióban azonosítottam. Ezt a töréspontot néhány felnőttkori és gyermekkori ALL esetben már leírták. Az analizált 28 gyermekkori AML-ben 3p deléciót nem találtam. A hagyományos citogenetikára épülő nagy összefoglaló tanulmányok alapján 3p deléció incidenciája 1-1,2% a felnőttkori AML-ben, gyermekkori AML esetekben ennél is alacsonyabb (0,71%). A 28 AML esetből CRR régiót érintő kromoszóma többlet 5 esetben fordult elő. Négy betegnél teljes hármas triszómiát, egynél 3q26.3-q28 tetraszómiát azonosítottam. A hármas triszómia a 8-as triszómia után a második leggyakoribb rendellenesség volt. A Mitelman adatbázis valamint magas esetszámot átfogó összefoglaló tanulmányok alapján a legismertebb triszómiák AML-ben, gyakorisági sorrendben a következők: +8, +21, +19 és + 4. Saját eredményeim és az irodalmi adatok közti eltérés esetleg a kromoszóma rendellenességek földrajzi különbözőségével, etnikai és környezeti tényezők genetikai aberrációkra gyakorolt hatásával magyarázható. A viszonylag alacsony esetszám is hozzájárulhatott az eredmények divergálásához. Egy AML esetben mintegy 9 Mb hosszúságú 3q26.3-q28 szegmentális tetraszómiát azonosítottam a sejtek 91%-ában, a 186,04-189,83 Mb között. Az I-FISH mintázat alapján az feltételezhető, hogy a tetraszómia izodiszómiának felel meg. Az említett 3q26.3-q28 próbák normális diszómiás mintázatot eredményeztek az összes többi e próbákkal vizsgált esetben. A többi hármas kromoszóma próbával történt FISH vizsgálat ennél a páciensnél normális, diszómiás jeleket eredményezett. Valószínű, hogy a tetraszómia az említett régió duplikációjával majd a kóros hármas megkettőződésével és a normális 5

7 hármas kromoszóma deléciójával keletkezett. A hármas hosszú kar AML-ben történő isodiszómiájára egyetlen irodalmi adatot találtam. A 3q26q29 triszómiát vagy tetraszómiát hordozó Fanconi anémiás betegeknél az MDS vagy AML kialakulásának rizikója szignifikánsabban magasabb volt mint a 3q többletet nem hordozó betegcsoportban. A szakirodalomból ismert 3 gyermekkori AML-ben előforduló a 3q többletet (3q13 3qter és 3q21 3qter) juvenilis mielo-monocitás leukémiában azonosítottak. Érdekes módon a 3q tetraszómiás AML-es betegünk is morfológialag monocitoid differenciációt mutatott. A T-sejtes ALL esetekben a 3p deléció illetve a CRR régiót érintő triszómiák viszonylag kis sejtpopulációban (11-32%) egy terjedelmesebb normális, diszómiás populáció mellett fordultak elő. A triszómiák a hosszú kart vagy az egész hármas kromoszómát érintették. Az AML esetekben a 3q többlet illetve a 3-as triszómia más triszómiákkal vagy szerkezeti rendellenességekkel társult és lényegesen nagyobb populációkat érintett. Ez arra enged következtetni, hogy a hagyományos citogenetikával nehezen követhető 3p deléciónak és a 3q többletnek a klonális evolúcióban vagy a tumor progressziójában lehet szerepe. A hármas kromoszómát érintő szerkezeti rendellenességek A vizsgált 61 gyermekkori leukémiában előforduló hármas kromoszómával kapcsolatos szerkezeti rendellenességek nagy részét (71%-át) mieloid leukémiában azonosítottam. Ezek az átrendeződések a 3q kart érintették. A többi rendellenesség (az AML esetekben a teljes hármas triszómia és 3q tetraszómia, T- sejtes leukémiában előforduló 3p deléció és 3q többlet) az eliminációs teszttel volt kapcsolatos. A 3q21 és/vagy a 3q26 töréspontokat érintő szerkezeti rendellenességet 4 AML és egy CML esetben azonosítottam. Két esetben mindkét töréspont érintett volt. A mindkét töréspontot egyszerre érintő kórkép, a 3q21q26 szindróma, melyet egy AML és egy CML blasztos fázisában azonosítottam. A 3q21 töréspontot az RPN1 (Ribophorin I) gén szomszédságában, a 3q26 töréspontot az EVI1 (ecotropic virus integration site-1) gén centroméra felé eső végére térképeztem. A sokpontos I-FISH vizsgálat a citogenetikailag feltételezett paracentrikus inverziót inv(3)(q21q26) igazolta mindkét esetben. Az inverzió során EVI1 gén kódoló régiója a konstitutívan expresszálódó RPN1 mellé helyeződött az EVI1 gén fokozott expresszióját eredményezve. Az EVI1 gén cinkujj típusú magi DNS kötő fehérjét kódol, mely gyakran fordul elő olyan transzkripciós faktorokban, melyek leukémiával asszociált kromoszóma transzlokációkban vesznek részt. Az EVI1 gén szokatlan expressziója megakadályozza a granulociták, eritroid sejtek és csontvelői progenitor sejtek terminális differenciálódását. A szindrómát a felnőtt AML esetek 5%-ában, a CML blasztos fázisának 20%-ában írták le. A 3q21 és 3q26 azonos fenotípusú variáns átrendeződései a CML-es esetek megakarioblasztos vagy akcelerált fázisára jellemzőek. Mindkét beteg bizonyos klinikai paraméterei, mint például az emelkedett trombocita szám, dismegakariocitopoesis, micromegakariociták jelenléte, több sejtvonal érintettsége, konvencionális kemoterápiára való rezisztencia, összhangban voltak a 3q szindrómával. A 3q21q26 szindróma előfordulása gyermekkori de novo AML-ben és CML-ben alacsony, a Mitelman adatbázis 317 hármas inverzió esetéből mindössze 6 gyermekkori eredetű, köztük csak három 12 év alatti gyermek. 6

8 A t(3;21)(q26;q22) transzlokációt egy terápiával összefüggő szekundér AML-ben (t-aml) azonosítottam. A 3q26 régió töréspontjának meghatározásához az RP11 vektor alapú BAC klónokat használtam fel. A töréspont az EVI1 gént érintette, de nem volt azonos a 3q inverziós Az AML1/EVI1 fúziós gén létrejöttét EVI1 gén lókusz specifikus BAC próba és a TEL/AML1 dual-color gyári próba kombinációjának együttes használatával bizonyítottam. A 3;21-es transzlokációban mindkét partner kromoszóma részéről a normális hemopoiesisben kulcsszerepet játszó gének sérülnek meg. A Mitelman adatbázis 59 t(3;21)(q26;q22) esetet tart számon. Nagyrészük CML blasztos fázisához kapcsolódik, kisebb részük t-aml vagy t-mds-ben fordul elő. A t(3;21) tipikusan felnőtt betegekre jellemző citogenetikai átrendeződés, a szakirodalom az itt értékelt eseten kívül, mindössze két gyermekkori esetet tart számon. Ez az AML1/EVI1 fúziós gént hordozó donor sejtes gyermekkori t-aml eset egyedi a szakirodalomban. A t(3;8)(q21;q24) transzlokációt egy 12 éves leánygyermeknél azonosítottam. Az irodalmi adatok alapján ez a transzlokáció rendkívül ritka, a Mitelman adatbázis egyetlen gyermekkori esetet sem tart számon és mindössze egy felnőtt, 74 éves t-aml-es betegről tesz említést, ahol a t(3;8)transzlokációt számos más átrendeződés kíséri. Egy AML es betegnél a hármas hosszú karon egy megközelítőleg 10 Mb nagyságú inersticiális deléciót, del(3)(q13q21)-et azonosítottam a 105,7 és 125,3 Mb között. A deléció töréspontja a 3q21 régióban, a RPN1 gén közvetlen szomszédságában található, de nem érintette a gént. A 3q21 AML valamennyi FAB szubtípusában ismert, gyakrabban előforduló terminális és intersticiális deléciós töréspont, ellentétben a 3q13 deléciós törésponttal, mely csak ritkán azonosítható AML-ben és más hematológiai malignitásokban. A 3q21 régióval kapcsolatos átrendeződések olyan mechanizmusokat indítanak el, melyek onkogén hatásukat bizonyos genetikai távolságról is képesek kifejteni. A CML-es beteg standard G-sáv, Dual-color és Multicolor-FISH vizsgálatok eredményeinek mozaikszerű összerakásából 4 kóros klón jelenléte igazolódott. Valamennyi klónban jelen volt a rejtett BCR-ABL fúziós gén. A multicolor FISH vizsgálattal vagy a 20-as kromoszóma q karjának a terminális végéhez vagy a der(14)-hez kapcsolódó 17q11-qter ugráló szegment transzlokációt ( unbalanced segmental jumping translocation ) azonosítottam. Az ugráló szegment transzlokáció hematológiai malignitásokban rendkívül ritka, a 17q11-qter transzlokációra nem találtam irodalmi adatot. A sokpontos I FISH vizsgálat inv(3)(q21q26) inverziót és 3q duplikációt is igazolt. Valószínű, hogy a (3)(q21q26) inverzió kialakulását egy másik átrendeződés, a (3)(q21q28) régió duplikációja követte. Az inverzió során az EVI1 gént tartalmazó 3q26 szegmens a 3q21 régióval lett szomszédos és a tőle lefelé, telomérikusan elhelyezkedő régió duplikálódott a 3q21-3q28 között. A 3q21q26 inverzió és duplikáció együttes előfordulásával sem gyermekkori, sem felnőttkori hematológiai malignitások szakirodalmában nem találkoztam. A Philadelphia kromoszómával együttesen előforduló 3q szindróma azonosítása prognosztikai jelentőségű mind gyermekkori, mind felnőttkori CML-ben. Az EVI1, MDS/EVI1 és a BCR/ABL együttes expressziója a mieloid irányú differenciálódást teljesen blokkolja és rövid idő alatt akut mieloblasztos leukémiát indukál. 7

9 KÖVETKEZTETÉSEK Összefoglalva a 61 gyermekkori leukémiás csontvelő hármas kromoszómára vonatkozó vizsgálataimat, a következőket állapítom meg: 1. A sokpontos I-FISH technikát elsőként vezettem be hematológiai rendellenességek azonosítására. Ez az egyedi metodika alkalmas volt hagyományos citogenetikával és más DNS-alapú korszerű technikákkal nem azonosítható, rejtett rendellenességek kimutatására, töréspontok azonosítására. 2. I-FISH vizsgálataim a 25 B sejtes ALL-ben eliminációs teszttel kapcsolatos elváltozásokat, a CER régió vesztését, illetve a CRR régió kópiaszám növekedését nem mutatták ki. Az analizált 7 T-sejtes ALL-ből kettőben 3p deléciót és 4-ben CRR régiót érintő duplikációt találtam. Az Et következetesen elvesző régiója, CER1 és CER2 az általam vizsgált T sejtes ALL esetekben nem deletálódott. A két T-sejtes ALL-ben a 3p intersticiális deléciót a 3p12-p13 régióban találtam. A deléció helye megfelel egy ismert, feltételezett tumor szuppresszor gén, a Deleted in U-Twenty- Twenty, DUTT1 gén helyének, melynek elvesztését szolid tumorok premalignus fázisában írták le. 3. A triszómiák viszonylag kis sejtpopulációban (11-15%) fordultak elő és a hármas kromoszóma hosszú karját vagy az egész hármas kromoszómát érintették. Az eredményeim, egymástól független, kóros hármas kromoszóma szubpopulációk kialakulását igazolják ugyanabban a tumorban. A kisebb szubpopulációk összefüggése a tumor kialakulásával és progressziójával kellőképpen még nincs tanulmányozva. A szubpopulációk szerepének tisztázáshoz további, nagyobb esetszámot átfogó vizsgálatok szükségesek. 4. Habár irodalmi adatok alapján 3p deléció az AML esetek 1-1,2%-ában előfordul, CER régióra vonatkozó vagy más 3p deléciót az analizált 28 gyermekkori AML-ben nem találtam. Öt AML esetben azonosítottam a CRR régió kópia szám növekedését, ebből 4 teljes hármas triszómia és egy, a CRR régiót magába foglaló 3q tetraszómia. Ebben a régióban olyan onkogének találhatók, mint pl. a TNFSF10, TERC/hTR, BCL6/LAZ3, melyek nem szövetspecifikusak, hanem általában játszanak szerepet a tumor iniciációban és progresszióban, vagy mint pl. az EVI1, mely többféle leukemogenezissel kapcsolatos sajátsággal rendelkezik. 5. A 32 gyermekkori ALL esetből 6-ban találtam 3-as kromoszóma rendellenességet a csontvelő I- FISH vizsgálatával. Ez a gyakoriság (8%) magasabb, mint amit a Mitelman adatbázisban regisztráltak (3,4%). Ez a magasabb gyakoriság a nagy felbontóképességű és specifikus sokpontos I-FISH technikának tudható be, mely alkalmas volt a sejtek osztódó képességétől függetlenül a kisebb kóros populációk detektálására gyermekkori AML esetből 9-ben hármas kromoszómával kapcsolatos rendellenességet azonosítottam. A rendellenességek egy része (3 eset) azzal magyarázható, hogy az alkalmazott 8

10 sokpontos I-FISH sokkal érzékenyebb metodika, mint a korábbi G-sáv alapú citogenetikai vizsgálat, mellyel 28/6 hármas kromoszóma rendellenesség volt kimutatható. 7. Három mieloid leukémia esetben, a 3q26 régióban az EVI1 gént érintő töréspontot azonosítottam. A töréspontok nem voltak azonosak, két különböző leukemogenezissel kapcsolatos mechanizmust indítottak el. A 3q inverziós töréspont az EVI1 gén centromérához közeli, a 3;21 transzlokációs töréspont a gén teloméra felé eső végét érintette. Sérülése az inverzió esetén fokozott expresszióját, transzlokáció esetén a normális EVI1/MDS1 és a partner kromoszóma AML1 génjének megzavarását okozta. 8. Négy mieloid leukémia esetben a töréspontot a 3q21 régióban térképeztem. A 3q21 mutagén expozicióra érzékeny fragilis hely, leggyakrabban t-aml-ben érintett. A töréspontot az RPN1 gén közvetlen szomszédságában azonosítottam. Az RPN1 olyan konstitutívan expresszálódó gén, mely erős enhancer eleme révén bizonyos genetikai távolságról is képes onkogén hatást kifejteni, pl. a 3q21q26 inverzió esetén az EVI1 gén kóros expresszióját eredményezve. 9. A rendkívül rossz prognózisú, felnőttkori t-aml-re és CML blasztos fázisára jellemző 3q21q26 szindrómát két esetben azonosítottam: egy de novo AML-ben és egy akcelerált fázisban diagnosztizált gyermekkori CML-ben. 10. Egy gyermekkori t-aml esetben az AML1/EVI1 fúziós gént azonosítottam. Az AML1 és EVI1 gének szabályozást irányító ( master regulator ) szerepet játszanak a normális hematopoietikus őssejtek képződésében. A transzlokáció esetén keletkező kimérikus fehérje mindkét eleme sérült és gátolja a sejtek normális differenciálódási képességét. 11. Gyermekkori AML-ben a felnőttekével azonos citogenetikai eltéréseket azonosítottam, de különbséget találtam előfordulási gyakoriságukban. A teljes hármas triszómia gyakoribb a gyermekeknél, az inv(3)(q21q26), t(3;21)(q26;q22) inkább felnőttekre jellemző. Ez egyrészt magyarázható a fiatalabb korosztály eltérő fogékonyságával, másrészt azzal, hogy a t-aml gyermekeknél ritkábban fordul elő, mint felnőtteknél. 12. A 3q-t érintő átrendeződések prognosztikai értéke egységesnek tűnik mind felnőtteknél, mind gyermekeknél. Az inv(3)(q21q26), t(3;21), 3q többlet és 3q deléció esetén nem lehetett teljes remisszióba hozni a betegeket. Az össztúlélés rendkívül rövid volt, átlagosan 6,2 hónap, annak ellenére, hogy valamennyi beteg magas rizikójú csoportnak megfelelő kezelést kapott. 13. Egy gyermekkori AML-re nézve új transzlokációt, t(3;8)(q21;q24)-et is találtam. Mivel a szakirodalom is csak egyetlen felnőtt esetet tart számon, ezen eset publikálása után a transzlokáció AML-re nézve visszatérő transzlokációnak tekinthető. 9

11 14. A vizsgált CML esetben hagyományos citogenetika, M-FISH és sokpontos I-FISH technika kombinálásával hematológiai esetekben ritkán előforduló ugráló szegment transzlokációt és 3q duplikációt illetve 3q21q26 inverziót azonosítottam. 15. A molekuláris genetikai módszerek (PCR-alapú) rendkívül gyors segítséget nyújtanak a diagnózis felállításában, a minimális reziduális betegség kimutatásában, de nem helyettesítik sem a klasszikus (GTG-sáv alapú), sem a modern citogenetikai (FISH-alapú) módszereket. A hagyományos és molekuláris citogenetikai módszerek kombinálása lehetőséget ad olyan magas rizikójú genotípus azonosítására, mint a rendkívül rossz prognózisú 3q21q26 szindróma, mely a konvencionális kemoterápiától eltérő kezelést igényel. 10

12 AZ ÉRTEKEZÉS TÉMAKÖRÉBEN KÉSZÜLT SAJÁT KÖZLEMÉNYEK Lektorált közlemények 1. Haltrich I, Müller J, Szabó J, Kovács G, Kóos R, Poros A, Dobos M, Fekete Gy. Donor cell myelodysplastic syndrome developing 13 years after marrow grafting for aplastic anemia. Cancer Genetics and Cytogenetics. 2003; 142: Haltrich I, Kost Alimova M, Kovács G, Kriván G, Dobos M, Stefan I, Fekete Gy. A 3q21q26 szindróma azonosítása sokpontos-interfázis-fish vizsgálattal gyermekkori myeloid leukémiában. Magyar Onkológia. 2005; 49: Haltrich I, Kost Alimova M, Kovács G, Kriván G, Tamáska J, Klein G, Fekete Gy, Imreh. S. Jumping translocation of 17q11-qter and 3q25q28 duplication in a variant Philadelphia chromosome t(9;14;22)(q34;q32;q11) carrying childhood CML. Cancer Genetics and Cytogenetics (közlésre elfogadva) 4. Haltrich I, Kost Alimova M, Kovács G, Klein G, Fekete Gy, Imreh S. Multipoint interphase FISH analysis of chromosome 3 abnormalities in 28 childhood AML patients. European Journal of Haematology (közlésre elfogadva) 5. Haltrich I, Kost-Alimova M, Fekete Gy, Klein G, Imreh. S. Multipoint-FISH in childhood T- cell-lineage ALL detects subpopulations that carry 3q trisomies or deletions in the DUTT1/ROBO1 tumor suppressor gene region at 3p12-p13. (közlésre benyújtva) Idézhető absztraktok 1. Haltrich I, Müller J. Donor eredetű juvenilis myelomonocytás leukémia kialakulásának genetikai háttere. Magyar Humángenetikai Társaság III. Kongresszusa, Debrecen, június 8-9. Absztrakt és poszter összefoglalók 55. old. 2. Müller J, Haltrich I, Koós R, Kriván G, Kovács GT. Juvenile Myelomonocyter Leukemia (JMMoL) of Donor Origin 12 Years after Successful Allogenic Bone Marrow Transplantation for Aplastic Anaemia. Medical and Pediatric Oncology. 2003; 41(4): Müller J, Haltrich I, Koós R, Kriván G, Kovács GT. Case Presentation of a Juvenile Myelomonocytic Leukemia of Donor Origin after Successful Allogenic Bone Marrow 11

13 Transplantation. Semmelweis Symposium New Trends In Medical Genomics. Budapest, november Müller J, Haltrich I, Szabó J, Kovács G, Koós R, Garami M, Kriván G. Fekete Gy. Donorderived acute myelomonocytic leukemia in a patient receiving allogenic bone marrow transplant for severe aplastic anaemia. 30th Annual Meeting of the European Group for Blood and Marrow Transplantation. Barcelona, Spanyolország, március Haltrich I, Kost Alimova M, Müller J, Imreh S, Fekete Gy. A new variant Philadelphia jumping segment translocation with two unusual 3q unbalances in a childhood CML case. 1 st International Conference on Basic and Clinical Immungenomics. 3-7 October, Budapest, Hungary. Tissue Antigens. 2004; 64:4. 6. Müller J, Haltrich I. Koós R. Kriván G, Kovács GT. Juvenile Myelomonocyter Leukemia (JMMoL) of Donor Origin 12 Years after Successful Allogenic Bone Marrow Transplantation for Aplastic Anaemia. 35 th Congress of the International Society of Paediatric Oncology (SIOP). Egyiptom, Kairó, október Bone marrow transplantation. 2004; 33:Suppl Haltrich I, Kost-Alimova M, Imreh S, Fekete Gy. Gyermekkori krónikus myeloid leukémia komplex citogenetikai vizsgálata. Semmelweis Egyetem, PhD Tudományos Napok 2004; 135. old. 8. Haltrich I, Kost-Alimova M, Müller J, Dobos M, Imreh S, Fekete Gy. A hármas kromoszóma vizsgálata gyermekkori akut myeloid leukémiában. Magyar Humángenetikusok V. Munkakonferenciája. Szeged, november Absztrakt és poszter összefoglalók 55. old. 9. Haltrich I, Kost Alimova M, Müller J, Dobos M, Imreh S, Fekete Gy. Klasszikus és modern citogenetika egy gyermekkori CML-eset kapcsán. Gyermekgyógyászat. 2004; 55:Suppl Haltrich I, Kost-Alimova M, Müller J, Dobos M, Imreh S, Fekete Gy. DUTT1/ROBO1 tumorszuppresszor gén deléciójának azonosítása gyermekkori akut lymphoid T-sejtes leukémiában. VI. Magyar Genetikai Kongresszus XIII Sejt- és Fejlődésbiológiai Napok, Eger, április A konferencia előadásainak és posztereinek összefoglalója 146. old. 11. Haltrich I, Kost Alimova M, Kovács G, Dobos M, Imreh S, Fekete Gy. A hármas kromoszóma vizsgálata gyermekkori akut lymphoid leukémiában. Semmelweis Egyetem, PhD Tudományos Napok 2005; 84. old. 12

14 12. Haltrich I, Kost Alimova M, Imreh S, Fekete Gy. Analysis of chromosome 3 abnormality in 28 childhood AML cases. 5th. European Cytogenetics Conference. Madrid, 2005, júniús 4-7. Chromosome research. 2005; 13:Suppl Haltrich I, Kost-Alimova M, Kovács G, Dobos M, Imreh S, Fekete Gy. A hármas kromoszóma sokpontos FISH vizsgálata gyermekkori akut myeloid leukémiában. A Magyar Onkológusok Társaságának XXVI. Kongresszusa. Budapest, november